CN103667406A - 菊粉源重组别藻蓝蛋白的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于微生物发酵法生产蛋白质的领域，具体涉及一种菊粉源重组别藻蓝蛋白的微生物制备方法。将菊粉作为原料经降解作为种子液，再将大肠杆菌P2在发酵培养基的作用下经摇床或发酵罐培养，最后经异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）诱导表达，即得到菊粉源重组别藻蓝蛋白。本发明所得重组别藻蓝蛋白能应用于食品、保健与医药及功能材料等领域。菊粉源重组别藻蓝蛋白制备方法简单，为菊粉的生物利用找到一条低成本高产出的应用途径，与以葡萄糖为碳源相比，大大降低了发酵生产重组别藻蓝蛋白的原料成本。
Description
技术领域
本发明属于微生物发酵法生产蛋白质的领域，具体涉及一种菊粉源重组别藻蓝蛋白的微生物制备方法。
技术背景
藻胆蛋白原产自海洋，主要从蓝藻与红藻类中提取而来。藻胆蛋白是蓝藻和红藻光合作用捕光复合物的功能组分，根据其吸收光谱和荧光光谱特征，藻胆蛋白可以分为藻红蛋白、藻红蓝蛋白、藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白。藻胆蛋白是是具有特殊生物性能的蛋白质。藻胆蛋白具有促进生物血细胞再生，全面增强机体的防病抗病能力，能抑制癌细胞生长，是一种无毒副作用的理想光敏剂，可减轻肿瘤化疗的副作用。此外，藻胆蛋白还具有抗氧化和抗炎作用。藻胆蛋白作为一种天然色素，也可作为高级天然色素应用于食品和化妆品中。藻胆蛋白由于还具有强烈的荧光性，在分子生物学上可用于制备荧光探针，适用于免疫学、细胞学、生理学和分子生物学等方面的研究与应用。
天然藻胆蛋白，不仅制备成本高昂、工艺复杂，且得到的是色素蛋白复合物，效果不稳定，难以建立规范统一的质量标准，要想深入研究其生物活性和开发藻胆蛋白成单体药物需要解决微藻培养、采收以及藻胆蛋白提取、纯化等一系列成本高昂的长周期工艺。因此，通过藻类得到藻胆蛋白用于药物开发几乎是不可能的。Bryant等1985年使聚球藻Synechococcus PCC 7002的藻蓝蛋白基因和Cyanophoraparadoxa的别藻蓝蛋白基因在大肠杆菌中成功表达，这标志着运用基因工程技术，开展藻胆蛋白异源表达的开始。且临床研究表明，重组别藻蓝蛋白无毒副作用，具有抗氧化和免疫调节作用，以此实现其抗肿瘤功能。稳定、良好的抗肿瘤活性和低廉的生产成本使其有望开发成为基因工程新药。
由于微生物易于批量培养，利用大肠杆菌、酵母等成熟的表达系统发酵生产重组别藻蓝蛋白具有极大地应用潜力。目前发酵法生产重组别藻蓝蛋白的主要碳源为葡萄糖。相比葡萄糖，菊粉具有广泛的来源。菊粉是从菊芋中提取而来的，菊芋耐旱、耐旱，对环境适应性强，自我繁殖力强，且生长过程中不需精细管理；种植菊芋不占用耕地，可充分利用荒地、坡地、盐碱地，且产量极高，目前，在中国青海、山东、新疆、黑龙江、江苏、四川、宁夏等省份都有大面积种植，所以菊粉成本低廉易得。同比葡萄糖为碳源，利用廉价的天然原料菊粉为原料，可以大大降低生产成本，易于工业化生产，进而满足食品、医药等各行业对重组别藻蓝蛋白的需求。
发明内容
本发明的目的在于提供一种菊粉源重组别藻蓝蛋白的微生物制备方法。
为实现上述目的，本发明采用技术方案为：
一种菊粉源重组别藻蓝蛋白的制备方法，将菊粉作为原料经降解作为种子液，再将大肠杆菌P2在发酵培养基的作用下经摇床或发酵罐培养，最后经异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）诱导表达，即得到菊粉源重组别藻蓝蛋白。
1）将大肠杆菌P2按体积比15-20%接种于种子液培养基中于35-39℃，摇床培养6-12h；而后将培养液按体积比1-5%（v／v）接种于二级种子液培养基中于35-39℃，摇床培养6-12h；
2）将上述培养液按1-5%（v／v）的接种量接种，于发酵培养基中以35-39℃，罐压0.5Kg/cm2，pH7.0-7.5，搅拌转速为200-400rpm，空气流量5-15L/min，在发酵至溶氧反弹时补入补料培养基，35-39℃，摇床培养至对数生长后期，于培养基中加入诱导剂，降温至25-30℃，再培养10-15h；
3）发酵结束后破碎细胞，对细胞破碎物进行分离纯化，得目的蛋白。
所述步骤1）培养大肠杆菌P2的培养基为：蛋白胨5-10g，酵母粉3-10g，NaCl 5-15g，自来水1L，60mg/ml的卡那霉素溶液0.5-1.5ml，用5mol／L的NaOH溶液调节pH至6.5-7.5；
二级种子液培养基为：蛋白胨10-20g，酵母粉5-15g，NaCl 3-10g，自来水1L，60mg／ml的卡那霉素溶液0.5-1.5ml，用5mol／L的NaOH溶液调节pH至6.5-7.5。
所述步骤2）发酵培养基为蛋白胨10-20g，酵母粉5-15g，NaCl3-10g，MgSO43-10g，菊粉酸解液（其中的还原糖浓度约为50gL）100-500ml，自来水补足1L的体积，60mg/ml的卡那霉素溶液0.5-1.5ml，用5mol／L的NaOH溶液调节pH至6.5-7.5；补料培养基为：蛋白胨10-20g，酵母粉5-15g，NaCl 3-10g，MgSO43-10g，1L菊粉酸解液，pH6.5-7.5。
所述菊粉酸解液中的还原糖浓度约为50g／L。
所述菊粉酸解液为将菊粉与1.0-2.0%（w／w）的硫酸溶液按比例1:8（w／v）混合，混合后于90℃水浴30-50min,然后用5mol／L的NaOH溶液将其pH调节至6.5-7.5。所述诱导剂为0.3mol／L的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）诱导时加诱导剂至其发酵液中终浓度为0.3mmol／L。所述大肠杆菌P2为能生产活性重组别藻蓝蛋白的大肠杆菌，该菌株是由大肠杆菌菌株P1，通过分子生物学手段敲除其中的氨苄霉素抗性基因，在原位点插入卡那霉素抗性基因而得到。
本发明与现有技术相比，具有以下优点：
1.与以藻类作为原料制备别藻蓝蛋白相比，本发明以大肠杆菌发酵法生产别藻蓝蛋白，繁殖周期短，生产工艺简单；
2.与藻类相比，大肠杆菌细胞壁容易破碎，纯化过程中可节省能源；
3.通过大肠杆菌生产，别藻蓝蛋白含量更高，体系中几乎没有性质类似的蛋白，提取方便；
4.菊粉源别藻蓝蛋白的制备，采用廉价的天然原料菊粉为主要碳源，成本低，易于工业化。
5.本发明所得重组别藻蓝蛋白能应用于食品、保健与医药及功能材料等领域。菊粉源重组别藻蓝蛋白制备方法简单，为菊粉的生物利用找到一条低成本高产出的应用途径，与以葡萄糖为碳源相比，大大降低了发酵生产重组别藻蓝蛋白的原料成本。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明，但不构成对本发明的任何限制。
实施例1：菌种的构建
大肠杆菌P2是由能生产活性重组别藻蓝蛋白的大肠杆菌菌株P1为出发菌，根据现有技术的记载构建得到大肠杆菌P2。
其中，能生产活性重组藻胆蛋白的大肠杆菌菌株P1构建方法参照申请号为9612023.x,发明名称，能生产活性重组藻胆蛋白的微生物及其制备方法文献的记载。P1现保藏于中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏编号CGMCC No.0261，保藏日期为1996年4月17日。
以大肠杆菌菌株P1为出发菌株，通过分子生物学手段敲除其中的氨苄霉素抗性基因，在原位点插入卡那霉素抗性基因，得到带卡那霉素抗性基因的产别藻蓝蛋白的菌株P2。具体分子生物学方法可参考，葛保胜，2005，抗肿瘤新药重组别藻蓝蛋白(雷普克)的药学研究及抗肿瘤机理探索，P29-38，中国博士学位论文全文数据库。
实施例2菊粉源别藻蓝蛋白的摇瓶制备
1）种子液的制备：按照装液量20%（v／v）的比例将种子液培养基装至三角瓶中，接种环挑取适量上述大肠杆菌P1斜面菌体接种，然后于37℃，摇床转速200rpm的条件下培养8h。
其中，种子培养基（以制备1L培养基为例）：蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g，自来水1L，用5mol／L的NaOH溶液调节pH至7.0，115°C，灭菌20min，然后加入60mg/ml的卡那霉素溶液1ml。
2）别藻蓝蛋白的摇瓶制备：按照装液量20%的比例将发酵培养基装至三角瓶中，接入种子液，接种量控制在5%（v／v），发酵温度37℃，摇床转速200rpm，培养4h后加入诱导剂0.3mol／L的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）至发酵液中至其的终浓度为0.3mmol／L，然后在28℃下再培养4h，发酵结束。
3）细胞破碎与蛋白纯化：细胞破碎：将上述发酵后菌体于-70℃存放而后于温水浴中化冻，取部分解冻的菌体用Breaking Buffer（即细胞破碎缓冲液，配方为Tris-HCl：20mM，NaCl：100mM，EDTA：10mM，巯基乙醇：1ml／L，pH 7.4）溶解，溶解用量为1g湿菌体用10ml Breaking Buffer，600W条件下超声破碎二次。破碎液在9000rpm，30min，4°C条件下离心。取上清，得粗提物；
然后采用硫酸铵分级沉淀与柱层析（疏水，离子交换，分子筛）相结合的纯化工艺对细胞破碎物进行分离纯化，具体参考唐志红，2004，镭普克（rAPC）关键工艺的建立及抗肿瘤活性的研究，P58-65，中国博士学位论文全文数据库。然后通过SDS-page和蛋白的紫外吸收光谱确定所得蛋白。然后通过SDS-page和蛋白的紫外吸收光谱确定所得本实施例蛋白与以葡萄糖为碳源得到的蛋白的大小均约为60kDa，紫外吸收光谱图一致，最大吸收峰均在240nm附近。
其中，发酵培养基（以制备1L培养基为例）：蛋白胨16g，酵母粉10g，NaCl 5g，MgSO45g，菊粉酸解液400ml，自来水补足1L的体积，用5mol／L的NaOH溶液调节pH至7.2，115°C，灭菌20min，然后加入60mg/ml的卡那霉素溶液1ml。
所述菊粉酸解液，称取一定量的菊粉与1.5%（w／w）的硫酸溶液按比例1:8（w／v）混合，混合后于90℃水浴40min,然后用5mol／L的NaOH溶液将其pH调节至7.2，得菊粉酸解液，待用。
实施例3菊粉源别藻蓝蛋白的发酵罐制备
1）一级种子液的制备：按照装液量20%（v／v）的比例将种子液培养基装至三角瓶中，接种环挑取适量上述大肠杆菌P1斜面菌体接种，然后于37℃，摇床转速200rpm的条件下培养8h。
所述，一级种子培养基（以制备1L培养基为例）：蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g，自来水1L，用5mol／L的NaOH溶液调节pH至7.0，115°C，灭菌20min，然后加入60mg/ml的卡那霉素溶液1ml。
2）二级种子液的制备（以制备1L培养基为例）：按照装液量20%的比例将二级种子液培养基装至三角瓶中，接入一级种子液，接种量控制在5%（v／v），然后于37℃，摇床转速200rpm的条件下培养8h。其中，二级种子培养基（以制备1L培养基为例）：蛋白胨16g，酵母粉10g，NaCl 5g，自来水1L，用5mol／L的NaOH溶液调节pH至6.5-7.5，115°C，灭菌20min，然后加入60mg/ml的卡那霉素溶液1ml。
3）别藻蓝蛋白的发酵罐制备：
a)首先对发酵过程中所用的PH电极、溶氧电极等进行校正，对所有管路进行检查，清洗发酵罐，对发酵罐进行空消，排水，待用。
b)按照装液量50%(体积比)的比例在30L发酵罐中装入发酵培养基按5%（v／v）的接种量将二级种子液接种至发酵罐中，发酵温度37℃，罐压0.5Kg/cm2，搅拌转速为300rpm，空气流量10L/min。在发酵至溶氧反弹（5h左右）时以补糖速率为0.167g glucose L-1min-1的恒速补入补料培养基2L；以37℃，罐压0.5Kg/cm2，搅拌转速为300rpm培养菌体至对数生长后期（补料后约2h）加入诱导剂0.3mol／L的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）至其的终浓度为0.3mmol／L，然后降温至28℃，再培养11h，发酵结束。
c）细胞破碎与蛋白纯化：细胞破碎：将上述发酵后菌体于-70℃存放而后于温水浴中化冻，取部分解冻的菌体用Breaking Buffer（即细胞破碎缓冲液，配方为Tris-HCl：20mM，NaCl：100mM，EDTA：10mM，巯基乙醇：1ml／L，pH 7.4）溶解，溶解用量为1g湿菌体用10ml Breaking Buffer，600W条件下超声破碎二次。破碎液在9000rpm，30min，4°C条件下离心。取上清，得粗提物；
然后采用硫酸铵分级沉淀与柱层析（疏水，离子交换，分子筛）相结合的纯化工艺对细胞破碎物进行分离纯化，具体参考唐志红，2004，镭普克（rAPC）关键工艺的建立及抗肿瘤活性的研究，P58-65，中国博士学位论文全文数据库。然后通过SDS-page和蛋白的紫外吸收光谱确定所得蛋白。然后通过SDS-page和蛋白的紫外吸收光谱确定所得本实施例蛋白与以葡萄糖为碳源得到的蛋白的大小均约为60kDa，紫外吸收光谱图一致，最大吸收峰均在240nm附近。
其中，发酵培养基以制备1L培养基为例，蛋白胨16g，酵母粉10g，NaCl 5g，MgSO45g，菊粉酸解液400ml，自来水补足1L的体积，用5mol／L的NaOH溶液调节pH至7.2，115°C，灭菌20min，降温后加入60mg/ml的卡那霉素溶液1ml。
补料培养基以制备1L培养基为例，蛋白胨16g，酵母粉10g，NaCl 5g，MgSO45g，1L菊粉酸解液，pH7.2。
应用例
将上述实施例纯化所得重组别藻蓝蛋白进行体外抗肿瘤药效学评价。采用MTT和SRB法，选择敏感肿瘤细胞株（人肺腺癌A549、小鼠P388淋巴白血病细胞、人肝癌细胞株BEL-7402、HepG2、Hep3B、早幼粒白血病细胞株HL-60、胃癌细胞株SGC-7901）进行重组别藻蓝蛋白的体外抗肿瘤药效学实验。发现重组别藻蓝蛋白对离体培养的敏感肿瘤细胞株，没有明显的抑制肿瘤生长的作用，显示重组别藻蓝蛋白无明显体外细胞毒作用。
其中，磺酰罗丹明B蛋白染色法（Sulforhodamine B）(SRB)是一种蛋白结合染料，可于生物大分子中的碱性氨基酸结合，其在515nm的OD读数与细胞数呈良好的线性关系，故可用作细胞数的定量。
MTT分析法以代谢还原3-(4,5-dimethylthiazol)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT)为基础。活细胞的线粒体中存在与NADH相关的脱氢酶，可将黄色的MTT还原为不溶性的蓝紫色的甲臜（Formazan），死细胞此酶消失，MTT不被还原。用DMSO溶解Formazan后可用酶标仪在570nm波长处检测光密度。
将上述实施例纯化所得重组别藻蓝蛋白对人肝癌裸小鼠移植瘤SMMC-7721的实验治疗作用进行判定。小鼠来源、种系、品系：BALB/cA裸小鼠，由中国科学院上海实验动物中心。合格证编号：沪动合证字122号。日龄：35-40天；体重：18-22g；性别：雌性；每组动物数：阴性对照组12只，给药组6只。
选择体外敏感的人肝癌SMMC-7721细胞株接种于裸小鼠皮下，细胞接种量为5×106，接种形成移植瘤后再在裸小鼠体内传3代以后使用。
取生长旺盛期的瘤组织剪切成1.5mm3左右，在无菌条件下，接种于裸小鼠右侧腋窝皮下。裸小鼠移植瘤用游标卡尺测量移植瘤直径，待肿瘤生长至100－300mm后将动物随机分组。使用测量瘤径的方法，动态观察被试动物抗肿瘤的效应。肿瘤直径的测量次数为每周3次，每次测量同时还需称鼠重。实验组静脉注射重组别藻蓝蛋白，每周3次，阴性对照组同时给等量生理盐水。肿瘤体积(tumor volume，TV)的计算公式为：TV=1/2×a×b2；其中a、b分别表示长宽。
根据测量的结果计算出相对肿瘤体积（relative tumor volume，RTV），计算公式为：RTV=Vt/V0；其中V0为分笼给药时(即d0)测量所得肿瘤体积，Vt为每一次测量时的肿瘤体积。
抗肿瘤活性的评价指标为相对肿瘤增殖率T/C（%），计算公式如T/C（%）=TRTV／CRTV×100%；其中TRTV：治疗组RTV；CRTV：阴性对照组RTV。
实验结果显示，静脉给药6.25mg／kg剂量时，T/C(%)为63.5，对人肝癌SMMC-7721裸小鼠移植瘤有较明显的生长抑制作用。给药后裸小鼠未出现毒性反应，也无死亡发生。重复三批裸鼠试验，结果基本一致，说明重组别藻蓝蛋白确实对人肝癌SMMC-7721细胞株具有显著的抑制作用。
Claims (8)
1.一种菊粉源重组别藻蓝蛋白的制备方法，其特征在于：将菊粉作为原料经降解作为种子液，再将大肠杆菌P2在发酵培养基的作用下经摇床或发酵罐培养，最后经异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）诱导表达，即得到菊粉源重组别藻蓝蛋白。
2.按权利要求1所述的菊粉源重组别藻蓝蛋白的制备方法，其特征在于：
1）将大肠杆菌P2按体积比15-20%接种于种子液培养基中于35-39℃，摇床培养6-12h；而后将培养液按体积比1-5%（v／v）接种于二级种子液培养基中于35-39℃，摇床培养6-12h；
2）将上述培养液按1-5%（v／v）的接种量接种，于发酵培养基中以35-39℃，罐压0.5Kg/cm2，pH7.0-7.5，搅拌转速为200-400rpm，空气流量5-15L/min，在发酵至溶氧反弹时补入补料培养基，35-39℃，摇床培养至对数生长后期，于培养基中加入诱导剂，降温至25-30℃，再培养10-15h；
3）发酵结束后破碎细胞，对细胞破碎物进行分离纯化，得目的蛋白。
3.按权利要求2所述的菊粉源重组别藻蓝蛋白的制备方法，其特征在于：所述步骤1）培养大肠杆菌P2的培养基为：蛋白胨5-10g，酵母粉3-10g，NaCl 5-15g，自来水1L，60mg/ml的卡那霉素溶液0.5-1.5ml，用5mol／L的NaOH溶液调节pH至6.5-7.5；二级种子液培养基为：蛋白胨10-20g，酵母粉5-15g，NaCl 3-10g，自来水1L，60mg／ml的卡那霉素溶液0.5-1.5ml，用5mol／L的NaOH溶液调节pH至6.5-7.5。
4.按权利要求2所述的菊粉源重组别藻蓝蛋白的制备方法，其特征在于：所述步骤2）发酵培养基为蛋白胨10-20g，酵母粉5-15g，NaCl 3-10g，MgSO43-10g，菊粉酸解液（其中的还原糖浓度约为50g／L）100-500ml，自来水补足1L的体积，60mg/ml的卡那霉素溶液0.5-1.5ml，用5mol／L的NaOH溶液调节pH至6.5-7.5；补料培养基为：蛋白胨10-20g，酵母粉5-15g，NaCl 3-10g，MgSO43-10g，1L菊粉酸解液，pH6.5-7.5。
5.按权利要求4所述的菊粉源重组别藻蓝蛋白的制备方法，其特征在于：所述菊粉酸解液中的还原糖浓度约为50g／L。
6.按权利要求5所述的菊粉源重组别藻蓝蛋白的制备方法，其特征在于：所述菊粉酸解液为将菊粉与1.0-2.0%（w／w）的硫酸溶液按比例1:8（w／v）混合，混合后于90℃水浴30-50min,然后用5mol／L的NaOH溶液将其pH调节至6.5-7.5。
7.按权利要求2所述的菊粉源重组别藻蓝蛋白的制备方法，其特征在于：所述诱导剂为0.3mol／L的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）诱导时加诱导剂至其发酵液中终浓度为0.3mmol／L。
8.按权利要求1所述的菊粉源重组别藻蓝蛋白的制备方法，其特征在于：所述大肠杆菌P2为能生产活性重组别藻蓝蛋白的大肠杆菌，该菌株是由大肠杆菌菌株P1，通过分子生物学手段敲除其中的氨苄霉素抗性基因，在原位点插入卡那霉素抗性基因而得到。
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Legal Events
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| GR01 | Patent grant |