CN101543499B - 一种天然化合物熊果酸在抗菌方面的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种天然化合物熊果酸在抗菌方面的应用，尤其涉及到天然化合物熊果酸与青霉素联合使用时在抗耐药金黄色葡萄球菌方面的应用。本发明的化合物熊果酸在自然界分布广泛，原料来源丰富。本发明针对目前金黄色葡萄球菌耐药性严重的问题，对熊果酸进行了体外和体内抗菌试验。体外试验特别是体外协同试验，发现其与青霉素的共同作用下对耐药金黄色葡萄球菌有较好的抗菌活性，最低抑菌浓度为1.13ug/disc，并且体内试验也表明熊果酸在协同作用下也有较好的活性。

Description

一种天然化合物熊果酸在抗菌方面的应用
技术领域
本发明涉及一种天然化合物熊果酸在抗菌方面的应用，尤其涉及一种该化合物在体内外的协同抗耐药菌方面的应用。
背景技术
金黄色葡萄球菌是医院感染的主要病原菌之一，金黄色葡萄球菌可以引起小到皮肤感染，大到可以致命的严重肺炎、脑膜炎以及骨关节感染、心内膜炎和菌血症。通常接受血液透析治疗的晚期肾脏疾病患者特别容易感染金黄色葡萄球菌，金黄色葡萄球菌感染是引起住院病人感染和死亡的主要原因。随着新型抗生素的不断问世，金黄色葡萄球菌的耐药性逐渐增强，成为临床治疗的棘手问题，而目前，对于新抗菌药物的研究开发，主要是合成，半合成与寻找新的、产生抗生素的高产优质微生物菌种，研发过程复杂，且抗菌药物价格昂贵。从植物中，尤其是药用植物中寻找具有抗耐药菌株活性成分的研究，一直是一个不被重视的领域。我国有着丰富的中草药资源，很多中草药的作用是通过抑菌作用表现出来的。因此，从中草药中提取化学成分，筛选具有抗耐药菌成分的药物，能进一步丰富中草药资源方面的研究内容。
熊果酸是从茜草科滇丁香属植物滇丁香中分离而来的，其在自然界分布很广，存在于白花蛇舌草、女贞子、乌梅、夏枯草等天然植物中，有研究表明熊果酸具有镇静、抗炎抗菌、抗糖尿病、抗癌等多种药理活性。目前，有关熊果酸活性的报道主要为抗肿瘤方面，也有抗菌方面的报道，如印度学者Chattopadhyay D(Antimicrobial and anti-inflammatory activity offolklore：Mallotus peltatus leaf extract.J Ethnopharmacol，2002，82.)对野桐属白背叶的甲醇提取液进行体外抗菌试验，发现熊果酸作为主要成分之一对金黄色葡萄球菌、腐生葡萄球菌及大肠杆菌等多种细菌有抑制作用，但这些抗菌方面报道，只是涉及了抗菌活性方面的普通筛选，并未涉及到其能否在体内外抗菌。
发明内容
本发明的目的在于提供一种天然化合物熊果酸在抗菌方面的应用。
为了实现上述目的，本发明的技术方案在于采用了一种天然化合物熊果酸在抗菌方面的应用。
进一步地讲，本发明的天然化合物熊果酸与青霉素联合使用时在抗耐药金黄色葡萄球菌方面的应用。
更进一步地讲，本发明的天然化合物熊果酸在协同抑制耐药金黄色葡萄球菌方面的应用。
所述的熊果酸与青霉素的重量比为(1-3)∶1。
更优选地，熊果酸与青霉素的重量比为1∶1。
本发明的化合物熊果酸对金黄色葡萄球菌(MIC 0.5mg/ml，MBC10mg/ml)具有抑制与杀灭活性，与青霉素混合进行协同作用试验中，发现化合物(MIC 10.01μg/disc)具有协同抑制耐药金黄色葡萄球菌菌株活性，且其稳定性优于β-内酰胺酶抑制剂克拉维酸钾。体内实验也表明熊果酸与青霉素在协同作用下对耐药金黄色葡萄球菌菌株也具有抑制活性。本发明的化合物熊果酸在自然界分布广泛，原料来源丰富。本发明针对目前金黄色葡萄球菌耐药性严重的问题，对熊果酸进行了体外和体内抗菌试验。体外试验特别是体外协同试验，发现其与青霉素的共同作用下对耐药金黄色葡萄球菌有较好的抗菌活性，最低抑菌浓度为1.13ug/disc，并且体内试验也表明熊果酸在协同作用下也有较好的活性。
附图说明
图1是本发明化合物在液体培养条件下与青霉素的协同作用；
图2是本发明化合物与青霉素协同作用下的抑菌率。
具体实施方式
以下是本发明的化合物熊果酸的应用实施例
实施例1
抗金黄色葡萄球菌活性研究：
滇丁香中化合物熊果酸对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度MIC和最低杀菌浓度MBC研究，培养基为琼脂，对照为青霉素，MIC和MBC分别见表1，表2(MIC以培养基上完全无菌生长的试药最高稀释度作为该药的最低抑菌浓度；MBC以培养基上完全无菌生长的试药最高浓度作为该试药的最低杀菌浓度)。
表1滇丁香中化合物熊果酸对金黄色葡萄球菌菌株抑菌活性的MIC试验
注：+：有菌生长；-：无菌生长
表2滇丁香中化合物熊果酸对金黄色葡萄球菌菌株抑菌活性的MBC试验
Figure S2008100494059D00032
注：+：有菌生长；-：无菌生长
由表1和表2可以看出，化合物熊果酸对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度MIC为0.5mg/ml，最低杀菌浓度MBC为10mg/ml。
实施例2
抗耐药金黄色葡萄球菌活性：
纸片扩散法对植物滇丁香的分离产物熊果酸进行抗耐药菌株的活性检测，发现其对耐药金黄色葡萄球菌没有抑制活性。鉴于此，本发明将熊果酸与青霉素进行协同实验。
实施例3
协同作用试验：
抗生素的联合使用以及增效剂在临床上的广泛使用，使协同作用理论日益完善。根据抗生素合并后的抗菌活性，有显著的差异决定于合并用药中每个抗生素的组分，对联合使用后的抗生素效果进行评判：当合并用药后的抗菌活性高于其组分抗菌活性总和时，则产生协同作用。
将熊果酸与青霉素Serva31749按重量比例为1∶1；2∶1；3∶1的比例混合，寻找最优配比。结果见表3。
                表3化合物与青霉素协同作用最优配比的筛选
注：3次试验均值；D：抑菌圈直径；Con：原始浓度，即未稀释前的浓度，单位ug/disc；
-：无菌生长；Ratio：化合物与青霉素配比；L10：化合物熊果酸
由表3可以看出，熊果酸与青霉素的最优配比是1∶1，将熊果酸与青霉素按比例混合，用甲醇配成4μg/ml的溶液，按浓度梯度加入接种菌株CMCC26003的10ml培养基试管中，置于摇床上，28℃150次/min下分别培养0，2，4，6，……24小时取出，分别置于冰箱内统一测定。同时做不加试药的空白对照和不加试药与接种菌株的空白对照，分别培养12小时和24小时，将待测定的培养试管，取600μl于EP管中，离心机10000r/min处理，取上清液200μl，作为空白对照，各取200μl分别加入菌体培养液于96孔板，Molecular DevicesSpectral Max 190比色仪器上，测定OD600(光密度)。利用细菌悬液与浑浊度成正比的关系，用以表示该菌株在本实验条件下的相对生长量。并可根据公式计算百分抑制率I％，公式见下：
           I％＝100％(Vmax-Vmaxb)/Vmaxl
(注：I％为百分抑制率；Vmax为样品OD600，Vmaxb为样品空白OD600，Vmaxl为阴性对照组OD600。)
以OD600为纵坐标，以实验药物的浓度微克/毫升为横坐标，对每次试验的结果在坐标上找出相应的点，联结这些点得到两条曲线，此为附图1。在根据上述公式计算出百分抑制率，以I％为纵坐标，以实验药物浓度微克/毫升为横坐标，作出柱状图，此为附图2。
由附图1可以看出，在培养12小时后，当浓度16μg/ml(A曲线)时已经表现出明显的抑制作用，32μg/ml时基本上抑制了菌株的生长；继续培养到24小时后，在该化合物与青霉素1∶1重量比浓度32μg/ml(B曲线)下，该菌株完全没有继续生长，并且有微弱的减少；由附图2可以看出，无论是12小时还是24小时，当浓度在32μg/ml以上时，增加试药的用量抑菌作用并不再增加。
实施例4
本发明化合物的体内试验：
材料仪器：
试药：本发明化合物熊果酸，青霉素Serva31749(德国Serva公司)
动物：昆明小鼠，空腹体重18-22g，雌雄各半，[河南省医学实验动物中心]
菌株：金黄色葡萄球菌(26112-5)青霉素敏感菌株；金黄色葡萄球菌(CMCC26003对青霉素G，苯唑青霉素，头孢唑啉，氟哌酸耐药)
仪器：恒温培养箱，电子天平
本发明化合物对金黄色葡萄球菌感染小鼠死亡的保护作用
将化合物与青霉素以最佳配比1∶1混合，作为试药。金黄色葡萄球菌(CMCC26003)原菌液，离心，沉淀以5％酵母液稀释至所需浓度(最小致死量MLD)，制备成感染菌液供小鼠腹腔注射用。
取昆明小鼠75只，空腹称重，随机分为5组，每组15只，即生理盐水组(A组)、青霉素阳性对照组(B组)、化合物与青霉素配比物的低、中、高剂量组(C1、C2、C3组)。实验日晨每只鼠均腹腔注入100％MLD感染菌液0.5ml，感染后即刻和6h分别对每只小鼠腹腔注射受试药物，观察各组小鼠死亡情况。结果见表4。
表4化合物与青霉素31745 1∶1协同作用下对感染CMCC 26003小鼠的影响(n＝15)
Figure S2008100494059D00061
对感染动物的保护率(％)＝(空白死亡率-给药组死亡率)/空白组死亡率
结果：由表4可见，化合物与青霉素协同作用下对感染金黄色葡萄球菌耐药菌株的小鼠具保护作用，150和200mg/kg剂量组对感染小鼠的保护率分别为58.3％和75％，且与生理盐水组比较具有显著性差异。
最后所应说明的是：以上实施例仅用以说明，而非限制本发明的技术方案，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解：依然可以对本发明进行修改或者等同替换，而不脱离本发明的精神和范围的任何修改或局部替换，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (2)

1.一种天然化合物熊果酸与青霉素联合使用在制备抗耐药金黄色葡萄球菌药物方面的应用，其特征在于：所述的天然化合物熊果酸与青霉素的重量比为1-3∶1。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：天然化合物熊果酸与青霉素的重量比为1∶1。
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