CN111904995B - 夏枯草联用抗生素在制备抗耐多药金黄色葡萄球菌药物中的应用 - Google Patents

夏枯草联用抗生素在制备抗耐多药金黄色葡萄球菌药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了夏枯草联用抗生素在制备抗耐多药金黄色葡萄球菌药物中的应用。本发明通过以夏枯草与抗生素联用，能够起到明显增效作用，降低了抗生素的用量，使得红霉素最低抑菌浓度(MIC)降低为单独用药的1/2，青霉素MIC可降低为单独用药的1/4，有效起到联合抗耐多药金黄色葡萄球菌效果。

Description

夏枯草联用抗生素在制备抗耐多药金黄色葡萄球菌药物中的 应用
技术领域
本发明涉及中药应用领域，特别是一种抗耐药菌的药物组合物。
背景技术
食用受致病性微生物污染的食品或饮料引起的食源性疾病是全球面临的主要卫生挑战之一。食品中微生物的存活是一个重要的问题，它会引起食品的变质和质量的恶化，导致感染和疾病。世卫组织首次对全球食源性疾病作出估计，发现每年几乎每10人中就有1人因食用受污染的食品而患病，导致42万人死亡，5岁以下儿童的患病风险尤其高，每年有12.5万儿童死于食源性疾病。金黄色葡萄球菌是最常见的与食物有关的病原体之一，入侵人体引起皮肤感染、食物中毒等疾病。
耐多药金黄色葡萄球菌，特别是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)，自1960年以来已成为一个新的威胁，由于其广泛的感染，近年来更广泛的传播，甚至成为一个21世纪的“超级挑战”。MRSA可以水解几乎所有的内酰胺类药物。耐药菌株传播迅速，耐药范围广，导致感染者死亡率高，严重透支医疗资源。因此，开发现有抗生素的替代品来对抗MRSA感染仍然是一个值得关注的问题。
近年来，化学合成防腐剂在食品工业中得到了广泛的应用。然而，使用这些合成的化合物来控制食物腐败和致病菌是很有争议的，因为有报道称它们会导致呼吸道疾病或其他健康问题。鉴于此，食品工业正在大力投资，从新的来源寻找新的抑制化合物或替代品，可用于天然抗菌剂，旨在延长食品的保质期。除了它们在抗菌性能上的作用，这些药剂的一个重要优点是微生物不太可能对它们表现出耐药性并且可减少抗生素的用量。
夏枯草(Prunella vulgaris Linn,PV)是唇形科植物，是一种重要的食用药用植物，广泛分布于韩国、日本、中国和欧洲等地。夏枯草具有许多显著的药理活性，如抗病毒、抗炎、抗癌、神经保护、抗氧化、抗菌和抗高血糖等作用。
发明内容
为解决上述问题，本发明的目的是提供夏枯草联用抗生素在制备抗耐多药金黄色葡萄球菌药物中的应用，其对抗耐多药金黄色葡萄球菌具有明显的抑制效果，有效降低抗生素的用量。
本发明的目的是这样实现的；夏枯草联用抗生素在制备抗耐多药金黄色葡萄球菌药物中的应用。
所述的夏枯草为夏枯草的提取物。
所述的提取物为水提物。
所述的水提物的制备工艺为：夏枯草粉碎后加入蒸馏水，于室温下搅拌1.5-2.5小时后，100℃搅拌1.5-2.5小时，离心处理后取上清液过滤，所得上清液蒸发、浓缩、干燥。
所述的抗生素为红霉素或青霉素。
所述的夏枯草的提取物与红霉素的重量比为1～1.5:0.006～0.070。
所述的夏枯草的提取物与青霉素的重量比为1～1.5:0.012～0.020。
所述的抗耐多药金黄色葡萄球菌为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。
一种抗耐多药金黄色葡萄球菌药物，其特征在于：药物由夏枯草的水提物和抗生素组成，所述的抗生素为红霉素或青霉素。
所述的夏枯草的水提物与红霉素的重量比为1～1.5:0.060～0.070；所述的夏枯草的水提物与青霉素的重量比为1～1.5:0.012～0.020。
本发明通过以夏枯草与抗生素合用，能够起到明显增效作用，降低了抗生素的用量，使得红霉素最低抑菌浓度(MIC)降低为单独用药的1/2，青霉素MIC可降低为单独用药的1/4，有效起到联合抗耐多药金黄色葡萄球菌效果。
具体实施方式
本发明是夏枯草联用抗生素在制备抗耐多药金黄色葡萄球菌药物中的应用。所述的夏枯草为夏枯草的提取物。优选的，所述的提取物为水提物。
更优选的，所述的水提物的制备工艺为：夏枯草粉碎后加入蒸馏水，于室温下搅拌1.5-2.5小时后，100℃搅拌1.5-2.5小时，离心处理后取上清液过滤，所得上清液蒸发、浓缩、干燥。夏枯草与蒸馏水的体积比为1:8-12，更优选为1:10。离心处理优选为(8,000-12,000)×g离心处理30-50min。离心处理后取上清液经滤纸过滤，所得上清液经过旋转蒸发浓缩后进行真空冷浓干燥，得到夏枯草提取物。
所述的抗生素为红霉素或青霉素。优选的，所述的夏枯草的提取物与红霉素的重量比为1～1.5:0.060～0.070，更优选1.25:0.064。优选的，所述的夏枯草的提取物与青霉素的重量比为1～1.5:0.012～0.020，更优选1.25:0.016。
所述的抗耐多药金黄色葡萄球菌为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。
本发明的一种抗耐多药金黄色葡萄球菌药物，其由夏枯草的水提物和抗生素组成，所述的抗生素为红霉素或青霉素。优选的，所述的夏枯草的水提物与红霉素的重量比为1`1.5:0.060～0.070，更优选1.25:0.064。优选的，所述的夏枯草的水提物与青霉素的重量比为1～1.5:0.012～0.020，更优选1.25:0.016。
所述的药物可以按现有制药工艺添加适当的药用辅料制备成粉剂、片剂、胶囊剂、水剂等剂型。夏枯草的水提物和抗生素可以是分别制备相应剂型后再配套合用或是两者混合后制备相应剂型，视乎使用要求而定，此并不影响抗菌效果。
实施例1
夏枯草粉碎后，以料液比1:10加入蒸馏水，置于磁力搅拌器在室温下搅拌2小时后，100℃搅拌2小时，10,000×g离心处理40min，取上清液经滤纸过滤，所得上清液经过旋转蒸发浓缩后进行真空冷浓干燥，得到夏枯草提取物。
将前述夏枯草提取物与红霉素按重量比1.25:0.064的比例合用作为抗耐多药金黄色葡萄球菌药物。
实施例2
将实施例1所得的夏枯草提取物与红霉素按重量比1:0.070的比例混合，制作成粉剂，作为抗耐多药金黄色葡萄球菌药物。
实施例3
将实施例1所得的夏枯草提取物与青霉素按重量比1:0.020的比例混合，并添加相应药用辅料制作成片剂，作为抗耐多药金黄色葡萄球菌药物。
实施例4
将实施例1所得的夏枯草提取物与青霉素按重量比1.5:0.012的比例混合，并添加相应药用辅料制作成片剂，作为抗耐多药金黄色葡萄球菌药物。
实施例5
将实施例1所得的夏枯草提取物与青霉素按重量比1.25:0.016的比例混合，并添加相应药用辅料制作成片剂，作为抗耐多药金黄色葡萄球菌药物。
实施例6
将实施例1所得的夏枯草提取物与红霉素按重量比1.5:0.060的比例溶解于蒸馏水中形成混合溶液，其中夏枯草提取物的浓度为1.5mg/mL，红霉素浓度为60mg/L，作为抗耐多药金黄色葡萄球菌药物。
实施例7
夏枯草粉碎后，以料液比1:12加入蒸馏水，置于磁力搅拌器在室温下搅拌2小时后，100℃搅拌2.5小时，10,000×g离心处理40min，取上清液经滤纸过滤，所得上清液经过旋转蒸发浓缩后进行真空冷浓干燥，得到夏枯草提取物。其他同实施例5。
对比试验
MRSA的培养：革兰氏阳性细菌MRSA NCTC 13142由英国贝尔法斯特女王大学生物科学学院提供，并保存至-80℃超低温冰箱。解冻后将菌株划线接种于Mueller-HintonAgar(MHA，购自Basingstoke,UK)固体培养架上，放置于恒温培养箱中，37℃培养18-20h。待菌落形成后，挑取平板上的3-5个单菌落接种到Mueller-Hinton Broth(MHB，购自Basingstoke,UK)液体培养基中，37℃，200rpm恒温震荡培养，以达到对数生长期(3-10h)，即得到活化的细菌菌液。
一、夏枯草不同方法和不同溶剂提取物对MRSA的抗菌效果评价
夏枯草提取物从不同方法不同溶剂提取中选择。
(1)24小时室温(RT)提取(24h RT)：夏枯草(广东省药材公司中药饮片厂，批号：X2419412)粉碎，精密称量10g，以料液比1:10(w/v)加入100mL蒸馏水，至于磁力搅拌室温下搅拌24h,10,000×g离心40min，取上清液经滤纸过滤，所得上清经过旋转蒸发仪(Buchirotavapor R-200,Germany)浓缩后进行真空冷浓干燥器(Lablyo,Germany)干燥，得到提取物0.6186g，提取率为6.19％。
(2)12小时60℃提取(12h 60℃)：夏枯草粉碎，精密称量10g，以料液比1:10(w/v)加入100mL蒸馏水，置于磁力搅拌器60℃下连续搅拌12小时,10,000×g离心40min，取上清液经滤纸过滤，所得上清经过旋转蒸发浓缩后进行真空冷浓干燥，得到提取物0.6321g，提取率为6.32％。
(3)2小时室温2小时100℃提取(2h RT 2h 100℃)：夏枯草粉碎，精密称量10g，以料液比1:10(w/v)加入100mL蒸馏水，置于磁力搅拌器室温下搅拌2小时后,100℃搅拌2小时10,000×g离心40min，取上清液经滤纸过滤，所得上清经过旋转蒸发浓缩后进行真空冷浓干燥，得到提取物1.0022g，提取率为10.02％。
(4)夏枯草乙醇提取物：夏枯草粉碎，精密称量10g，以料液比1:10(w/v)加入70％乙醇，至于磁力搅拌器室温下搅拌24h,10,000×g离心40min，取上清液经滤纸过滤，所得上清经过旋转蒸发浓缩后进行真空冷浓干燥，得到乙醇提取物585mg，提取率为5.85％。
(5)夏枯草甲醇提取物：夏枯草粉碎，精密称量10g，以料液比1:10(w/v)加入甲醇，至于磁力搅拌器室温下搅拌24h,10,000×g离心40min，取上清液经滤纸过滤，所得上清经过旋转蒸发浓缩后进行真空冷浓干燥，得到甲醇提取物450mg，提取率为4.5％。
夏枯草提取物对MRSA最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)测定
通过二倍浓度稀释法测定PV对MRSA的最小抑菌浓度和最小杀菌浓度，向MHB培养液中分别添加以上几种夏枯草提取物，并逐级稀释，最终各浓度中PV浓度为0.078mg/mL，0.156mg/mL，0.313mg/mL，0.625mg/mL，1.25mg/mL，2.5mg/mL，5mg/mL，10mg/mL。向各孔添加MRSA菌液，使其初始浓度105-6CFU/mL,混匀，置于37℃恒温振荡器中培养。将只添加菌液，不添加夏枯草的孔作为阴性对照。培养18-20h后，观察夏枯草提取物的抑菌效果。MHB培养基仍然澄清透亮，孔底部未见肉眼可观察的菌落的最小PV浓度即为MIC。从所有澄清透亮的孔中接种菌涂布于MHA固体培养基上，在37℃下培养24h后取出。平板上菌落数减少率达到99.99％的最小PV浓度为MBC。
夏枯草不同方法水提取物抗MRSA活性如表1所示，2小时常温搅拌，2小时100℃加热搅拌水提物的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)都是最小，分别为2.5mg/ml和5mg/ml提示夏枯草水提物方法中，2小时常温搅拌，2小时100℃加热搅拌抗MRSA效果最好。
表1夏枯草不同方法水提取物抗MRSA活性
Figure BDA0002617920290000051
夏枯草不同溶剂提取物抗MRSA活性如表2所示，与夏枯草乙醇提取物和甲醇提取物比较，同样水提取物的抗MRSA效果较好。
表2夏枯草不同溶剂提取物抗MRSA活性
Figure BDA0002617920290000052
二、夏枯草联用抗生素对MRSA的抗菌效果评价
微量棋盘稀释法测定夏枯草水提取物(2h RT 2h 100℃)联合红霉素和青霉素对MRSA的作用
在无菌96孔板以二维棋盘的方式，以纵向(A-H),横向(1-12)两个方向对联用的两种药物分别进行稀释。
以夏枯草水提取物2*MIC-1/64MICa的浓度分别与青霉素2*MIC-1/256MICb，红霉素MIC-1/256MICb的浓度进行联合(每孔加入两种药液各50μL),在每孔加入100μL已经稀释好的MRSA菌悬液。设定阴性对照组(200μL MHB培养基)及阳性对照组(100μL MHB和100μL菌液)，置于37℃恒温培养箱中培养24h，MHB培养基仍然澄清透亮，孔底部未见肉眼可观察的菌落的最小浓度即为联用时的MIC值。两药连用时，夏枯草水提取物对抗MRSA的MIC值为MICA，抗生素对抗MRSA的MIC值表示为MICB。
联合用药以抑菌浓度指数(FICI)为判定标准(参见Chan B C,Ip M,Lau C B,etal.Synergistic effects of baicalein with ciprofloxacin against NorA over-expressed methicillin-resistant Staphylococcus aureus(MRSA)and inhibition ofMRSA pyruvate kinase[J].J Ethnopharmacol.2011,137(1):767-773.)：FICI＝MICA/MICa+MICB/MICb。FICI≤0.5时，两药作用方式为协同；0.5＜FICI≤1时，两药作用方式为相加；1＜FICI≤2时，两药作用方式为无关；FICI＞2时，两药作用方式为拮抗。
夏枯草水提取物与红霉素联用抗MRSA活性如表3所示，夏枯草水提取物与红霉素联合作用后，增加了红霉素的抗菌作用，降低了抗生素的用量，使得红霉素最低抑菌浓度(MIC)降低为单独用药的1/2。
表3夏枯草水提取物与红霉素联用抗MRSA活性
Figure BDA0002617920290000061
夏枯草水提取物与青霉素联用抗MRSA活性如表4所示，夏枯草水提取物与青霉素联合作用后，明显增加了青霉素的抗菌作用，降低了抗生素的用量，青霉素MIC可降低为单独用药的1/4，有效起到联合抗耐多药金黄色葡萄球菌效果。
表4夏枯草水提取物与青霉素联用抗MRSA活性
Figure BDA0002617920290000062
对夏枯草不同方法及不同溶剂提取物抗MRSA活性进行评价，结果显示夏枯草水提取物的提取方法为2小时常温搅拌、2小时100℃加热搅拌抗MRSA效果最佳，与红霉素和青霉素联合作用后，降低了抗生素的用量，使得红霉素最低抑菌浓度(MIC)降低为单独用药的1/2，青霉素MIC可降低为单独用药的1/4，有效起到联合抗耐多药金黄色葡萄球菌效果。

Claims (3)

1.夏枯草水提物联用红霉素在制备抗耐多药金黄色葡萄球菌药物中的应用，所述的水提物的制备工艺为：夏枯草粉碎后加入蒸馏水，于室温下搅拌1.5-2.5小时后，100℃搅拌1.5-2.5小时，离心处理后取上清液过滤，所得上清液蒸发、浓缩、干燥；所述的夏枯草水提物与红霉素的重量比为1～1.5:0.060～0.070。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的抗耐多药金黄色葡萄球菌为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。
3.一种抗耐多药金黄色葡萄球菌药物，其特征在于：药物由夏枯草水提物和抗生素组成，所述的抗生素为红霉素；所述的水提物的制备工艺为：夏枯草粉碎后加入蒸馏水，于室温下搅拌1.5-2.5小时后，100℃搅拌1.5-2.5小时，离心处理后取上清液过滤，所得上清液蒸发、浓缩、干燥；所述的夏枯草水提物与红霉素的重量比为1～1.5:0.060～0.070。
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