CN103614481B - 用于检测gdnf剪接变异体2、4的实时荧光定量pcr专用引物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于检测GDNF剪接变异体2、4的实时荧光定量PCR专用引物。所述引物序列如SEQ？ID？NO.1和SEQ？ID？NO.2所示。所述荧光定量PCR引物，以脑组织cDNA样品为模板，同时设立无模板对照，摸索并优化定量反应体系的条件参数，开发出可靠、灵敏的剪接变异体定量检测引物。本发明引物可以检测GDNF剪接变异体4(Gene？codeNO.：NM_001190469.1)和剪接变异体2(Gene？code？NO.:NM_199231.2)表达水平，具有特异性强、重复性高的优点。
Description
技术领域
本发明属于生物检测领域，具体涉及检测GDNF剪接变异体的实时荧光定量PCR引物，特别涉及一种检测GDNF剪接变异体4(GenecodeNO.：NM_001190469.1)和剪接变异体2(GenecodeNO.:NM_199231.2)表达水平的引物。
背景技术
胶质细胞系源性神经营养因子(glialcell-linederivedneurotrophicfactor,GDNF)是一个研究历史较长的蛋白，最初在大鼠胶质瘤细胞株B49的培养基中分离出来，被认为可维持神经元的发育和再生，促进神经元轴突的生长(Linetal.1993)。从蛋白质结构来看，GDNF属转化生长因子-β超家族成员(transforminggrowthfactor-β,TGF-β)(AiraksinenandSaarma,2002)。距今为止，各国研究者对它的研究已接近20年，对其生物学作用也开展了多方面探索，认为该蛋白不仅仅以旁分泌途径作用于其他细胞，也以自分泌途径作用于自身，是一个具重要调节作用多效能营养因子。比如：在帕金森病动物模型和一些体外研究中，该因子保护多巴胺能神经元，是一个很重要的治疗帕金森病的候选因子(Linetal.,1993；etal.,2000；AiraksinenandSaarma,2002)；在生殖方面的研究中，GDNF可在支持细胞中分泌，通过旁分泌途径对精原干细胞的增值和分化起具有决定作用(Guanetal,2006)。
人类GDNF基因位于5号染色体p12-p13.1区，含2个启动子、4个内含子和5个外显子(BaeckerPAetal,1999，结构模式图详见图1)。该基因在转录过程中外显子4发生5’选择性剪切，同时由于存在两个启动子，可转录为不同的mRNA序列，其剪接模式详见图2。
在对基因转录过程中的产生的各种mRNA剪接变异体进行检测过程中，通常采用复杂且昂贵的杂交探针，相较于杂交探针的方法，采用荧光定量PCR具有快速、廉价和精确的特点，为达到检测基因的选择性剪接目的，适应于荧光定量方法，筛选出合适的引物以及适当的PCR扩增条件体系是关键。针对现有技术的检测发现，国内外尚未用于检测GDNF剪接变异体2、4(亦即pre-(β)pro-GDNF)的实时荧光定量PCR专用引物及方法的报道。
发明内容
为解决以上技术问题，需要开发专门用于检测pre-(β)pro-GDNFmRNA表达水平的实时荧光定量PCR专用引物。本发明目的之一在于提供一种特异性引物，用于人组织或细胞内剪接变异体4(GenecodeNO.：NM_001190469.1)和剪接变异体2(GenecodeNO.:NM_199231.2)荧光定量检测(注：如背景技术所述，由于该两个剪接变异体存在相同的78bp剪接片段缺失，该种类型剪接变异体被称之为pre-(β)pro-GDNF，故以下均用pre-(β)pro-GDNF代表以上cDNA序列)。
本发明的目的是这样实现的：
一种用于检测pre-(β)pro-GDNFmRNA表达水平实时荧光定量的引物，其关键在于:其特异性双向引物，其核苷酸序列分别如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示。
特异性序列的引物序列为：
上游引物：CCGCCGGACGGGACTTTA(SEQIDNO.1)，
下游引物：ATATTTGCGGCGGGCAGC(SEQIDNO.2)。
一种用于检测人组织或细胞内检测pre-(β)pro-GDNFmRNA表达水平的实时荧光定量引物体系。其特征包括以下几个步骤：
人组织或细胞cDNA标准品的制备，以样品cDNA为模板，利用本发明提供的引物进行荧光定量PCR，建立实时荧光定量PCR的体系。
本发明提供的优选实时荧光定量扩增反应程序：
应用480SystemRealTimePCR扩增仪，95℃预变性30秒，1Cycle；95℃变性5秒，60℃退火20秒，72℃延伸10秒，40Cycles；
本发明提供的优选配制PCR反应液，包括：10μl的SYBRExTaq，0.5μl的浓度为10μM的PCR引物SEQIDNO.1,0.5μl的浓度为10μM的PCRSEQIDNO.2，1μl的cDNA模板，8μl的dH2O。
该方法的有益效果主要体现在:本发明通过设计特异性引物，用于特异性检测人组织或细胞中pre-(β)pro-GDNFmRNA表达水平，通过摸索并优化实时荧光定量PCR反应体系的条件参数等，建立一种快速有效的荧光定量PCR检测方法，可对人组织或细胞中的pre-(β)pro-GDNFmRNA表达水平进行准确的定量检测。通过融解曲线、扩增效率等验证，结果表明该体系特异性强、重复性好、操作简单，可作为准确检测pre-(β)pro-GDNFmRNA表达水平检测样品的手段。
(1)特异性强：结果显示，该荧光定量PCR引物仅对pre-(β)pro-GDNFmRNA进行特异性扩增，而对其他GDNF剪接变异体如pre-(α)pro-GDNFmRNA均未见扩增。
(2)重复性好：同样样品PCR模板与Ct值之间具有良好的线性函数关系，操作简单大大缩短检测周期。
附图说明
图1为人类GDNF基因示意图注：1、据EMBL-bank、GenBank中数据修订，原图自Baeckeretal.(1999)，黑色方框表示外线子，黑色实线表示内含子；2、虚线内所示区域为外显子1至外显子4序列结构，基因在转录过程中该区域发生的选择性剪接，可转录为不同的mRNA序列。
图2为GDNF基因选择性剪接位点及引物设计位点示意图。(A)由于GDNF基因在转录过程中在外显子4和5之间存在选择性剪接，导致对应转录为不同的mRNA，其GenecodeNO.分别为：NM_000514.3、NM_001190469.1、NM_001190468.1、NM_199231.2。由于NM_001190469.1和NM_199231.2都存在5’选择性剪接，两个剪接变异体存在相同的78bp剪接片段缺失，该种类型剪接变异体被称之为pre-(β)pro-GDNF，78bp剪接片段没有缺失的NM_000514.3和NM_001190468.1称之为pre-(α)pro-GDNF；(B)该SEQIDNO.1和SEQIDNO.2的引物对组合可特异性扩增pre-(β)pro-GDNF。
图3为该荧光定量引物的特异性评价。其中，A为采用该引物获得的目的基因的电泳图谱，1为DNAMarker，2-7为PCR产物，采用该对引物获得目的片段，其大小为100bp，符合设计要求；B为荧光定量产物熔解曲线，多个重复的熔解曲线具有单一峰值。
图4为引物扩增效率标准曲线：采用该引物，荧光定量体系条件下，采用标准品cDNA10倍系列稀释的扩增效率曲线，误差为0.00817，扩增效率为1.968，斜率为:-3.400，截距为:26.93，相关系数为:0.999。
图5为引物精确度评价：采用该引物，荧光定量体系条件下，采用标准品cDNA10倍系列稀释及阴性对照的扩增曲线。
图6为在60℃条件采用荧光定量体系和引物检测，神经胶质细胞中SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR检测pre-(β)pro-GDNF表达量。A为Ct值曲线；B为Ct值数值；C为熔解曲线检测整个过程中荧光实时信号。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本方法的内容，但不以任何形式限制本发明。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领技术人员所熟知的常规手段。
实施例1
pre-(β)pro-GDNF表达检测特异性引物的设计，针对研究背景所述pre-(β)pro-GDNFmRNA的特殊序列，应用PrimerPremier5.0软件设计引物序列。交由上海生工生物有限公司合成。
本发明得到的引物序列为：
上游引物：CCGCCGGACGGGACTTTA(SEQIDNO.1)，
下游引物：ATATTTGCGGCGGGCAGC(SEQIDNO.2)。
实施例2RNA提取
在培养U251细胞的培养板中加入TRIzol(Invitrogen公司)裂解细胞，每10cm2面积加入1mlTrizol，移液器吸打后，室温静置5min，加入0.2ml氯仿，颠倒混匀15s，静置2min后，4℃条件下10000g离心10min，吸取上层水相至另一干净EP管中，加入0.5ml异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置10min后，4℃条件下10000g离心10min，弃上清；加入1ml85％乙醇洗涤沉淀。4℃，5000g离心30s，弃上清；晾干，加入30μl的DEPCH2O溶解。
实施例3mRNA反转录:按照1ststrandcDNAsynthesiskit(TAKARAD6210S)试剂盒说明进行反转录。
1st-StrandcDNA合成反应
1.在Microtube中配制下列反应混合液：OligodTPrimer(50μM)1μl，dNTPMixture(10mMeach)1μl，TotalRNA：5μg以下，加入RNasefreedH2O至10μl。
2.65℃保温5min后，冰上迅速冷却。
3.在上述Microtube管中配制下列反转录反应液，总量为20μl。上述变性后反应液10μl，5×PrimeScriptIIBuffer4μl，RNaseInhibitor(40U/μl)0.5μl(20U)，PrimeScriptIIRTase(200U/μl)1μl(200U)，加入RNasefreedH2O至20μl。缓慢混匀。
4.按下列条件进行反转录反应：30℃10min，42℃40min，95℃5min，冰上冷却。获得cDNA。
实施例4胶质瘤细胞内检测pre-(β)pro-GDNFmRNA表达水平的实时荧光定量方法的建立。本发明提供的优选实时荧光定量扩增反应程序：
应用480SystemRealTimePCR扩增仪，将所有DNA样品分别配置RealtimePCR反应体系。体系配置如下：10μl的SYBRExTaq，0.5μl的浓度为10μM的PCR引物SEQIDNO.1,0.5μl的浓度为10μM的PCRSEQIDNO.2，1μl的cDNA模板，8μl的dH2O,轻弹管底将溶液混合，5000rpm短暂离心；将19μl混合液加到PCR板对应的每个孔中，再加入对应的1μlDNA，小心粘上封口膜，并短暂离心混合。在设置PCR程序前将准备好的PCR板放在冰上。
所有的指标均按以下程序进行：
95℃预变性30秒，1Cycle；95℃变性5秒，60℃退火20秒，72℃延伸10秒(收集荧光)，40Cycles；从60℃缓慢加热到95℃执行熔解曲线检测。
Claims (2)
1.用于检测GDNF剪接变异体2、4的实时荧光定量PCR专用引物，其特征是：其实时荧光定量PCR专用引物，主要用于检测人组织或细胞内剪接变异体4(GenecodeNO.：NM_001190469.1)和剪接变异体2(GenecodeNO.:NM_199231.2)表达量，其核苷酸序列分别如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示。
2.用于检测GDNF剪接变异体2、4的实时荧光定量PCR专用引物体系，主要用于检测人组织或细胞内pre-(β)pro-GDNF实时荧光定量检测，其特征在于：应用SystemRealTimePCR扩增仪，95℃预变性30秒，1Cycle；95℃变性5秒，60℃退火20秒，72℃延伸10秒，40Cycles；本发明提供的优选配制的PCR反应液，包括：10μl的SYBRExTaq，0.5μl的浓度为10μM的PCR引物SEQIDNO.1,0.5μl的浓度为10μM的PCRSEQIDNO.2，1μl的cDNA模板，8μl的dH2O。
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