CN103627738B - 一种直接发酵法生产l-苹果酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种直接发酵法生产L-苹果酸的方法，以霉菌为出发菌株，葡萄糖为主要生产原料，添加一定量的碳酸钙和有机无机混合氮源，通过摇床培养考察生产L一苹果酸的发酵条件。通过对发酵菌株、发酵温度、培养基初始pH、转速和接种量等参数的优化，其产酸水平最高可达150.3g/L。其具有广阔的应用前景。

Description

一种直接发酵法生产L-苹果酸的方法

技术领域  本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种直接发酵法生产L-苹果酸的方法。

背景技术

苹果酸,又名羟基丁二酸、羟基琥珀酸或1-羟基乙烷二羧酸,分子式为C₄H₆O₅，分子量134.09，结构式为HOOCCHOHCH₂COOH。苹果酸具有右旋（D-型）和左旋（L-型）两种旋光异构体及DL-型外消旋体三种型式产品。其中L-苹果酸，广泛存在于生物体中，作为三羧酸循环的一员参与细胞代谢；D-苹果酸人体不易代谢，吸入或吞咽其对人体有害，作为手性合成的手性源，可以合成许多重要的有机化合物；等量L-苹果酸和D-苹果酸的混合物为外消旋DL-苹果酸，在化学工业方面用途广泛。

L-苹果酸是天然果酸的重要组成部分，广泛存在于自然界蔬菜和其它水果中，其呈味作用明显，酸味持久柔和、风味别致、解渴爽口、性质稳定，是优良的酸味剂和调酸剂，是国际公认的安全、无毒无害的食用有机酸。此外，它还具有重要的生理功能，可食药两用，对加强机体健康有所裨益。例如，我国是肝炎高感染、高发病国家，据统计，人群感染各类肝炎病毒者达10%左右，目前对肝炎的治疗尚无特效药。发挥苹果酸护肝作用，将其与民间治疗肝病的草药配伍，开发成护肝产品，作为肝病患者及健康人的日常保健食品，可以加强人体新陈代谢，提高免疫力。总之苹果酸的应用领域十分广阔。

近年来, L-苹果酸市场逐渐启动, 国际市场对苹果酸的需求量快速增加，已呈现严重供不应求的局面，需求量一直以年均10%左右的高速度增长和保持。由于用天然产物提取或者化学合成工艺生产苹果酸的方法成本过高, ,因此用微生物的方法合成L-苹果酸是今后大规模生产的趋势。

利用微生物发酵法生产L-苹果酸，目前主要有三种方法，一种是直接发酵法，一般采用糖类为原料，用霉菌直接发酵生产L-苹果酸；一种是两步发酵法，即先用根霉菌将糖类发酵成富马酸，在由酵母将底物富马酸转化成L-苹果酸的工艺；另一种是酶转化法，即用微生物生产的延胡索酸酶将底物富马酸转化为L-苹果酸。以糖质为原料发酵苹果酸工艺中,一步发酵法和混合发酵法都有较大进展,但有关的研究报道尚少。本发明以霉菌为出发菌株,葡萄糖为主要生产原料,通过摇床培养考察葡萄糖生产L-苹果酸的发酵条件,通过对发酵温度、培养基初始pH、转速和接种量等参数的优化,其产酸水平最高可达150.3g/L。

发明内容

本发明提供了一种直接发酵法生产L-苹果酸的方法,本专利以霉菌为出发菌株,葡萄糖为主要生产原料,通过摇床培养考察糖蜜生产L-苹果酸的发酵条件, 通过对碳酸钙浓度、氮源的选择、发酵温度和转速的优化，克服了现有技术的不足，进行了多次探索和试验，获得一种生产苹果酸的方法。

本发明的技术方案是通过如下方式来实施的：

一种直接发酵法生产L-苹果酸的方法，其包括如下步骤：

将霉菌混合菌液(米曲霉(Aspergillus oryzae)和黄曲霉(Aspergillus flavus)两种菌液体积比为3∶1，两种菌液中菌体的浓度均约为1×10⁸CFU/mL)按照10％(体积比)的接种量接入种子罐中进行培养，在温度为34℃，摇床转速为180r/min，培养16小时得到液体A，其中，种子罐的培养基组分为：蔗糖3g，NaNO₃  0.2g，(NH₄)₂SO₄  0.5g，FeSO₄·7H₂O 0.01g，MnSO₄·H₂O 0.02g ，MgSO₄ 0.02g，KH₂PO₄ 0.1g，pH值6.0。然后按照液体A∶发酵罐培养基为1∶10的体积比例转入发酵罐中培养，温度34℃，培养6d，所述发酵罐培养基组分为：葡萄糖80g/L，加玉米浆10g/L，碳酸钙75g/L，KH₂PO₄ 0.1g/L，K₂HPO₄ 0.1g/L， (NH₄)₂SO₄ 2g/L，MgSO₄ 2 g/L，NaCl 0.2g/L，pH值6.0；

1.一种直接发酵法生产L-苹果酸的方法,其特征在于发酵时，500mL三角瓶装一定量的培养液, 接入霉菌孢子悬液,在一定的温度下，以一定转速，培养6d。

2.步骤1所述的培养基: 葡萄糖80g/L，加玉米浆10g/L，碳酸钙75g/L，KH₂PO₄ 0.1g/L，K₂HPO₄ 0.1g/L， (NH₄)₂SO₄ 2g/L，MgSO₄ 2 g/L，NaCl 0.2g/L，pH值6.0 。

3.步骤1所述的孢子悬液的制备过程为: 米曲霉(Aspergillus oryzae)，黄曲霉(Aspergillus flavus)两种菌液的体积比为3∶1，两种菌液中菌体的浓度均约为1×10⁸CFU/mL,按照10％(体积比)的接种量接入种子罐中进行培养，在温度为34℃，摇床转速为180r/min，培养16小时得到。

4.步骤3所述的种子罐培养基（每升）：蔗糖3g，NaNO₃  0.2g，(NH₄)₂SO₄  0.5g，FeSO₄·7H₂O 0.01g，MnSO₄·H₂O 0.02g， MgSO₄ 0.02g，KH₂PO₄ 0.1g，pH值6.0。

5.步骤1所述的最佳摇床转速为180r/min。

6.步骤1所述的最佳发酵温度为34℃。

本发明技术方案通过对现有技术的改进，带来一系列的有益效果：

1、本发明在现有技术的基础上，通过大量试验发现，采用米曲霉(Aspergillus oryzae)，黄曲霉(Aspergillus flavus)两种菌液按照一定比例混合，二者之间具备一定的协同作用，比常规的米曲霉发酵方法，能够大大提高苹果酸的产量，采用最优比例3∶1混合，其他条件不变的前提下，产量可提高30％左右。

 2、培养基筛选：在单因素试验的基础上, 以L-苹果酸产量为响应值, 选取对L-苹果酸产量影响显著的因素以及因素较好的水平区间, 根据Box-Behnken 中心组合试验设计原理, 采用响应面分析法对发酵培养基参数进行优化, 获得最优培养基组成。每组试验重复3 次, 结果取其平均值，由于本申请发酵阶段采用添加两种霉菌，针对两种霉菌的种子培养及发酵培养，摸索最佳的培养成分配方，种子培养阶段主要进行菌体繁殖生长，碳源的消耗量相对要小得多，而且高浓度的碳源底物可阻止细胞生长速度和酶的分泌表达。且苹果酸的积累是一个复杂的代谢过程，与许多酶的活性有关，而金属离子作为酶的激活剂或者抑制剂也直接或间接影响苹果酸的积累，针对黄曲霉与米曲霉两种霉菌的发酵液对金属离子的耐性，应用二次通用旋转组合设计最佳金属离子浓度，针对不同阶段，对培养基进行合理的配伍，能够获得最佳的生产效率，最终获得 L-苹果酸产量为150.3 g/L，且残糖含量最小为0.7g/L。

具体实施方法

以下实施例用于说明本发明,但不用来限制本发明的范围。

实施例1

将霉菌混合菌液(米曲霉(Aspergillus oryzae)，黄曲霉(Aspergillus flavus)两种菌液的体积比为3∶1，两种菌液中菌体的浓度均约为1×10⁸CFU/mL)按照10％(体积比)的接种量接入种子罐中进行培养，在温度为34℃，摇床转速为180r/min，培养16小时得到液体A，其中，种子罐的培养基组分为：蔗糖3g，NaNO3  0.2g，(NH4)2SO4  0.5g，FeSO4·7H2O  0.01g，MnSO4·H2O  0.02g ，MgSO4  0.02g，KH2PO4  0.1g，pH值6.0。然后按照液体A∶发酵罐培养基为1∶10的体积比例转入发酵罐中培养，温度34℃，培养6d得苹果酸发酵液，所述发酵罐培养基组分为：葡萄糖80g/L，加玉米浆10g/L，碳酸钙75g/L，KH2PO4  0.1g/L，K2HPO4  0.1g/L， (NH4)2SO4  2g/L，MgSO4  2 g/L，NaCl 0.2g/L，pH值6.0；所述米曲霉为米曲霉(Aspergillus oryzae)ACCC30584（例如参见CN2011102578402），所述黄曲霉为黄曲霉(Aspergillus flavus)ATCC 13697（参见参考文献：Organic acids: old metabolites, new themes Israel Goldberg ET AL, Journal of Chemical Technology and Biotechnology）;

L-苹果酸的测定：采用2,7—萘二酚显色法，取样品溶液1.0 mL，加入6.0 mL分析纯的浓硫酸，再加入0.1 mL 2,7—萘二酚溶液，接着在100℃水浴中加热15-20 min，取出待冷却至室温后，于385 nm下进行比色测定，以蒸馏水作对照校正仪器零点。用标准样品先作标准曲线，以苹果酸含量为横坐标，385 nm处吸收值即OD385为纵坐标，通过未知样品在385 nm处的OD值，则可在标准曲线上查得相应的苹果酸含量。检测 L-苹果酸产量为150.3 g/L，且残糖含量为0.7g/L。

实施例2

本实施例说明两种菌协同培养对产酸的影响：将米曲霉菌液(米曲霉菌液中菌体的浓度为1×10⁸CFU/mL)按照10％(体积比)的接种量接入种子罐中进行培养，在温度为34℃，摇床转速为180r/min，培养16小时得到液体A，其中，种子罐的培养基组分为：蔗糖3g，NaNO3  0.2g，(NH4)2SO4  0.5g，FeSO4·7H2O 0.01g，MnSO4·H2O 0.02g ，MgSO4 0.02g，KH2PO4 0.1g，pH值6.0。然后按照液体A∶发酵罐培养基为1∶10的体积比例转入发酵罐中培养，温度34℃，培养6d得苹果酸发酵液，所述发酵罐培养基组分为：葡萄糖80g/L，加玉米浆10g/L，碳酸钙75g/L，KH2PO4 0.1g/L，K2HPO4 0.1g/L， (NH4)2SO4 2g/L，MgSO4 2 g/L，NaCl 0.2g/L，pH值6.0；所述米曲霉优选为米曲霉(Aspergillus oryzae)ACCC30584（例如参见CN2011102578402）。

采用2,7—萘二酚显色法测定L-苹果酸产量为105.2 g/L

实施例3

本实施案例说明碳酸钙浓度对生产L-苹果酸产量的影响, 在使用糖质原料直接发酵L-苹果酸时，培养基中碳酸钙的存在是L-苹果酸有效积累的必要条件。因此，试验研究了碳酸钙浓度对两种霉菌生产L-苹果酸产量的影响，在发酵培养基中分别添加浓度为0 g/L，60 g/L, 65g/L, 70 g/L, 75 g/L, 80 g/L, 85g/L的硫酸钙,发酵温度为34℃，转速为180r/min,发酵6d。

由表1可知，从经济角度分析，当添加碳酸钙浓度为75g/L时，可获得较高产量的L-苹果酸为150.3 g/L，且残糖含量最小。

表1：不同碳酸钙浓度对L-苹果酸产量的影响

实施例4

本实施案例说明不同氮源对本发明方法生产L-苹果酸产量的影响。氮源是合成菌体中蛋白质和核酸等含氮物质的主要来源，因此在微生物培养过程中其重要性仅次于碳源。菌体利用有机氮源较无机氮源缓慢，而无机氮源中铵盐的利用率较高，使用也最多，工业上多选用玉米浆和豆饼粉作为有机氮源。为了保证整个发酵过程中，可以持续的提供氮源，本试验选取了不同浓度的无机氮源和有机氮源的混合物作为发酵氮源，并研究了其对L-苹果酸产量的影响，其它参数同实施例1。

结果由表2可知，当发酵培养基中添加10g/L的玉米浆和2g/L的(NH₄)₂SO₄作为发酵氮源时，L-苹果酸的产量最高。

表2：不同氮源对L-苹果酸产量的影响

实施例5

本实施案例说明不同温度对苹果酸米曲霉生产L-苹果酸产量的影响,温度分别控制在26℃，28℃，30℃，32℃，34℃，36℃，38℃，添加75g/L的碳酸钙，10g/L的玉米浆和2g/L的硫酸铵，在180r/min下，发酵6d，其余操作参数同实施例1。

得出在温度为34℃的条件下，发酵产率最高。

实施例6

本实施案例说明不同转速对苹果酸米曲霉生产L-苹果酸产量的影响,转速分别为:140 r/min，160 r/min，180 r/min，200 r/min，220 r/min，添加75g/L的碳酸钙，10g/L的玉米浆和1g/L的硫酸铵，在34℃条件下，发酵6d。

得出在转速为180 r/min的条件下，产苹果酸效率最高。

以上列举的仅是本发明的最佳具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (1)

1.一种直接发酵法生产L-苹果酸的方法，其特征在于，将霉菌混合菌液按照10％的体积比的接种量接入种子罐中进行培养，温度34℃，转速为180r/min，培养16小时得到液体A，其中，种子罐的培养基组分为：蔗糖3g，NaNO₃  0.2g，(NH₄)₂SO₄ 0.5g，FeSO₄·7H₂O 0.01g，MnSO₄·H₂O 0.02g ，MgSO₄ 0.02g，KH₂PO₄ 0.1g，pH值6.0；然后按照液体A∶发酵罐培养基为1∶10的体积比例转入发酵罐中培养，温度34℃，培养6d，所述发酵罐培养基组分为：葡萄糖80g/L，加玉米浆10g/L，碳酸钙75g/L，KH₂PO₄ 0.1g/L，K₂HPO₄ 0.1g/L，(NH₄)₂SO₄  2g/L，MgSO₄ 2 g/L，NaCl 0.2g/L，pH值6.0；

所述霉菌混合菌液为：米曲霉(Aspergillus oryzae)和黄曲霉(Aspergillus flavus)两种菌液体积比为3∶1，两种菌液中菌体的浓度均为1×10⁸CFU/mL；

所述米曲霉为米曲霉(Aspergillus oryzae)ACCC30584，所述黄曲霉为黄曲霉(Aspergillus flavus)ATCC13697。