CN103622937A

CN103622937A - 去氧紫草素的应用

Info

Publication number: CN103622937A
Application number: CN201310350032.XA
Authority: CN
Inventors: 尹一兵; 张雪梅; 张帅; 胥文春; 刘宇思
Original assignee: Chongqing Medical University
Current assignee: Chongqing Medical University
Priority date: 2013-08-13
Filing date: 2013-08-13
Publication date: 2014-03-12

Abstract

本发明公开了去氧紫草素(5，8-二羟基-2-(4-甲基-3-苯基)-1，4-萘二酮)在体外作为组氨酸激酶VicK抑制剂或者在制备组氨酸激酶VicK抑制剂中的应用，对体内对肺炎链球菌及临床耐青霉素肺炎链球菌均有一定的抗菌作用，此外，该药物与青霉素联合作用对肺炎链球菌有很好的抗菌作用，并对金黄色葡萄球菌有明显的抑菌作用。

Description

去氧紫草素的应用

技术领域

本研究涉及医药技术领域，具体涉及中药单体去氧紫草素(5，8-二羟基-2-(4-甲基-3-苯基)-1，4-萘二酮)作为组氨酸激酶VicK抑制剂的应用。

背景技术

双组份系统(two-component system，TCS)是存在细菌内的主要信号传导系统，不仅参与了细菌的基本生命活动，更重要的是与很多病原菌的致病与耐药密切相关。细菌的TCS系统具有以下两个特点：不同种类细菌中组氨酸激酶和反应调节子具有明显的同源性，尤其是活性中心的氨基酸残基，因此这种系统调控的方式在细菌中具有普遍性。TCS调控系统是细菌(主要是革兰阳性菌和少数革兰阴性菌)所特有的，哺乳动物中不具有这种信号转导机制。因此，组氨酸激酶成为近年关注的新的作用靶点。

肺炎链球菌共有13对TCS，其中组氨酸激酶VicK/R作为必需的TCS，不仅影响毒力、感受态的形成，同时也与细菌生物被膜形成有关，VicK/R为细菌生存所必须，如果抑制其活性可导致细菌死亡。同时，在芯片分析中发现，VicK/R的表达减少后，有10个簇的49个基因的表达受到影响，这些基因涉及转运、热休克、细胞表面等等重要的功能。所以，VicK/R是肺炎链球菌的重要靶标，针对它设计的特异性阻断剂很有可能成为研究和治疗肺炎链球菌的潜在药物。

目前已报道的以组氨酸激酶VicK为靶点的抑制剂包括针对金黄色葡萄球菌的(Takafumi Watanabe，et al，Antimicrob Agents Chemother.2012July；56(7)：3657-3663.)；针对枯草芽孢杆菌的(KaneyoshiY，et a1，Biosci Biotechnol Biochem，2001，65(10)：2306-2310)等。这说明VicK抑制剂应用于临床治疗肺炎链球菌相关的细菌感染应该有广阔的应用前景。

去氧紫草素(5，8-二羟基-2-(4-甲基-3-苯基)-1，4-萘二酮)购自百灵威科技有限公司(http：//wwwjkchemical.com/)有文献报道去氧紫草素具有抗癌活性，(Rajasekar S，et al，J Ethnopharmacol.2012Nov21；144(2)：335-45.)并能诱导人早幼粒白血病细胞的凋亡(YoonY，et al，PlantaMed.1999Aug；65(6)：532-5.)(Wang R，Expert Opin Ther Pat.2012Sep；22(9)：977-97.)但是至今未见任何该药物作为抗菌剂的报导1

发明内容

本发明的目的是提供中药单体去氧紫草素的新用途，所述的用途是在体外作为组氨酸激酶VicK抑制剂或者在制备组氨酸激酶VicK抑制剂中的应用。

在本发明的一个优选实施方式中，所述的组氨酸激酶VicK抑制剂用于金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和/或肺炎链球菌抗菌剂，优选的，作为肺炎链球菌抗菌剂。

在本发明的另一个优选实施方式中，所述的肺炎链球菌抗菌剂为耐青霉素肺炎链球菌抗菌剂。

在本发明的另一个优选实施方式中，所述的抗菌剂仅包含中药单体去氧紫草素或者仅包括中药单体去氧紫草素和青霉素作为药物活性成分。

在本发明的另一个优选实施方式中，所述的抗菌剂包括药学上可接受的载体，优选的，所述的抗菌剂为选自口服液、片剂、胶囊剂的口服剂型。

本发明提供了中药单体作为肺炎链球菌组氨酸激酶抑制剂的新用途。中药单体去氧紫草素的化学结构式表1所示：

表1：具有抗菌活性的药物结构式

CAS：43043-74-9购自百灵威科技有限公司(http：//www.ikchemical.com/)

该中药单体经过体外激酶活性实验，能够明显的抑制VicK的激酶活性；同时，体外抑菌实验显示，该中药单体具有抑菌作用且有明显的浓度依赖性，本研究的中药单体可以用作肺炎链球菌组氨酸激酶VicK抑制剂。

附图说明

图1：肺炎链球菌感染小鼠体内治疗试验结果，其中：NC：阴性对照(菌+PBS)；PNC(青霉素)：阳性对照(菌+青霉素)；去氧紫草素**：药物(未加菌)：去氧紫草素：实验组(药物+菌)

图2：药物对临床耐青霉素肺炎链球菌定植的影响

图3：细菌的定植曲线

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明进行详细描述。

实施例1：中药单体体外激酶活性实验.

体外激酶活性实验应用promega公司提供的Kinase-Glo

Plus Luminescent Kinase Assay试剂盒，实验步骤严格按照试剂盒附带的说明书操作。步骤如下：

1、主要试剂和仪器：

ATP购自Sigma公司；

Plus Luminescent Kinase Assay购自Promega公司Cat#V3772：

酶反应缓冲液：40mM Tris-HCl[pH7.5]，20mM MgCl2，0.1mg/ml BSA；

酶标仪为Tecan GENios；酶标板为costar^R solid white，fiat-bottom96-well plates；电热恒温水浴箱：北京长安科学仪器厂HH-W21CY600型。

2、实验步骤：

检测中药单体浓度为200μM对VicK激酶的抑制作用：

以100％二甲亚砜(DMSO)为溶剂分别将中药单体配成300mM母液，临用前用酶反应缓冲液稀释成200μM(含1％DMSO)。

1)96孔微孔板中加入等量6μg的激酶VicK；

2)加入10μL中药单体(终浓度为200μM)；

3)用反应缓冲液补充至终体积为45μl；

4)37℃反应10min；

5)加入5μl ATP(终浓度5μM)；

6)37℃反应10min；

7)加入50μl的Kinase-Glo^R Plus Reagent，混匀，37℃反应10min；

8)用酶标仪测相对荧光单位(relative luminescent unit，RLU)；

9)计算药物对VicK磷酸化的抑制率，用如下公式：

抑制率(％)＝1-(药物对照组荧光值②-药物组荧光值④)/(本底组荧光值①-蛋白组荧光值③)×100％

3、实验结果：

得到的结果如下表2：

样品	化合物终浓度	荧光值	抑制率
				ATP①		46024
药物+ATP②	200μM	17094
				DMSO+ATP		45433
VicK+DMSO+ATP③		32158
				药物+VicK+DMSO+ATP④	200μM	15086	88％

实施例2最小抑菌浓度(MIC，minimal inhibitory concentration)及最小杀菌浓度(MBC，minimal bactericidal concentration)的测定

1.MIC采用微量肉汤稀释法

1)无菌操作，将倍比稀释后不同浓度的抗菌药物溶液分别加到灭菌的96孔聚苯乙烯板中，第1至第11孔加药液，每孔10μl，第12孔不加药作为生长对

照，同时做DMSO对照。

2)将用生长法或直接菌悬液法制备的浓度相当于0.5麦氏比浊标准的菌悬液，经肉汤1∶1000稀释后，向每孔中加200μl，密封后置37℃普通空气孵箱中，孵育16-20h判断结果。

3)结果判断以在小孔内完全抑制细菌生长的最低药物浓度为MIC。当阳性对照孔(即不含抗生素)内细菌明显生长试验才有意义。当在微量肉汤稀释法出现单一的跳孔时，应记录抑制细菌生长的最高药物浓度。如出现多处跳孔，则不应报告结果，需重复试验。

2.MBC的测定

药物最低浓度管无细菌生长者，即为受试菌的MIC，将未长细菌的管依次铺板，其平板菌落生长数少于5个为受试菌的MBC。

结果见图1和表3。

表3：去氧紫草素对VicK和肺炎链球菌D39的抑制效应

实施例：3中药单体对金黄色葡萄球菌的抑菌作用(步骤同实施例2)

表4：去氧紫草素和PNC(青霉素)对金黄色葡萄球菌的抑制作用

ATCC29213、8506305、8569082、854899均来源于重庆市儿童医院检验科，经BD公司的PHOENIX-100全自动微生物鉴定仪鉴定为金黄色葡萄球菌。

实施例4：去氧紫草素提高细菌对青霉素的敏感性

步骤：1.将200μL临床肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌(来源于儿童医院)加入5ML C+Y培养基中生长至OD₆₀₀为0.5，稀释1000倍至菌液浓度为10⁵CFU/ML2.将96孔板中每孔加入25μL C+Y培养基，第一孔加入每种细菌的MIC下个浓度的PNC(青霉素)，依次倍比稀释，然后加入25μL组合药物。同时做不加药物做阳性对照及加入5％DMSO做对照，每次试验做一个平行样。

3.每孔加入150μL菌液，37度培养过夜，以在小孔内完全抑制细菌生长的最低药物浓度为MIC

4.将每组药物中未见细菌生长的孔依次铺板，平板菌落生长数低于5个为该菌的MBC

结果显示(如表5和表6)，加入去氧紫草素后，PNC(青霉素)对肺炎链球菌和金黄色葡萄球菌的MIC、MBC显著下调，提示去氧紫草素能提高这些细菌对PNC(青霉素)的敏感性，增强PNC(青霉素)对其的抑制和杀灭作用。

表5：PNC(青霉素)单独使用及与去氧紫草素合用对肺炎链球菌的MIC/MBC(μM)

12092624、736007、8364981、652336均来源于重庆市儿童医院检验科，经Optochin试验、胆汁溶菌试验鉴定为肺炎链球菌。

表6：PNC(青霉素)单独使用及与去氧紫草素合用对金黄色葡萄球菌的MIC/MBC(mM)

ATCC29213、8506305、8569082、854899均来源于重庆市儿童医院检验科，经鉴定为金葡菌。

实施例5：小鼠体内实验

1.主要试剂和材料：6-8W雌性Balb/C小鼠(来自实验动物中心)

2.实验步骤

1)细菌的准备：将肺炎链球菌(D39)培养到对数生长后期(0D₆₀₀＝0.6)，收集菌液，4℃、2500rpm离心10min，PBS洗3次。用PBS稀释至3×10³CFU/ml、5×10³CFU/ml，1.5×10⁴CFU/ml

2)感染菌量的确定：按照药理试验常规方法求出1-2d内引起小鼠100％死亡的最小致死菌量(MLD)，作为体内感染试验的感染菌量。

3)动物感染治疗模型的建立：

将实验鼠随机分2组(每组6只)，雌性6-8w；均腹腔感染试验菌液(MLD)；一组立即给予青霉素200μl(终浓度为：2.5μg/ml)，3次/d，连续给药3d；另一组不做任何处理；观察记录感染后1-8d的小鼠存活数，实验重复3次。

4)体内抗菌活性试验

按体重随机分组，每组10只，雌性6-8w；分别于腹腔感染试验菌液(MLD)，每只0.1ml；感染后即刻分别给于腹腔注射药物(iv为0.1ml，终浓度为200μM)，3次/d，连续给药3d；给药后观察并记录小鼠死亡数，连续观察14d。

3.实验结果：如图2所示，200μM去氧紫草素对动物无毒性作用，并能明显延长感染肺炎链球菌的动物的生存时间，提示其有体内抗肺炎链球菌的活性。

实施例6：药物对临床耐青霉素肺炎链球菌定植的影响

1.实验步骤：

1)将临床菌株652336接种于C+Y培养基，培养至0D600＝0.6，收集菌液，4℃、2500rpm离心10min，PBS洗3次。

2)75只6-8W雌性Balb/C小鼠随机分为5组，每组15只，分别鼻腔滴注30μl菌液，含菌量约5×108，并于实验组同时腹腔注射药物100μl(终浓度为125μM)，每天注射三次，连续三天，分别在感染后24h、48h、72h处死每组中的5只小鼠，取鼻腔灌洗液、肺组织和心脏血，个标本做系列稀释后取100μL铺板，37℃培养12-24h.

3)根据每组中5只小鼠的平均菌落计数结果，分别以每毫升鼻腔灌洗液、每毫克肺组织和每毫升血液中所含菌量为纵坐标，绘制细菌的定植曲线

2.实验结果如图3所示，去氧紫草素能明显降低肺炎链球菌在小鼠鼻腔的定植和对肺部的侵袭，其抑制效率与阳性对照(氯霉素)和青霉素的相当，提示该化合物具有较强的体内抗肺炎链球菌作用。

本发明经实验表明，该药物对组氨酸激酶VicK有明显的抑制作用，体内对肺炎链球菌及临床耐青霉素肺炎链球菌均有一定的抗菌作用，所以该药物可以用作VicK抑制剂发挥抗菌作用。继而提示其可以作为制备治疗肺炎链球菌的药物或消毒剂的应用研究，本发明具有良好的药物应用前景。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。

Claims

1.中药单体去氧紫草素的用途，所述的用途是在体外作为组氨酸激酶VicK抑制剂或者在制备组氨酸激酶VicK抑制剂中的应用。

2.根据权利要求1所述的用途，所述的组氨酸激酶VicK抑制剂用于金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和/或肺炎链球菌抗菌剂，优选的，作为肺炎链球菌抗菌剂。

3.根据权利要求2所述的用途，所述的肺炎链球菌抗菌剂为耐青霉素肺炎链球菌抗菌剂。

4.根据权利要求1-3任意一项所述的用途，所述的抗菌剂仅包含中药单体去氧紫草素或者仅包括中药单体去氧紫草素和青霉素作为药物活性成分。

5.根据权利要求4所述的用途，所述的抗菌剂包括药学上可接受的载体，优选的，所述的抗菌剂为选自口服液、片剂、胶囊剂的口服剂型。