CN101434932A - 甘蔗细胞悬浮液制备方法 - Google Patents
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Abstract
甘蔗细胞悬浮液制备方法，以甘蔗新叶作为外植体，采用三次固体培养基培养得到颗粒状甘蔗愈伤组织，甘蔗愈伤组织接种到N6液体培养基中，在转速为120rpm/min、温度为28℃的摇床上振荡培养12天后，将培养液中的悬浮液转接到离心管中，在转速为5000rpm的转速下离心20分钟，去除上清液；留下的离心沉积物转接到N6液体培养基中，在转速为120rpm/min、温度为28℃的摇床上振荡培养48小时，即可得到分散均匀的甘蔗细胞悬浮液；本发明简化了液体培养过程中多次更换液体培养基以达到细胞数量增殖的操作过程，缩短了液体振荡培养周期，不需要多次更换液体培养基，降低了材料因多次更换液体培养基导致污染的风险。
Description
技术领域：
本发明涉及甘蔗细胞工程育种领域，尤其是一种甘蔗细胞悬浮液制备方法。
技术背景：
植物细胞的悬浮培养是指将植物细胞或较小的细胞团悬浮在液体培养基中进行培养，在培养过程中能够保持良好的分散状态。由于液体培养基的旋转和震荡，使得愈伤组织上分裂的细胞不断游离下来。液体培养基中的培养物是混杂的，既有游离的单个细胞，也有较大的细胞团，还有接种残渣。目前植物细胞悬浮培养技术已经广泛应用于植物细胞的形态、生理、遗传、凋亡等研究工作，特别是为基因工程在植物细胞水平上及植物化学诱变育种的操作提供了理想的材料和途径。遗传转化或者化学诱变的植物细胞经过诱导分化形成植株，即可获得携带有目标基因的或者诱变后变异的个体。目前采用的植物细胞悬浮液制备方法通常为直接对外植体进行液体振荡培养，或者以第一代愈伤组织，即第一次从外植体分化的愈伤组织作为振荡培养材料，这种类型需要较长的液体振荡培养多个周期，每个周期12～18天，需要时间长。而且，每个周期必须进行液体培养基的更换，以达到细胞数增殖的目的。由于进行液体培养基的更换操作必须在无菌条件下进行，操作不当，容易造成培养材料受污染，与固体培养相比较，操作难度更大，培养材料容易在更换液体培养基的过程中被污染。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能简便高效地获得甘蔗细胞悬浮液的制备方法。
本发明通过以外植体、第一代愈伤组织、第二代愈伤组织、第三代愈伤组织和颗粒状愈伤组织等多种类型材料作为液体振荡培养材料，试验了90rpm/min，120rpm，180rpm及220rpm/min等多个摇床转速，对不同2.4-D浓度液体培养基进行了比较研究，最终获得了简便制备甘蔗细胞悬浮液的方法。
本发明以生长旺盛期的甘蔗新叶作为外植体，通过三次固体培养，使得培养材料愈伤组织数量得到大量增殖。第一次采用[N6+2.4-D(3mg/L)+琼脂(7g/L)+蔗糖(30g/L)+活性碳(0.5g/L)]固体培养基培养，即采用较高的2.4-D浓度，培养15～20天，使得外植体快速分化获得甘蔗愈伤组织。第二次和第三次继代培养均采用以上相同的培养基，仅降低2.4-D浓度至2mg/L和减去了活性碳，每次培养时间为25～30天，使得第一次培养分化出的愈伤组织充分增殖并风化为颗粒状愈伤组织，即再经过两次[N6+2.4-D(2mg/L)+琼脂7(g/L)+蔗糖(30g/L)]的固体培养基培养，获得颗粒状甘蔗愈伤组织。以此愈伤组织作为悬浮培养材料，以2.4-D浓度为1mg/L的液体培养基作为培养液，在摇床上振荡培养，摇床转速为120rpm/min，摇床温度为28℃，培养12天后，培养液中的颗粒状愈伤组织即分散为较均匀的细胞小团块，团块细胞数目在1～200之间。在无菌条件下，将此悬浮液转接到离心管中，在转速为5000rpm的转速下离心20分钟，去除上清液；将得到的细胞或者细胞团溶解于N6液体培养基中，在摇床转速为120rpm/min，摇床温度为28℃，培养48小时，即可得到分散均匀的甘蔗细胞悬浮液。
所述的外植体是指拔节期无病虫危害健康植株的甘蔗新叶，经过75％酒精消毒处理后，切割为2～3毫米长作为外植体。
所述N6液体培养基是指[N6+2.4-D(1mg/L)+蔗糖(30g/L)]。
有益效果：
悬浮培养获得的甘蔗细胞团是进行甘蔗基因工程育种、诱变育种、细胞学研究的理想材料。特别是在甘蔗化学诱变育种中，与采用块状愈伤组织或者幼嫩新叶作为诱变受体相比较，采用悬浮细胞系作为诱变受体能够有效提高诱变效率。本发明提出的甘蔗细胞悬浮液制备方法采用三次固体培养基培养，使得外植体分化的愈伤组织得到了充分增殖，仅采用了一个12天的液体振荡培养周期和一个2天的细胞分散培养；简化了液体培养过程中多次更换液体培养基以达到细胞数量增殖的操作过程，缩短了液体振荡培养周期，不需要多次更换液体培养基，降低了材料因多次更换液体培养基导致污染的风险；该细胞悬浮液制备方法可作为甘蔗科研单位或相关育种机构借鉴利用。
具体实施方式：
一种甘蔗细胞悬浮液制备方法，实施中用到的仪器设备有：超净工作台、灭菌锅、控温摇床和超速离心机等，其详细实施步骤如下：
1、愈伤组织培养：在甘蔗拔节以后，选择无病虫危害的健康植株，采取幼嫩新叶，用自来水洗净，以75％酒精擦洗消毒，在无菌工作台内剥去外层老叶，每剥一层，以75％酒精擦洗消毒一次，最后一层新叶无需再进行消毒。选择自甘蔗茎尖生长点2～3厘米长的新叶作为外植体，将其切为2～3毫米长后，接种到固体培养基上[N6+2.4-D(3mg/L)+琼脂(7g/L)+蔗糖(30g/L)+活性碳(0.5g/L)]，每个培养皿培养8～10个外植体，在暗环境，温度28～30℃下培养时间为15～20天，即可得到第一次由外植体分化的愈伤组织。
2、颗粒状愈伤组织培养：颗粒状愈伤组织培养包含两次继代过程。首先，在无菌条件下，将步骤1所得到的愈伤组织接种到[N6+2.4-D(2mg/L)+琼脂(7g/L)+蔗糖(30g/L)]的固体培养基上。接种过程中，选择分化良好的愈伤组织进行继代培养，去除褐化及死亡的外植体或者愈伤组织。每个培养皿接种6～8块大小适中的愈伤组织，自然光，室温培养25～30天，使愈伤组织充分分化；然后，在无菌条件下将得到的甘蔗愈伤组织接种到如上述相同的固体培养基中，自然光室温下继续培养25～30天，即可以得到活性较好、黄绿色的颗粒状愈伤组织。
3、颗粒状愈伤组织悬浮培养：在无菌条件下，将按照步骤2所述得到的颗粒状愈伤组织接种到N6液体培养基中[N6+2，4-D(1mg/L)+蔗糖(30g/L)]，在摇床上振荡培养12天，摇床转速为120rmp/min，温度为28℃。因为用于振荡培养的愈伤组织已经为小的颗粒状，因此，经过12天的振荡培养后即均匀分散为小的细胞团块，悬浮于液体培养基中。液体振荡培养的目的在于将固体培养阶段得到的颗粒状愈伤组织分散为均匀更小的细胞团块。
4、悬浮物离心：在无菌条件下，将步骤3所述的小细胞团块溶液转接到离心管中进行离心，离心机转速设置为5000rpm/min，离心20min。在无菌条件下，去除上清液，留下离心沉积物。
5、细胞悬浮液的获得：在无菌条件下，将步骤4所得到的离心沉积物转接到如步骤3所述的液体培养基中，在转接的过程中，去除褐化、死亡的小细胞团块和大的细胞团块。摇床上振荡培养2天，摇床转速为120rmp/min。即可得到分散均匀的甘蔗细胞悬浮液。
Claims (4)
1、一种甘蔗细胞悬浮液制备方法，其特征在于：以甘蔗新叶作为外植体，采用三次固体培养基培养得到颗粒状甘蔗愈伤组织，第一次培养时间15～20天，第二次和第三次培养时间各为25～30天；颗粒状甘蔗愈伤组织接种到N6液体培养基中，在转速为120rpm/min、温度为28℃的摇床上振荡培养12天后，将培养液中的悬浮液转接到离心管中，在转速为5000rpm的转速下离心20分钟，去除上清液；留下的离心沉积物转接到N6液体培养基中，在转速为120rpm/min、温度为28℃的摇床上振荡培养48小时，即可得到分散均匀的甘蔗细胞悬浮液。
2、根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述三次固体培养基培养时，第一次采用[N6+2.4-D(3mg/L)+琼脂(7g/L)+蔗糖(30g/L)+活性碳(0.5g/L)]固体培养基，第二次和第三次采用[N6+2.4-D(2mg/L)+琼脂(7g/L)+蔗糖(30g/L)]固体培养基。
3、根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述的外植体选择自甘蔗茎尖生长点2～3厘米长的新叶，经过75％酒精消毒处理后，切割为2～3毫米长作为外植体。
4、根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述的N6是指[N6+2.4-D(1mg/L)+蔗糖(30g/L)]液体培养基。
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|---|---|---|---|---|
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| CN102796704B (zh) * | 2012-08-31 | 2014-06-25 | 北京天辰空间生物医药研发有限公司 | 一种温度控制细胞培养方法 |
| CN107006374A (zh) * | 2017-05-26 | 2017-08-04 | 云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所 | 一种水稻悬浮细胞系快速培养的方法 |
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