CN110960545A - 安石榴苷在抑制多重耐药肺炎克雷伯菌生长中的应用 - Google Patents

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孙照欢
王婷
沈兰芳
杨敏
刘淼
张家宁
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Abstract

本发明公开了安石榴苷在抑制多重耐药肺炎克雷伯菌生长中的应用，根据安石榴苷对多重耐药肺炎克雷伯菌具有较好的体外杀灭作用，能够抑制多重耐药肺炎克雷伯菌的生长，且最低杀菌浓度为3.6mg/mL，最小抑菌浓度为1.8mg/mL，本发明提出了安石榴苷对多重耐药肺炎克雷伯菌的抑制作用，在医药等领域具有广泛的应用价值。

Description

安石榴苷在抑制多重耐药肺炎克雷伯菌生长中的应用
技术领域
本发明涉及中药有效成分安石榴苷作为肺炎克雷伯菌的抑制剂的研究开发和应用，具体涉及安石榴苷在抑制多重耐药肺炎克雷伯菌生长中的应用。
背景技术
肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumonia)是常见的医院感染病原体，是肠杆菌科克雷伯氏菌属中最为重要的一种细菌。肺炎克雷伯菌可引起典型的原发性肺炎，也可引起各种肺外感染，如婴儿肠炎、脑膜炎、成人医源性泌尿道感染，以及外伤感染和菌血症等。随着抗生素在临床上的广泛使用，细菌的耐药性也越来越强。多重耐药肺炎克雷伯菌的产生给临床治疗带来了巨大挑战。
中药的成分复杂、杀菌机制多，不易产生耐药性，在感染治疗中有一定效果。安石榴苷是石榴皮多酚中的主要活性成分，国内外对其抗氧化、抗癌、抗菌、抗病毒、抗炎等方面都有一定的研究。文献(徐云凤,李光辉,梁秀君,等.石榴皮单宁的提取、纯化及抑菌用的研究[J].食品工业科技,2014,35(2):83-86.)报道了石榴皮提取物的主要成分为安石榴苷，纯化后质量浓度由12.3％提高到64.2％；石榴皮粗提物、纯化物对金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特氏菌、沙门氏菌和大肠杆菌有抑制作用，其中，大肠杆菌是肠杆菌科埃希氏菌属，李斯特氏菌是肠杆菌科李斯特氏菌属，沙门氏菌是肠杆菌科沙门氏菌属，金黄色葡萄球菌是葡萄球菌属。但是关于安石榴苷抑制多重耐药肺炎克雷伯菌生长方面报道较少。
发明内容
本发明针对目前临床医学面临的耐药难题，目的在于提供安石榴苷在抑制多重耐药肺炎克雷伯菌生长中的应用。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
利用纸片扩散法确定肺炎克雷伯菌对抗生素的耐药性，通过微量二倍稀释法确定安石榴苷对肺炎克雷伯菌的最小抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)。结果表明：安石榴苷对多重耐药肺炎克雷伯菌具有较好的抑菌作用，可以用于抑制多重耐药肺炎克雷伯菌的生长。
优选的，所述多重耐药肺炎克雷伯菌为耐亚胺培南、美罗培南、厄他培南、多尼培南、头孢噻肟、环丙沙星、阿奇霉素中多种抗生素的人源肺炎克雷伯菌。
优选的，所述多重耐药肺炎克雷伯菌选自耐亚胺培南、美罗培南、厄他培南、多尼培南、头孢噻肟及环丙沙星的人源肺炎克雷伯菌。
优选的，所述安石榴苷的最低杀菌浓度为3.6mg/mL，最小抑菌浓度为1.8mg/mL。
本发明的有益效果体现在：
本发明从现存的药用植物资源库入手，挖掘潜在的耐药菌抑制剂，基于安石榴苷对多重耐药肺炎克雷伯菌的作用的研究，发现非抗生素类化合物安石榴苷可以有效抑制多重耐药肺炎克雷伯菌的生长，为多重耐药肺炎克雷伯菌抑制剂的研究开发和应用提供新的思路和来源，在医药等领域具有广泛的应用价值。
进一步的，本发明明确了安石榴苷对多重耐药肺炎克雷伯菌的抑制作用，将其作为抗生素替代品，能够有效缓解或解决多重耐药肺炎克雷伯菌的耐药及感染问题，降低病死率。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步详细说明。所述实施例仅用于解释本发明，并非对本发明保护范围的限制。
1、人源肺炎克雷伯菌的药敏实验
本发明以多株人源肺炎克雷伯菌(菌株样本取自宁波市疾病预防控制中心)为出发菌株，选用亚胺培南、美罗培南、厄他培南、多尼培南、庆大霉素、头孢噻肟、环丙沙星和阿奇霉素8种常用抗生素的药敏试纸片进行药敏试验。
挑取培养18～24h的纯菌落均匀溶解于2～5mL无菌生理盐水中，调节其浊度与0.5麦氏比浊管等浊。无菌吸取50～200μL菌液，均匀涂布平板，室温下放置3～5min。用无菌镊子按要求将药敏试纸片(直径为6mm)紧贴于平板表面，每种药敏试纸片三个平行。将接种好的平板放置于36～37℃孵育16～24h。用0.02mm精度的游标卡尺测定抑菌圈直径，以抑菌圈的直径来判断药物的敏感性，抑菌结果根据美国临床试验室国家标准化管理委员会(CLSl2017)标准判定，判定标准见表1。实验结果见表2，结果显示，3#人源肺炎克雷伯菌可以耐受6种临床上常见的抗生素，因此将其作为下一步实验的研究对象。
表1.美国临床试验室国家标准化管理委员会(CLSl2017)标准判定结果
Figure BDA0002355556730000021
Figure BDA0002355556730000031
表2.人源肺炎克雷伯菌的药敏实验中抑菌圈直径结果
Figure BDA0002355556730000032
注：抑菌圈直径的单位为mm，数值均为三个平行的平均值
2、安石榴苷对多重耐药菌株的抑制作用
为了充分考虑用药安全，本发明以安石榴苷这一单一活性成分为研究对象，以ATCC13883为参考菌株(参考菌株对多粘菌素和头孢唑林高度敏感)，以3#菌株为实验菌株，进行耐药性抑制作用的研究。挑取培养18～24h的纯菌落均匀溶解于2～5mL LB液体培养基中，调节其浊度与0.5麦氏比浊管等浊，并用酶标仪测定其OD600值。用二甲基亚砜配制浓度为30mg/mL的安石榴苷作为药液，利用试管二倍稀释法将药液、菌液及LB液体培养基加入96孔培养板中过夜培养，不同浓度的药液组别均为三个平行，确保实验数据的可信度。
利用酶标仪测定安石榴苷对多重耐药肺炎克雷伯菌的最小抑菌浓度(MIC)，并以MIC浓度为参照，对进行培养的菌液增加药物稀释梯度，将相应培养液转接于无菌的TSA固体培养基中培养24h，若无单菌落生成，此浓度为安石榴苷对多重耐药肺炎克雷伯菌的最低杀菌浓度(MBC)，实验结果见表3。
表3.安石榴苷对多重耐药肺炎克雷伯菌的抑制结果
Figure BDA0002355556730000041
由表3可知，安石榴苷对耐亚胺培南、美罗培南、厄他培南、多尼培南、头孢噻肟及环丙沙星的肺炎克雷伯菌的抑制作用较好，其MIC为1.8mg/mL，MBC为3.6mg/mL。结果表明安石榴苷不仅对参考菌株ATCC13883有抑菌作用，对本发明中的多重耐药肺炎克雷伯菌(例如，3#菌株)也有抑菌作用。
根据以上实验结果，结合中草药来源广泛、不良反应少及不易产生耐药性等特点，可通过获得活性单品成分安石榴苷，直接针对临床主要的多重耐药肺炎克雷伯菌发挥抑制作用，可有效缓解或解决多重耐药肺炎克雷伯菌的感染问题，降低病死率，对研究临床分离的肺炎克雷伯菌的抑菌剂提供科学依据，为开发抑制多重耐药肺炎克雷伯菌的药物和抗生素替代品提供新思路和来源。

Claims (10)

1.安石榴苷在抑制多重耐药肺炎克雷伯菌生长中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述多重耐药肺炎克雷伯菌为人源肺炎克雷伯菌。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述肺炎克雷伯菌的耐药性是通过纸片扩散法确定的。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述多重耐药肺炎克雷伯菌耐受的抗生素选自亚胺培南、美罗培南、厄他培南、多尼培南、头孢噻肟、环丙沙星、阿奇霉素中的多种。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述多重耐药肺炎克雷伯菌选自耐亚胺培南、美罗培南、厄他培南、多尼培南、头孢噻肟及环丙沙星的肺炎克雷伯菌。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述安石榴苷对多重耐药肺炎克雷伯菌的最低杀菌浓度为3.6mg/mL，最小抑菌浓度为1.8mg/mL。
7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述安石榴苷对多重耐药肺炎克雷伯菌具有体外杀灭作用，以及抑制多重耐药肺炎克雷伯菌的体外生长。
8.安石榴苷在制备抗多重耐药肺炎克雷伯菌的药物中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述多重耐药肺炎克雷伯菌为人源肺炎克雷伯菌。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述多重耐药肺炎克雷伯菌选自对亚胺培南、美罗培南、厄他培南、多尼培南、头孢噻肟、环丙沙星、阿奇霉素中多种抗生素耐药的肺炎克雷伯菌。
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