CN110279679B - 柠檬醛在抑制多重耐药阴沟肠杆菌生长中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了柠檬醛在抑制多重耐药阴沟肠杆菌生长中的应用，根据柠檬醛对耐头孢唑啉、头孢噻肟、溴格门汀、美罗培能、氧氟沙星、左氧氟沙星、环丙沙星、头孢西汀、米诺环素、亚胺培南、哌拉西林、阿奇霉素、呋喃妥因、磺胺甲基异恶唑、萘啶酸的多重耐药阴沟肠杆菌具有较好的体外杀灭作用，能够抑制多重耐药阴沟肠杆菌的生长，且最低杀菌浓度为1.6mg/mL，最小抑菌浓度为1.0mg/mL，本发明提出了柠檬醛对多重耐药阴沟肠杆菌的抑制作用，在医药领域具有广泛的应用价值。

Description

柠檬醛在抑制多重耐药阴沟肠杆菌生长中的应用

技术领域

本发明涉及中药有效成分柠檬醛作为细菌抑制剂的研究开发和应用，具体涉及柠檬醛在抑制多重耐药阴沟肠杆菌生长中的应用。

背景技术

阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)属于肠杆菌科，广泛存在于自然界中，在人和动物的粪便、水、泥土、植物中均有分布。阴沟肠杆菌可引起多系统感染，也可引起败血症、尿路感染、伤口感染和泌尿道感染等，由于β内酰胺类抗生素的广泛使用，阴沟肠杆菌的耐药性日益严重，其可形成耐药株，甚至形成多重耐药菌株(产β-内酰胺酶)，作为条件致病菌的阴沟肠杆菌已成为医院感染主要的致病菌之一(高秀娟,张晓丽,刘骙骙,张瑜.某医院临床分离阴沟肠杆菌分布及耐药性变迁[J].中国消毒学杂志,2017,34(04):350-352.)。抗生素的广泛使用、过度使用导致细菌耐药性在全球不断扩散，“超级细菌”成为全球关注的焦点，多重耐药菌的产生给临床治疗带来了巨大挑战。

中草药是中国特有的药材资源，其具有来源广泛、品种繁多、价格低廉、不良作用小、不易使细菌产生耐药性、易于代谢等优点(刘晶莹.中药在现代养殖中应用的发展趋势[J].天津科技,2010,37(04):117-118.)，在面对细菌耐药性增强的问题上，中草药可以成为寻找高效、低毒的细菌抑制剂的新来源。

柠檬醛(分子式C₁₀H₁₆O)存在于山苍子、紫苏、吉龙草等的植物精油中，它既是一种天然香料，也是合成高级香料的重要原料之一。同时，柠檬醛具有驱蚊、杀虫等作用，且在剂量范围内对哺乳动物低毒，而且具有抗菌、抗氧化、抗炎及防腐等生物活性。

研究发现柠檬醛对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、肠球菌、蜡状芽孢杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、单增李斯特菌、变形杆菌、淋球菌均有显著的抑菌活性(GE,B.,Donnicola,D.N.,Corthesy Theulaz,I.E.2003.Essential Oils as Components of a Diet-BasedApproach to Management of Helicobacter Infection.Antimicrobial Agents&Chemotherapy,47(10):3240-6.)。郭都等人(孙慧慧,孙正,孙怡,夏效东,石超.柠檬醛对副溶血性弧菌的抑制作用[J/OL].食品科学:1-11[2019-05-07].)研究了七种植物源活性物质(丁香酸、阿魏酸、绿原酸、硫辛酸、原儿茶酸、原儿茶醛和柠檬醛)对副溶血性弧菌的最小抑菌浓度，发现柠檬醛对副溶血性弧菌有着良好的抑制效果，其能够引起副溶血性弧菌细胞膜电位去极化、胞内ATP浓度降低及细胞膜完整性下降，同时可使细胞皱缩变形，并有潜力作为天然的抗菌物质应用于控制食品中副溶血性弧菌。崔惠敬等人(崔惠敬,孟玉霞,徐永平,赵前程,姜龙,马永生.植物精油对大菱鲆弧菌的体外和体内抗菌活性[J].微生物学通报,2017,44(02):274-284.)研究了天然植物精油对大菱鲆弧菌的体外和体内抗菌活性，发现山苍子精油可破坏大菱鲆弧菌的细胞膜，并导致胞内蛋白酶和核酸外泄；经200μL/L山苍子精油浸浴后，大菱鲆攻毒后死亡率由对照组50％降至0，对大菱鲆弧菌具有良好抗菌活性。但是关于柠檬醛抑制阴沟肠杆菌的研究报道尚未发现。

发明内容

本发明的目的在于提供柠檬醛在抑制多重耐药阴沟肠杆菌生长中的应用，为开发新型抗生素替代物提供实践基础。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

利用纸片扩散法确定阴沟肠杆菌对抗生素的耐药性，通过二倍稀释法确定柠檬醛对阴沟肠杆菌的最低杀菌浓度和最小抑菌浓度。结果表明：非抗生素类化合物柠檬醛对多重耐药阴沟肠杆菌具有较好的抑菌作用，可以用于抑制多重耐药阴沟肠杆菌的生长。

优选的，所述多重耐药阴沟肠杆菌为人源耐头孢唑啉、头孢噻肟、溴格门汀、美罗培能、氧氟沙星、左氧氟沙星、环丙沙星、头孢西汀、米诺环素、亚胺培南、哌拉西林、阿奇霉素、呋喃妥因、磺胺甲基异恶唑、萘啶酸中多种抗生素的阴沟肠杆菌。

优选的，所述柠檬醛的最低杀菌浓度为1.6mg/mL，最小抑菌浓度为1.0mg/mL。

优选的，所述柠檬醛对耐头孢唑啉、头孢噻肟、溴格门汀、美罗培能、氧氟沙星、左氧氟沙星、环丙沙星、头孢西汀、米诺环素、亚胺培南、哌拉西林、阿奇霉素、呋喃妥因、磺胺甲基异恶唑及萘啶酸的阴沟肠杆菌具有抑制作用。

本发明的有益效果体现在：

本发明从现存的药用植物资源库入手，挖掘潜在的耐药菌抑制剂，基于柠檬醛对多重耐药阴沟肠杆菌的作用研究，利用柠檬醛抑制多重耐药阴沟肠杆菌的生长，为多重耐药阴沟肠杆菌抑制剂的研究开发和应用提供新的思路，并为解决抗生素类耐药性提供有益帮助，在医药领域具有广泛的应用价值。

进一步的，本发明针对临床耐药难题，利用柠檬醛对多重耐药阴沟肠杆菌的抑制作用，将其作为抗生素的替代品，可缓解或解决多重耐药阴沟肠杆菌的耐药感染问题，降低病死率。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步详细说明。所述实施例仅用于解释本发明，并非对本发明保护范围的限制。

1、人源阴沟肠杆菌的药敏实验

本发明以3株人源阴沟肠杆菌为出发菌株(菌株样本取自中国人民解放军总医院)，选用头孢唑啉、头孢噻肟、溴格门汀、美罗培能、氧氟沙星、左氧氟沙星、环丙沙星、头孢西汀、米诺环素、亚胺培南、哌拉西林、阿奇霉素、呋喃妥因、庆大霉素等16种抗生素的药敏试纸片进行药敏试验。

挑取培养18～24h的纯菌落均匀溶解于2～5mL无菌生理盐水中，调节其浊度与0.5麦氏比浊管等浊。无菌吸取50～200μL菌液，均匀涂布平板，室温下放置3～5min。用无菌镊子按要求将药敏试纸片(直径为6mm)紧贴于平板表面，每种药敏试纸片三个平行。将接种好的平板于36～37℃孵育16～24h。用0.02mm精度的游标卡尺测定抑菌圈直径，以抑菌圈的直径来判断人源阴沟肠杆菌对药物的敏感性，抑菌结果根据美国临床试验室国家标准化管理委员会(CLSl2017)标准判定，判定标准见表1。实验结果见表2，结果显示，其中一株人源阴沟肠杆菌(1#菌株)可以耐受15种临床上使用的抗生素。

表1.美国临床试验室国家标准化管理委员会(CLSl2017)标准判定结果

表2.人源阴沟肠杆菌的药敏实验抑菌圈直径结果

注：抑菌圈直径的单位为mm，数值均为三个平行的平均值；

2、柠檬醛对多重耐药菌株的抑制作用

为了充分考虑用药安全，本发明以柠檬醛单一活性成分为研究对象，以庆大霉素作为阳性对照，进行耐药性抑制作用的研究。挑取培养18～24h的纯菌落均匀溶解于2～5mLLB液体培养基中，调节其浊度与0.5麦氏比浊管等浊，并用酶标仪测定其OD₆₀₀值。用二甲基亚砜配制浓度为50mg/mL的柠檬醛作为药液，利用试管二倍稀释法将药液、菌液及LB液体培养基加入96孔培养板中过夜培养，不同浓度的药液组均为三个平行，确保实验数据的可信度。

利用酶标仪测定柠檬醛对多重耐药阴沟肠杆菌(1#菌株、2#菌株、3#菌株)的最小抑菌浓度(MIC)。并将MIC浓度下的培养液转接于无菌的LB液体培养基中继续培养，利用酶标仪测定柠檬醛对多重耐药阴沟肠杆菌的最低杀菌浓度(MBC)，实验结果见表3。

表3.柠檬醛对人源多重耐药阴沟肠杆菌的抑制结果

由表3可知，柠檬醛对耐头孢唑啉、头孢噻肟、溴格门汀、美罗培能、氧氟沙星、左氧氟沙星、环丙沙星、头孢西汀、米诺环素、亚胺培南、哌拉西林、阿奇霉素、呋喃妥因、磺胺甲基异恶唑、萘啶酸的多重耐药阴沟肠杆菌的抑制作用较好，以1#菌株为例，其MIC为1.2mg/mL，MBC为1.6mg/mL。

根据以上实验结果，综合中草药不易产生耐药性等特点，可通过获得柠檬醛活性单品成分，直接针对多重耐药阴沟肠杆菌发挥抑制作用，有效缓解或解决多重耐药阴沟肠杆菌的耐药、感染、致病等问题，有效发挥抑制作用，降低致病率和病死率，为抑制多重耐药阴沟肠杆菌提出新的思路，为开发多重耐药阴沟肠杆菌的抑制剂奠定了坚实的基础。

Claims (5)

1.柠檬醛在制备抗多重耐药阴沟肠杆菌的药物中的应用，其特征在于：所述多重耐药阴沟肠杆菌耐受的抗生素选自头孢唑啉、头孢噻肟、溴格门汀、美罗培能、氧氟沙星、左氧氟沙星、环丙沙星、头孢西汀、米诺环素、亚胺培南、哌拉西林、阿奇霉素、呋喃妥因、磺胺甲基异恶唑、萘啶酸中的多种。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述多重耐药阴沟肠杆菌为人源阴沟肠杆菌。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述阴沟肠杆菌对抗生素的耐药性是通过纸片扩散法确定的。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述柠檬醛对所述阴沟肠杆菌的最低杀菌浓度为1.6 mg/mL，最小抑菌浓度为1.2 mg/mL。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述柠檬醛对多重耐药阴沟肠杆菌具有体外杀灭作用，以及抑制多重耐药阴沟肠杆菌的体外生长。