CN103492562A - 用于增强细菌中功能蛋白表达的方法和材料 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了可用于在原核细胞中表达异源蛋白的新型材料和方法，所述原核细胞包括表达FkpA和/或Skp的原核细胞。

Description

用于增强细菌中功能蛋白表达的方法和材料
相关申请的交叉引用
本申请要求于2011年2月3日提交的美国临时申请号61/439,232的优先权，该临时申请以引用方式整体并入。
电子提交材料的以引用方式并入
以引用方式整体并入了与此同时提交并标识如下的计算机可读氨基酸序列表：一个创建于2012年2月3日的名称为“45785A_seq_listing.txt”的8,192字节ASCII（文本）文件。
技术领域
本发明涉及可用于在原核细胞中表达异源蛋白的材料和方法。
背景技术
FkpA为表现分子伴侣和顺-反肽基脯氨酰异构酶活性的大肠杆菌(E.coli)的周质蛋白。天然FkpA通过指导向周质分泌的信号序列而作为大肠杆菌中的245个氨基酸的同二聚体局限于周质间隙。FkpA的伴侣活性存在于成熟蛋白的前120个氨基酸中，并且肽基脯氨酰异构酶活性存在于第121至245位氨基酸中。已研究了周质中的FkpA过表达对抗体单链可变片段(scFv)的周质产量的影响。参见Ramm和Pluckthun,J BiolChem,275:22,17106-17113(2000)。
Skp为用于大肠杆菌中外膜蛋白组装的17-kDa周质伴侣，其有利于外膜蛋白中间体的正确折叠以及帮助维持它们的溶解性。Skp用作同三聚体并且属于含腔体伴侣的家族，这些伴侣将其底物结合到腔体中，从而为正确折叠提供合适的环境并且防止底物聚集。已研究了胞质中的Skp和细菌胞质中的Fab抗体片段的共表达的作用。参见Levy等,Protein Expr Purif.23(2):338-47(2001)。
在原核系统中表达异源蛋白诸如抗体的常见问题是，异源蛋白的聚集程度使得大部分蛋白质不溶解或失去功能。本发明的方法和材料提供该问题的解决方案。
发明内容
本公开涉及可用于提高原核细胞（例如，大肠杆菌细胞）中异源表达蛋白（例如，抗体）的产量的方法和材料。提供了在胞质中表达FkpA和/或Skp并分泌所关注的异源蛋白（例如，抗体）的原核宿主细胞。发明人意外地发现，缺乏信号序列使得FkpA和Skp局限于胞质而非周质的表达FkpA和Skp的大肠杆菌细胞可显著提高大肠杆菌周质中分泌的可溶性正确折叠的功能异源蛋白的产量。
本公开的一个方面提供用于重组制备的表达异源蛋白的原核宿主细胞，其包含(a)编码(i)不连接到功能信号序列或其功能片段的FkpA或(ii)不连接到功能信号序列或其功能片段的Skp的多核苷酸，以及(b)编码该异源蛋白的多核苷酸，其中该异源蛋白连接到功能信号序列。在一些实施方案中，宿主细胞包含(i)编码不连接到功能信号序列或其功能片段的FkpA的多核苷酸，以及(ii)编码不连接到功能信号序列或其功能片段的Skp的多核苷酸。在一些实施方案中，所述多核苷酸位于相同的载体中；而在其他实施方案中，它们位于不同的载体中。在一些实施方案中，两种多核苷酸在相同的信使RNA上表达。
本公开的相关方面提供这些可操作地连接到调节控制序列的多核苷酸，所述调节控制序列用于调节被编码蛋白质的表达。另一个相关方面提供包含这些多核苷酸的载体或染色体。本公开的另一个相关方面提供包含此类多核苷酸和/或载体和/或染色体的宿主细胞，以及使用此类宿主细胞重组表达此类异源蛋白（包括抗体和抗体片段）的方法。本公开的又一个相关方面提供由多核苷酸编码的异源蛋白，其展示在噬菌体粒子的表面上，或者以分离或纯化的形式。
在本文所述的一些或任何实施方案中，原核宿主细胞选自大肠杆菌(Escherichiacoli)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)以及粘质沙雷氏菌(Serratia marcescans)。在示例性实施方案中，原核宿主细胞为大肠杆菌。
在本文所述的一些或任何实施方案中，异源蛋白在不存在FkpA和Skp的情况下与错误折叠或缓慢折叠速率相关。此类异源蛋白包括：生长因子（例如表皮生长因子、胰岛素样生长因子-1）；凝血因子（例如抗血友病因子）；激素（例如，胰岛素、胰高血糖素、生长激素、促生长素、促红细胞生成素）；细胞因子（例如，干扰素、白细胞介素、粒细胞集落刺激因子、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、CD86）；趋化因子（例如，CCL3）；受体（例如，趋化因子受体、酪氨酸激酶受体）；酶（例如，蛋白酶、脂肪酶、碳水化物酶、凝乳酶、DNA酶、尿激酶原、精氨酸脱氨酶、胞嘧啶脱氨酶、L-天冬酰胺酶）；酶激活剂（例如，组织型纤溶酶原激活剂）；酶抑制剂（例如，金属蛋白酶的组织抑制剂）；肽（例如，水蛭素、神经调节素-1片段）；抗体片段（例如，Fab片段）；蛋白质骨架（例如Adnectin、亲和体(affibody)、抗运载蛋白(Anticalin)、DARPin、工程改造的Kunitz型抑制剂、四连接素、A-结构域蛋白、脂质运载蛋白、重复蛋白（诸如锚蛋白重复蛋白）、免疫蛋白、α2p8肽、昆虫防御素A、PDZ结构域、卡律蝎毒素、PHD指蛋白、TEM-1β-内酰胺酶、纤连蛋白III型结构域、CTLA-4、T细胞受体、打结素(knottin)、新抑癌蛋白(neocarzinostatin)、碳水化合物结合模块4-2、绿荧光蛋白、硫氧还蛋白）；疫苗（例如流感疫苗、诸如rPA疫苗的炭疽菌疫苗、诸如ORF2疫苗的戊型肝炎病毒疫苗、人乳头瘤病毒疫苗）；毒素；和免疫毒素(Misawa和Kumagai,Biopolymers51:297-307(1999);Zhang等,Protein Expr.Purif.25(1):105-13(2002);Demain,Trends in Biotech.18(1):26-31(2000);Gebauer和Skerra,Curr.Opin.Chem.Biol.13:245-55(2009);Gill和Damle,Curr.Opin.Biotech17:653-58(2006);Hosse等,ProteinSci.15:14-27(2006);Skerra,Curr.Opin.Biotech18:295-3-4(2007);Song等,PLoS ONE3(5):e2257(2008);Vahedi等,Applied Biochem.and Biotech.157(3):554-61(2009);Hakim和Benhar,MAbs.1(3):281–87(2009))。
在本文所述的一些或任何实施方案中，异源蛋白为脯氨酸异构化依赖性的。在示例性实施方案中，脯氨酸异构化依赖性异源蛋白为包含κ轻链的抗体或抗体片段。
在本文的一些或任何实施方案中，异源蛋白融合到丝状噬菌体外壳蛋白或其片段。在示例性实施方案中，使用包含融合到丝状噬菌体外壳蛋白或其片段的异源蛋白的宿主细胞制备在其表面上展示异源蛋白的噬菌体粒子。
在本文所述的一些或任何实施方案中，异源蛋白为抗体。在示例性实施方案中，抗体为选自Fv、二硫键连接的Fv、scFv、κ轻链片段、λ轻链片段以及Fab片段的抗体片段。
在本文的一些或任何实施方案中，FkpA的功能片段包括伴侣结构域片段，例如，SEQ ID NO:1的第26-140位氨基酸或其保持增加功能异源蛋白产量的能力的片段或变体。在示例性实施方案中，伴侣结构域片段包含与SEQ ID NO:1的第26至140位氨基酸的至少100个氨基酸具有至少75%同一性的氨基酸序列。
在本文的一些或任何实施方案中，FkpA的功能片段包含肽基脯氨酰异构酶结构域片段，例如，SEQ ID NO:1的第141-270位氨基酸或其保持增加功能异源蛋白产量的能力的片段或变体。在示例性实施方案中，肽基脯氨酰异构酶结构域片段包含与SEQID NO:1的第141至270位氨基酸的至少100个氨基酸的片段具有至少75%同一性的氨基酸序列。
在本文的一些或任何实施方案中，Skp的功能片段包含SEQ ID NO:2的第21-161位氨基酸或其保持增加功能异源蛋白产量的能力的片段或变体。在示例性实施方案中，Skp的功能片段包含与SEQ ID NO:2的至少100个氨基酸的片段具有至少75%同一性的氨基酸序列。
在本文所述的一些或任何实施方案中，提供了多个细胞，包括至少约103、104、105、106、107、108、109个或更多个根据本文所述的任何实施方案的不同原核宿主细胞，每个这样的宿主细胞表达不同的异源蛋白（例如，抗体，诸如单链抗体）。
本公开的另一个方面提供用于增加原核宿主细胞中功能异源蛋白（例如，抗体）的重组制备的方法，该方法包括共表达多核苷酸，所述多核苷酸选自编码不连接到功能信号序列或其功能片段的FkpA的多核苷酸，和编码不连接到功能信号序列或其功能片段的Skp的多核苷酸；以及编码连接到功能信号序列的异源蛋白的多核苷酸，由此与在不存在FkpA和/或Skp的情况下表达异源蛋白相比，所制得的功能异源蛋白的量增加。
在本文的一些或任何实施方案中，连接到异源蛋白的信号序列指导异源蛋白向周质的分泌。
本公开的多核苷酸可操作地连接到调节控制序列，诸如启动子、增强子或一个或多个其他转录调控序列，所述序列任选地作为包含这些序列的载体的部分。在一些或任何实施方案中，(a)编码(i)不连接到功能信号序列或其功能片段的FkpA，或(ii)不连接到功能信号序列或其功能片段的Skp的多核苷酸，以及(b)编码连接到功能信号序列的异源蛋白的多核苷酸可操作地连接到相同的调控序列（即，编码序列为多顺反子性的）。可以使用本领域已知或本文所述的方法制备包含此类多核苷酸或载体的宿主细胞。
应当理解，本文所述的每个特征或实施方案或组合为本发明任何方面的非限制性的示例性实例，并且因此旨在与本文所述的任何其他特征或实施方案或组合相结合。例如，在以诸如“一个实施方案”、“一些实施方案”、“又一个实施方案”、“具体示例性实施方案”和/或“另一个实施方案”的语言描述特征的情况中，这些类型的实施方案的每一个为旨在与本文所述的任何其他特征或特征组合相结合的特征的非限制性实例，而没有必要列举每一个可能的组合。此类特征或特征的组合适用于本发明的任何方面。相似地，在本公开对编码通过某些特征表征的多肽的多核苷酸进行描述的情况中，通过本公开还可以预期通过那些特征表征的多肽、表达此类多肽的宿主细胞以及使用此类宿主细胞的所有相关方法。在公开落在范围内的值的实例的情况中，可以预期将这些实例中的任何一个作为范围的可能端点，可以预期此类端点之间的任何和所有数值，并且可以设想上端点和下端点的任何和所有组合。
在考虑以下描述其目前优选实施方案的本发明的详细描述时，本发明的许多其他方面和优势将对本领域的技术人员显而易见。本申请中提及的所有美国专利、美国专利申请公开、美国专利申请、外国专利、外国专利申请以及非专利出版物以引用方式整体并入本文。
附图说明
图1为用于本文所公开的实验的FkpA和Skp构建体的示例说明。
图2示出了在大肠杆菌中表达的并通过Western印迹检测的各种Skp（图2A）和FkpA（图2B）构建体。
图3示出了用于检测在表达FkpA和Skp构建体的各种组合的大肠杆菌菌株中所表达的抗EpCAM ING1Fab或功能（黑色条）ING1Fab的总量（灰色条）的ELISA结果。“cytSkp”表示不具有信号序列的Skp（即，胞质Skp）。相似地，“cytFkpA”表示不通过信号序列时表达的FkpA（即，胞质FkpA）。“perSkp”和“perFkpA”表示通过其信号序列表达的Skp和FkpA（即，周质Skp或FkpA）。“cytBic”表示FkpA和Skp两者由双顺反子消息的胞质表达。“perBic”表示FkpA和Skp两者由双顺反子消息的周质表达。
图4示出了用于检测在表达FkpA和Skp构建体的各种组合的大肠杆菌菌株中所表达的抗IL1XPA23Fab或功能（黑色条）XPA23Fab的总量（灰色条）的ELISA结果。Skp和FkpA构建体如上文对于图3所述。
图5示出了用于检测在表达FkpA和Skp构建体的各种组合的大肠杆菌菌株中所表达的鼠轻链κ抗人胰岛素受体83-7Fab或功能83-7Fab的总量的ELISA结果。图5A为检测制得的83-7Fab的总量的抗体稀释系列，而图5B为检测功能83-7Fab的抗体稀释系列。Skp和FkpA构建体如上文对于图3所述。
图6示出了用于检测在表达胞质FkpA（浅灰色条）或胞质FkpA和胞质Skp（深灰色条）构建体两者的大肠杆菌菌株中所表达的人κBM7-2Fab（其识别专有激酶）或功能BM7-2Fab的总量的ELISA结果。图6A为检测制得的BM7-2Fab的总量的抗体稀释系列，而图6B为检测功能BM7-2Fab的抗体稀释系列。
图7示出了用于检测在表达胞质FkpA或胞质FkpA和胞质Skp构建体两者的大肠杆菌菌株中所表达的抗胃泌素人κ抗TIE1-Fc Fab CF1或功能CF1Fab的总量的ELISA结果。“表达ELISA”为检测制得的CF1Fab的总量的抗体稀释系列，而“靶标ELISA”为检测功能CF1Fab的抗体稀释系列。
图8示出了用于检测在表达胞质FkpA或胞质FkpA和胞质Skp构建体两者的大肠杆菌菌株中所表达的A10、C10、D1和E6Fab的总和功能人λ轻链的ELISA结果。图8A为检测所示制得的所示Fab的总量的抗体稀释系列，而图8B为检测功能Fab的抗体稀释系列。
图9示出了用于计算在表达如图所示各种FkpA和Skp构建体的大肠杆菌菌株中产生的所示Fab的实际产量的表面等离子体共振测定结果。
图10示出了用于检测能够结合靶抗原的κ轻链Fab的噬菌体淘选测定(phagepanning assay)结果。图10A示出了用于检测不表达胞质FkpA的噬菌体展示文库的Fab的ELISA结果，而10B示出了用于检测表达胞质FkpA的文库的Fab的ELISA结果。测定中所鉴定的阳性克隆以粗体显示。
图11示出了用于检测能够结合靶抗原的λ轻链Fab的噬菌体淘选测定结果。图11A示出了用于检测不表达胞质FkpA的噬菌体展示文库的Fab的ELISA结果，而11B示出了用于检测表达胞质FkpA的文库的Fab的ELISA结果。测定中所鉴定的阳性克隆以粗体显示。
图12示出了用于检测能够结合靶抗原的scFv的噬菌体淘选测定结果。图12A示出了用于检测不表达胞质FkpA的噬菌体展示文库的scFv的ELISA结果，而12B示出了用于检测表达胞质FkpA的文库的scFv的ELISA结果。测定中所鉴定的阳性克隆以粗体显示。
图13示出了来自多个细菌物种的FkpA直系同源物的氨基酸序列比对，所述多个细菌物种具有来自大肠杆菌O6的FkpA的第39-248位残基（SEQ ID NO:1的第39-248位残基）。
图14示出了用于检测能够结合TIE2的λFab和κFab的噬菌体淘选测定结果。ELISA显色后450nm处的吸光度为每个方格中下面的数字，而上面的数字则为成倍高的背景阴性对照（A1和A2）。测定中所鉴定的阳性克隆以粗体显示。孔H12为阳性对照。圆圈代表具有唯一氨基酸序列的克隆。
图15示出了在噬菌体挽救(phage rescue)过程中使用TG1或TG1+cytFkpA细胞进行淘选时所选的唯一克隆的竞争性ELISA结果。将TIE2，100nM（白色条）、10nM（灰色条）或1nM（黑色条）与包含Fab的周质提取物混合。ELISA显色后，将各TIE2浓度下450nm处的吸光度与未向周质提取物添加TIE2时450nm处的吸光度进行比较，并表示为比率。
图16示出了κ和λFab在表达胞质FkpA的TG1细胞或TG1细胞中产生的噬菌体上的相对展示结果。在辅助噬菌体感染后8(K8,L8)和25(K25,L25)小时采集样本。在感染后25小时，分别相对于TG1细胞中的κ或λ文库挽救显示值。
图17A为在大肠杆菌周质中（参见实施例1）表达ING1（抗EpCAM）Fab的噬菌粒载体的示意图，该载体经过修饰以将编码M13噬菌体pIII蛋白的基因片段替换为胞质表达的伴侣cytFkpA（不具有其天然信号序列的FkpA），从而得到表达ING1Fab和胞质FkpA的三顺反子质粒。图17B为用抗FLAG抗体显色的Western印迹（还原），以用于检测来自图17A中所述三顺反子Fab载体的Fkp(-)（在TG1细胞中表达）。图17C和17D示出了通过表达ELISA和靶标ELISA评估的大肠杆菌周质中ING1Fab的总量和功能量。这些结果显示，cytFkpA共表达时总Fab水平（图17C）和EpCAM结合（图17D）的表达均取得实质性改善。
图18A和18B示出了基于标准曲线估算的周质ING1Fab产量的SPR传感图（图18A）和图表（图18B）。在大肠杆菌胞质中共表达cytFkpA时，ING1Fab的总产量(14.2μg/ml)显著增加。图18C示出了结合到抗原EpCAM的活性ING1Fab的量及其比活性，如实施例1中所述而计算。cytFkpA的共表达增加了功能ING1Fab的量。其比活性保持不变。
图19A和19B示出了使用在具有或不具有胞质FkpA的情况下表达ING1Fab的渗漏大肠杆菌菌株CY15070的实验结果。分别通过表达ELISA和靶标ELISA评估了周质中表达的ING1Fab的总量（图19A）和结合ING1靶抗原EpCAM的活性ING1Fab的量（图19B）。在表达ELISA中，将抗κ包被的抗体用于检测Fab轻链。然后通过识别CH1的C端上的V5标签的抗体检测了Fab重链。
具体实施方式
本公开涉及可用于提高原核细胞（例如，大肠杆菌细胞）中异源表达蛋白（例如，抗体）的产量的方法和材料。本公开中的方法和材料涉及以下发现：表达不连接到功能信号序列的FkpA和/或Skp使得FkpA和/或Skp位于原核宿主细胞的胞质中导致分泌到周质的可溶性、正确折叠的功能异源蛋白的产量显著提高。本发明的一个优势方面在于：噬菌体展示程序可通过在本公开所提供的宿主细胞中产生的噬菌体更高效地执行。例如，使用这些宿主细胞更可能发现具有所需抗原结合性质的罕见抗体，因为在噬菌体外壳上展示的异源蛋白更可能正确折叠且发挥功能。
A.定义
如本文所使用，为“抗原特异性的”、对抗原为“特异性的”或与抗原“免疫反应性的”“特异性结合”的抗体是指以比与相似序列无关的其他抗原更高的亲和力结合某一抗原的抗体，优选地高至少103、104、105或106的亲和力。在一个方面，本发明的抗体、其片段、变体或衍生物将以与其对其他（即，非人）物种的相似抗原的结合亲和力相比更高的亲和力结合到人抗原，但是设想了识别和结合直系同源物的抗体。
例如，对其同源抗原为“特异性的”抗体或其片段表示：该抗体的可变区以可检测的偏好识别并结合所需的抗原（例如，在所需的抗原为多肽的情况下，抗体的可变区能够凭借结合亲和力的可测量差异而区分抗原多肽与同一家族的其他已知多肽，尽管在家族成员之间可能存在局部序列同一性、同源性或相似性）。应当理解，特定的抗体还可通过与抗体可变区之外并且具体地讲在分子的恒定区中的序列的相互作用而与其他蛋白质（例如，金黄色葡萄球菌(S.aureus)蛋白A或ELISA技术中的其他抗体）发生相互作用。用在本发明方法中的测定抗体结合特异性的筛选测定是熟知的并在本领域中常规进行。对于此类测定的详尽论述，参见Harlow等(编著),Antibodies:A Laboratory Manual;Cold Spring Harbor Laboratory;Cold Spring Harbor,NY(1988),第6章。用于本发明的抗体可使用本领域已知的任何方法产生并将在本文更详细地描述。
术语“表位”是指能够在抗原结合区中的一个或多个被选择性结合剂识别和结合的任何分子的部分。表位通常由分子的化学活性表面基团（诸如氨基酸或碳水化合物侧链）组成，并具有特定的三维结构特性以及特定的电荷特性。如本文所用的表位可以是连续的或非连续的。
术语“衍生物”当结合多肽（例如，所关注的蛋白质、抗体或其抗原结合片段）使用时是指通过诸如以下技术进行了化学修饰的多肽：泛素化、偶联到治疗剂或诊断剂、标记（例如，用放射性核素或各种酶）、诸如聚乙二醇化（通过聚乙二醇衍生化）的共价聚合物连接，以及通过诸如鸟氨酸（通常不存在于人蛋白质中）的氨基酸的化学合成而插入或置换。衍生物保持本发明的未衍生化分子的结合性质。
“可检测部分”或“标记”是指可通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学或化学手段检测的组合物。例如，有用的标记包括32P、35S、荧光染料、高电子密度试剂、酶（例如，如常用于ELISA中的）、生物素-链霉亲和素、地高辛、半抗原以及可获得其抗血清或单克隆抗体的蛋白质，或具有与另一标记的核酸分子互补的序列的核酸分子。可检测部分通常生成可用于对样本中结合的可检测部分的量进行定量的可测量信号，诸如放射性、发色或荧光信号。
术语“宿主细胞”应被理解为不仅指一个或多个特定的受试者细胞还指代其子代。还应当理解，在培养期间，天然或偶然的突变可在后代中发生，并因此这种子代可能不与亲本细胞完全相同，但是仍包括在如本文所用的术语的范围内。
术语“可操作地连接”是指两个或更多个多核苷酸（例如，DNA）片段之间的功能关系。通常，它是指调节控制序列（例如，转录调控序列）与转录的序列的功能关系。例如，启动子/增强子序列（包括顺式作用的转录控制元件的任何组合）在以下情况中则为可操作地连接到编码序列：如果其刺激或调节编码序列在合适宿主细胞或其他表达系统中的转录。通常，可操作地连接到转录序列的启动子转录调控序列与转录序列在物理上连续，即，它们为顺式作用的。然而，一些转录调控序列诸如增强子不需要与它们增强转录的编码序列在物理上连续或在位置上紧邻。多聚接头提供用于插入编码序列的便利位置，因而基因可操作地连接到启动子。多聚接头是包含一系列三个或更多个密集的限制性内切酶识别序列的多核苷酸序列。
术语“信号序列”是指编码存在于通常由细胞导出到非胞质位置（例如，分泌）或为膜组分的某些蛋白质的NH2端的短氨基酸序列（即，信号肽）的多核苷酸序列。“功能信号序列”能够指导蛋白质从胞质转运到非胞质位置，诸如周质。
如本文所用，术语“不连接到功能信号序列”涵盖其中移除了天然信号序列或对天然信号序列进行了修饰（例如，突变或截短）而不具有指导蛋白质从胞质转运到非胞质位置的功能并且不连接到非天然功能信号序列的多肽。因此，该术语涵盖其中多肽由其中一个或多个编码信号序列的密码子已被移除或发生了突变的多核苷酸以及从头合成的多核苷酸编码的实施方案，使得不并入编码信号序列的一个或多个密码子。
术语“功能片段”在关于多肽使用时意指被截短（即，从N端或C端失去一个或多个氨基酸）并保持所需活性的多肽。当关于FkpA或Skp使用时，“功能片段”意指保持增加功能异源蛋白产量的能力的片段。该术语可相似地应用于被截短的多核苷酸。
术语“变体”当关于多肽使用时意指具有相对于亲本多肽的一个或多个置换、缺失或插入的多肽。在一些情况下，变体为保持所需活性的变体。当结合FkpA或Skp使用时，“功能变体”意指保持增加功能异源蛋白产量的能力的变体。该术语可相似地应用于具有相对于亲本多核苷酸的一个或多个置换、缺失或插入的多核苷酸。
如本文所用，术语“保守氨基酸置换”是将一个氨基酸替换为具有相似性质（例如大小、电荷、疏水性、亲水性和/或芳香性）的另一个氨基酸，并包括如下所示的交
共有共同侧链性质的氨基酸残基通常如下分组。
(1)疏水性：正亮氨酸、met、ala、val、leu、ile；
(2)中性亲水性：cys、ser、thr；
(3)酸性：asp、glu；
(4)碱性：asn、gln、his、lys、arg；
(5)影响链取向的残基：gly、pro；以及
(6)芳族：trp、tyr、phe。
B.FkpA
FkpA(SEQ ID NO:1)以270个氨基酸的蛋白质表达。第1-25位氨基酸残基用作在指导FkpA分泌进周质后进行裂解的信号序列，从而产生245个氨基酸的成熟蛋白。该成熟蛋白序列如SEQ ID NO:3所示并对应于SEQ ID NO:1的第26至270位氨基酸。伴侣活性位于第26-140位氨基酸残基，而肽基脯氨酰异构酶活性位于第141-270位氨基酸残基。
在示例实施方案中，本公开的原核宿主细胞包含编码不连接到功能信号序列的FkpA或保持增加功能异源蛋白产量的能力的FkpA的功能片段或功能变体的多核苷酸。在一些或任何实施方案中，功能片段包括SEQ ID NO:1的第26-270位氨基酸或其保持增加功能异源蛋白产量的能力的片段。在一些或任何实施方案中，功能变体包含保持增加功能异源蛋白产量的能力的与SEQ ID NO:1的第26-270位残基的至少50个氨基酸具有至少75%、80%、85%、90%或95%同一性的氨基酸序列。
在一些或任何实施方案中，功能片段包括SEQ ID NO:1的第26至140位氨基酸残基、伴侣结构域或其保持增加功能异源蛋白产量的能力的片段，例如SEQ IDNO:1的第40至140位残基。在示例实施方案中，该片段的长度为至少约50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105或更多个氨基酸。在一些或任何实施方案中，功能变体包含保持增加功能异源蛋白产量的能力的与SEQ ID NO:1的第26-140或40-140位残基的至少50个氨基酸具有至少75%、80%、85%、90%或95%同一性的氨基酸序列。伴侣结构域的此类功能片段和功能变体在本文称为“伴侣结构域片段”。
在一些或任何实施方案中，功能片段包括FkpA的肽基脯氨酰异构酶结构域（即，SEQ ID NO:1的第141至270位氨基酸残基）或其保持增加功能异源蛋白产量的能力的片段，例如，SEQ ID NO:1的第141至249位残基。在示例实施方案中，该片段的长度为至少约50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105或更多个氨基酸。在一些或任何实施方案中，功能变体包含保持增加功能异源蛋白产量的能力的与SEQ ID NO:1的第141-270或141-249位残基的至少50个氨基酸具有至少75%、80%、85%、90%或95%同一性的氨基酸序列。肽基脯氨酰异构酶结构域的此类功能片段和功能变体在本文称为“肽基脯氨酰异构酶结构域片段”。
在一些或任何实施方案中，FkpA为来自不同细菌物种的SEQ ID NO:1的直系同源物。实例包括阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)（Swiss-Prot登录号CBK86063）、坂崎氏肠肝菌(Cronobacter sakazakii)（Swiss-Prot登录号YP001440409）、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)（Swiss-Prot登录号YP002921574）、克氏柠檬酸杆菌(Citrobacter koseri)（Swiss-Prot登录号YP001456234）、弗氏志贺菌(Shigella flexneri)（Swiss-Prot登录号NP709121）、鲍氏志贺菌(Shigella boydii)（Swiss-Prot登录号YP001882020）、痢疾志贺菌(Shigelladysenteriae)（Swiss-Prot登录号YP404977）、阿尔伯蒂埃希氏杆菌(Escherichiaalbertii)（Swiss-Prot登录号ZP02904021）、弗格森埃希氏菌(Escherichia fergusonii)（Swiss-Prot登录号YP002384399）、鼠柠檬酸杆菌(Citrobacter rodentium)（Swiss-Prot登录号YP003367879）、克氏耶尔森氏菌(Yersinia kristensenii)（Swiss-Prot登录号ZP04624699）、塔斯曼尼亚欧文氏菌(Erwinia tasmaniensis)（Swiss-Prot登录号YP001909086）、Erwinia billingiae（Swiss-Prot登录号YP003743520）、迟钝爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)（Swiss-Prot登录号YP003297282）、Sodalis glossinidius（Swiss-Prot登录号YP455971）、肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)（Swiss-Prot登录号NP462357）和气味沙雷氏菌(Serratiaodorifera)（Swiss-Prot登录号ZP06192651）。
上述FkpA直系同源物的序列比对在图13中提供。得自序列比对的信息可用于生成如上定义的FkpA的功能变体和功能片段变体。使氨基酸缺失和突变的技术在本领域是熟知的。参见Ausubel,F.M.等,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley和Sons,(1998)，包括在整个2011年中的所有增刊。一般来讲，为了构建功能变体，可在物种之间不同的位置处引入非保守或保守置换或缺失，因为这些位置往往允许非保守置换同时保持功能。对于具有在物种之间保守的氨基酸残基的位置，或者保留该残基或者引入保守置换。根据本文所公开的方法测试FkpA变体增加功能异源蛋白产量的能力。
C.Skp
Skp(SEQ ID NO:2)以161个氨基酸的蛋白质表达。第1-20位氨基酸残基用作在指导Skp分泌进周质后进行裂解的信号序列，从而产生用作同三聚体的141个氨基酸的成熟蛋白。该成熟蛋白序列如SEQ ID NO:4所示并对应于SEQ ID NO:2的第21至161位氨基酸残基。
在示例实施方案中，本公开的原核宿主细胞包含编码不连接到功能信号序列的Skp或保持增加功能异源蛋白产量的能力的Skp的功能片段或功能变体的多核苷酸。在一些或任何实施方案中，功能片段包括SEQ ID NO:2的第21至161位氨基酸或其保持增加功能异源蛋白产量的能力的片段。在示例实施方案中，该片段的长度为至少约50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130或更多个氨基酸。在一些或任何实施方案中，功能变体包含保持增加功能异源蛋白产量的能力的与SEQ ID NO:2的第21-161位残基的至少50个氨基酸具有至少75%、80%、85%、90%或95%同一性的氨基酸序列。
在一些或任何实施方案中，Skp为来自不同细菌物种的SEQ ID NO:2的直系同源物。
来自不同细菌物种的Skp直系同源物的序列比对可用于生成如上所定义的Skp的功能变体。Skp的功能变体以与FkpA所述相同的一般方式生成。根据本文所公开的方法测试Skp变体增加功能异源蛋白产量的能力。
D.宿主细胞
在一些或任何实施方案中，宿主细胞为原核细胞。适用于此目的的原核细胞包括真细菌，诸如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体，例如肠杆菌科(Enterobacteriaceae)，诸如埃希杆菌属(Escherichia)，（例如大肠杆菌）、肠杆菌属(Enterobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、克雷伯氏杆菌属(Klebsiella)、变形杆菌属(Proteus)、沙门氏菌属(Salmonella)（例如鼠伤寒沙门菌(S.typhimurium)）、沙雷氏菌属(Serratia)（例如粘质沙雷氏菌(S.marcescans)）和志贺氏菌属(Shigella)，以及杆菌(Bacilli)，诸如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)（例如，在1989年4月12日公布的DD266,710中所公开的地衣芽孢杆菌41P）、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)、短芽孢杆菌(B.brevi)；假单胞菌属(Pseudomonas)，诸如铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)和荧光假单胞菌(P.fluorescens)；罗尔斯通菌属(Ralstonia)，例如富养罗尔斯通氏菌(R.eutropha)；葡萄球菌属(Staphylococcus)，例如肉葡萄球菌(S.carnosus)；以及链霉菌属(Streptomyces)。一种优选的大肠杆菌克隆宿主为大肠杆菌294(ATCC31,446)，但是诸如大肠杆菌B、大肠杆菌X1776(ATCC31,537)和大肠杆菌W3110(ATCC27,325)的其他菌株也是合适的。另一种优选的大肠杆菌宿主细胞为“渗漏”菌株CY15070(Paluh等,Nucl.Acids Res.24;14(20):7851-60(1986);(ATCC#47022))。这些实例为示例性的而非限制性的。“渗漏表型”的宿主细胞是指具有允许周质组分释放进细胞外培养基的改变的细胞被膜的细胞。细胞外重组蛋白产生具有若干潜在优势，包括简化纯化、避免蛋白酶攻击以及最大程度降低因周质间隙中重组蛋白的高水平集聚而对宿主细胞造成的有害影响。导致“渗漏”表型的许多突变（天然发生的或工程改造的）在本领域是已知的(Ni和Chen,Biotechnol.Lett.31:1661-70(2009))。例如，编码胞壁质脂蛋白(Braun’s lipoprotein)的lpp基因的突变或缺失已证实可显著增加大肠杆菌外膜的渗透性(Ni等,Biotech.and Bioeng.97(6):1347-56(2007))。
E.所关注的异源蛋白
1.易于错误折叠和/或聚集的异源蛋白
在示例实施方案中，异源蛋白在不存在FkpA和Skp（或其他伴侣）的情况下与错误折叠或缓慢折叠速率相关。异源蛋白（诸如哺乳动物蛋白，例如，抗体）在原核细胞中以低水平表达或聚集成包涵体是一种普遍的现象。此类异源蛋白包括：生长因子（例如表皮生长因子、胰岛素样生长因子1）；凝血因子（例如抗血友病因子）；激素（例如胰岛素、胰高血糖素、生长激素、促生长素、促红细胞生成素）；细胞因子（例如，干扰素、白细胞介素、粒细胞集落刺激因子、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、CD86）；趋化因子（例如，CCL3）；受体（例如，趋化因子受体、酪氨酸激酶受体）；酶（例如，蛋白酶、脂肪酶、碳水化物酶、凝乳酶、DNA酶、尿激酶原、精氨酸脱氨酶、胞嘧啶脱氨酶、L-天冬酰胺酶）；酶激活剂（例如，组织型纤溶酶原激活剂）；酶抑制剂（例如，金属蛋白酶的组织抑制剂）；肽（例如，水蛭素、神经调节素1片段）；抗体片段（例如，Fab片段）；蛋白骨架（例如Adnectin、亲和体、抗运载蛋白、DARPin、工程改造的Kunitz型抑制剂、四连接素、A结构域蛋白、脂质运载蛋白、重复蛋白（诸如锚蛋白重复蛋蛋白）、免疫蛋白、α2p8肽、昆虫防御素A、PDZ结构域、卡律蝎毒素、PHD指蛋白、TEM-1β-内酰胺酶、纤连蛋白III型结构域、CTLA-4、T细胞受体、打结素、新抑癌蛋白、碳水化合物结合模块4-2、绿荧光蛋白、硫氧还蛋白）；疫苗（例如流感疫苗、诸如rPA疫苗的炭疽菌苗、诸如ORF2疫苗的戊型肝炎病毒疫苗、人乳头瘤病毒疫苗）；毒素和免疫毒素(Misawa和Kumagai,Biopolymers51:297-307(1999);Zhang等,Protein Expr.Purif.25(1):105-13(2002);Demain,Trends in Biotech.18(1):26-31(2000);Gebauer和Skerra,Curr.Opin.Chem.Biol.13:245-55(2009);Gill和Damle,Curr.Opin.Biotech17:653-58(2006);Hosse等,Protein Sci.15:14-27(2006);Skerra,Curr.Opin.Biotech18:295-3-4(2007);Song等,PLoS ONE3(5):e2257(2008);Vahedi等,Applied Biochem.and Biotech.157(3):554-61(2009);Hakim和Benhar,MAbs.1(3):281–87(2009))。异源蛋白的结构域或片段也将受益于本发明。
可容易地筛选将会受益于本发明的异源蛋白。例如，所关注的异源蛋白可在应激反应性启动子控制下也表达报告基因（诸如LacZ）的原核细胞中表达。应激反应性启动子将响应错误折叠的蛋白聚集体的集聚。合适的应激反应性启动子包括但不限于得自大肠杆菌的ibpAB、ybeD、yhgI和yrfGHI基因的启动子。参见Lesley等,Protein Eng,15(2):153-60(2002)。此外，将会受益于本发明的异源蛋白可仅用蛋白质的氨基酸组成作为预测基础而鉴定，因为诸如电荷平均值和转角形成残基分数(turn-forming residue fraction)的参数已表明与大肠杆菌中的包涵体形成相关(Wilkinson和Harrison,Nat.Biotech.9,443-448(1991))。
2.需要顺反异构化的异源蛋白
蛋白质中的大部分脯氨酸残基极大地促进形成反式构象。然而，一些蛋白质需要顺式构象才能发挥功能，并且肽基脯氨酰顺反异构酶催化这种转化。一些重要的脯氨酰异构酶天然底物现在是已知的，例如，1型人免疫缺陷病毒病毒粒子的Gag多肽、类固醇受体和细胞内钙释放通道，从而证实了在活细胞中多种多样的脯氨酰异构酶功能(
Figure BDA0000392443860000141
等,Cell.Mol.Life Sci.55(3):423-36(1999)。因此，在示例实施方案中，异源蛋白对于正确的折叠和/或功能为脯氨酸异构化依赖性的。在一个实施方案中，脯氨酸异构化依赖性异源蛋白包含含有可变轻(κ)链(Vκ)的抗体或抗体片段。
3.抗体和抗体片段
在示例实施方案中，异源蛋白为抗体。术语“抗体”以其最广泛的含义使用并包括完全组装的抗体、四聚抗体、单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体（例如，双特异性抗体）、可结合抗原的抗体片段（例如，Fab’、F’(ab)2、Fv、单链抗体、双体）以及包含前述抗体的重组抗体，只要它们表现出所需的生物活性即可。“免疫球蛋白”或“四聚抗体”是由两条重链和两条轻链（均包含可变区和恒定区）组成的四聚糖蛋白。抗原结合部分可通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶促或化学裂解而产生。抗体片段或抗原结合部分包括：Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、结构域抗体(dAb)、FcabTM、互补决定区(CDR)片段、单链抗体(scFv)、单链抗体片段、仅含由骨架区连接的两个CDR的抗体分子（例如，VHCDR1-VHFR2-VLCDR3融合肽）、嵌合抗体、双体、三体、四体、微型抗体(minibody)、线性抗体、螯合重组抗体、三体或双体、胞内抗体、纳米抗体、小模块免疫药物(SMIP)、抗原结合结构域免疫球蛋白融合蛋白、骆驼化抗体、含VHH的抗体或者其变体或衍生物，以及含有足以赋予与多肽发生特异性抗原结合的免疫球蛋白至少一部分（诸如一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR序列）的多肽，只要抗体保持所需的生物活性即可。
在天然存在的免疫球蛋白中，各四聚体由两对相同的多肽链组成，每一对具有一条“轻”链（约25kDa）和一条“重”链（约50-70kDa）。每条链的氨基末端部分包含主要负责抗原识别的约100至110或更多个氨基酸的可变区。每条链的羧基末端部分限定主要负责效应功能的恒定区。人轻链被分类为kappa(κ)和lambda(λ)轻链。重链被分类为mu(μ)、delta(Δ)、gamma(γ)、alpha(α)和epsilon(ε)，并分别将抗体同种型限定为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在轻链和重链内，可变区和恒定区通过约12或更多个氨基酸的“J”区连接，其中重链还包含约10个或更多个氨基酸的“D”区。一般可参见Fundamental Immunology，第7章(Paul,W.,编著，第2版，Raven Press,N.Y.(1989))（整体以引用方式并入以用于所有目的）。每个轻链/重链对的可变区形成抗体结合位点，使得完整的免疫球蛋白具有两个结合位点。
每条重链在一个末端具有一个可变结构域(VH)然后是多个恒定结构域。每条轻链在一个末端具有可变结构域(VL)和在其另一末端具有恒定结构域；轻链的恒定结构域与重链的第一恒定结构域对齐，并且轻链可变结构域与重链的可变结构域对齐。据信，特定的氨基酸残基在轻链与重链可变结构域之间形成界面(Chothia等，J.Mol.Biol.196:901-917,1987)。
免疫球蛋白可变结构域表现出与通过三个高变区或CDR连接的相对保守的骨架区(FR)相同的一般结构。从N端到C端，轻链和重链均包含FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4结构域。氨基酸向各结构域的分配根据Kabat Sequencesof Proteins of Immunological Interest(National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1987和1991))或Chothia与Lesk(J.Mol.Biol.196:901-917,1987)、Chothia等(Nature342:878-883,1989)的定义进行。
抗体的高变区是指负责抗原结合的抗体的CDR氨基酸残基。高变区包含来自CDR的氨基酸残基（轻链可变结构域中的残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)以及重链可变结构域中的31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)，如Kabat等,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991)所述）和/或来自高变环的那些残基（轻链可变结构域中的残基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)以及重链可变结构域中的26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)，如Chothia等，J.Mol.Biol.196:901-917(1987)所述）。
骨架或FR残基是那些非高变区残基的可变结构域残基。
如本文所用的“重链可变区”是指包含所述抗体重链可变结构域的至少一个互补决定区(CDR)的抗体分子的区域。重链可变区可包含所述抗体重链的一个、两个或三个CDR。
如本文所用的“轻链可变区”是指包含所述抗体轻链可变结构域的至少一个互补决定区(CDR)的抗体分子区域。轻链可变区可包含所述抗体轻链的一个、两个或三个CDR，所述轻链取决于抗体可以为κ或λ轻链。
具有κ轻链可变区(Vκ)的抗体或抗体片段特别适合本文所述的方法和材料。Vκ结构域具有顺式脯氨酸（按Kabat编号的L8和L95）。此外，Pro-L95之前的肽键的缓慢异构化是重要的，因为其必须为顺式的用于形成天然VH/VL界面。事实上，Pro-L95的顺反异构化是VL和VH的正确对接的限速步骤。无正确的肽基-脯氨酰异构化可驱动形成会促进聚集的关闭通路(off-pathway)折叠中间体。
取决于其重链的恒定结构域的氨基酸序列，可将免疫球蛋白分配到不同的种类：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，它们可进一步分成亚类或同种型，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。免疫球蛋白的不同类的亚基结构和三维构型是熟知的。不同的同种型具有不同的效应功能；例如，IgG1和IgG3同种型具有ADCC活性。本发明的抗体如果包含恒定结构域则可以具有这些亚类或同种型的任何一种，或其变体或共有序列，或不同同种型的杂交体（例如，IgG1/IgG2杂交体）。
在一个示例性实施方案中，本发明的抗体可包含人kappa(κ)或人lambda(λ)轻链或由其衍生的氨基酸序列或其杂交体，任选地与人重链或从其衍生的序列一起，或在单条链中一起的重链和轻链，二聚，四聚（例如，两条重链和两条轻链）或其他形式。
“单克隆抗体”是指得自一群基本上均匀的抗体的抗体，即，除了可以微量存在的可能天然发生的突变外，构成该群的单个抗体是相同的。
如本文所用的“抗体变体”是指在天然抗体可变区结构域的可变区中包含至少一个氨基酸置换、缺失或插入的抗体多肽序列。变体可与未修饰的抗体基本上同源或基本上相同。
如本文所用的“嵌合抗体”是指包含衍生自通常源于不同物种的两个不同抗体（参见例如，美国专利号4,816,567）的序列的抗体。最通常的是，嵌合抗体包含人和啮齿类动物抗体片段，一般为人恒定区和鼠可变区。
“中和抗体”是能够消除或显著减弱其结合到的抗原的生物功能的抗体分子。因此，“中和”抗体能够消除或显著减弱生物功能，诸如酶活性、配体结合或细胞内信号转导。
“分离的”抗体是已鉴定并从其天然环境的组成部分中分离和回收的抗体。其天然环境的污染组分为将会干扰抗体的诊断或治疗用途的物质，并可以包括酶、激素和其他蛋白质类或非蛋白质类溶质。在一些实施方案中，将抗体纯化例如(1)达到高于95重量%的抗体（如通过Lowry方法测定），并且优选地高于99重量%，(2)达到足以通过使用自旋杯测序仪(spinning cup sequenator)获得N端的至少15个残基或内部氨基酸序列的程度，或(3)达到使用考马斯亮蓝或银染在还原或非还原条件下通过SDS-PAGE确定的均一性。分离的抗体包括在重组细胞内的原位抗体，因为所述抗体的天然环境的至少一个组成部分将不存在。然而，通常的是，分离的抗体将通过至少一个纯化步骤制备。
F.载体
本发明的载体通常包含调节控制序列，例如，表达外源多肽所必需的转录或翻译控制序列。合适的调节控制序列包括但不限于复制起点、启动子、增强子、阻遏蛋白结合区、转录起始位点、核糖体结合位点、翻译起始位点以及转录和翻译终止位点。
在一些或任何实施方案中，编码不连接到功能信号序列的FkpA和不连接到功能信号序列的Skp的多核苷酸存在于相同的载体上。在一些实施方案中，当存在于相同的载体上时，多核苷酸的布置使得它们形成操纵子，即，多核苷酸的转录将生成多顺反子信使RNA。在一些或任何实施方案中，编码不连接到功能信号序列的FkpA和/或不连接到功能信号序列的Skp的多核苷酸以及编码连接到功能信号序列的异源蛋白的多核苷酸存在于相同的载体上。在一些实施方案中，当存在于相同的载体上时，编码胞质FkpA和/或Skp的多核苷酸以及编码异源蛋白的多核苷酸的布置使得它们形成操纵子。在一些实施方案中，编码胞质FkpA的多核苷酸、编码可变区轻链的多核苷酸以及编码可变区重链的多核苷酸可操作地连接到相同的调节序列（即，它们形成操纵子）。如本领域技术人员将认识到，各编码FkpA和Skp的多核苷酸将具有允许在宿主细胞中适当表达的合适调节控制序列。
1.复制起点
复制起点（通常称为ori序列）允许载体在合适的宿主细胞中复制。ori的选择将取决于所采用的宿主细胞的类型。在宿主细胞为原核细胞的情况中，表达通载体常包含在原核细胞内指导载体自主复制的ori。这一类ori的非限制性实例包括pMB1、pUC以及其他细菌起点。
2.信号序列
在一些或任何实施方案中，宿主细胞包含用于重组制备的编码异源蛋白的多核苷酸，其中异源蛋白连接到功能信号序列。在细菌细胞中指导融合多肽的周质分泌的信号序列包括衍生自spA、phoA、核糖结合蛋白、pelB、ompA、ompT、dsbA、torA、torT和tolT的那些(de Marco,Microbial Cell Factories,8:26(2009))。在美国专利号5,846,818和5,576,195中所公开的pelB信号序列整体以引用方式并入。
还包括在本发明范围内的是也在原核宿主细胞（例如，大肠杆菌）中用作信号序列的衍生自真核细胞的信号序列。此类序列在美国专利号7,094,579中有所公开，该专利的内容整体以引用方式并入。
Watson(Nucleic Acids Research12:5145-5164(1984))公开了信号序列的编译。美国专利号4,963,495公开了成熟真核蛋白在宿主生物体的周质间隙中的表达和分泌，其中使用原核分泌信号序列DNA，该DNA在其3'端连接到编码所述成熟蛋白的DNA的5'端。Chang等(Gene55:189-196(1987))公开了使用STII信号序列在大肠杆菌中分泌hGH。Gray等(Gene39:247-245(1985))公开了使用人生长激素的天然信号序列以及使用大肠杆菌碱性磷酸酶启动子和信号序列在大肠杆菌中分泌人生长激素。Wong等(Gene,68:193-203(1988))公开了融合到LamB和OmpF分泌前导序列的胰岛素样生长因子1(IGF-1)在大肠杆菌中的分泌，并且在存在prlA4突变的情况下这些信号序列的加工效率增加。Fujimoto等(J.Biotech.8:77-86(1988))公开了使用四个不同的大肠杆菌肠毒素信号序列STI、STII、LT-A和LT-B在大肠杆菌中分泌人表皮生长因子(hEGF)。Denefle等(Gene85:499-510(1989))公开了使用OmpA和PhoA信号肽分泌成熟的人白介素1β。所有上述文献的内容整体以引用方式并入。
3.选择性标记
除了上述元件外，载体还可以包含选择性标记（例如，编码用载体转染的宿主细胞的存活或生长所必需的蛋白质的基因），但是这样的标记基因可携带在共同引入宿主细胞中的另一个多核苷酸序列上。只有那些已向其中引入了选择性基因的宿主细胞才会在选择性条件下存活和/或生长。典型的选择基因编码(a)赋予抗生素或其他毒素（例如，氨苄青霉素、卡那霉素、新霉素、G418、甲氨蝶呤等）抗性；(b)补充营养缺陷型缺乏；或(c)提供不能从复杂培养基中获得的关键营养物的蛋白质。选择适当的选择性标记基因将取决于宿主细胞，并且不同宿主的合适基因是本领域已知的。
本发明所涵盖的载体可使用重组克隆方法和/或通过化学合成获得。大量的重组克隆技术诸如PCR、限制性内切酶消化和连接在本领域是熟知的。本领域的技术人员还可以使用本文提供的或在公共或专有数据库中的序列数据通过本领域可用的任何合成手段获得所需的载体。另外，使用熟知的限制性和连接技术，可将合适的序列从各种DNA来源切割并以可操作的关系与待根据本发明表达的外源序列整合。
G.噬菌体展示
本公开的材料和方法还可用于噬菌体展示技术。如本文所述表达胞质FkpA和/或Skp及其功能片段和功能变体的大肠杆菌细胞增强噬菌体展示的效率，从而导致鉴定出罕见克隆。在一些实施方案中，本公开的原核宿主细胞（例如，大肠杆菌细胞）用于筛选噬菌体展示文库。
噬菌体展示文库（包括由噬菌粒载体构建的文库）的构建利用细菌噬菌体在其表面上即在其衣壳上展示肽和蛋白质的能力。通常，使用诸如M13、f1或fd的丝状噬菌体。丝状噬菌体包含由主要和次要外壳蛋白例如pIII的多个拷贝围绕的单链DNA。所关注的蛋白质可融合到外壳蛋白例如pIII的片段。包含编码pIII片段的序列的噬菌粒载体可与辅助噬菌体一起用于构建噬菌体展示文库。外壳蛋白在衣壳的外表面上展示。将插入具有衣壳蛋白基因的框内的DNA序列共转录，以生成在噬菌体表面上展示的融合蛋白或蛋白质片段。肽噬菌体文库因此可展示代表所插入的基因组序列的多样性的肽。值得注意地，这些表位可以天然的折叠构象展示。在噬菌体展示文库上表达的肽然后可结合靶分子，即，它们可与结合伴侣分子诸如抗体(Petersen Mol.Gen.Genet.249:425-31(1995))、细胞表面受体(Kay,Gene128:59-65)(1993)以及细胞外和细胞内蛋白质(Gram,J.Immunol.Methods161:169-76(1993))发生特异性相互作用。
使用诸如M13、fd或fl的丝状噬菌体在噬菌体衣壳表面上展示肽的概念最早由Smith,Science228:1315-1317(1985)提出。肽已在噬菌体表面上展示以鉴定许多潜在的配体（参见例如，Cwirla,Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:6378-6382(1990)）。存在许多在科学和专利文献中描述的用于生成噬菌体展示文库的系统和方法（参见例如，Sambrook和Russell,Molecule Cloning:A Laboratory Manual,第3版,ColdSpring Harbor Laboratory Press,第18章,2001;"Phage Display of Peptides andProteins:A Laboratory Manual,Academic Press,San Diego,1996;Crameri,Eur.J.Biochem.226:53-58(1994);de Kruif,Proc.Natl.Acad.Sci.USA92:3938-42(1995);McGregor,Mol.Biotechnol.6:155-162(1996);Jacobsson,Biotechniques,20:1070-1076(1996);Jespers Gene173:179-181(1996);Jacobsson,Microbiol Res.152:121-128(1997);Fack,J.Immunol.Methods206:43-52(1997);Rossenu,J.ProteinChem.16:499-503(1997);Katz,Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct.26:27-45(1997);Rader,Curr.Opin.Biotechnol.8:503-508(1997);Griffiths,Curr.Opin.Biotechnol.9:102-108(1998))。
通常，将编码待展示的肽或蛋白质的外源核酸插入外壳蛋白基因，例如噬菌体的基因III或基因VIII。所得的融合蛋白可展示在衣壳的表面上。蛋白VIII以大约每个噬菌体2700个拷贝存在，相比之下，蛋白III为3至5个拷贝。诸如噬菌体或噬菌粒的多价表达载体可用于操纵外源基因组DNA或cDNA并在细菌中产生噬菌体粒子（参见例如，Felici,J.Mol.Biol.222:301-310(1991)）。
噬菌粒载体通常用于构建噬菌体文库。这些载体包括来自单链丝状噬菌体例如M13、f1或fd的基因组的DNA复制起点。噬菌粒可按相同的方式用作传统质粒载体，但也可用于产生含有DNA的克隆片段的单链拷贝的丝状细菌噬菌体粒子。双链T7载体也可使用，其中在成熟噬菌体粒子上的展示产物通过细胞裂解而释放。
抗体或抗体片段（例如，scFv、Fab或Fv）可使用噬菌体展示技术展示在噬菌体的表面上。示例性抗体噬菌体展示方法是本领域的技术人员已知的并例如在Hoogenboom,Overview of Antibody Phage-Display Technology and Its Applications,from Methods in Molecular Biology Antibody Phage Display:Methods and Protocols(2002)178:1-37(O'Brien和Aitken，编辑,Human Press,Totowa,N.J.)中有所描述。例如，抗体或抗体片段（例如，scFv、Fab、dAb、具有工程改造的分子间二硫键以稳定VH-VL对的Fv以及双体）的文库可展示在丝状噬菌体诸如非裂解性丝状噬菌体fd或M13的表面上。然后可选择具有所需结合特异性的抗体或抗体片段。
蛋白支架可使用噬菌体展示技术展示在噬菌体的表面上。示例性蛋白支架文库包括但不限于：Adnectin、亲和体、抗运载蛋白、DARPin、工程改造的Kunitz型抑制剂、四连接素、A结构域蛋白、脂质运载蛋白、重复蛋白（诸如锚蛋白重复蛋白）、免疫蛋白、α2p8肽、昆虫防御素A、PDZ结构域、卡律蝎毒素、PHD指蛋白、TEM-1β-内酰胺酶、纤连蛋白III型结构域、CTLA-4、T细胞受体、打结素、新抑癌蛋白、碳水化合物结合模块4-2、绿荧光蛋白、硫氧还蛋白(Gebauer和Skerra,Curr.Opin.Chem.Biol.13:245-55(2009);Gill和Damle,Curr.Opin.Biotech17:653-58(2006);Hosse等,Protein Sci.15:14-27(2006);Skerra,Curr.Opin.Biotech18:295-3-4(2007))。
H.亲和力成熟
本文所公开的材料和方法还可用于亲和力成熟。根据本发明，大量置换变体可以生成，在多个噬菌体粒子的表面上展示，并通过将噬菌体粒子与靶蛋白接触而针对所需的靶标结合特性加以选择。亲和力成熟通常涉及制备和筛选在亲本多肽的CDR内具有置换的多肽变体（例如，抗体变体）并选择具有改善的生物性质诸如相对于亲本多肽的结合亲和力的变体。用于生成此类置换变体的便利方式是亲和力成熟。简而言之，对多个高变区残基（例如6-7个残基）进行突变，以在每个位点生成所有可能的氨基酸置换。如此生成的抗体变体以单价方式展示在细胞表面上。然后针对它们的生物活性（例如结合亲和力）对细胞表面展示的变体进行筛选。有关亲和力成熟的噬菌体展示方法的实例，参见例如，WO92/01047、WO93/112366、WO95/15388和WO93/19172。
当前的抗体亲和力成熟方法属于两个诱变类别：随机和非随机。易错PCR、致突变菌株(Low等,J.Mol.Biol.260,359-68(1996))和饱和诱变(Nishimiya等,J.Biol.Chem.275:12813-20(2000);Chowdhury,P.S.Methods Mol.Biol.178,269-85(2002))是随机诱变方法的典型实例(Rajpal等,Proc Natl Acad Sci USA.102:8466-71(2005))。非随机技术通常使用丙氨酸扫描或定点诱变以生成有限的特异性变体集合。可用的方法包括：通过淘选方法进行的亲和力成熟、精确突变(look-throughmutagenesis)、易错PCR、基因位点饱和诱变、靶向亲和力成熟(targeted affinitymaturation)和DNA改组(Huls等,Cancer Immunol Immunother.50:163-71(2001);Zaccolo等,J.Mol.Biol.285:775-783(1999);Kretz等,Methods Enzymol.388:3-11(2004);WO2009/088933;Stemmer,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,91:10747-51(1994))。
I.标记
在一些实施方案中，对细胞和/或异源蛋白进行标记以有利于其检测。“标记”或“可检测的部分”是可通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学、化学或其他物理手段检测的组合物。例如，适用于本发明的标记包括放射性标记（例如，32P）、荧光团（例如，荧光素）、高电子密度试剂、酶（例如，如常用于ELISA中的）、生物素、地高辛或半抗原，以及可使得能够被检测（例如通过将放射性标记并入到半抗原或肽中）或用于检测与半抗原或肽特异性反应的抗体的蛋白质。其他抗原样标签诸如FLAG标签、His标签等在本领域是已知的。
适用于本公开的标记的实例包括但不限于荧光染料（例如，、异硫氰酸荧光素、德州红(Texas red)、若丹明等）、放射性标记（例如，3H、125I、35S、14C或32P）、酶（例如，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶以及常用于ELISA的其他酶）和比色标记，诸如胶体金、有色玻璃或塑料珠（例如，聚苯乙烯、聚丙烯、乳胶等）。
标记可根据本领域熟知的方法掺入。
检测标记的手段对本领域的技术人员是熟知的。因此，例如，在标记为放射性标记的情况中，用于检测的手段包括闪烁计数器或感光胶片，如在放射自显影中。在标记为荧光标记的情况中，其可通过用合适波长的光激发荧光物并检测所得的荧光而加以检测。荧光可通过使用诸如电荷耦合器件(CCD)或光电倍增管等电子检测器在视觉上进行检测。相似地，酶标记可通过提供合适的酶底物并检测所得的反应产物而检测。比色或化学发光标记可通过观察与标记相关的颜色而简单地检测。适用于本发明方法的其他标记和检测系统将对本领域的技术人员显而易见。此类标记的异源蛋白可用于疾病或健康状况的诊断。
实施例
实施例1
材料和方法
i.表达FkpA或Skp伴侣的质粒载体的构建
XL1Blue细胞(recA1endA1gyrA96thi-1hsdR17supE44relA1lac[F′proABlacIqZΔM15Tn10(Tetr)])和TG1细胞(supE thi-1Δ(lac-proAB)Δ(mcrB-hsdSM)5(rK-mK–)[F′traD36proAB lacIqZΔM15])购自Stratagene（现Agilent,Santa Clara,CA）。对于伴侣的胞质表达，将天然信号序列从编码伴侣FkpA(SwissProt No.P65764)和Skp(SwissProt No.P0AEU7)的基因中去除。对于伴侣的周质表达，将天然信号序列包括在内。为了生成伴侣Skp、FkpA和双顺反子Skp-FkpA的胞质或周质形式的质粒构建体，将伴侣基因片段通过PCR扩增，然后克隆进质粒载体pAR3(ATCC No.87026)。载体pAR3(Pérez-Pérez等,Gene,1995,158(1):141-2)包含pBAD启动子和赋予氯霉素抗生素抗性的cat基因。它还具有与用于在后续实验中共表达所有Fab或scFv的载体的复制起点pBR322(ColE1)相容的p15A复制起点。首先，设计了两个不同的正向引物，以便与一个反向引物一起在具有或不具有信号序列的情况下通过PCR从XL1Blue细胞扩增FkpA。相似地，设计了两个正向引物和一个反向引物以在具有或不具有信号序列的情况下通过PCR从XL1Blue细胞扩增Skp。
为了生成单顺反子伴侣质粒构建体pAR3-FkpA_per、pAR3-Skp_per（对于周质表达）和pAR3-FkpA_cyt、pAR3-Skp_cyt（对于胞质表达），将之前PCR反应的产物用作使用正向引物的PCR再扩增的模板以并入BglII限制性位点，然后是伴侣编码基因片段上游的增强子序列GAATTCATTAAAGAGGAGAAATTAACT。将反向引物用于将V5标签序列(GGTAAGCCTATCCCTAACCCTCTCCTCGGTCTCGATTCTACG)并入pAR3-Skp_per和pAR3-Skp_cyt以及将FLAG标签序列(GACTACAAGGACGATGACGACAAG)并入pAR3-FkpA_per和pAR3-FkpA_cyt，然后是限制性位点HindIII。
为了生成双顺反子周质pAR3-Skp-FkpA_per和胞质pAR3-Skp-FkpA_cyt构建体，对单顺反子PCR产物进行再扩增。为了扩增Skp，设计了正向引物以并入BglII，然后是增强子GAATTCATTAAAGAGGAGAAATTAACT以及Skp的周质或胞质形式。设计了与整个V5标签以及驱动FkpA翻译起始的优化Shine-Dalgarno(SD)序列退火的反向引物。为了再扩增FkpA，设计了正向引物与V5的C端部分、优化的SD以及FkpA的周质或胞质形式退火。设计了反向引物与FkpA的C端部分、FLAG标签序列退火并添加HindIII限制性位点。然后使用Qiagen凝胶提取试剂盒(Valencia,CA)对Skp和FkpA PCR产物进行了凝胶纯化，并用作使用外部正向Skp引物和外部反向FkpA引物的重叠延伸PCR反应的模板。图1显示了伴侣构建体的示意图。
然后将BglII-HindIII消化的PCR产物与BglII-HindIII消化的pAR3载体的连接物电穿孔进XL1Blue细胞，并通过DNA测序对所得的构建体进行确认。
ii.表达Fab的质粒构建体的构建
将用于此工作的所有Fab和scFv克隆到具有三重6His-cmyc-V5标签、赋予氨苄青霉素抗性的β内酰胺酶基因以及与pAR3载体（伴侣表达载体的主链）的p15A起点相容的pBR322(ColE1)复制起点的噬菌粒载体中。本文使用的代表性κFab为a)XPA23（抗IL1β，人）、b)ING1（抗EpCAM，人），c)83-7（抗人胰岛素受体(huINSR)，鼠），d)CF1（抗TIE-1，人）和BM7-2（激酶靶标特异性的，人）。本文使用的λ胃泌素特异性Fab为a)A10、b)C10、c)D1和d)E6。抗原试剂huINSR、TIE1-Fc和IL1β购自R&D Systems(Minneapolis,MN)。
iii.胞质和周质大肠杆菌提取物的制备
将TG1电穿孔感受态细胞用两个质粒共转化：a)表达单顺反子载体pAR3-FkpA_per、pAR3-Skp_per、pAR3-FkpA_cyt、pAR3-Skp_cyt或双顺反子载体pAR3-Skp-FkpA_per、pAR3-Skp-FkpA_cyt的伴侣与b)Fab表达载体（或用作阴性对照的空质粒pAR3）。
为了制备只表达伴侣的胞质和周质提取物，使具有空pAR3（阴性对照）或者单顺反子或双顺反子伴侣质粒构建体的TG1细胞在37℃下在补充了34μg/ml氯霉素和2%(重量/体积)葡萄糖的2YT生长培养基中生长过夜。然后将它们在37℃下在100ml烧瓶中传代培养，直到OD600达到0.5-0.6。然后将伴侣的表达在30℃下用0.2%阿拉伯糖(重量/体积)诱导过夜。在那时，记录OD600并将培养物归一化到相同的OD600。然后将细胞沉淀，并以1:4的稀释度重悬在10ml冰冷的PPB蔗糖缓冲液(Teknova,Hollister,CA)中。在4℃下孵育1小时后，将样本离心30分钟，然后收集含有周质提取物的上清液。将沉淀重悬在10ml BugbusterTM溶液(Novagen,Gibbstown,NJ)中，并补充10μl benzonase核酸酶(Novagen)以便降低裂解物的粘度以及一片完全、无EDTA蛋白酶的抑制剂混合物(Roche,Idianapolis,IN)。在冰上孵育1小时后，将裂解物在4℃下以16,000g离心20分钟，然后收集含有胞质提取物的上清液。
为了制备表达Fab与伴侣的细胞的周质提取物，使具有Fab和伴侣质粒构建体（或用作阴性对照的仅pAR3）的TG1细胞在37℃下在补充了34μg/ml氯霉素、100μg/ml氨苄青霉素和2%(重量/体积)葡萄糖的2YT生长培养基中生长过夜。然后将它们在37℃下在100ml烧瓶中传代培养，直到OD600达到0.5-0.6。添加0.2%阿拉伯糖(重量/体积)后30分钟，将IPTG加入达到1mM的最终浓度，然后在30℃下孵育过夜。在那时，记录OD600并将培养物归一化到相等的OD600。然后将细胞沉淀，并且按1:4的稀释度重悬在10ml冰冷的PPB蔗糖缓冲液(Teknova)中和一片完全、无EDTA的蛋白酶抑制剂混合物(Roche)。在4℃下孵育1小时后，将样本离心30分钟，然后收集含有周质提取物的上清液。
iv.Western印迹
对于Western印迹分析，将周质和胞质提取物的样本(20μl)重悬在含有0.7Mβ-巯基乙醇的SDS上样缓冲液中，煮沸，然后上样到使用NuPAGE MOPS SDS运行缓冲液(Invitrogen)的NuPAGETM4-12%Bis-Tris预制凝胶(Invitrogen,Carlsbad,CA)。然后将还原凝胶中的蛋白质使用Millipore-SNAP-i.d.TM电转印仪(MilliporeCorp.,Bedford,CA)转移到PVDF膜。将膜用0.5%牛血清白蛋白(BSA)/磷酸盐缓冲盐水(PBS)封闭，然后在室温下与0.5%BSA/PBS中1:2,000稀释度的小鼠抗V5抗体(Sigma,St.Louis,MO)（对于skp检测）或与1:1,000稀释度的小鼠抗FLAG一抗(Sigma)孵育15分钟，然后是1:2,000稀释度的与辣根过氧化物酶(JacksonImmunoresearch,West Grove,PA)偶联的山羊抗小鼠IgG(H+L)。通过1步TMB–印迹底物溶液(Pierce,Thermo Fisher Scientific,Rockford,IL)显色。
v.ELISA
a.靶标ELISA
通过ELISA测定了功能Fab的量。将MaxisorpTM96孔板(Nunc,Rochester,NY)用在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中以50μl/孔稀释（具体参见下文）的3μg/ml或1μg/ml抗原包被。将EpCAM（结合ING-1Fab)）、IL1β（结合XPA23Fab）和TIE1-Fc（结合CF1Fab）以3μg/ml包被。将激酶靶标（结合BM7-2Fab）以2μg/ml包被。将人胰岛素受体(huINSR)（结合83-7Fab）以1μg/ml包被。将生物素化胃泌素（由A10、C10、D1、E6Fab识别的14-mer肽）以在PBS中稀释的1μg/ml包被在Reacti-BindTM链霉亲和素包被的96孔板(Thermo Scientific,Minneapolis,MN)上。将包被的板在4℃下孵育过夜，然后用在PBS缓冲液中的5%脱脂奶粉(Carnation,Nestle,OH)(350μl/孔）封闭（对于链霉亲和素包被的板不需要封闭）。在含有0.05%Tween20的PBS中进行板洗涤。在PBS中的5%脱脂奶粉中对Fab、一抗和二抗进行系列稀释。使稀释后的Fab（50μl/孔）在室温下结合到其封闭抗原，持续1小时。使用1:2,000稀释度的山羊抗人IgG（F(ab’)2特异性的）(JacksonImmunoresearch)一抗然后是1:10,000稀释度的与辣根过氧化物酶(Santa CruzBiotechnology,Santa Cruz,CA)偶联的驴抗山羊IgG(H+L)确认了ING1、XPA23、CF1、BM7-2、A10、C10、D1、E6Fab的存在。使用1:2,000稀释度的兔抗小鼠IgG[F(ab’)2特异性的](Jackson Immunoresearch)一抗然后是1:10,000稀释度的与辣根过氧化物酶(Jackson Immunoreasearch)偶联的山羊抗兔IgG(H+L)检测了83-7Fab的存在。通过添加TBD可溶性底物(CALBIOCHEM,La Jolla,CA)对测定物进行显色。将反应通过添加50μl4.5N的H2SO4猝灭，并通过SPECTRAmax PlusTM酶标仪(Molecular Devices,Sunnyvale,CA)在405nm处读取。
b.表达ELISA
通过ELISA测定了总Fab的量。对于ING1、XPA23、BM7-2和CF1人κFab的检测，将MaxisorpTM96孔板(Nunc,Thermo Scientific)用50μl/孔的在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中稀释的3μg/ml山羊抗人κ(Invitrogen,Carlsbad,CA)包被。对于83-7鼠κFab的检测，将MaxisorpTM96孔板用50μl/孔的在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中稀释的3μg/ml山羊抗小鼠κ抗体(Jackson Immunoresearch)包被。对于人λA10、C10、D1和E6Fab的检测，将96孔高结合测定MaxisorpTM96孔板用50μl/孔的在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中稀释的3μg/ml山羊抗人λ(Pierce,Rockford,IL)包被。将包被的板在4℃下孵育过夜，然后用在PBS缓冲液中的5%脱脂奶粉(Carnation,Nestle,OH)(350μl/孔）封闭（对于链霉亲和素包被的板不需要封闭）。在含有0.05%Tween20的PBS中进行板洗涤。在PBS中的5%脱脂奶粉中对Fab、一抗和二抗的进行系列稀释。使稀释后的Fab（50μl/孔）在室温下结合到其封闭抗原，持续1小时。使用1:2,000稀释度的兔抗V5(Sigma)一抗然后是1:10,000稀释度的与辣根过氧化物酶(Jackson Immunoresearch)偶联的山羊抗兔IgG（Fc特异性的）检测了Fab的存在。通过添加TBD可溶性底物(CALBIOCHEM,La Jolla,CA)对测定物进行显色。将反应通过添加50μl4.5N的H2SO4猝灭，并通过SPECTRAmax PlusTM酶标仪(Molecular Devices,Sunnyvale,CA)在450nm处读取。
vi.表面等离子体共振
在Biacore2000仪器(GE Healthcare)上通过表面等离子体共振(SPR)对周质提取物中的人Fab进行了定量。Fab使用以高密度固定在Biacore CM5传感器芯片（GEHealthcare目录号BR-1000-12）上的山羊抗人IgG[F(ab’)2特异性的]（JacksonImmunoresearch目录号109-006-097）定量。通过按两倍系列稀释度将人Fab（Jackson Immunoresearch目录号009-000-007）稀释到测定运行缓冲液中而生成标准曲线，并用于估计Fab浓度。使用BIAevaluation软件V4.1(GE Healthcare,Piscataway,NJ)进行数据分析。
结合到抗原EpCAM的活性ING1Fab的浓度及其比活性（[结合的配体(RU)]/[捕获的Fab(RU)]×[MW(Fab)/MW(配体)]×100）通过将相同量的Fab（与或不与cytFkpA共表达）固定到山羊抗人IgG[F(ab’)2特异性的]表面上然后注射2μg/ml EpCAM来估计。
vii.scFv和Fab初始噬菌体展示文库；选择和挽救
a.淘选和挽救
将激酶靶标使用制造商的方法和10倍摩尔过量的生物素试剂通过Sulfo-NHS-LC-Biotin(Pierce,Rockford,IL)进行生物素化。激酶的生物素化通过SPR进行了确认。然后将生物素化的试剂用于淘选scFv和Fab初始噬菌体展示文库。
对于使用κscFv初始文库的第一轮噬菌体淘选，使用了4.5×1012个集落形成单位(cfu)的噬菌体粒子。对于使用Fab初始文库的第一轮噬菌体淘选，将1.5×1013cfu的Fabλ文库的噬菌体粒子或1×1013cfu的Fabκ文库的噬菌体粒子在室温在PBS中的1ml5%脱脂奶粉(Carnation,Nestle,OH)和在温和旋转下封闭1小时。因此，进行了两次单独的淘选选择：一个来自Fab-κ，一个来自Fab-λ文库。
将封闭的噬菌体针对链霉亲和素包被的磁
Figure BDA0000392443860000261
M-280(InvitrogenDynal AS,Oslo,Norway)进行去选择两次，持续30分钟。对于第1、2和3轮选择，分别使用了200、50和10pmol的生物素化激酶试剂。然后在温和旋转下将生物素-激酶与封闭的链霉亲和素包被的磁
Figure BDA0000392443860000271
M-280孵育1小时，以便固定生物素-激酶并移除未生物素化的材料。然后将捕获了激酶的磁珠用PBS洗涤两次。将去选择的噬菌体与生物素-激酶链霉亲和素磁珠在室温下孵育90分钟。
对于第一轮淘选，将磁珠用PBS-0.05%Tween快速洗涤（即，使用磁体将磁珠从溶液中吸出，并重悬在1ml洗涤缓冲液中）三次，然后用PBS洗涤三次。对于第二轮淘选，将磁珠用PBS-0.05%Tween快速洗涤六次，然后在室温下在温和旋转下用PBS-0.05%Tween在1ml洗涤缓冲液中进行单次10分钟洗涤，再用PBS洗涤六次，然后用PBS进行一次10分钟洗涤。对于第三轮淘选，将磁珠用PBS-0.05%Tween快速洗涤六次，然后用PBS-0.05%Tween进行四次5分钟的洗涤，再用PBS进行六次快速洗涤，然后用PBS进行四次5分钟的洗涤。将结合了激酶的噬菌体通过在室温下与100mM三乙基胺(TEA)孵育30分钟而洗脱，接着用1M Tris-HCl(pH7.4)进行中和。将从第一轮和第二轮淘选中洗脱的噬菌体用于在OD600等于0.5时感染TG1大肠杆菌细胞。将来自第三轮淘选的噬菌体输出分成两个等分试样。将其一半用于感染单独在2YT培养基中生长的TG1细胞，而将另一半用于感染在补充了34ug/ml氯霉素的2YT培养基中生长的表达胞质伴侣FkpA（来自质粒pAR3-FkpA_cyt）的TG1细胞。
在以90rpm振荡下在37℃感染1小时后，将细胞离心，并将沉淀重悬在补充了100μg/ml氨苄青霉素和2%(重量/体积)葡萄糖的2YT生长培养基中。然后将重悬的细胞铺到含有100ug/ml羧苄青霉素和2%葡萄糖的2YT琼脂板上，并在30℃下孵育过夜。相似地，将表达伴侣FkpA的TG1细胞铺到含有100ug/ml羧苄青霉素、34ug/ml氯霉素和2%葡萄糖的2YT琼脂板上，并在30℃下孵育过夜。
以约20的感染复数(MOI)用辅助噬菌体M13K07对噬菌体进行挽救。为此，使第三轮选择输出克隆生长到OD600为约0.5。在那时，将细胞在37℃下用辅助噬菌体感染1小时，同时以100rpm进行振荡。将细胞沉淀重悬在补充了100ug/ml氨苄青霉素和50ug/ml卡那霉素的2YT培养基中，并允许在25℃下生长过夜。通过离心回收上清液中的噬菌体，并用于下一轮淘选。为了估计由噬菌体选择产生的富集，对输入和输出噬菌体的量进行滴定，并铺到补充了合适抗生素的2YT琼脂板上。
b.由文库选择的抗体克隆产生周质提取物
挑取单个TG1集落，然后在37℃下在补充了100ug/ml氨苄青霉素和0.1%(重量/体积)葡萄糖的2YT中生长。然后在OD600达到0.5的值时用1mM IPTG诱导Fab或scFv表达。诱导在30℃下持续过夜。
相似地，从第三轮选择输出中挑取具有表达胞质FkpA的质粒的单个TG1克隆，然后在37℃下在补充了100μg/ml氨苄青霉素、34μg/ml氯霉素和0.1%(重量/体积)葡萄糖的2YT生长培养基中生长。为了表达FkpA，在30℃下当OD600达到0.5时添加阿拉伯糖。添加阿拉伯糖后三十分钟，添加1mM IPTG以诱导Fab或scFv的表达，并且孵育在30℃下持续过夜。
根据标准方法使用在补充了无EDTA的蛋白酶抑制剂混合物片(Roche,IN)的重蒸馏水(ddH2O)中1:4稀释度的冰冷PPB溶液(Teknova)制备细菌周质提取物。将所得的裂解物上清液（周质提取物）如下所述通过ELISA进行测定。
c.抗体噬菌体克隆的ELISA筛选
将ELISA板在4℃下用PBS中2ug/ml的激酶试剂包被过夜。然后将板在室温下用350μl/孔的5%奶粉/PBS封闭1小时。也将细菌周质提取物用5%脱脂奶粉封闭1小时，然后上样到ELISA板（50ul/孔）并使其在室温下结合到包被的激酶，持续2小时。将抗激酶mAb用作阳性ELISA筛选对照。将ELISA结合的抗体片段用1:2,000稀释度的鼠抗V5抗体(Sigma)在室温下检测1小时，然后是1:10,000稀释度的与辣根过氧化物酶(Jackson Immunoresearch)偶联的山羊抗小鼠IgG(H+L)。在ELISA筛选的每个阶段后，用PBS-0.05%Tween-20(Teknova)进行三次洗涤。将阳性对照mAb通过与辣根过氧化物酶偶联的山羊抗人IgG(H+L)在室温下检测1小时。通过添加TBD可溶性底物(CALBIOCHEM)对测定物进行显色。将反应通过添加50μl4.5N的H2SO4猝灭，并通过SPECTRAmax Plus酶标仪(Molecular Devices)在450nm处读取。
实施例2
i.在大肠杆菌周质中Fab和scFv表达的增强
研究了在大肠杆菌肽基脯氨酰顺/反异构酶FkpA、大肠杆菌分子伴侣Skp和双顺反子Skp-FkpA共表达时κ和λ轻链Fab片段的周质表达。为了使得能够在大肠杆菌周质或胞质中表达伴侣，将编码伴侣的基因由含有或不含其天然信号序列的XL1Blue细胞的大肠杆菌染色体通过PCR扩增。然后将PCR产物克隆进表达载体pAR3。通过重叠延伸PCR生成周质和胞质Skp-FkpA双顺反子产物，并将其克隆进pAR3。将伴侣质粒首先通过电穿孔转化进大肠杆菌TG1细胞，并如实施例1中所述生成了周质以及胞质提取物。然后使用抗V5和抗FLAG标签抗体通过Western印迹测试伴侣在TG1细胞中的表达，以检测Skp和FkpA的存在（参见图2A、2B）。Skp、FkpA和双顺反子Skp-FkpA在大肠杆菌胞质提取物中不含其周质信号序列（参见(-)符号）以及在大肠杆菌周质提取物中含其周质信号序列（参见(+)符号）成功表达。不出意料，由于在周质和胞质提取物的制备过程中大肠杆菌内部膜的渗漏，少量不含其前导序列的Skp和FkpA也可存在于细菌周质中，而少量具有其前导序列的Skp和FkpA也可存在于胞质中。
a.具有κ轻链的Fab：
首先，将人κ轻链抗EpCAM ING1Fab在具有或不具有单顺反子或双顺反子伴侣构建体的TG1中表达。分别通过表达和靶标ELISA评估在周质中表达的Fab的总量以及结合蛋白EpCAM的活性Fab的量。在表达ELISA中，将抗κ包被的抗体用于检测Fab轻链。然后通过识别CH1的C端上的V5标签的抗体检测Fab重链（参见图3，灰色柱）。在靶标ELISA中，将Fab特异性多克隆抗体用于鉴定能够识别包被的EpCAM抗原的功能抗体（参见图3，黑色柱）。
这些ELISA结果表明功能ING1Fab的表达在其与FkpA（从左边起的第六条黑色柱）的胞质（不含信号序列）形式共表达时实质性增加。还令人感兴趣的是，在存在胞质FkpA（从左边起的第六条灰色柱）下表达的完整Fab量为功能性的。
相似地，将人轻κ链抗IL1βXPA23Fab在具有或不具有单顺反子或双顺反子伴侣构建体的TG1中表达。分别通过表达（图4，灰色柱）和靶标ELISA（图4，黑色柱）评估了在周质中表达的Fab的总量以及结合蛋白IL1β的活性Fab的量。
这些ELISA结果表明功能XPA23Fab的表达在其与FkpA（图4，从左边起的第六条黑色柱）的胞质（不含信号序列）形式共表达时实质性增加。这些结果还表明，在存在或不存在伴侣的情况下表达的Fab的总量的绝大部分（胞质FkpA除外）为非功能性的。
将鼠轻κ抗人胰岛素受体(huINSR)83-7Fab在具有或不具有单顺反子或双顺反子伴侣构建体的TG1中表达。分别通过表达（图5A）和靶标ELISA（图5B）评估了在周质中表达的Fab的总量以及结合huINSR的活性Fab的量。进行了83-7Fab抗体系列稀释。
这些结果表明活性83-7Fab产量由于胞质FkpA（从左边起的第五个重叠柱）的伴随表达而改善。
将识别激酶靶标的人κBM7-2Fab在具有或不具有FkpA和Skp-FkpA的胞质形式的TG1中表达。如之前所述，分别通过表达（图6A）和靶标ELISA（图6B）测试总周质Fab和抗原结合活性Fab。进行了三个（图6）或五个（图6B）抗体稀释。
这些结果表明在大肠杆菌胞质中仅通过胞质FkpA以及通过表达Skp和FkpA的双顺反子构建体均实现了总BM7-2Fab表达的显著增加。然而，在仅胞质FkpA共表达时存在活性Fab的实质性增加。
将抗TIE1-Fc Fab CF1在具有或不具有单顺反子FkpA和双顺反子Skp-FkpA胞质构建体的TG1中共表达。然后分别通过表达（图7，从左边起前四组柱）和靶标ELISA（图7，从左边起后三组柱）测试总和功能Fab产量。进行了五个抗体稀释。
这些ELISA结果显示胞质FkpA改善功能CF1在大肠杆菌周质中的表达。
b.具有λ轻链的Fab
通过ELISA评估在存在胞质FkpA、Skp和Skp-FkpA的情况下在TG1大肠杆菌周质中总的和活性人抗胃泌素含λ轻链Fab A10、C10、D1和E6的表达。为了测定总Fab表达，首先将抗λ抗体包被在板上。随后，通过识别CH1的C端上的V5标签的抗体探查了Fab重链（参见图8A）。为了鉴定特异性结合胃泌素的功能Fab的相对量，使用了Fab特异性多克隆抗体（参见图8B）。将系列Fab稀释用于两种ELISA。
不同于包含顺式构象的脯氨酸残基的具有κ轻链的Fab，FkpA对活性λ轻链Fab（不具有顺式Pro残基）的表达产量的影响不太明显。我们的结果显示只有C10和D1Fab表达似乎略微受益于胞质FkpA的过表达。FkpA未影响E6的表达，当没有伴侣共表达时，E6不可检测。令人感兴趣的是，FkpA在TG1胞质中的共表达取消了A10Fab在TG1周质中的表达。FkpA的分子伴侣功能对含有λ轻链的Fab的表达的影响似乎比对含有κ轻链的Fab的影响更不可预测。重要的是，我们的研究证实了A10的表达得到实质性改善并且E6的表达在胞质双顺反子Skp-FkpA共表达后得到显著挽救。这些结果表明胞质Skp导致A10和E6Fab的活性蛋白产量升高，其中FkpA没有帮助。
为了计算在Skp、FkpA或双顺反子Skp-FkpA共表达时实际的Fab蛋白产量，使用捕获人Fab的抗人Fab传感器芯片，采用了表面等离子体共振。基于之前的ELISA结果，测试了与导致最明显蛋白质产量升高的伴侣形式共表达的人Fab的周质提取物。首先使用对照人Fab生成标准曲线，然后基于SPR共振单位(RU)估计蛋白质浓度（参见图9）。
ii.胞质FkpA对scFv和Fab噬菌体文库表达的影响
a.κFab文库
我们的结果出人意料地示出胞质FkpA的共表达增强大肠杆菌周质中功能κ轻链Fab（和某些λFab）的表达。随后，我们测试了FkpA改善通过噬菌体展示选择的初始Fab或scFv文库的表达的能力。首先，如实施例1中所述，使用κFab初始噬菌体展示文库，针对生物素化激酶靶标进行了三轮噬菌体淘选选择。在第三轮淘选后，挑取93个输出克隆，并使其在96孔板中生长。如之前所述进行Fab表达的诱导，并如实施例1所述通过ELISA测试了周质提取物与靶标抗原的结合（参见图10A）。在所有板中，孔A1和A2均为阴性对照，而孔H12为阳性对照。挑取了第三轮淘选后的另外93个输出克隆，并进行了诱导以与胞质FkpA一起表达Fab片段。通过ELISA评估了在细菌周质中的活性Fab的表达（参见图10B）。
我们得出结论，胞质FkpA的过表达提高大肠杆菌周质中的κ轻链Fab表达产量，因为鉴定了六个阳性克隆，而相比之下在不存在伴侣时则无阳性克隆。
b.λFab文库
相似地，在用Fabλ链文库淘选后，选择并测试了第三轮克隆。在TG1细胞中对Fab周质提取物的ELISA筛选鉴定了结合到激酶靶标的32个克隆（图11A）。在胞质FkpA共表达后，鉴定了26个结合体。表达水平（参见图11B）在存在FkpA时明显更高。
c.κScFv文库
还针对激酶靶标使用初始XOMAκscFv文库进行了噬菌体选择。当将scFv与胞质FkpA共表达时，scFv周质提取物的ELISA筛选鉴定了65个阳性（及更强的）结合体（参见图12B）。在不存在伴侣的情况下，只鉴定了26个较弱的结合体（参见图12A）。
因此，PPIase FkpA的胞质形式的共表达显著增加从κscFv噬菌体文库选择的抗体候选物的a)数量和b)表达。
实施例3
i.胞质Fkp的表达提高淘选噬菌体展示文库时的命中多样性和表达
对于使用初始Fab文库的第一轮噬菌体淘选，将1.6×1013cfu的Fabλ文库的噬菌体粒子和2.2×1013cfu的Fabκ文库的噬菌体粒子在温和旋转下在3.5ml PBS缓冲液中的5%脱脂奶粉(Marvel,Premier Foods,UK)中在室温下封闭1小时。将封闭的噬菌体针对链霉亲和素包被的磁
Figure BDA0000392443860000311
M-280(Invitrogen Dynal AS,Oslo,Norway)进行去选择两次，持续45分钟。将使用制造商的方案和20倍摩尔过量的生物素试剂通过Sulfo-NHS-LC-Biotin(Pierce,Rockford,IL)生物素化并通过ELISA确认的TIE2在温和旋转下与封闭的链霉亲和素包被的磁
Figure BDA0000392443860000312
M-280孵育45分钟，以便固定生物素-TIE2并移除未生物素化的材料。然后将捕获了TIE2的磁珠用PBS洗涤两次。对于第一、第二和第三轮选择，分别使用100、50和10pmol的生物素化TIE2。对于第一轮，将去选择的噬菌体分成两个等分试样：一个用于感染TG1细胞，而另一个用于感染具有pAR3-FkpA_cyt的TG1细胞。通过与生物素-TIE2链霉亲和素珠在室温下孵育90分钟，将挽救的、去选择的噬菌体用于执行并列第一轮淘选。通过从第一轮TG1感染或具有pAR3-FkpA_cyt的第一轮TG1的单独挽救，生成了第二和三轮的输出噬菌体。
对于第一轮淘选，将磁珠用PBS-0.05%Tween洗涤三次每次5分钟（即，使用磁体将磁珠吸出并重悬在1ml洗涤缓冲液中，然后温和旋转5分钟），然后用PBS洗涤三次。对于第二轮淘选，将磁珠用PBS-0.05%Tween洗涤六次每次5分钟，然后用PBS洗涤六次每次5分钟。对于第三轮淘选，将磁珠用PBS-0.05%Tween洗涤八次每次5分钟，然后用PBS洗涤八次每次个5分钟。将结合TIE2的噬菌体通过在室温下与100mM三乙基胺(TEA)孵育30分钟而洗脱，并随后用1M Tris-HCl(pH7.4)中和。将从各轮淘选中洗脱的噬菌体在OD600等于0.5时用于感染TG1大肠杆菌细胞或具有pAR3-FkpA_cyt的TG1。使TG1细胞在2YT培养基中生长，并且使表达胞质伴侣FkpA（来自质粒pAR3-FkpA_cyt）的TG1细胞在补充了34μg/ml氯霉素的2YT培养基中生长。
在37℃下感染1小时后，将细胞离心，并将沉淀重悬在补充了100μg/ml羧苄青霉素和2%(重量/体积)葡萄糖的2YT生长培养基中。然后将重悬的细胞铺到含有100μg/ml羧苄青霉素和2%葡萄糖的2YT琼脂板上，并在30℃下孵育过夜。相似地，将表达伴侣FkpA的TG1细胞铺到含有100μg/ml羧苄青霉素、34μg/ml氯霉素和2%葡萄糖的2YT琼脂板上，并在30℃下孵育过夜。
以约20的感染复数(MOI)用辅助噬菌体M13K07对噬菌体进行挽救。为此，使第一和第二轮选择输出克隆生长到OD600为约0.5。在那时，使细胞在37℃下用辅助噬菌体感染1小时，同时以100rpm进行振荡。将细胞沉淀重悬在补充了100μg/ml羧苄青霉素和50μg/ml卡那霉素的2YT培养基中，并允许在25℃下生长过夜。通过离心回收上清液中的噬菌体，并用于下一轮淘选。为了估计由噬菌体选择产生的富集程度，对输入和输出噬菌体的量进行滴定，并铺到补充了合适抗生素的2YT琼脂板上。
根据实施例1中的方案通过包被在Reacti-BindTM链霉亲和素包被96孔板（不需要封闭）上的生物素-TIE2进行周质提取物的生成和ELISA筛选。进行了竞争ELISA以粗略估计单个克隆的亲和力。用于竞争ELISA的方案除了以下方面外与上文的筛选ELISA相似：将未生物素化的TIE2以0、1、10和100nM的浓度添加到封闭的周质提取物中，并使其孵育1小时，然后添加到ELISA板中。将TIE2各浓度对应的450nm时的OD与未将TIE2添加到周质提取物时的450nm时的OD进行比较。混合有竞争Fab与板上包被的TIE2-生物素发生结合的周质提取物的TIE2的最低浓度（具有TIE2的A450与不具有TIE2的A450的比率<0.6）指示抗体片段在周质提取物中的亲和力(Sidhu等,JMB,338:299-310(2004);Deshayes等,Chem.&Biol.,9:495-505(2002))。
从各淘选分支—TG1或表达胞质FkpA的TG1(TG1+cytFkpA)中，筛选了结合到TIE2的93个克隆。TG1和TG1+cytFkpA淘选产生了几乎相等数量的命中（OD450>背景信号以上3倍），分别为47和43。然而，TG1+cytFkpA淘选中的命中似乎表达得更好，因为这些命中中的40%具有高于背景以上12倍的OD450，而对于TG1命中，只有15%高于背景以上12倍。TG1+cytFkpA淘选还具有更大的多样性，其中47个克隆中的40个为唯一性抗体片段，而对于TG1淘选47个克隆中只有15个为唯一性的（图14）。
然后将唯一性克隆（TG1中的15个和TG1+cytFkpA中的40个）的周质提取物用于竞争ELISA。在用TG1+cytFkpA进行的淘选中选择的更大百分比的克隆仍能够在存在与周质提取物混合的每种浓度的TIE2下结合ELISA板（图15）。在淘选过程中胞质FkpA的表达增加了所选克隆的多样性，并且这种多样性的增加导致了所选高亲和力克隆的增加。
实施例4
i.Fkp的胞质表达增加Fab抗体片段在噬菌体上的展示
将一升TG1或具有pAR3-FkpA_cyt的TG1(TG1+cytFkpA)培养物（各自还携带表达具有λ或κ轻链的Fab的XOMA文库的噬菌粒）以OD600=0.1开始。使这四种培养物在补充了2%葡萄糖(重量/体积)和100μg/ml羧苄青霉素的2YT培养基中在250rpm振荡下生长，直到OD600达到了0.5。还将氯霉素(34μg/ml)添加到TG1+cytFkpA中。然后以20的MOI将细胞用M13K07辅助噬菌体感染。感染在37℃下进行1小时；其中30分钟无振荡，30分钟以100rpm振荡。感染后，将培养基改为补充了100μg/ml羧苄青霉素、50μg/ml卡那霉素的2YT，并且TG1+cytFkpA培养物还具有34μg/ml的氯霉素。在开始用辅助噬菌体感染后8和25小时，从各培养物中采集样本(50ml)。将这些样本离心并加热到60℃以除去细菌。将噬菌体保存在-80℃下的15%甘油中。
将在8和25小时时采集的样本进行PEG沉淀以浓缩噬菌体。在PBS中的3%奶粉中进行这些样本的系列稀释，然后在室温下经1小时施加到Maxisorp板（已在4℃下用PBS中1:1000稀释度的抗M13(27-9420-01,GE Healthcare)或PBS中1:2000稀释度的抗V5(V-8012,Sigma-Aldrich)包被过夜），然后在室温下用PBS中的3%奶粉封闭1小时。在室温下将噬菌体用PBS中的3%奶粉中1:5000稀释度的抗M13-HRP(27-9421-01,GE Healthcare)检测1小时。通过添加TMB可溶性底物(50-76-11,KPL)对测定物进行显色。将反应通过添加50ul2N的H2SO4猝灭，并通过
Figure BDA0000392443860000341
Plus酶标仪在450nm处读取。通过使用GraphPad Prism拟合S形剂量反应曲线计算各组稀释的EC50。通过将得自抗V5ELISA的EC50的倒数（其中V5标签表明存在在噬菌体上展示的Fab分子）除以得自抗M13ELISA的EC50的倒数并将各比率与TG1细胞中25小时挽救时间点计算得到的比率进行比较来计算Fab展示的相对水平（图16）。在25小时时间点（正常收获时间），通过FkpA的胞质表达进行的挽救比无FkpA表达时的文库挽救具有高3.5倍的展示。因此，将此伴侣用于噬菌体文库产生提高了文库的质量。
实施例5
i.表达ING1Fab和胞质FkpA的三顺反子质粒的构建
对在大肠杆菌周质中表达ING1（抗EpCAM）Fab的噬菌粒载体（参见实施例1）进行了修饰，以将编码M13噬菌体pIII蛋白的基因片段替换为在胞质中表达的伴侣cytFkpA（无其天然信号序列的FkpA）。将两个非琥珀终止密码子添加到三重检测标签（6His-cmyc-V5；在专利申请号WO2010/040073A1中有所描述）的下游。将编码cytFkpA的基因片段由与增强子序列和C端FLAG标签一起的载体pAR3-FkpA_cyt（在实施例1中所述）通过PCR进行扩增，然后克隆进表达ING1Fab的质粒以产生表达ING1Fab和胞质FkpA的三顺反子质粒（图17A）。
在具有与ING1Fab一起共表达cytFkpA的三顺反子质粒的TG1细胞中表达不含周质前导序列（参见(-)符号）的FkpA（图17B）。使用无氯霉素（仅氨苄青霉素）的选择和采用1mM IPTG对ING1Fab和cytFkpA进行的同时诱导，如实施例1中所述生成周质提取物。
如之前所述，通过表达和靶标ELISA评估大肠杆菌周质中ING1Fab的总和功能量。这些结果显示在cytFkpA共表达时总Fab表达水平（参见图17C）和EpCAM结合（参见图17D）均实质性改善。这证实了在单个质粒载体中在单个启动子的控制下在大肠杆菌胞质中cytFkpA的异源共表达的有用性。
如实施例1中所述，通过SPR计算了周质ING1Fab产量。SPR传感图和基于标准曲线估计的蛋白产量的图表分别在图18A和18B中示出。总之，在大肠杆菌胞质中共表达cytFkpA时，ING1Fab的总产量(14.2μg/ml)显著升高。如实施例1中所述，还计算了结合到抗原EpCAM的活性ING1Fab的量及其比活性。图18C显示了cytFkpA的共表达增加了功能ING1Fab的量。其比活性保持不变。
实施例6
i.胞质FkpA对“渗漏”大肠杆菌菌株CY15070的ING1Fab蛋白产量的影响
使用允许将重组抗体片段（或其他蛋白质）导出到细胞外培养基中的大肠杆菌（渗漏）菌株可免除生成周质提取物的需要。这可大大加速高通量筛选过程并降低制造成本且缩短制造时间。使人轻κ抗EpCAM ING1Fab在具有或不具有伴侣质粒pAR3-FkpA_cyt的渗漏菌株CY15070(Paluh等,Nucl.Acids Res.24;14(20):7851-60(1986))中表达。根据既定的方案(Biotechniques,20:42-44(1996))制备了CY15070电穿孔感受态细胞(ATCC#47022)，并用单独的或与表达伴侣的单顺反子载体pAR3-FkpA_cyt（实施例1中所述的载体）一起的表达ING1Fab的质粒载体转化。如实施例1中所述制备了表达单独的或与cytFkpA一起的Fab的CY15070细胞的周质提取物。在细胞离心后收集细胞上清液。将得自具有ING1Fab和pAR3-FkpA_cyt伴侣质粒的TG1细胞的周质提取物用作后续ELISA测定的阳性对照。分别通过表达和靶标ELISA评估在周质中表达的ING1Fab的总量和结合ING1靶标抗原EpCAM的活性ING1Fab的量。在表达ELISA中，将抗κ包被的抗体用于检测Fab轻链。然后通过识别CH1的C端上的V5标签的抗体检测Fab重链（参见图19A）。在靶标ELISA中，将Fab特异性多克隆抗体用于鉴定能够识别包被的EpCAM抗原的功能抗体（参见图19B）。如实施例1中所述，通过ELISA测试CY15070上清液中Fab的量。表达ELISA（图19A）证实了仅当Fab与胞质FkpA共表达时存在于CY15070上清液中的ING1Fab的总量才略微高于在TG1细胞的周质中表达的总Fab。在不存在该伴侣的情况下，CY10570的周质中无Fab表达，而一些Fab可存在于上清液中。
靶标ELISA结果（图19B）显示仅当与胞质FkpA共表达时在CY15070周质和上清液中的功能ING1Fab的水平才与在TG1细胞的周质中表达的活性Fab的水平相似。这些发现强调了在CY15070大肠杆菌细胞中此伴侣在ING1Fab的折叠中的重要性。
Figure IDA0000392443910000011
Figure IDA0000392443910000021
Figure IDA0000392443910000031
Figure IDA0000392443910000041
Figure IDA0000392443910000051

Claims (39)

1.一种用于重组制备的表达异源蛋白的原核宿主细胞，包含：
(a)编码(i)不连接到功能信号序列或其功能片段的FkpA，或(ii)不连接到功能信号序列或其功能片段的Skp的多核苷酸，以及
(b)编码连接到功能信号序列的异源蛋白的多核苷酸。
2.根据权利要求1所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞包含编码不连接到功能信号序列或其功能片段的FkpA的多核苷酸。
3.根据权利要求1所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞包含编码不连接到功能信号序列或其功能片段的Skp的多核苷酸。
4.根据权利要求2所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞还包含编码不连接到功能信号序列或其功能片段的Skp的多核苷酸。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的宿主细胞，其中所述原核宿主细胞选自大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、荧光假单胞菌、富养罗尔斯通氏菌、肉葡萄球菌和粘质沙雷氏菌。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的宿主细胞，其中所述异源蛋白在不存在FkpA和Skp的情况下与错误折叠或缓慢折叠速率相关。
7.根据权利要求1-5中任一项所述的宿主细胞，其中所述异源蛋白的折叠为脯氨酸异构化依赖性的。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的宿主细胞，其中所述异源蛋白融合到丝状噬菌体外壳蛋白或其片段。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的宿主细胞，其中所述异源蛋白为抗体。
10.根据权利要求9所述的宿主细胞，其中所述抗体为选自Fv、二硫键连接的Fv、scFv、κ轻链片段、λ轻链片段、dAb和Fab片段的抗体片段。
11.根据权利要求1-2和4-10中任一项所述的宿主细胞，其中FkpA的所述功能片段为伴侣结构域片段。
12.根据权利要求11所述的宿主细胞，其中所述伴侣结构域片段包含SEQ IDNO:1的第26-140位氨基酸。
13.根据权利要求11所述的宿主细胞，其中所述伴侣结构域片段包含与SEQ IDNO:1的第26至140位氨基酸的至少100个氨基酸具有至少75%同一性的氨基酸序列。
14.根据权利要求1-2和4-10中任一项所述的宿主细胞，其中FkpA的所述功能片段为肽基脯氨酰异构酶结构域片段。
15.根据权利要求14所述的宿主细胞，其中所述肽基脯氨酰异构酶结构域片段包含SEQ ID NO:1的第141-270位氨基酸。
16.根据权利要求14所述的宿主细胞，其中所述肽基脯氨酰异构酶结构域片段包含与SEQ ID NO:1的第141至270位氨基酸的至少100个氨基酸的片段具有至少75%同一性的氨基酸序列。
17.根据权利要求3-14中任一项所述的宿主细胞，其中Skp的所述功能片段包含SEQ ID NO:2的第21-161位氨基酸。
18.包括根据权利要求1-17中任一项的至少103个不同原核宿主细胞的多个细胞，每个这样的宿主细胞表达不同的异源蛋白。
19.根据权利要求18所述的多个细胞，包括根据权利要求1-17中任一项的至少103个不同原核宿主细胞，每个这样的宿主细胞表达不同的异源蛋白。
20.一种用于增加原核宿主细胞中功能异源蛋白的重组制备的方法，包括共表达：
(a)编码(i)不连接到功能信号序列或其功能片段的FkpA，或(ii)不连接到功能信号序列或其功能片段的Skp的多核苷酸，以及
(b)编码连接到功能信号序列的异源蛋白的多核苷酸，
由此与不存在(a)的情况下表达(b)相比所制得的功能异源蛋白的量增加。
21.根据权利要求20所述的方法，其中连接到所述异源蛋白的所述功能信号序列指导向所述周质的分泌。
22.根据权利要求20所述的方法，其中所述宿主细胞包含：(a)编码不连接到功能信号序列或其功能片段的FkpA的多核苷酸，以及(b)编码不连接到功能信号序列或其功能片段的Skp的多核苷酸。
23.根据权利要求20-22中任一项所述的方法，其中所述原核宿主细胞选自大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、荧光假单胞菌、富养罗尔斯通氏菌、肉葡萄球菌和粘质沙雷氏菌。
24.根据权利要求20-23中任一项所述的方法，其中所述异源蛋白在不存在FkpA和Skp的情况下与错误折叠或缓慢折叠速率相关。
25.根据权利要求20-23中任一项所述的方法，其中所述异源蛋白的折叠为脯氨酸异构化依赖性的。
26.根据权利要求20-25中任一项所述的方法，其中所述异源蛋白融合到丝状噬菌体外壳蛋白或其片段。
27.根据权利要求20-26中任一项所述的方法，其中所述异源蛋白为抗体。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述抗体为选自Fv、二硫键连接的Fv、scFv、κ轻链片段、λ轻链片段、dAb和Fab片段的抗体片段。
29.根据权利要求20-28中任一项所述的方法，其中FkpA的所述功能片段为伴侣结构域片段。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述伴侣结构域片段包含SEQ ID NO:1的第26-140位氨基酸。
31.根据权利要求29所述的方法，其中所述伴侣结构域片段包含与SEQ ID NO:1的第26至140位氨基酸的至少100个氨基酸具有至少75%同一性的氨基酸序列。
32.根据权利要求20-28中任一项所述的方法，其中FkpA的所述功能片段为肽基脯氨酰异构酶结构域片段。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述肽基脯氨酰异构酶结构域片段包含SEQ ID NO:1的第141-270位氨基酸。
34.根据权利要求32所述的方法，其中所述肽基脯氨酰异构酶结构域片段包含与SEQ ID NO:1的第141至270位氨基酸的至少100个氨基酸的片段具有至少75%同一性的氨基酸序列。
35.根据权利要求20-34中任一项所述的方法，其中Skp的所述功能片段包含SEQ ID NO:2的第21-161位氨基酸。
36.根据权利要求1-19中任一项所述的宿主细胞或根据权利要求20-35中任一项所述的方法，其中所述宿主细胞具有渗漏表型。
37.根据权利要求1-19中任一项所述的宿主细胞或根据权利要求20-35任一项所述的方法，其中(a)的所述多核苷酸和(b)的所述多核苷酸可操作地连接到相同的调节控制序列。
38.根据权利要求1-19中任一项所述的宿主细胞或根据权利要求20-35中任一项所述的方法，其中(a)的所述多核苷酸和(b)的所述多核苷酸在相同的质粒上。
39.根据权利要求1-19中任一项所述的宿主细胞或根据权利要求20-35中任一项所述的方法，其中(a)的所述多核苷酸和(b)的所述多核苷酸在不同的质粒上。
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