JP2014505482A - 細菌中の機能的タンパク質発現を向上させるための方法および物質 - Google Patents

Abstract

ＦｋｐＡおよび／またはＳｋｐを発現する原核細胞を含む、原核細胞中で異種タンパク質を発現するために有用な新規の物質および方法を提供する。

Description

関連出願の相互参照
本願は、参照することによって全体として組み込まれる、２０１１年２月３日出願の米国仮出願第６１／４３９，２３２号の優先権を主張するものである。

電子的に提出した資料の参照による引用
本願と並行して提出され、「４５７８５Ａ＿ｓｅｑ＿ｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ」というファイル名の８，１９２バイトのＡＳＣＩＩ（テキスト）ファイル（２０１２年２月３日に作成）として識別される、コンピュータ可読アミノ酸配列表が、参照することによって全体として組み込まれる。

発明の分野
本発明は、原核細胞中で異種タンパク質を発現するために有用な物質および方法に関する。

背景
ＦｋｐＡは、分子シャペロンおよびｃｉｓ−ｔｒａｎｓペプチジル−プロリル異性化活性の両方を呈する、Ｅ．ｃｏｌｉの周辺質タンパク質である。未変性ＦｋｐＡは、周辺質への分泌を指示するシグナル配列によって、Ｅ．ｃｏｌｉ中の２４５個のアミノ酸ホモ二量体として、細胞膜周辺腔に局在化する。ＦｋｐＡのシャペロン活性は、成熟タンパク質の最初の１２０個のアミノ酸中に常駐し、ペプチジル−プロリル異性化活性は、アミノ酸１２１〜２４５中に常駐する。抗体一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）の周辺質収率に及ぼす、周辺質中のＦｋｐＡ過剰発現の影響が、研究されている。Ｒａｍｍ ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２７５：２２，１７１０６−１７１１３（２０００）（非特許文献1）を参照されたい。

Ｓｋｐは、外膜タンパク質中間体の適切なフォールディングを促進し、その溶解度を維持するために有用である、Ｅ．ｃｏｌｉ中の外膜タンパク質集合のための１７ｋＤａ周辺質シャペロンである。Ｓｋｐは、ホモ三量体として機能し、その基質と空洞中で結合する、空洞含有シャペロンファミリーに属し、それによって、適切なフォールディングのための好適な環境を提供し、基質を凝集から保護する。細胞質中のＳｋｐおよび細菌細胞質中のＦａｂ抗体断片の共発現の影響が、研究されている。Ｌｅｖｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ Ｐｕｒｉｆ．２３（２）：３３８−４７（２００１）（非特許文献2）を参照されたい。

原核細胞系中の異種タンパク質、例えば、抗体の発現に関する一般的問題は、タンパク質のかなりの部分が、不溶性または非機能的となる程度までの異種タンパク質の凝集である。本発明の方法および物質は、本問題に対する解決策を提供する。

Ｒａｍｍ ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２７５：２２，１７１０６−１７１１３（２０００） Ｌｅｖｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ Ｐｕｒｉｆ．２３（２）：３３８−４７（２００１）

本開示は、原核細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞）中での異種発現したタンパク質（例えば、抗体）の収率を改善するために有用である、方法および物質に関する。当該原核宿主細胞は、ＦｋｐＡおよび／またはＳｋｐを細胞質中で発現し、目的とする異種タンパク質（例えば、抗体）を分泌するように提供される。発明者らは、予想外にも、ＦｋｐＡおよびＳｋｐが、周辺質ではなく、細胞質に局在化されるように、シグナル配列を欠いたＦｋｐＡおよびＳｋｐを発現するＥ．ｃｏｌｉ細胞が、Ｅ．ｃｏｌｉ周辺質中に分泌される、可溶性であって、正しくフォールディングされ、かつ機能的である異種タンパク質の収率を有意に改善することを発見した。

本開示の一態様は、（ａ）（ｉ）機能的シグナル配列に連結されていないＦｋｐＡもしくはその機能的断片、または（ｉｉ）機能的シグナル配列に連結されていないＳｋｐもしくはその機能的断片、をコードするポリヌクレオチドと、（ｂ）異種タンパク質をコードするポリヌクレオチドとを含む、異種タンパク質を発現する組換え生産用の原核宿主細胞を提供し、当該異種タンパク質は、機能的シグナル配列に連結されている。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、（ｉ）機能的シグナル配列に連結されていないＦｋｐＡまたはその機能的断片をコードするポリヌクレオチドと、（ｉｉ）機能的シグナル配列に連結されていないＳｋｐまたはその機能的断片をコードするポリヌクレオチドの両方を含む。当該ポリヌクレオチドは、いくつかの実施形態では同一のベクター内にあり、他の実施形態では異なるベクター内にある。いくつかの実施形態では、２つのポリヌクレオチドは、同一のメッセンジャーＲＮＡ上に発現される。

本開示の関連態様は、コードされたタンパク質の発現を調節するように作用する制御調節配列に、動作可能なように連結されている、これらのポリヌクレオチドを提供する。別の関連態様は、これらのポリヌクレオチドを含む、ベクターまたは染色体を提供する。本開示のさらなる関連態様は、そのようなポリヌクレオチドおよび／またはベクターおよび／または染色体を含む宿主細胞、ならびに、そのような宿主細胞を用いて、抗体および抗体断片を含むそのような異種タンパク質を組換え発現する方法を提供する。本開示のさらに別の関連態様は、ファージ粒子の表面上において、あるいは単離または精製形態においてのいずれかで表される、ポリヌクレオチドによってコードされた異種タンパク質を提供する。

本明細書に説明される実施形態のいくつかまたはいずれかでは、原核宿主細胞は、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、サルモネラ・ティフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、シュードモナス・エルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、およびセラチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃａｎｓ）から成る群より選択される。例示的実施形態では、原核宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉである。

本明細書に説明される実施形態のいくつかまたはいずれかでは、異種タンパク質は、ＦｋｐＡおよびＳｋｐの不在下ではミスフォールディングまたは低フォールディング速度を伴う。そのような異種タンパク質として、成長因子（例えば、上皮成長因子、インスリン様成長因子−１）；血液凝固因子（例えば、抗血友病因子）；ホルモン（例えば、インスリン、グルカゴン、成長ホルモン、ソマトトロピン、エリスロポエチン）；サイトカイン（例えば、インターフェロン、インターロイキン；果粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、ＣＤ８６）；ケモカイン（例えば、ＣＣＬ３）；受容体（例えば、ケモカイン受容体、チロシンキナーゼ受容体）；酵素（例えば、プロテアーゼ、リパーゼ、カルボヒドラーゼ、キモシン、ＤＮＡアーゼ、プロウロキナーゼ、アルギニンデイミナーゼ、シトシンデアミナーゼ、Ｌ−アスパラギナーゼ）；酵素アクチベーター（例えば、組織型プラスミノゲンアクチベーター）；酵素インヒビター（例えば、メタロプロテアーゼの組織インヒビター）；ペプチド（例えば、ヒルジン、ニューレグリン−１断片）；抗体断片（例えば、Ｆａｂ断片）；タンパク質骨格（例えば、Ａｄｎｅｃｔｉｎｓ、Ａｆｆｉｂｏｄｉｅｓ、Ａｎｔｉｃａｌｉｎｓ、ＤＡＲＰｉｎｓ、遺伝子組換えＫｕｎｉｔｚ型インヒビター、テトラネクチン、Ａ−ドメインタンパク質、リポカリン、反復タンパク質、例えば、アンキリン反復タンパク質、免疫タンパク質、α２ｐ８ペプチド、昆虫ディフェンシンＡ、ＰＤＺドメイン、カリブドトキシン、ＰＨＤフィンガー、ＴＥＭ−１β−ラクタマーゼ、フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン、ＣＴＬＡ−４、Ｔ細胞受容体、ノッティン、ネオカルチノスタチン、糖結合モジュール４−２、緑色蛍光タンパク質、チオレドキシン）；ワクチン（例えば、インフルエンザワクチン、アンスラックスワクチン、例えば、ｒＰＡワクチン、肝炎Ｅウイルスワクチン、例えば、ＯＲＦ２ワクチン、ヒトパピローマウイルスワクチン）；毒素；および免疫毒素（Ｍｉｓａｗａ ａｎｄ Ｋｕｍａｇａｉ，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ５１：２９７−３０７（１９９９）、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．２５（１）：１０５−１３（２００２）、Ｄｅｍａｉｎ，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１８（１）：２６−３１（２０００）、Ｇｅｂａｕｅｒ ＆ Ｓｋｅｒｒａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１３：２４５−５５（２００９）、Ｇｉｌｌ ＆ Ｄａｍｌｅ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ １７：６５３−５８（２００６）、Ｈｏｓｓｅ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．１５：１４−２７（２００６）、Ｓｋｅｒｒａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ １８：２９５−３−４（２００７）、Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ，ＰＬｏＳ ＯＮＥ ３（５）：ｅ２２５７（２００８）、Ｖａｈｅｄｉ ｅｔ ａｌ，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｃｈｅｍ．ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１５７（３）：５５４−６１（２００９）、Ｈａｋｉｍ ａｎｄ Ｂｅｎｈａｒ，ＭＡｂｓ．１（３）：２８１-８７（２００９））が挙げられる。

本明細書に説明される実施形態のいくつかまたはいずれかでは、異種タンパク質は、プロリン異性化に依存する。例示的実施形態では、プロリン異性化依存異種タンパク質は、カッパ軽鎖を含む、抗体または抗体断片である。

本明細書の実施形態のいくつかまたはいずれかでは、異種タンパク質は、繊維状ファージコートタンパク質またはその断片に融合されている。例示的実施形態では、繊維状ファージコートタンパク質またはその断片に融合されている異種タンパク質を含む、宿主細胞は、その表面上に異種タンパク質を表すファージ粒子を産生するために使用される。

本明細書に説明される実施形態のいくつかまたはいずれかでは、異種タンパク質は、抗体である。例示的実施形態では、抗体は、Ｆｖ、ジスルフィド結合Ｆｖ、ｓｃＦｖ、カッパ軽鎖断片、ラムダ軽鎖断片、およびＦａｂ断片から成る群より選択される、抗体断片である。

本明細書の実施形態のいくつかまたはいずれかでは、ＦｋｐＡの機能的断片は、機能的異種タンパク質の収率を増加させる能力を留保する、シャペロンドメイン断片、例えば、配列番号１のアミノ酸２６〜１４０あるいはその断片またはバリアントを含む。例示的実施形態では、シャペロンドメイン断片は、配列番号１のアミノ酸２６〜１４０のうち少なくとも１００個のアミノ酸と少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を含む。

本明細書の実施形態のいくつかまたはいずれかでは、ＦｋｐＡの機能的断片は、機能的異種タンパク質の収率を増加させる能力を留保する、ペプチジルプロリルイソメラーゼドメイン断片、例えば、配列番号１のアミノ酸１４１〜２７０あるいはその断片またはバリアントを含む。例示的実施形態では、ペプチジルプロリルイソメラーゼドメイン断片は、配列番号１のアミノ酸１４１〜２７０のうちの少なくとも１００個のアミノ酸の断片と少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を含む。

本明細書の実施形態のいくつかまたはいずれかでは、Ｓｋｐの機能的断片は、機能的異種タンパク質の収率を増加させる能力を留保する、配列番号２のアミノ酸２１〜１６１あるいはその断片またはバリアントを含む。例示的実施形態では、Ｓｋｐの機能的断片は、配列番号２の少なくとも１００個のアミノ酸の断片と少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を含む。

本明細書に説明される実施形態のいくつかまたはいずれかでは、本明細書に説明される実施形態のいずれかによる、少なくとも約１０^３、１０^４、１０^５、１０^６、１０^７、１０^８、１０^９、またはそれ以上の異なる原核宿主細胞を含む、複数の細胞が提供され、各そのような宿主細胞は、異なる異種タンパク質（例えば、抗体、例えば、一本鎖抗体）を発現する。

本開示の別の態様は、原核宿主細胞中の機能的異種タンパク質（例えば、抗体）の組換え生産を増加させるための方法であって、機能的シグナル配列に連結されていないＦｋｐＡまたはその機能的断片をコードするポリヌクレオチド、および機能的シグナル配列に連結されていないＳｋｐまたはその機能的断片をコードするポリヌクレオチドから成る群より選択される、ポリヌクレオチドと、機能的シグナル配列に連結されている異種タンパク質をコードするポリヌクレオチドとを共発現させる工程を含み、それによって、産生される機能的異種タンパク質の量が、ＦｋｐＡおよび／またはＳｋｐの不在下での異種タンパク質発現と比較して増加する、方法を提供する。

本明細書の実施形態のいくつかまたはいずれかでは、異種タンパク質に連結されているシグナル配列は、周辺質への異種タンパク質の分泌を指示する。

本開示のポリヌクレオチドは、制御調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、または１つ以上の他の転写調節配列）に、随意に、これらの配列を含むベクターとして、動作可能なように連結されてもよい。いくつかのまたはいずれかの実施形態では、（ａ）（ｉ）機能的シグナル配列に連結されていないＦｋｐＡもしくはその機能的断片、または（ｉｉ）機能的シグナル配列に連結されていないＳｋｐもしくはその機能的断片、をコードするポリヌクレオチドと、（ｂ）機能的シグナル配列に連結されている異種タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、同一の調節配列（すなわち、被覆配列は、多シストロン性である）に、適切に作用するように連結されている。そのようなポリヌクレオチドまたはベクターを含む宿主細胞は、当技術分野において公知のまたは本明細書に説明される方法を使用して、調製されてもよい。

本明細書に説明される各特徴または実施形態、あるいは組み合わせは、本発明の態様のいずれかの非限定的例証的実施例であって、したがって、本明細書に説明される任意の他の特徴または実施形態、あるいは組み合わせと組み合わせ可能であるとことが意図されることを理解されたい。例えば、特徴が、「一実施形態」、「いくつかの実施形態」、「さらなる実施形態」、「特異的例示的実施形態」、および／または「別の実施形態」等の用語によって説明される場合、これらのタイプの実施形態はそれぞれ、あらゆる可能性として考えられる組み合わせを列挙する必要なく、本明細書に説明される任意の他の特徴または特徴の組み合わせと組み合わせられることが意図される、特徴の非限定的実施例である。そのような特徴または特徴の組み合わせは、本発明の態様のいずれかに適用される。同様に、本開示が、ある特徴によって特徴付けられるポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチドについて説明する場合、それらの特徴によって特徴付けられるポリペプチド、そのようなポリペプチドを発現する宿主細胞、およびそのような宿主細胞を使用する全ての関連方法もまた、本開示によって想定される。ある範囲中の値の実施例が開示される場合、これらの実施例のいずれも、ある範囲の可能性として考えられる終点として想定され、そのような終点間のあらゆる数値が、想定され、かつ上限および下限終点のあらゆる組み合わせが、想定される。

本発明の多数の付加的態様および利点が、その現在好ましい実施形態を説明する、以下の発明を実施するための形態の検討によって、当業者に明白となるであろう。本願で参照される、全ての米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願、および非特許刊行物は、参照することによってその全体として本明細書に組み込まれる。

本明細書に開示される実験において使用される、ＦｋｐＡおよびＳｋｐ構築物の例証である。 Ｅ．ｃｏｌｉ中に発現し、ウエスタンブロット法によって検出された種々のＳｋｐ（図２Ａ）およびＦｋｐＡ（図２Ｂ）構築物を図示する。 ＦｋｐＡおよびＳｋｐ構築物の種々の組み合わせを発現する、Ｅ．ｃｏｌｉ菌株中に発現した抗ＥｐＣＡＭ ＩＮＧ１ Ｆａｂの総量（灰色バー）または機能的（黒色バー）ＩＮＧ１ Ｆａｂを検出するためのＥＬＩＳＡの結果を図示する。「ｃｙｔＳｋｐ」は、シグナル配列を伴わないＳｋｐ（すなわち、細胞質Ｓｋｐ）を示す。同様に、「ｃｙｔＦｋｐＡ」は、シグナル配列を伴わずに発現したＦｋｐＡ（すなわち、細胞質ＦｋｐＡ）を示す。「ｐｅｒＳｋｐ」および「ｐｅｒＦｋｐＡ」は、シグナル配列を伴って発現したＳｋｐおよびＦｋｐＡ（すなわち、周辺質ＳｋｐまたはＦｋｐＡ）を示す。「ｃｙｔＢｉｃ」は、２シストロン性メッセージからのＦｋｐＡおよびＳｋｐ両方の細胞質発現を示す。「ｐｅｒＢｉｃ」は、２シストロン性メッセージからのＦｋｐＡおよびＳｋｐ両方の周辺質発現を示す。 ＦｋｐＡおよびＳｋｐ構築物の種々の組み合わせを発現する、Ｅ．ｃｏｌｉ菌株中に発現した抗ＩＬ１ ＸＰＡ２３ Ｆａｂの総量（灰色バー）または機能的（黒色バー）ＸＰＡ２３ Ｆａｂを検出するためのＥＬＩＳＡの結果を図示する。ＳｋｐおよびＦｋｐＡ構築物は、図３に関して前述された通りである。 ＦｋｐＡおよびＳｋｐ構築物の種々の組み合わせを発現する、Ｅ．ｃｏｌｉ菌株中で発現したマウス軽鎖カッパ抗ヒトインスリン受容体８３−７Ｆａｂまたは機能的８３−７Ｆａｂの総量を検出するためのＥＬＩＳＡの結果を図示する。図５Ａは、産生された８３−７Ｆａｂの総量を検出する、抗体希釈系列である一方、図５Ｂは、機能的８３−７Ｆａｂを検出する、抗体希釈系列である。ＳｋｐおよびＦｋｐＡ構築物は、図３に関して前述された通りである。 細胞質ＦｋｐＡ（淡灰色バー）または両細胞質ＦｋｐＡおよび細胞質Ｓｋｐ（濃灰色バー）構築物を発現する、Ｅ．ｃｏｌｉ菌株中で発現しヒトカッパＢＭ７−２Ｆａｂ（固有のキナーゼを認識する）または機能的ＢＭ７−２Ｆａｂの総量を検出するためのＥＬＩＳＡの結果を図示する。図６Ａは、産生されたＢＭ７−２Ｆａｂの総量を検出する、抗体希釈系列である一方、図６Ｂは、機能的ＢＭ７−２Ｆａｂを検出する、抗体希釈系列である。 細胞質ＦｋｐＡまたは両細胞質ＦｋｐＡおよび細胞質Ｓｋｐ構築物を発現する、Ｅ．ｃｏｌｉ菌株中で発現した抗ガストリンヒトカッパ抗ＴＩＥ１−Ｆｃ Ｆａｂ ＣＦ１または機能的ＣＦ１ Ｆａｂの総量を検出するためのＥＬＩＳＡの結果を図示する。「発現ＥＬＩＳＡ」は、産生されるＣＦ１ Ｆａｂの総量を検出する、抗体希釈系列である一方、「標的ＥＬＩＳＡ」は、機能的ＣＦ１ Ｆａｂを検出する、抗体希釈系列である。 細胞質ＦｋｐＡまたは両細胞質ＦｋｐＡおよび細胞質Ｓｋｐ構築物を発現する、Ｅ．ｃｏｌｉ菌株中で発現したＡ１０、Ｃ１０、Ｄ１、およびＥ６Ｆａｂの総量および機能的ヒトラムダ軽鎖を検出するためのＥＬＩＳＡの結果を図示する。図８Ａは、産生される示されたＦａｂの総量を検出する、抗体希釈系列である一方、図８Ｂは、機能的Ｆａｂを検出する、抗体希釈系列である。 示されるように、種々のＦｋｐＡおよびＳｋｐ構築物を発現する、Ｅ．ｃｏｌｉ菌株中で産生される示されたＦａｂの実際の収率を計算するための表面プラズモン共鳴アッセイの結果を図示する。 標的抗原に結合するための能力を伴う、カッパ軽鎖Ｆａｂを検出するためのファージパニングアッセイの結果を図示する。図１０Ａは、細胞質ＦｋｐＡの発現を伴わない、ファージディスプレイライブラリからＦａｂを検出するためのＥＬＩＳＡの結果を表す一方、１０Ｂは、細胞質ＦｋｐＡの発現を伴う、ライブラリからＦａｂを検出するためのＥＬＩＳＡの結果を表す。アッセイ中で同定された陽性クローンは、太字で示される。 標的抗原に結合するための能力を伴う、ラムダ軽鎖Ｆａｂを検出するためのファージパニングアッセイの結果を図示する。図１１Ａは、細胞質ＦｋｐＡの発現を伴わない、ファージディスプレイライブラリからＦａｂを検出するためのＥＬＩＳＡの結果を表す一方、１１Ｂは、細胞質ＦｋｐＡの発現を伴う、ライブラリからＦａｂを検出するためのＥＬＩＳＡの結果を表す。アッセイ中で同定された陽性クローンは、太字で示される。 標的抗原に結合するための能力を伴う、ｓｃＦｖを検出するためのファージパニングアッセイの結果を図示する。図１２Ａは、細胞質ＦｋｐＡの発現を伴わない、ファージディスプレイライブラリからｓｃＦｖを検出するためのＥＬＩＳＡの結果を表す一方、１２Ｂは、細胞質ＦｋｐＡの発現を伴う、ライブラリからｓｃＦｖを検出するためのＥＬＩＳＡの結果を表す。アッセイ中で同定された陽性クローンは、太字で示される。 種々の細菌種からのＦｋｐＡオルソログと、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ６からのＦｋｐＡの残基３９−２４８（配列番号１の残基３９−２４８）とのアミノ酸配列アライメントを描写する。 ＴＩＥ２に結合する能力を伴う、ラムダＦａｂおよびカッパＦａｂを検出するためのファージパニングアッセイの結果を図示する。ＥＬＩＳＡの展開後の４５０ｎｍにおける吸光度が、各正方形中の下の数字であって、上の数字は、フォールドオーバーバックグラウンド陰性対照（Ａ１およびＡ２）である。アッセイ中に同定された陽性クローンは、太字で示される。Ｗｅｌｌ Ｈ１２は、陽性対照である。円形は、一意のアミノ酸配列を伴う、クローンを表す。 ファージレスキューの間、ＴＧ１またはＴＧ１＋ｃｙｔＦｋｐＡ細胞を使用する、パニング中に選択された一意のクローンに対する競合ＥＬＩＳＡの結果を図示する。ＴＩＥ２、１００ｎＭ（白色バー）、１０ｎＭ（灰色バー）、または１ｎＭ（黒色バー）を、Ｆａｂを含有する周辺質抽出物と混合した。ＥＬＩＳＡの展開後、ＴＩＥ２の各濃度に対する４５０ｎｍにおける吸光度を、ＴＩＥ２が周辺質抽出物に添加されなかったときの４５０ｎｍにおける吸光度と比較し、比率として表した。 ＴＧ１細胞または細胞質ＦｋｐＡを発現するＴＧ１細胞中に産生されるファージ上のカッパおよびラムダＦａｂの相対的ディスプレイの結果を図示する。ヘルパーファージ感染から８（Ｋ８、Ｌ８）および２５（Ｋ２５、Ｌ２５）時間後に、試料を採取した。値は、それぞれ、感染から２５時間後、ＴＧ１細胞中のカッパまたはラムダライブラリレスキューに対して表される。 図１７Ａは、Ｍ１３ファージｐＩＩＩタンパク質をコードする遺伝子断片を、細胞質発現したシャペロンｃｙｔＦｋｐＡ（その未変性シグナル配列を伴わないＦｋｐＡ）と置き換え、ＩＮＧ１ Ｆａｂおよび細胞質ＦｋｐＡを発現する、３シストロン性プラスミドをもたらすように修飾されたＥ．ｃｏｌｉ周辺質（実施例１参照）中でＩＮＧ１（抗ＥｐＣＡＭ）Ｆａｂを発現する、ファージミドベクターの概略である。図１７Ｂは、図１７Ａで説明された３シストロン性Ｆａｂベクター（ＴＧ１細胞中で発現された）からのＦｋｐ（−）の検出のために、抗ＦＬＡＧ抗体で展開されたウエスタンブロット法（還元された）である。図１７Ｃおよび１７Ｄは、発現および標的ＥＬＩＳＡによって査定されたＥ．ｃｏｌｉ周辺質中のＩＮＧ１ Ｆａｂの総量および機能量を図示する。これらの結果は、ｃｙｔＦｋｐＡの共発現に応じて、総Ｆａｂレベル（図１７Ｃ）およびＥｐＣＡＭ結合（図１７Ｄ）の両方の発現の実質的改善を示した。 図１８Ａおよび１８Ｂは、標準曲線に基づいて、推定される周辺質ＩＮＧ１ Ｆａｂ収率のＳＰＲセンサーグラム（図１８Ａ）およびチャート（図１８Ｂ）を図示する。ＩＮＧ１ Ｆａｂ（１４．２μｇ／ｍｌ）の総収率は、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞質中のｃｙｔＦｋｐＡの共発現に応じて、劇的に増加した。図１８Ｃは、実施例１に説明されるように計算された、抗原ＥｐＣＡＭに結合された活性ＩＮＧ１ Ｆａｂの量およびその特異的活性を図示する。ｃｙｔＦｋｐＡの共発現は、機能的ＩＮＧ１ Ｆａｂの量を増加させた。その特異的活性は、不変のままであった。 図１９Ａおよび１９Ｂは、細胞質ＦｋｐＡを伴う、または伴わない、ＩＮＧ１ Ｆａｂを発現する、漏出Ｅ．ｃｏｌｉ菌株ＣＹ１５０７０を使用した実験の結果を図示する。周辺質中に発現したＩＮＧ１ Ｆａｂの総量（図１９Ａ）およびＩＮＧ１標的抗原ＥｐＣＡＭに結合する活性ＩＮＧ１ Ｆａｂの量（図１９Ｂ）は、それぞれ、発現および標的ＥＬＩＳＡによって査定した。発現ＥＬＩＳＡでは、抗カッパ被覆抗体を使用して、Ｆａｂ軽鎖を検出した。次いで、Ｆａｂ重鎖を、ＣＨ１のＣ−末端上のＶ５タグを認識する抗体によって検出した。

発明の詳細な説明
本開示は、原核細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞）中で異種発現したタンパク質（例えば、抗体）の収率を改善するために有用な方法および物質に関する。本開示中の方法および物質は、ＦｋｐＡおよび／またはＳｋｐが、原核宿主細胞の細胞質内に局在化するように、機能的シグナル配列に連結されていない、ＦｋｐＡおよび／またはＳｋｐを発現することによって、周辺質に分泌される、可溶性であって、正しくフォールディングされ、かつ機能的の異種タンパク質の有意に改善された収率をもたらすという発見に関する。本発明の有利な態様の１つは、ファージディスプレイ法が、本開示によって提供される宿主細胞中に産生されるファージによって、より効率的に実施することができることである。例えば、望ましい抗原結合特性を伴う希少抗体は、ファージ被覆上に表される異種タンパク質が、正しくフォールディングされ、かつ機能的となる可能性がより高いため、これらの宿主細胞を使用して発見される可能性がより高い。

Ａ．定義
本明細書で使用されるように、「特異的に結合する」、「抗原特異的」である、抗原「に対して特異的」である、または抗原と「免疫反応性」である、抗体とは、類似配列に関連のない他の抗原よりも高い親和性、好ましくは、少なくとも１０^３、１０^４、１０^５、または１０^６を超える親和性で、抗原に結合する抗体を指す。一態様では、本発明の抗体、あるいはその断片、バリアント、または誘導体は、他の、すなわち、非ヒト種の類似抗原に対するその結合親和性と比較して、ヒト抗原に対してより高い親和性を伴って結合するであろうが、オルソログを認識および結合する抗体も、想定される。

例えば、その同種抗原に対して「特異的」抗体またはその断片は、抗体の可変領域が、検出可能選好によって、所望の抗原を認識および結合することを示す（例えば、所望の抗原が、ポリペプチドである場合、抗体の可変領域は、ファミリー構成要素間の局在化された配列同一性、相同性、または類似性の可能性として考えられる存在にかかわらず、結合親和性における測定可能差異によって、抗原ポリペプチドを同一ファミリーの他の公知のポリペプチドと区別可能である）。特異的抗体はまた、抗体の可変領域外、特に、分子の定常領域中の配列との相互作用を通して、他のタンパク質と相互作用し得ることを理解されるであろう（例えば、ＥＬＩＳＡ技法におけるＳ．ａｕｒｅｕｓタンパク質Ａまたは他の抗体）。本発明の方法において使用するための抗体の結合特異性を判定するためのスクリーニングアッセイは、周知であって、当技術分野において、日常的に実践されている。そのようなアッセイの包括的議論については、Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．（Ｅｄｓ），Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８８），Ｃｈａｐｔｅｒ ６を参照されたい。本発明において使用するための抗体は、当技術分野において公知であって、本明細書でより詳細に説明される、任意の方法を使用して産生することができる。

用語「エピトープ」は、抗原結合領域のうちの１つ以上において、選択的結合剤によって認識および結合されることが可能な任意の分子のその部分を指す。エピトープは、通常、分子の化学的活性表面基、例えば、アミノ酸または炭化水素側鎖から成り、特異的３次元構造特性ならびに特異的電荷特性を有する。エピトープは、本明細書で使用されるように、連続的または非連続的であってもよい。

用語「誘導体」は、ポリペプチド（例えば、目的とするタンパク質、その抗体または抗原結合断片）と併用されるとき、ユビキチン化、治療または診断剤への結合、標識化（例えば、放射性核種または種々の酵素によって）、共有結合ポリマー付着、例えば、ペグ化（ポリエチレングリコールによる誘導体化）、およびアミノ酸、例えば、通常、ヒトタンパク質では生じない、オルニチンの化学合成による挿入または置換等の技法によって、化学的に修飾されたポリペプチドを指す。誘導体は、本発明の非誘導化分子の結合特性を留保する。

「検出可能部分」または「標識」は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、または化学的手段によって検出可能な組成物を指す。例えば、有用標識として、３２Ｐ、３５Ｓ、蛍光染料、高電子密度試薬、酵素（例えば、一般に、ＥＬＩＳＡにおいて使用されるような）、ビオチン−ストレプトアビジン、ジゴキシゲニン、ハプテン、および抗血清またはモノクローナル抗体が利用可能である、タンパク質、あるいは別の標識された核酸分子に相補的配列を伴う核酸分子が挙げられる。検出可能部分は、多くの場合、試料中の結合された検出可能部分の量を定量化するために使用することができる、測定可能シグナル、例えば、放射線活性、色素産生、または蛍光シグナルを生成する。

用語「宿主細胞」は、特定の対象細胞または複数の細胞だけではなく、また、その子孫も指すと理解されたい。また、培養の間、自然または偶発的変異が、後続世代において生じ得、したがって、そのような子孫は、親細胞と完全に同じではない場合があるが、依然として、本明細書で使用される用語の範囲内に含まれるものと理解されたい。

用語「動作可能なように連結されている」は、２つ以上のポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）セグメント間の機能的関係を指す。典型的には、転写された配列に対する、制御調節配列、例えば、転写制御配列の機能的関係を指す。例えば、ｃｉｓ作用性転写制御要素の任意の組み合わせを含む、プロモーター／エンハンサー配列は、適切な宿主細胞または他の発現系中の被覆配列の転写を刺激または調節する場合、動作可能なように被覆配列に連結されている。概して、転写された配列に、動作可能なように連結されているプロモーター転写制御配列は、転写された配列に対して、物理的に連続的である、すなわち、それらは、ｃｉｓ作用性である。しかしながら、いくつかの転写制御配列、例えば、エンハンサーは、物理的に連続的である、またはその転写を向上させる被覆配列に近接して位置する必要はない。ポリリンカーは、被覆配列を挿入するための便宜的場所を提供し、したがって、遺伝子は動作可能なようにプロモーターに連結されている。ポリリンカーは、一連の３つ以上の密集した制限エンドヌクレアーゼ認識配列を含む、ポリヌクレオチド配列である。

用語「シグナル配列」は、通常、細胞によって、非細胞質場所に運ばれる（例えば、分泌）、または膜成分となる、あるタンパク質のＮＨ_２−末端に存在する、短アミノ酸配列（すなわち、シグナルペプチド）をコードする、ポリヌクレオチド配列を指す。「機能的シグナル配列」は、細胞質から、非細胞質場所、例えば、周辺質へのタンパク質の輸送を指示することが可能である。

本明細書で使用されるように、用語「機能的シグナル配列に連結されていない」は、未変性シグナル配列が、細胞質から、非細胞質場所へのタンパク質の輸送を指示する機能を欠くように除去または修飾（例えば、変異または切断）され、非未変性機能的シグナル配列に連結されていない、ポリペプチドを包含する。本用語は、したがって、ポリペプチドが、シグナル配列をコードする１つ以上のコドンが、除去または変異されている、ポリヌクレオチドによってコードされる実施形態、ならびにシグナル配列をコードする１つ以上のコドンが、組み込まれないように、新たに合成されたポリヌクレオチドを包含する。

用語「機能的断片」は、ポリペプチドを参照して使用されるとき、切断される、すなわち、Ｎ−末端またはＣ−末端から１つ以上のアミノ酸が欠けており、所望の活性を留保する、ポリペプチドを意味する。ＦｋｐＡまたはＳｋｐを参照して使用されるとき、「機能的断片」は、機能的異種タンパク質の収率を増加させる能力を留保する、断片を意味する。本用語は、同様に、切断される、ポリヌクレオチドにも適用されてもよい。

用語「バリアント」は、ポリペプチドを参照して使用されるとき、親ポリペプチドに対して、１つ以上の置換、欠失、または挿入を有する、ポリペプチドを意味する。いくつかの状況では、バリアントは、所望の活性を留保するものである。ＦｋｐＡまたはＳｋｐを参照して使用されるとき、「機能的バリアント」は、機能的異種タンパク質の収率を増加させる能力を留保する、バリアントを意味する。本用語は、同様に、親ポリヌクレオチドに対して、１つ以上の置換、欠失、または挿入を有する、ポリヌクレオチドに適用されてもよい。

本明細書で使用されるように、用語「同類アミノ酸置換」は、類似特性、例えば、サイズ、電荷、疎水性、親水性、および／または芳香族性を有する、別のアミノ酸とのあるアミノ酸の置き換えであって、以下に示されるような交換を含む。

共通側鎖特性を共有する、アミノ酸残基は、多くの場合、以下のようにグループ化される。
（１）疎水性：ノルロイシン、ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ；
（２）中性親水性：ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；
（３）酸性：ａｓｐ、ｇｌｕ；
（４）塩基性：ａｓｎ、ｇｌｎ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響を及ぼす残基：ｇｌｙ、ｐｒｏ；および
（６）芳香族：ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｐｈｅ。

Ｂ．ＦｋｐＡ
ＦｋｐＡ（配列番号１）は、２７０アミノ酸タンパク質として発現される。アミノ酸残基１〜２５は、周辺質中へのＦｋｐＡの分泌を指示後、裂開され、２４５アミノ酸成熟タンパク質をもたらす、シグナル配列として機能する。成熟タンパク質配列は、配列番号３に記載されており、配列番号１のアミノ酸２６〜２７０に対応する。シャペロン活性は、アミノ酸残基２６〜１４０中に常駐し、ペプチジル−プロリル異性化活性は、アミノ酸残基１４１〜２７０中に常駐する。

例示的実施形態では、本開示の原核宿主細胞は、機能的シグナル配列に連結されていない、機能的異種タンパク質の収率を増加させる能力を留保する、ＦｋｐＡあるいはＦｋｐＡの機能的断片または機能的バリアントをコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかのまたはいずれかの実施形態では、機能的断片は、機能的異種タンパク質の収率を増加させる能力を留保する、配列番号１のアミノ酸２６〜２７０またはその断片を含む。いくつかのまたはいずれかの実施形態では、機能的バリアントは、機能的異種タンパク質の収率を増加させる能力を留保する、配列番号１のアミノ酸２６〜２７０のうちの少なくとも５０個のアミノ酸と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％同一であるアミノ酸配列を含む。

いくつかのまたはいずれかの実施形態では、機能的断片は、機能的異種タンパク質の収率を増加させる能力を留保する、シャペロンドメインである、配列番号１のアミノ酸残基２６〜１４０またはその断片、例えば、配列番号１の残基４０〜１４０を含む。例示的実施形態では、断片は、少なくとも約５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５以上のアミノ酸長である。いくつかのまたはいずれかの実施形態では、機能的バリアントは、機能的異種タンパク質の収率を増加させる能力を留保する、配列番号１の残基２６〜１４０または４０〜１４０のうち少なくとも５０個のアミノ酸と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％同一であるアミノ酸配列を含む。シャペロンドメインのそのような機能的断片および機能的バリアントは、本明細書では、「シャペロンドメイン断片」と称される。

いくつかのまたはいずれかの実施形態では、機能的断片は、機能的異種タンパク質の収率を増加させる能力を留保する、ＦｋｐＡ（すなわち、配列番号１のアミノ酸残基１４１〜２７０）またはその断片のペプチジル−プロリル異性化ドメイン、例えば、配列番号１の残基１４１〜２４９を含む。例示的実施形態では、断片は、少なくとも約５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５またはそれより長いアミノ酸長である。いくつかのまたはいずれかの実施形態では、機能的バリアントは、機能的異種タンパク質の収率を増加させる能力を留保する、配列番号１の残基１４１−２７０または１４１−２４９の少なくとも５０個のアミノ酸と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％または９５％同一であるアミノ酸配列を含む。ペプチジル−プロリル異性化ドメインのそのような機能的断片および機能的バリアントは、本明細書では、「ペプチジル−プロリル異性化ドメイン断片」と称される。

いくつかのまたはいずれかの実施形態では、ＦｋｐＡは、異なる細菌種からの配列番号１のオルソログである。実施例として、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託番号ＣＢＫ８６０６３）、Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｓａｋａｚａｋｉｉ（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託番号ＹＰ００１４４０４０９）、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託番号ＹＰ００２９２１５７４）、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｋｏｓｅｒｉ（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託番号ＹＰ００１４５６２３４）、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託番号ＮＰ７０９１２１）、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｂｏｙｄｉｉ（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託番号ＹＰ００１８８２０２０）、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託番号ＹＰ４０４９７７）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ａｌｂｅｒｔｉｉ（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託番号ＺＰ０２９０４０２１）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｆｅｒｇｕｓｏｎｉｉ（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託番号ＹＰ００２３８４３９９），Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託番号ＹＰ００３３６７８７９）、Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｋｒｉｓｔｅｎｓｅｎｉｉ（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託番号ＺＰ０４６２４６９９）、Ｅｒｗｉｎｉａ ｔａｓｍａｎｉｅｎｓｉｓ（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託番号ＹＰ００１９０９０８６），Ｅｒｗｉｎｉａ ｂｉｌｌｉｎｇｉａｅ（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託番号ＹＰ００３７４３５２０）、Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ ｔａｒｄａ（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託番号ＹＰ００３２９７２８２）、Ｓｏｄａｌｉｓ ｇｌｏｓｓｉｎｉｄｉｕｓ（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託番号ＹＰ４５５９７１）、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託番号ＮＰ４６２３５７）、およびＳｅｒｒａｔｉａ ｏｄｏｒｉｆｅｒａ（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託番号ＺＰ０６１９２６５１）が挙げられる。

前述のＦｋｐＡオルソログの配列アライメントは、図１３に提供される。配列アライメントからの情報は、前述に定義されるように、ＦｋｐＡの機能的バリアントおよび機能的断片バリアントを生成するために使用することができる。アミノ酸を欠失および変異させるための技法は、当技術分野において周知である。Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ． ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，（１９９８）（２０１１年までの全ての増補を含む）を参照されたい。概して、機能的バリアントを構築するために、非同類または同類置換あるいは欠失のいずれかが、種間で異なる位置に導入されることができ、これらの位置は、機能を留保しながら、非同類置換を可能にする傾向にある。種にわたって保存されるアミノ酸残基を伴う位置に対しては、残基が、留保されるか、または同類置換が、導入されるかのいずれかとなる。ＦｋｐＡバリアントは、本明細書に開示される方法に従って、機能的異種タンパク質の収率を増加させるための能力のために試験される。

Ｃ．Ｓｋｐ
Ｓｋｐ（配列番号２）は、１６１アミノ酸タンパク質として発現される。アミノ酸残基１〜２０は、周辺質中へのＳｋｐの分泌を指示した後、裂開され、ホモ三量体として機能する、１４１アミノ酸成熟タンパク質をもたらす、シグナル配列として機能する。成熟タンパク質配列は、配列番号４に記載されており、配列番号２のアミノ酸残基２１〜１６１に対応する。

例示的実施形態では、本開示の原核宿主細胞は、機能的シグナル配列に連結されていない、機能的異種タンパク質の収率を増加させる能力を留保する、ＳｋｐあるいはＳｋｐの機能的断片または機能的バリアントをコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかのまたはいずれかの実施形態では、機能的断片は、機能的異種タンパク質の収率を増加させる能力を留保する、配列番号２のアミノ酸２１〜１６１またはその断片を含む。例示的実施形態では、断片は、少なくとも約５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０以上のアミノ酸長である。いくつかのまたはいずれかの実施形態では、機能的バリアントは、機能的異種タンパク質の収率を増加させる能力を留保する、配列番号２の残基２１〜１６１の少なくとも５０個のアミノ酸と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％または９５％同一であるアミノ酸配列を含む。

いくつかのまたはいずれかの実施形態では、Ｓｋｐは、異なる細菌種からの配列番号２のオルソログである。

異なる細菌種からのＳｋｐオルソログの配列アライメントは、前述に定義されるように、Ｓｋｐの機能的バリアントを生成するために使用することができる。Ｓｋｐの機能的バリアントは、ＦｋｐＡに関して説明されるものと同一の一般的様式において生成される。Ｓｋｐバリアントは、本明細書に開示される方法に従って、機能的異種タンパク質の収率を増加させる能力のために試験される。

Ｄ．宿主細胞
いくつかのまたはいずれかの実施形態では、宿主細胞は、原核細胞である。本目的のための好適な原核生物として、真正細菌、例えば、グラム陰性またはグラム陽性菌、例えば、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、例えば、Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、例えば、Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃａｎｓ、およびＳｈｉｇｅｌｌａ、ならびにＢａｃｉｌｌｉ、例えば、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓおよびＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ（例えば、１９８９年４月１２日出版のＤＤ２６６，７１０に開示されるＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ ４１Ｐ）、Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂ．ｂｒｅｖｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、例えば、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、およびＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ、例えば、Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、例えば、Ｓ．ｃａｒｎｏｓｕｓ、およびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓが挙げられる。ある好ましいＥ．ｃｏｌｉクローニング宿主は、Ｅ．ｃｏｌｉ ２９４（ＡＴＣＣ ３１，４４６）であるが、他の菌株、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉＢ、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ ３１，５３７）、およびＥ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ ２７，３２５）も好適である。別の好ましいＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞は、「漏出」菌株ＣＹ１５０７０（Ｐａｌｕｈ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２４；１４（２０）：７８５１−６０（１９８６）；（ＡＴＣＣ＃４７０２２））である。これらの実施例は、限定ではなく、例証である。「漏出表現型」である、宿主細胞は、細胞外培地中への周辺質成分の放出をもたらす、変性した細胞エンベロープを伴う細胞を指す。細胞外組換えタンパク質産生は、精製の単純性、プロテアーゼ攻撃の回避、および細胞膜周辺腔中の組換えタンパク質の高レベル蓄積によって生じる、宿主細胞に及ぼす有害な影響の最小化を含む、いくつかの潜在的利点を有する。「漏出」表現型を生じさせる、いくつかの変異（自然発生または遺伝子組換え）は、当技術分野において公知である（Ｎｉ ａｎｄ Ｃｈｅｎ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．３１：１６６１−７０（２００９））。例えば、Ｂｒａｕｎリポタンパク質をコードするｌｐｐ遺伝子の変異または欠失は、Ｅ．ｃｏｌｉ外膜の浸透性を劇的に増加させることが示されている（Ｎｉ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｔｅｃｈ．ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇ．９７（６）：１３４７−５６（２００７））。

Ｅ．目的とする異種タンパク質
１．異種タンパク質は、ミスフォールディングおよび／または凝集しやすい
例示的実施形態では、異種タンパク質は、ＦｋｐＡおよびＳｋｐ（または、他のシャペロン）の不在下ではミスフォールディングまたは低フォールディング速度を伴う。異種タンパク質（例えば、哺乳類タンパク質、例えば、抗体）は、低レベルで原核細胞中に発現される、または封入体中に凝集することがよくある。そのような異種タンパク質として、成長因子（例えば、上皮成長因子、インスリン様成長因子−１）；血液凝固因子（例えば、抗血友病因子）；ホルモン（例えば、インスリン、グルカゴン、成長ホルモン、ソマトトロピン、エリスロポエチン）；サイトカイン（例えば、インターフェロン、インターロイキン；果粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、ＣＤ８６）；ケモカイン（例えば、ＣＣＬ３）；受容体（例えば、ケモカイン受容体、チロシンキナーゼ受容体）；酵素（例えば、プロテアーゼ、リパーゼ、カルボヒドラーゼ、キモシン、ＤＮＡアーゼ、プロウロキナーゼ、アルギニンデイミナーゼ、シトシンデアミナーゼ、Ｌ−アスパラギナーゼ）；酵素アクチベーター（例えば、組織型プラスミノゲンアクチベーター）；酵素インヒビター（例えば、メタロプロテアーゼの組織インヒビター）；ペプチド（例えば、ヒルジン、ニューレグリン−１断片）；抗体断片（例えば、Ｆａｂ断片）；タンパク質骨格（例えば、Ａｄｎｅｃｔｉｎｓ、Ａｆｆｉｂｏｄｉｅｓ、Ａｎｔｉｃａｌｉｎｓ、ＤＡＲＰｉｎｓ、遺伝子組換えＫｕｎｉｔｚ型インヒビター、テトラネクチン、Ａ−ドメインタンパク質、リポカリン、反復タンパク質、例えば、アンキリン反復タンパク質、免疫タンパク質、α２ｐ８ペプチド、昆虫ディフェンシンＡ、ＰＤＺドメイン、カリブドトキシン、ＰＨＤフィンガー、ＴＥＭ−１β−ラクタマーゼ、フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン、ＣＴＬＡ−４、Ｔ細胞受容体、ノッティン、ネオカルチノスタチン、糖結合モジュール４−２、緑色蛍光タンパク質、チオレドキシン）；ワクチン（例えば、インフルエンザワクチン、アンスラックスワクチン、例えば、ｒＰＡワクチン、肝炎Ｅウイルスワクチン、例えば、ＯＲＦ２ワクチン、ヒトパピローマウイルスワクチン）；毒素；ならびに免疫毒素（Ｍｉｓａｗａ ａｎｄ Ｋｕｍａｇａｉ，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ５１：２９７−３０７（１９９９）、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．２５（１）：１０５−１３（２００２）、Ｄｅｍａｉｎ，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１８（１）：２６−３１（２０００）、Ｇｅｂａｕｅｒ ＆ Ｓｋｅｒｒａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１３：２４５−５５（２００９）、Ｇｉｌｌ ＆ Ｄａｍｌｅ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ １７：６５３−５８（２００６）、Ｈｏｓｓｅ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｔｅｉｎ、Ｓｃｉ．１５：１４−２７（２００６）、Ｓｋｅｒｒａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ、１８：２９５−３−４（２００７）；Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ，ＰＬｏＳ ＯＮＥ ３（５）：ｅ２２５７（２００８）、Ｖａｈｅｄｉ ｅｔ ａｌ，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｃｈｅｍ．ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１５７（３）：５５４−６１（２００９）、Ｈａｋｉｍ ａｎｄ Ｂｅｎｈａｒ，ＭＡｂｓ．１（３）：２８１-８７（２００９））が挙げられる。異種タンパク質のドメインまたは断片もまた、本発明から恩恵を受けるであろう。

本発明から恩恵を受けるであろう異種タンパク質は、容易に表されることができる。例えば、目的とする異種タンパク質は、ストレス応答プロモーターの制御下、レポーター（例えば、ＬａｃＺ）も発現している、原核細胞中で発現することができる。ストレス応答プロモーターは、ミスフォールドしたタンパク質凝集の蓄積に応答するであろう。好適なストレス応答プロモーターとして、Ｅ．ｃｏｌｉのｉｂｐＡＢ、ｙｂｅＤ、ｙｈｇＩ、およびｙｒｆＧＨＩ遺伝子からのプロモーターが挙げられるが、それらに限定されない。Ｌｅｓｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ，１５（２）：１５３−６０（２００２）を参照されたい。さらに、本発明から恩恵を受けるであろう異種タンパク質は、パラメータ、例えば、電荷平均およびターン形成残基断片が、Ｅ．ｃｏｌｉ中の封入体形成と相関することが示されているため、予測のための基礎として、タンパク質のアミノ酸組成物のみを使用して、同定することができる（Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｈａｒｒｉｓｏｎ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．９，４４３−４４８（１９９１））。

２．ｃｉｓ−ｔｒａｎｓイソメラーゼを要求する異種タンパク質
タンパク質中の大部分のプロリン残基は、配座にエネルギー的に有利に働く。しかしながら、いくつかのタンパク質は、機能のために、ｃｉｓ配座を要求し、ペプチジル−プロリル（ｐｒｏｙｌｙ）ｃｉｓ−ｔｒａｎｓイソメラーゼは、本変換触媒作用を及ぼす。プロリルイソメラーゼのいくつかの重要な天然基質は、現在、公知であって、例えば、ヒト免疫不全ウイルス−１ビリオンのＧａｇポリペプチド、ステロイド受容体、および細胞内カルシウム放出チャネルであって、生存細胞中の種々のプロリル異性化機能を実証する（Ｇoｔｈｅｌ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．５５（３）：４２３−３６（１９９９）。したがって、例示的実施形態では、異種タンパク質は、適切なフォールディングおよび／または機能に対して、プロリン異性化に依存する。一実施形態では、プロリン異性化依存異種タンパク質は、可変軽（カッパ）鎖（Ｖκ）を含む、抗体または抗体断片を含む。

３．抗体および抗体断片
例示的実施形態では、異種タンパク質は、抗体である。用語「抗体」は、広範な意味で使用され、完全集合抗体、四量体抗体、モノクローナル抗体、多クローン性抗体、多選択性抗体（例えば、二重特異性抗体）、抗原（例えば、Ｆａｂ′、Ｆ′（ａｂ）２、Ｆｖ、一本鎖抗体、二特異性抗体）に結合する抗体断片、および所望の生物学的活性を呈する限り、前述を含む組換えペプチドを含む。「免疫グロブリン」または「四量体抗体」は、２つの重鎖および２つの軽鎖から成り、それぞれ、可変領域および定常領域を含む、四量体糖タンパク質である。抗原結合部分は、組換えＤＮＡ技法によって、または無傷抗体の酵素または化学裂開によって、産生されてもよい。抗体断片または抗原結合部分として、Ｆａｂ、Ｆａｂ′、Ｆ（ａｂ′）２、Ｆｖ、ドメイン抗体（ｄＡｂ）、Ｆｃａｂ（商標）、相補性決定領域（ＣＤＲ）断片、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、一本鎖抗体断片、フレームワーク領域によって連結されている２つのみのＣＤＲを含有する抗体分子、例えば、Ｖ_ＨＣＤＲ１−Ｖ_ＨＦＲ２−Ｖ_ＬＣＤＲ３融合ペプチド、キメラ抗体、二特異性抗体、三特異性抗体、四特異性抗体、低分子化抗体、線形抗体；キレート化組換え抗体、三量体抗体または二量体抗体、細胞内抗体、ナノ抗体、小モジュール免疫薬（ＳＭＩＰ）、抗原結合−ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質、ラクダ化抗体、ＶＨＨ含有抗体、あるいはそのバリアントまたは誘導体、および抗体が所望の生物学的活性を留保する限り、特異的抗原結合をポリペプチドにもたらすために十分な免疫グロブリンの少なくとも一部、例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つのＣＤＲ配列を含有する、ポリペプチドが挙げられる。

天然の免疫グロブリンでは、各四量体は、２つの同じ対のポリペプチド鎖から成り、各対は、１つの「軽」鎖（約２５ｋＤａ）および１つの「重」鎖（約５０〜７０ｋＤａ）を有する。各鎖のアミノ末端部分は、主に、抗原認識に関与する、約１００〜１１０個以上のアミノ酸の可変領域を含む。各鎖のカルボキシ末端部分は、主に、エフェクター機能に関与する、定常領域を定義する。ヒト軽鎖は、カッパ（κ）およびラムダ（λ）軽鎖として分類される。重鎖は、ミュー（μ）、デルタ（Δ）、ガンマ（γ）、アルファ（α）、およびエプシロン（ε）として分類され、それぞれ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＥとして、抗体のアイソタイプを定義する。軽鎖および重鎖内では、可変および定常領域は、約１２個以上のアミノ酸の「Ｊ」領域によって結び付けられ、重鎖はまた、約１０個以上のアミノ酸の「Ｄ」領域を含む。概して、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｃｈ．７（Ｐａｕｌ，Ｗ．，ｅｄ．，２ｎｄ ｅｄ．Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９））（あらゆる目的のために、参照することによって全体として組み込まれる）を参照されたい。各軽／重鎖対の可変領域は、無傷免疫グロブリンが２つの結合部位を有するように、抗体結合部位を形成する。

各重鎖は、一端に、可変ドメイン（ＶＨ）に続いて、いくつかの定常ドメインを有する。各軽鎖は、可変ドメインを一端（ＶＬ）に、定常ドメインをその他端に有する。すなわち、軽鎖の定常ドメインは、重鎖の第１の定常ドメインとアライメントされ、軽鎖可変ドメインは、重鎖の可変ドメインとアライメントされる。特定のアミノ酸残基は、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインとの間の界面を形成すると考えられる（Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７，１９８７）。

免疫グロブリン可変ドメインは、３つの超可変領域またはＣＤＲによって結び付けられる、比較的に保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）の同一の一般構造を呈する。Ｎ−末端からＣ−末端へと、両軽鎖および重鎖は、ドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、およびＦＲ４を含む。各ドメインへのアミノ酸の割当は、Ｋａｂａｔ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９８７ ａｎｄ １９９１））、またはＣｈｏｔｈｉａ ＆ Ｌｅｓｋ，（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７，１９８７）；Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，（Ｎａｔｕｒｅ３４２：８７８−８８３，１９８９）の定義に従う。

抗体の超可変領域は、抗原結合に関与する、抗体のＣＤＲアミノ酸残基を指す。超可変領域は、ＣＤＲからのアミノ酸残基（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１））によって説明されるように、軽鎖可変ドメイン中の残基２４〜３４（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）、および８９〜９７（Ｌ３）と、重鎖可変ドメイン中の３１〜３５（Ｈ１）、５０〜６５（Ｈ２）、および９５〜１０２（Ｈ３））、および／または超可変ループからのそれらの残基（Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７）によって説明されるように、軽鎖可変ドメイン中の残基２６〜３２（Ｌ１）、５０〜５２（Ｌ２）、および９１〜９６（Ｌ３）と、重鎖可変ドメイン中の２６〜３２（Ｈ１）、５３〜５５（Ｈ２）、および９６〜１０１（Ｈ３））を含む。

フレームワークまたはＦＲ残基は、超可変領域残基以外のそれらの可変ドメイン残基である。

「重鎖可変領域」は、本明細書で使用されるように、該抗体重鎖可変ドメインの少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、抗体分子の領域を指す。重鎖可変領域は、該抗体重鎖の１つ、２つ、または３つのＣＤＲを含有してもよい。

「軽鎖可変領域」は、本明細書で使用されるように、該抗体軽鎖可変ドメインの少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、抗体分子の領域を指す。軽鎖可変領域は抗体に応じて、カッパまたはラムダ軽鎖のいずれかであり得る、該抗体軽鎖の１つ、２つ、または３つのＣＤＲを含有してもよい。

カッパ軽鎖可変領域（Ｖκ）を伴う抗体または抗体断片は、本明細書に説明される方法および物質に特に好適である。Ｖκドメインは、ｃｉｓ−プロリン（Ｋａｂａｔのナンバリングでは、Ｌ８およびＬ９５）を有する。さらに、Ｐｒｏ−Ｌ９５に先行するペプチド結合のゆっくりとした異性化は、未変性Ｖ_Ｈ／Ｖ_Ｌ界面の形成のために、ｃｉｓでなければならないため、重要である。実際、Ｐｒｏ−Ｌ９５のｃｉｓ、ｔｒａｎｓ異性化は、Ｖ_ＬおよびＶ_Ｈの正しいドッキングのための律速段階である。適切なペプチジル（ｐｅｔｉｄｙｌ）−プロリル異性化の欠如は、凝集を助長する、異常通路フォールディング中間体の形成をもたらし得る。

その重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンは、異なるクラス、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭに割り当てられることができ、さらに、サブクラスまたはアイソタイプ、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２に分割されてもよい。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造および３次元構成は、周知である。異なるアイソタイプは、異なるエフェクター機能を有する。例えば、ＩｇＧ１およびＩｇＧ３アイソタイプは、ＡＤＣＣ活性を有する。本発明の抗体は、定常ドメインを含む場合、これらのサブクラスまたはアイソタイプ、あるいはそのバリアントまたは共通配列、もしくは異なるアイソタイプのハイブリッド（例えば、ＩｇＧ１／ＩｇＧ２ハイブリッド）のいずれかであってもよい。

例示的実施形態では、本発明の抗体は、ヒトカッパ（κ）またはヒトラムダ（λ）軽鎖、あるいはそこから誘導されたアミノ酸配列、もしくはそのハイブリッド、随意に、そこから誘導されたヒト重鎖または配列とともに、あるいは一本鎖、二量体、四量体（例えば、２つの重鎖および２つの軽鎖）、または他の形態中の両重および軽鎖を一緒に含むことができる。

「モノクローナル抗体」は、実質的に均一である抗体の個体群から得られる抗体を指す、すなわち、個体群を含む個々の抗体は、微量で存在し得る、可能性として考えられる自然発生変異を除き、同じである。

「抗体バリアント」は、本明細書で使用されるように、天然抗体可変領域ドメインの可変領域に少なくとも１つのアミノ酸置換、欠失、または挿入を含有する、抗体ポリペプチド配列を指す。バリアントは、非修飾抗体と実質的に相同性または実質的に同じであってもよい。

「キメラ抗体」は、本明細書で使用されるように、典型的には、異なる種に由来する、２つの異なる抗体から誘導された配列を含有する抗体を指す（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号参照）。最も典型的には、キメラ抗体は、ヒトおよび齧歯類抗体断片、概して、ヒト定常およびマウス可変領域を含む。

「中和抗体」は、それが結合する抗原の生物学的機能を排除または有意に低減させることが可能な抗体分子である。故に、「中和」抗体は、生物学的機能、例えば、酵素活性、リガンド結合、または細胞内シグナル伝達を排除あるいは有意に低減させることが可能である。

「単離された」抗体は、同定され、その天然環境の成分から分離され、復元されるものである。その天然環境の汚染成分は、抗体のための診断または治療用途に干渉するであろう物質であって、酵素、ホルモン、および他のタンパク質性または非タンパク質性溶質を含み得る。いくつかの実施形態では、抗体は、例えば、（１）Ｌｏｗｒｙ法によって判定されるように、抗体の９５重量％を上回って、好ましくは、９９重量％を上回って、（２）スピニング・カップ・シークエネーターの使用によって、Ｎ末端または内部アミノ酸配列の少なくとも１５個の残基を得るために十分な程度まで、または（３）クマーシー・ブルーもしくは銀染色を用いて、還元もしくは非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによって均一になるまで精製される。単離された抗体は、抗体の天然環境の少なくとも１つの成分が存在しないであろうため、組換え細胞内にインサイチューで抗体を含む。しかしながら、通常、単離された抗体は、少なくとも１つの精製ステップによって調製されるであろう。

Ｆ．ベクター
本発明のベクターは、概して、制御調節配列、例えば、外因性ポリペプチドを発現するために要求される、転写または翻訳調節配列を含む。好適な制御調節配列は、複製起点、プロモーター、エンハンサー、リプレッサ結合領域、転写開始部位、リボソーム結合部位、翻訳開始部位、ならびに転写および翻訳の終結部位を含むが、それらに限定されない。

いくつかのまたはいずれかの実施形態では、機能的シグナル配列に連結されていないＦｋｐＡおよび機能的シグナル配列に連結されていないＳｋｐをコードする、ポリヌクレオチドは、同一のベクター上に存在する。いくつかの実施形態では、同一のベクター上に存在するとき、ポリヌクレオチドは、オペロンを形成するように配列される、すなわち、ポリヌクレオチドの転写は、多シストロン性メッセンジャーＲＮＡを生成するであろう。いくつかのまたはいずれかの実施形態では、機能的シグナル配列に連結されていないＦｋｐＡおよび／または機能的シグナル配列に連結されていないＳｋｐをコードする、ポリヌクレオチド、ならびに機能的シグナル配列に連結されている異種タンパク質をコードする、ポリヌクレオチドは、同一のベクター上に存在する。いくつかの実施形態では、同一のベクター上に存在するとき、細胞質ＦｋｐＡおよび／またはＳｋｐをコードする、ポリヌクレオチド、ならびに異種タンパク質をコードする、ポリヌクレオチドは、それらがオペロンを形成するように配列される。いくつかの実施形態では、細胞質ＦｋｐＡをコードする、ポリヌクレオチド、可変領域軽鎖をコードする、ポリヌクレオチド、および可変領域重鎖をコードする、ポリヌクレオチドは、同一の制御配列に、適切な作用するように連結されている（すなわち、それらは、オペロンを形成する）。当業者によって理解されるであろうように、各ＦｋｐＡ−およびＳｋｐ−コードポリヌクレオチドは、宿主細胞中に適切な発現をもたらす好適な制御調節配列を有するであろう。

１．複製起点
複製起点（概して、ｏｒｉ配列と称される）は、好適な宿主細胞中でベクターの複製を可能にする。ｏｒｉの選択肢は、採用される宿主細胞のタイプに依存するであろう。宿主細胞が、原核生物である場合、発現ベクターは、典型的には、原核細胞中のベクターの自律複製を指示するｏｒｉを含む。本クラスのｏｒｉの非限定的実施例として、ｐＭＢ１、ｐＵＣ、ならびに他の細菌起点が挙げられる。

２．シグナル配列
いくつかのまたはいずれかの実施形態では、宿主細胞は、組換え生産用に異種タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含み、当該異種タンパク質は、機能的シグナル配列に連結されている。細菌細胞中の周辺質分泌のための融合ポリペプチドを指示するシグナル配列は、ｓｐＡ、ｐｈｏＡ、リボース結合タンパク質、ｐｅｌＢ、ｏｍｐＡ、ｏｍｐＴ、ｄｓｂＡ、ｔｏｒＡ、ｔｏｒＴ、およびｔｏｌＴ（ｄｅ Ｍａｒｃｏ，Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔｏｒｉｅｓ，８：２６（２００９））から誘導されるものを含む。米国特許第５，８４６，８１８号および第５，５７６，１９５号に開示されるｐｅｌＢシグナル配列は、参照することによってその全体として組み込まれる。

また、発明の範囲内に含まれるのは、原核宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）中のシグナル配列としても機能する、真核性細胞から誘導されるシグナル配列である。そのような配列は、米国特許第７，０９４，５７９号に開示されており、その内容は、参照することによって全体として組み込まれる。

Ｗａｔｓｏｎ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２：５１４５−５１６４（１９８４））は、シグナル配列の編成について開示している。米国特許第４，９６３，４９５号は、成熟タンパク質をコードする、ＤＮＡのその３′末端から５′末端において連結されている原核分泌シグナル配列ＤＮＡを使用して、宿主生物の細胞膜周辺腔中の成熟真核性タンパク質の発現および分泌について開示している。Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（Ｇｅｎｅ ５５：１８９−１９６（１９８７））は、Ｅ．ｃｏｌｉ中でｈＧＨを分泌するためのＳＴＩＩシグナル配列の使用について開示している。Ｇｒａｙ ｅｔ ａｌ．（Ｇｅｎｅ ３９：２４７−２４５（１９８５））は、ヒト成長ホルモンの天然シグナル配列の使用と、Ｅ．ｃｏｌｉ中のヒト成長ホルモンの分泌のためのＥ．ｃｏｌｉアルカリホスファターゼプロモーターおよびシグナル配列の使用について開示している。Ｗｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（Ｇｅｎｅ，６８：１９３−２０３（１９８８））は、Ｅ．ｃｏｌｉ中のＬａｍＢおよびＯｍｐＦ分泌リーダー配列に融合されているインスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）の分泌と、ｐｒｌＡ４変異の存在下におけるこれらのシグナル配列の処理効率の向上について開示している。Ｆｕｊｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．８：７７−８６（１９８８））は、Ｅ．ｃｏｌｉ中のヒト上皮成長因子（ｈＥＧＦ）の分泌のための４つの異なるＥ．ｃｏｌｉエンテロトキシンシグナル配列、ＳＴＩ、ＳＴＩＩ、ＬＴ−Ａ、およびＬＴ−Ｂの使用について開示している。Ｄｅｎｅｆｌｅ ｅｔ ａｌ．（Ｇｅｎｅ ８５：４９９−５１０（１９８９））は、成熟ヒトインターロイキン１βの分泌のためのＯｍｐＡおよびＰｈｏＡシグナルペプチドの使用について開示している。前述の文書の全ての内容は、参照することによって全体として組み込まれる。

３．選択可能マーカー
前述の要素に加え、ベクターは、選択可能マーカー（例えば、ベクターによって形質転換された宿主細胞の生存または成長のために必要なタンパク質をコードする、遺伝子）を含有してもよいが、そのようなマーカー遺伝子は、宿主細胞中に同時導入された別のポリヌクレオチド配列上にも担持され得る。選択可能遺伝子が導入されたそれらの宿主細胞のみが、選択的条件下、生存および／または成長するであろう。典型的選択遺伝子は、（ａ）抗生物質または他の毒素、例えば、アンピシリン、カナマイシン、ネオマイシン、Ｇ４１８、メトトレキサート等に対する耐性をもたらす、（ｂ）栄養要求性欠損を補完する、または（ｃ）複合培地から利用可能ではない必須栄養素を供給する、タンパク質をコードする。適切な選択可能マーカー遺伝子の選択肢は、宿主細胞に依存し、異なる宿主のための適切な遺伝子は、当技術分野において公知である。

本発明によって包含されるベクターは、組換えクローニング方法を使用して、および／または化学合成によって、得ることができる。膨大の数の組換えクローニング技法、例えば、ＰＣＲ、制限エンドヌクレアーゼ消化、およびライゲーションが、当技術分野において周知である。当業者はまた、本明細書に提供される配列データ、または当技術分野において利用可能な任意の合成手段によって、所望のベクターを得るための公共または固有のデータベース中の配列データを使用することができる。加えて、公知の制限およびライゲーション技法を使用して、適切な配列は、本発明に従って、種々のＤＮＡ源から切り取られ、外因性配列との操作性関係に統合されることができる。

Ｇ．ファージディスプレイ
本開示の物質および方法はまた、ファージディスプレイ技法において有用である。細胞質ＦｋｐＡ、ならびに本明細書に説明されるようなその機能的断片および機能的バリアントおよび／またはＳｋｐを発現するＥ．ｃｏｌｉ細胞は、ファージディスプレイの効率を向上させ、希少クローンの同定をもたらす。いくつかの実施形態では、本開示の原核宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞）は、ファージディスプレイライブラリをスクリーニングするために使用される。

ファージミドベクターから構築されたライブラリを含むファージディスプレイライブラリの構築は、その表面上、すなわち、そのカプシド上にペプチドおよびタンパク質を表すために、バクテリオファージの能力を利用する。多くの場合、線維状ファージ、例えば、Ｍ１３、ｆ１またはｆｄが、使用される。線維状ファージは、主要および微量被覆タンパク質、例えば、ｐＩＩＩの複数のコピーによって囲繞される一本鎖ＤＮＡを含有する。目的とするタンパク質は、被覆タンパク質の断片、例えば、ｐＩＩＩに融合されていてもよい。ｐＩＩＩ断片のための配列コーディングを含む、ファージミドベクターは、ヘルパーファージとともに使用され、ファージディスプレイライブラリを構築してもよい。被覆タンパク質は、カプシドの外側表面上に表される。カプシドタンパク質遺伝子とともにフレーム内に挿入されたＤＮＡ配列は、同時転写され、ファージ表面上に表される融合タンパク質またはタンパク質断片を生成する。ペプチドファージライブラリは、したがって、挿入されるゲノム配列の多様性を表す、ペプチドを表すことができる。有意に、これらのエピトープは、天然のフォールドされた配座内に表され得る。ファージディスプレイライブラリ上に発現されたペプチドは、次いで、標的分子に結合することができる、すなわち、それらは、結合パートナー分子、例えば、抗体（Ｐｅｔｅｒｓｅｎ Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２４９：４２５−３１（１９９５））、細胞表面受容体（Ｋａｙ，Ｇｅｎｅ １２８：５９−６５）（１９９３）、ならびに細胞外および細胞内タンパク質（Ｇｒａｍ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １６１：１６９−７６（１９９３））と特異的に相互作用することができる。

ペプチドをファージカプシド表面上に表すために、線維状ファージ、例えば、Ｍ１３、ｆｄ、またはｆｌを使用する概念は、最初に、Ｓｍｉｔｈによって、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２８：１３１５−１３１７（１９８５）において紹介された。ペプチドは、ファージ表面上に表され、多くの潜在的リガンドを同定する（例えば、Ｃｗｉｒｌａ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：６３７８−６３８２（１９９０）参照）。科学的および特許文献に説明される、ファージディスプレイライブラリを生成するための多数のシステムおよび方法が存在する（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｈａｐｔｅｒ １８，２００１、"Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，１９９６、Ｃｒａｍｅｒｉ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２６：５３−５８（１９９４）、ｄｅ Ｋｒｕｉｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：３９３８−４２（１９９５）、ＭｃＧｒｅｇｏｒ，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６：１５５−１６２（１９９６）、Ｊａｃｏｂｓｓｏｎ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２０：１０７０−１０７６（１９９６）、Ｊｅｓｐｅｒｓ Ｇｅｎｅ １７３：１７９−１８１（１９９６）、Ｊａｃｏｂｓｓｏｎ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｓ．１５２：１２１−１２８（１９９７）、Ｆａｃｋ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０６：４３−５２（１９９７）、Ｒｏｓｓｅｎｕ，Ｊ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍ．１６：４９９−５０３（１９９７）、Ｋａｔｚ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．２６：２７−４５（１９９７）、Ｒａｄｅｒ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：５０３−５０８（１９９７）、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９：１０２−１０８（１９９８）参照）。

典型的には、表されるべきペプチドまたはタンパク質をコードする、外因性核酸が、被覆タンパク質遺伝子、例えば、ファージの遺伝子ＩＩＩまたは遺伝子ＶＩＩＩ中に挿入される。得られた融合タンパク質は、カプシドの表面上に表され得る。タンパク質ＶＩＩＩは、タンパク質ＩＩＩに対する３個から５個のコピーと比較して、ファージあたり約２７００個のコピー中に存在する。多価発現ベクター、例えば、ファージまたはファージミドは、外因性ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡの操作および細菌中のファージ粒子の産生のために使用することができる（例えば、Ｆｅｌｉｃｉ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：３０１−３１０（１９９１）参照）。

ファージミドベクターは、多くの場合、ファージライブラリを構築するために採用される。これらのベクターは、一本鎖線維状バクテリオファージ、例えば、Ｍ１３、ｆ１、またはｆｄのゲノムからのＤＮＡ複製起点を含む。ファージミドは、オーソドックスなプラスミドベクターと同一の方法で使用することができるが、また、ＤＮＡのクローン化されたセグメントの一本鎖コピーを含有する、線維状バクテリオファージ粒子を産生するためにも使用することができる。成熟ファージ粒子上に表された産物が、細胞溶解によって放出される、二本鎖Ｔ７ベクターもまた、採用することができる。

抗体または抗体断片、例えば、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、またはＦｖは、ファージディスプレイ技法を使用して、ファージの表面上に表されてもよい。例示的抗体ファージディスプレイ法は、当業者に公知であって、例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｈａｇｅ−Ｄｉｓｐｌａｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｔｓ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｆｒｏｍ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（２００２）１７８：１−３７（Ｏ'Ｂｒｉｅｎ ａｎｄ Ａｉｔｋｅｎ，ｅｄｓ．，Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．）に説明されている。例えば、抗体または抗体断片のライブラリ（例えば、Ｖ_Ｈ−Ｖ_Ｌ対を安定化させるための遺伝子組換え分子間ジスルフィド結合を伴う、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、ｄＡｂ、Ｆｖｓ、および二特異性抗体）は、線維状ファージ、例えば、非溶解性線維状ファージｆｄまたはＭ１３の表面上に表すことができる。所望の結合特異性を伴う、抗体または抗体断片を、次いで、選択することができる。

タンパク質骨格は、ファージディスプレイ技法を使用して、ファイージの表面上に表されてもよい。例示的タンパク質骨格ライブラリとして、Ａｄｎｅｃｔｉｎｓ、Ａｆｆｉｂｏｄｉｅｓ、Ａｎｔｉｃａｌｉｎｓ、ＤＡＲＰｉｎｓ、遺伝子組換えＫｕｎｉｔｚ型インヒビター、テトラネクチン、Ａ−ドメインタンパク質、リポカリン、反復タンパク質例えば、アンキリン反復タンパク質、免疫タンパク質、α２ｐ８ペプチド、昆虫ディフェンシンＡ、ＰＤＺドメイン、カリブドトキシン、ＰＨＤフィンガー、ＴＥＭ−１β−ラクタマーゼ、フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン、ＣＴＬＡ−４、Ｔ細胞受容体、ノッティン、ネオカルチノスタチン、糖結合モジュール４−２、緑色蛍光タンパク質、チオレドキシン（Ｇｅｂａｕｅｒ ＆ Ｓｋｅｒｒａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１３：２４５−５５（２００９）、Ｇｉｌｌ ＆ Ｄａｍｌｅ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ １７：６５３−５８（２００６）、Ｈｏｓｓｅ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．１５：１４−２７（２００６）、Ｓｋｅｒｒａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ １８：２９５−３−４（２００７））が挙げられるが、それらに限定されない。

Ｈ．親和性成熟
本明細書に開示される物質および方法はまた、親和性成熟のためにも有用である。本発明による、多数の置換バリアントが、生成され、複数のファージ粒子の表面上に表され、ファージ粒子を標的タンパク質と接触させることによって、所望の標的結合特性のために選択することができる。親和性成熟は、概して、親ポリペプチドのＣＤＲ内に置換を有する、ポリペプチドバリアント、例えば、抗体バリアントを調製およびスクリーニングし、生物学的特性、例えば、親ポリペプチドに対する結合親和性を改善したバリアントを選択することを伴う。そのような置換バリアントを生成するための便宜的方法は、親和性成熟である。概説すると、いくつかの超可変領域残基（例えば、６〜７個の残基）が、全ての可能性として考えられる置換を各部位に生成するように変異される。したがって、生成された抗体バリアントは、細胞の表面上に一価様式で表される。細胞表面に表されるバリアントは、次いで、その生物学的活性（例えば、結合親和性）のためにスクリーニングされる。例えば、親和性成熟のファージディスプレイ法の、例えば、第ＷＯ９２／０１０４７号、第ＷＯ９３／１１２３６６号、第ＷＯ９５／１５３８８号、および第ＷＯ９３／１９１７２号を参照されたい。

２つの変異誘発に属する現在の抗体親和性成熟方法は、確率論的および非確率論的のカテゴリに分けられる。変異性ＰＣＲ、ミューテーター細菌菌株（Ｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６０，３５９−６８（１９９６））、および飽和変異誘発（Ｎｉｓｈｉｍｉｙａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：１２８１３−２０（２０００）；Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ，Ｐ．Ｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１７８，２６９−８５（２００２））は、確率論的変異誘発方法（Ｒａｊｐａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１０２：８４６６−７１（２００５））の典型的実施例である。非確率論的技法は、多くの場合、アラニンスキャニングまたは部位特異的変異誘発を使用して、特異的バリアントの限定集合を生成する。利用可能な方法として、パニング法を介した親和性成熟、ルックスルー型変異誘発、変異性ＰＣＲ、遺伝子部位飽和変異誘発、標的親和性成熟、およびＤＮＡシャフリング（（Ｈｕｌｓ ｅｔ ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５０：１６３−７１（２００１）、Ｚａｃｃｏｌｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８５：７７５−７８３（１９９９）、Ｋｒｅｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．３８８：３−１１（２００４）、第ＷＯ２００９／０８８９３３号、Ｓｔｅｍｍｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１：１０７４７−５１（１９９４））が挙げられる。

Ｉ．標識
いくつかの実施形態では、細胞および／または異種タンパク質は、その検出を促進するために標識される。「標識」または「検出可能部分」は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、化学的、または他の物理的手段によって検出可能な組成物である。例えば、本発明において使用するために好適な標識として、放射線活性標識（例えば、^３２Ｐ）、蛍光体（例えば、フルオレセイン）、高電子密度試薬、酵素（例えば、一般に、ＥＬＩＳＡで使用されるように）、ビオチン、ジゴキシゲニン、またはハプテン、ならびに、例えば、放射線標識をハプテンまたはペプチド中に組み込むことによって、検出可能である、ハプテンまたはペプチドとの抗体特異性反応を検出するために使用することができる、タンパク質が挙げられる。他の抗原様タグ、例えば、ＦＬＡＧタグ、Ｈｉｓタグ等も、当技術分野において公知である。

本開示において使用するために好適な標識の例として、蛍光染料（例えば、フルオレセインイソチオシアネート、テキサスレッド、ローダミン、および同等物）、放射線標識（例えば、^３Ｈ、^１２５Ｉ、^３５Ｓ、^１４Ｃ、または^３２Ｐ）、酵素（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、およびＥＬＩＳＡにおいて一般に使用されるその他）、および発色標識、例えば、コロイド金、着色ガラス、またはプラスチックビーズ（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックス等）が挙げられるが、それらに限定されない。

標識は、当技術分野において公知の方法に従って、組み込まれてもよい。

標識を検出するための手段は、当業者に周知である。したがって、例えば、標識が、放射線活性である場合、検出のための手段は、オートラジオグラフィーにおけるように、シンチレーション計数器または写真用フィルムを含む。標識が、蛍光標識である場合、適切な光の波長によって、蛍光色素を励起させ、結果として生じる蛍光発光を検出することによって検出されてもよい。蛍光発光は、電子検出器、例えば、電荷結合素子（ＣＣＤ）または光電子倍増管および同等物の使用によって、視覚的に検出されてもよい。同様に、酵素標識は、酵素のための適切な基質を提供し、結果として生じる反応産物を検出することによって検出されてもよい。発色または化学発光標識は、単に、標識に伴う色を観察することによって検出されてもよい。本発明の方法における使用のために好適な他の標識および検出システムは、当業者に容易に明白となるであろう。そのような標識された異種タンパク質は、疾患または健康状態の診断において使用することができる。

実施例１
材料および方法
ｉ．ＦｋｐＡまたはＳｋｐシャペロンを発現するプラスミドベクターの構築
ＸＬ１Ｂｌｕｅ細胞（ｒｅｃＡ１ ｅｎｄＡ１ ｇｙｒＡ９６ ｔｈｉ−１ ｈｓｄＲ１７ ｓｕｐＥ４４ ｒｅｌＡ１ ｌａｃ ［Ｆ´ ｐｒｏＡＢ ｌａｃＩｑＺΔＭ１５ Ｔｎ１０ （Ｔｅｔｒ）］）およびＴＧ１細胞（ｓｕｐＥ ｔｈｉ−１ Δ（ｌａｃ−ｐｒｏＡＢ） Δ（ｍｃｒＢ−ｈｓｄＳＭ）５ （ｒＫ−ｍＫ-） ［Ｆ´ ｔｒａＤ３６ ｐｒｏＡＢ ｌａｃＩｑＺΔＭ１５］）を、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（現在は、Ａｇｉｌｅｎｔ（Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ））から購入した。シャペロンの細胞質発現のために、未変性シグナル配列を、シャペロンＦｋｐＡ（Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔ番号Ｐ６５７６４）およびＳｋｐ（Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔ番号Ｐ０ＡＥＵ７）をコードする、遺伝子から欠失した。シャペロンの周辺質発現のために、未変性シグナル配列が含まれた。シャペロンＳｋｐ、ＦｋｐＡ、および２シストロン性Ｓｋｐ−ＦｋｐＡの細胞質または周辺質バージョンのプラスミド構築物を生成するために、シャペロン遺伝子断片を、ＰＣＲによって増幅し、次いで、プラスミドベクターｐＡＲ３（ＡＴＣＣ番号８７０２６）中にクローン化した。ベクターｐＡＲ３（Ｐeｒｅｚ−Ｐeｒｅｚ ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｅ，１９９５，１５８（１）：１４１−２）は、ｐＢＡＤプロモーターと、クロラムフェニコール抗生物質耐性をもたらす、ｃａｔ遺伝子とを含有する。また、後続実験において、全てのＦａｂまたはｓｃＦｖを共発現させるベクターのために使用された複製起点ｐＢＲ３２２（ＣｏｌＥ１）と適合性がある、ｐ１５Ａ複製起点を持つ。最初に、２つの異なる順方向プライマーを、１つの逆方向プライマーとともに、シグナル配列を伴う、または伴わない、ＰＣＲによって、ＦｋｐＡをＸＬ１Ｂｌｕｅ細胞から増幅させるように設計した。同様に、２つの順方向プライマーおよび１つの逆方向プライマーを、シグナル配列を伴う、または伴わない、ＰＣＲによって、ＳｋｐをＸＬ１Ｂｌｕｅ細胞から増幅させるように設計した。

単シストロン性シャペロンプラスミド構築物ｐＡＲ３−ＦｋｐＡ＿ｐｅｒ、ｐＡＲ３−Ｓｋｐ＿ｐｅｒ（周辺質発現に対して）およびｐＡＲ３−ＦｋｐＡ＿ｃｙｔ、ｐＡＲ３−Ｓｋｐ＿ｃｙｔ（細胞質発現に対して）を生成するために、以前のＰＣＲ反応の産物を、順方向プライマーを使用して、ＰＣＲ再増幅のための鋳型として使用し、ＢｇｌＩＩ制限部位の後、遺伝子断片をコードするシャペロンから上流のエンハンサー配列

を組み込んだ。逆方向プライマーを使用して、Ｖ５タグ配列

をｐＡＲ３−Ｓｋｐ＿ｐｅｒおよびｐＡＲ３−Ｓｋｐ＿ｃｙｔ中に、かつＦＬＡＧタグ配列

をｐＡＲ３−ＦｋｐＡ＿ｐｅｒおよびｐＡＲ３−ＦｋｐＡ＿ｃｙｔ中に、その後、制限部位ＨｉｎｄＩＩＩを組み込んだ。

２シストロン性周辺質ｐＡＲ３−Ｓｋｐ−ＦｋｐＡ＿ｐｅｒおよび細胞質ｐＡＲ３−Ｓｋｐ−ＦｋｐＡ＿ｃｙｔ構築物を生成するために、単シストロン性ＰＣＲ産物を再増幅した。Ｓｋｐを再増幅するために、順方向プライマーを、ＢｇｌＩＩを組み込んだ後、エンハンサー

およびＳｋｐの周辺質または細胞質バージョンが続くように設計した。逆方向プライマーを、Ｖ５タグ全体および最適化されたＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ（ＳＤ）配列にアニールし、ＦｋｐＡの翻訳開始をもたらすように設計した。ＦｋｐＡを再増幅するために、順方向プライマーを、Ｖ５のＣ末端部分、最適化されたＳＤ、およびＦｋｐＡの周辺質または細胞質バージョンにアニールするように設計した。逆方向プライマーを、ＦｋｐＡのＣ末端部分、ＦＬＡＧタグ配列にアニールし、ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を付加するように設計した。ＳｋｐおよびＦｋｐＡ ＰＣＲ産物を、次いで、Ｑｉａｇｅｎゲル抽出キット（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を使用して、ゲル精製し、外部順方向Ｓｋｐプライマーおよび外部逆方向ＦｋｐＡプライマーを使用して、重複伸長ＰＣＲ反応のための鋳型として使用した。図１は、シャペロン構築物の略図を示す。

ＢｇｌＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ消化ｐＡＲ３ベクターへのＢｇｌＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ消化ＰＣＲ産物のライゲーションを、次いで、ＸＬ１Ｂｌｕｅ細胞中へ電気穿孔処理し、結果として生じる構築物を、ＤＮＡシークエンシングによって確認した。

ｉｉ．Ｆａｂを発現するプラスミドベクターの構築
本研究のために使用された全てのＦａｂおよびｓｃＦｖを、トリプル６Ｈｉｓ−ｃｍｙｃ−Ｖ５タグ、アンピシリン耐性をもたらすベータラクタマーゼ遺伝子、およびｐＡＲ３ベクター（シャペロン発現ベクターのための主鎖）のｐ１５Ａ起点に適合性があるｐＢＲ３２２（ＣｏｌＥ１）複製起点を持つ、ファージミドベクター中でクローン化した。本明細書で使用される代表的カッパＦａｂは、ａ）ＸＰＡ２３（抗ＩＬ１β、ヒト）、ｂ）ＩＮＧ１（抗ＥｐＣＡＭ、ヒト）、ｃ）８３−７（抗ヒトインスリン受容体（ｈｕＩＮＳＲ）、マウス）、ｄ）ＣＦ１（抗ＴＩＥ−１、ヒト）、およびＢＭ７−２（キナーゼ標的に特異的、ヒト）であった。本明細書で使用されるラムダガストリン特異的Ｆａｂは、ａ）Ａ１０、ｂ）Ｃ１０、ｃ）Ｄ１、およびｄ）Ｅ６であった。抗原試薬ｈｕＩＮＳＲ、ＴＩＥ１−Ｆｃ、およびＩＬ１βを、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）から購入した。

ｉｉｉ．細胞質および周辺質Ｅ．ｃｏｌｉ抽出物の調製
ＴＧ１電気穿孔法適格細胞を、２つのプラスミド：ａ）シャペロン発現単シストロン性ベクターｐＡＲ３−ＦｋｐＡ＿ｐｅｒ、ｐＡＲ３−Ｓｋｐ＿ｐｅｒ、ｐＡＲ３−ＦｋｐＡ＿ｃｙｔ、ｐＡＲ３−Ｓｋｐ＿ｃｙｔ、または２シストロン性ベクターｐＡＲ３−Ｓｋｐ−ＦｋｐＡ＿ｐｅｒ、ｐＡＲ３−Ｓｋｐ−ＦｋｐＡ＿ｃｙｔとともに、ｂ）Ｆａｂ発現ベクター（または、陰性対照として使用された空プラスミドｐＡＲ３）と同時形質転換した。

シャペロンのみを発現する、細胞質および周辺質抽出物を調製するために、空ｐＡＲ３（陰性対照）あるいは単シストロン性または２シストロン性シャペロンプラスミド構築物を持つＴＧ１細胞を、一晩、３７°Ｃで、３４μｇ／ｍｌクロラムフェニコールおよび２％（ｗ／ｖ）グルコースで補充された２ＹＴ成長培地中において、成長させた。次いで、ＯＤ_６００が０．５〜０．６に到達するまで、３７°Ｃで１００ｍｌフラスコ中にてサブカルチャーを行った。次いで、シャペロンの発現を、３０°Ｃで一晩、０．２％アラビノース（ｗ／ｖ）で誘発した。その時点で、ＯＤ_６００を記録し、培養物を同一のＯＤ_６００に正規化した。細胞を、次いで、ペレット状にし、１：４の希釈で、１０ｍｌ氷冷ＰＰＢスクロース緩衝剤（Ｔｅｋｎｏｖａ（Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ，ＣＡ））中で再懸濁させた。４°Ｃで、１時間、インキュベーション後、試料を、３０分間、遠心分離し、周辺質抽出物を含有する上清を収集した。ペレットを、１０ｍｌ Ｂｕｇｂｕｓｔｅｒ（商標）溶液（Ｎｏｖａｇｅｎ（Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ））中で再懸濁させ、溶解物の粘度を低下させるための１０μｌベンゾナーゼヌクレアーゼ（Ｎｏｖａｇｅｎ）および１錠の完全ＥＤＴＡ不在プロテアーゼインヒビターカクテル（Ｒｏｃｈｅ（Ｉｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ））で補充された。氷上で１時間インキュベーション後、溶解物を、１６，０００ｇで、２０分間、４°Ｃで遠心分離し、細胞質抽出物を含有する上清を収集した。

シャペロンとともに、Ｆａｂを発現する細胞の周辺質抽出物を調製するために、Ｆａｂをおよびシャペロンプラスミド構築物（または、陰性対照として使用されるｐＡＲ３のみ）持つＴＧ１細胞を、一晩、３７°Ｃで、３４μｇ／ｍｌクロラムフェニコール、１００μｇ／ｍｌアンピシリン、および２％（ｗ／ｖ）グルコースで補充された２ＹＴ成長培地中で成長させた。次いで、ＯＤ_６００が０．５〜０．６に到達するまで、３７°Ｃで、１００ｍｌフラスコ中にてサブカルチャーを行った。０．２％アラビノース（ｗ／ｖ）の添加３０分後、ＩＰＴＧを１ｍＭの最終濃度になるまで添加し、一晩、３０°Ｃで、インキュベートした。その時点で、ＯＤ_６００を記録し、培養物を、同等のＯＤ_６００に正規化した。細胞を、次いで、ペレット状にし、１：４の希釈における１０ｍｌ氷冷ＰＰＢスクロース緩衝剤（Ｔｅｋｎｏｖａ）および１錠の完全ＥＤＴＡ不在プロテアーゼインヒビターカクテル（Ｒｏｃｈｅ）中に再懸濁させた。４°Ｃで、１時間、インキュベーション後、試料を、３０分間、遠心分離し、周辺質抽出物を含有する上清を収集した。

ｉｖ．ウエスタンブロット法
ウエスタンブロット法分析のために、周辺質および細胞質抽出物の試料（２０μｌ）を、０．７Ｍベータ−メルカプトエタノールとともに、ＳＤＳ装填緩衝剤中に懸濁させ、沸騰させ、次いで、ＮｕＰＡＧＥ ＭＯＰＳ ＳＤＳ泳動緩衝剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、ＮｕＰＡＧＥ（商標）４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓプレキャストゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））中に装填した。還元されたゲルからのタンパク質を、次いで、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ−ＳＮＡＰ−ｉ．ｄ．（商標）エレクトロブロッター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．（Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＣＡ））を使用して、ＰＶＤＦ膜に転移させた。膜を、０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）／リン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）でブロッキングし、１５分間、室温で、０．５％ＢＳＡ／ＰＢＳ中において、１：２，０００でマウス抗Ｖ５抗体（Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））（ｓｋｐ検出のため）と、または１：１，０００希釈でマウス−抗ＦＬＡＧ一次抗体（Ｓｉｇｍａ）と、その後、１：２，０００希釈でホースラディッシュペルオキシダーゼ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ））共役したヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）とともにインキュベートした後。色を、１−ＳｔｅｐＴＭＢ-Ｂｌｏｔｔｉｎｇ基質溶液（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ））で展開させた。

ｖ．ＥＬＩＳＡ
ａ．標的ＥＬＩＳＡ
機能的Ｆａｂの量を、ＥＬＩＳＡによって判定した。Ｍａｘｉｓｏｒｐ（商標）９６−ウェルプレート（Ｎｕｎｃ（Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ））を、リン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で希釈された５０μｌ／ウェル（以下の詳細参照）において、３μｇ／ｍｌまたは１μｇ／ｍｌ抗原で被覆した。ＥｐＣＡＭ（ＩＮＧ−１ Ｆａｂに結合）、ＩＬ１β（ＸＰＡ２３ Ｆａｂに結合）、およびＴＩＥ１−Ｆｃ（ＣＦ１ Ｆａｂに結合）を、３μｇ／ｍｌで被覆した。キナーゼ標的（ＢＭ７−２Ｆａｂに結合）を、２μｇ／ｍｌで被覆した。ヒトインスリン受容体（ｈｕＩＮＳＲ）（８３−７Ｆａｂに結合）を、１μｇ／ｍｌで被覆した。ビオチン化ガストリン（Ａ１０、Ｃ１０、Ｄ１、Ｅ６Ｆａｂによって認識された１４量体ペプチド）を、Ｒｅａｃｔｉ−Ｂｉｎｄ（商標）ストレプトアビジン被覆９６−ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ））上において、ＰＢＳ中で希釈された１μｇ／ｍｌで被覆した。被覆されたプレートを、一晩、４°Ｃで、インキュベートし、次いで、ＰＢＳ緩衝剤（３５０μｌ／ウェル）（ブロッキングは、ストレプトアビジン被覆プレートに対して要求されなかった）中で、５％乾燥脱脂乳（Ｃａｒｎａｔｉｏｎ（Ｎｅｓｔｌｅ，ＯＨ））でブロッキングした。プレート洗浄を、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０を伴うＰＢＳ中で実施した。Ｆａｂ、一次、および二次抗体の連続希釈を、ＰＢＳ中の５％乾燥脱脂乳中で行った。希釈されたＦａｂ（５０μｌ／ウェル）を、１時間、室温で、そのブロッキングされた抗原に結合させた。ＩＮＧ１、ＸＰＡ２３、ＣＦ１、ＢＭ７−２、Ａ１０、Ｃ１０、Ｄ１、Ｅ６ Ｆａｂの存在を、１：２，０００希釈で、ヤギ−抗ヒトＩｇＧ（Ｆ（ａｂ′）_２に特異的）（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）一次抗体の後、１：１０，０００希釈でホースラディッシュペルオキシダーゼ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＳａｎｔａＣｒｕｚ，ＣＡ））と共役したロバ抗ヤギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）を使用して確認いた。８３−７Ｆａｂの存在は、１：２，０００希釈でウサギ−抗マウスＩｇＧ［Ｆ（ａｂ′）_２に特異的］（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）一次抗体の後、１：１０，０００希釈でホースラディッシュペルオキシダーゼ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅａｓｅａｒｃｈ）と共役したヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）を使用して検出した。アッセイを、ＴＢＤ可溶性基質（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ））の添加によって展開した。反応物を、５０μｌの４．５ ＮＨ_２ＳＯ_４の添加によって急冷し、ＳＰＥＣＴＲＡｍａｘ Ｐｌｕｓ（商標）マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）によって、４０５ｎｍで読み取った。

ｂ．発現ＥＬＩＳＡ
総Ｆａｂの量を、ＥＬＩＳＡによって判定した。ＩＮＧ１、ＸＰＡ２３、ＢＭ７−２、およびＣＦ１ヒトカッパＦａｂの検出のために、Ｍａｘｉｓｏｒｐ（商標）９６−ウェルプレート（Ｎｕｎｃ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、リン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で希釈した３μｇ／ｍｌヤギ−抗ヒトカッパ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）の５０μｌ／ウェルで被覆した。８３−７マウスカッパＦａｂの検出のために、Ｍａｘｉｓｏｒｐ（商標）９６−ウェルプレートを、リン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で希釈した３μｇ／ｍｌヤギ−抗マウスカッパ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）の５０μｌ／ウェルで被覆した。ヒトラムダＡ１０、Ｃ１０、Ｄ１、およびＥ６ Ｆａｂの検出のために、９６−ウェル高結合アッセイＭａｘｉｓｏｒｐ（商標）９６−ウェルプレートを、リン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で希釈した３μｇ／ｍｌヤギ−抗ヒトラムダ（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）の５０μｌ／ウェルで被覆した。被覆されたプレートを、一晩、４°Ｃで、インキュベートし、次いで、ＰＢＳ緩衝剤（３５０μｌ／ウェル）（ブロッキングは、ストレプトアビジン被覆プレートに対して要求されなかった）中で、５％乾燥脱脂乳（Ｃａｒｎａｔｉｏｎ、Ｎｅｓｔｌｅ、ＯＨ）でブロッキングした。プレート洗浄は、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０を伴うＰＢＳで実施された。Ｆａｂ、一次および二次抗体の連続希釈を、ＰＢＳ中５％乾燥脱脂乳中で行った。希釈されたＦａｂ（５０μｌ／ウェル）を、１時間、室温で、そのブロッキングされた抗原に結合させた。Ｆａｂの存在は、１：２，０００希釈でウサギ−抗Ｖ５（Ｓｉｇｍａ）一次抗体の後、１：１０，０００希釈でホースラディッシュペルオキシダーゼ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）と共役されたヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｆｃ特異的）を使用して検出した。アッセイを、ＴＢＤ可溶性基質（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ））の添加によって展開した。反応物を、４．５Ｎ Ｈ_２ＳＯ_４の５０μｌの添加によって急冷し、ＳＰＥＣＴＲＡｍａｘ Ｐｌｕｓ（商標）マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）によって、４５０ｎｍで読み取った。

ｖｉ．表面プラズモン共鳴
周辺質抽出物中のヒトＦａｂの定量化を、Ｂｉａｃｏｒｅ ２０００装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上における表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって判定した。Ｆａｂを、ＢｉａｃｏｒｅＣＭ５センサチップ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅカタログ番号ＢＲ−１０００−１２）上に高密度で固定したヤギ−抗ヒトＩｇＧ［Ｆ（ａｂ′）２に特定的］（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈカタログ番号１０９−００６−０９７）を使用して定量化した。標準曲線を、２倍の連続希釈でのヒトＦａｂ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈカタログ番号００９−０００−００７）をアッセイ泳動緩衝剤中に希釈することによって生成し、Ｆａｂ濃度の推定に用いた。データ分析を、ＢＩＡ評価ソフトウェアＶ４．１（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ））を使用して実施した。

抗原ＥｐＣＡＭに結合した活性ＩＮＧ１ Ｆａｂの濃度およびその特異的活性（［リガンド結合（ＲＵ）］／［Ｆａｂ捕捉（ＲＵ）］ｘ［ＭＷ（Ｆａｂ）／ＭＷ（リガンド）］ｘ１００）を、同一の量のＦａｂ（ｃｙｔＦｋｐＡと共発現した、またはしなかった）をヤギ−抗ヒトＩｇＧ［Ｆ（ａｂ′）２に特異的］表面上に固定後、２μｇ／ｍｌ ＥｐＣＡＭを注入して推定した。

ｖｉｉ．ｓｃＦｖおよびＦａｂナイーブファージディスプレイライブラリ；選択およびレスキュー
ａ．計画およびレスキュー
キナーゼ標的を、製造業者のプロトコルおよび１０倍のモル過剰ビオチン試薬を使用して、Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ（Ｐｉｅｒｃｅ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ））でビオチン化した。キナーゼのビオチン化を、ＳＰＲによって確認した。次いで、ビオチン化試薬を使用して、ｓｃＦｖおよびＦａｂナイーブファージディスプレイライブラリをパニングした。

カッパｓｃＦｖナイーブライブラリを使用した１回目のファージパニングに対して、４．５ｘ１０^１２コロニー形成単位（ｃｆｕ）のファージ粒子を使用した。Ｆａｂナイーブライブラリを使用した１回目のファージパニングに対しては、Ｆａｂラムダライブラリの１．５ｘ１０^１３ｃｆｕのファージ粒子またはＦａｂカッパライブラリの１ｘ１０^１３ｃｆｕのファージ粒子を、１時間、室温で、ゆっくりと回転させながら、ＰＢＳ緩衝剤中で、１ｍｌの５％乾燥脱脂乳（Ｃａｒｎａｔｉｏｎ（Ｎｅｓｔｌｅ，ＯＨ））中でブロッキングした。したがって、２つの別個のパニング選択（１つは、Ｆａｂ−カッパライブラリから、１つは、Ｆａｂ−ラムダライブラリから）を、実施した。

ブロッキングされたファージを、２回、３０分間、ストレプトアビジン被覆磁気Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｍ−２８０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｄｙｎａｌ ＡＳ（Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙ））に対して除外した。１回目、２回目、および３回目の選択に対して、それぞれ、２００、５０、および１０ピコモルのビオチン化キナーゼ試薬を使用した。次いで、ビオチン−キナーゼを固定化し、非ビオチン化物質を除去するために、ビオチン−キナーゼを、ブロッキングされたストレプトアビジン被覆磁気Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｍ−２８０とともに、１時間、ゆっくり回転させながら、インキュベートした。キナーゼ−捕捉ビーズを、次いで、２回、ＰＢＳで洗浄した。除外されたファージを、ビオチン−キナーゼストレプトアビジンビーズとともに、９０分間、室温で、インキュベートした。

１回目のパニングに対して、ビーズを、３回、ＰＢＳ−０．０５％ Ｔｗｅｅｎで、その後、３回、ＰＢＳで、急速洗浄した（すなわち、ビーズを、磁石を使用して、溶液から引き出し、１ｍｌ洗浄緩衝剤中に再懸濁させた）。２回目のパニングに対して、ビーズを、６回、ＰＢＳ−０．０５％ Ｔｗｅｅｎで、その後、室温で、ゆっくり回転させながら、ＰＢＳ−０．０５％ Ｔｗｅｅｎで、１ｍｌ洗浄緩衝剤中での単回の１０分間洗浄、次いで、６回、ＰＢＳで、その後、ＰＢＳでの１回の１０分間の洗浄で、急速洗浄した。３回目のパニングに対して、ビーズを、６回、ＰＢＳ−０．０５％ Ｔｗｅｅｎで、その後、５分間、ＰＢＳ−０．０５％ Ｔｗｅｅｎで、４回の洗浄、次いで、ＰＢＳでの６回の急速洗浄、その後、ＰＢＳでの４回の５分間洗浄で急速に洗浄した。キナーゼ−結合ファージを、３０分間、１００ｍＭトリエチルアミン（ＴＥＡ）とともに、室温で、インキュベーションを介して溶出し、続いて、１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）で中和した。１回目および２回目のパニングから溶出したファージを使用して、ＯＤ_６００が０．５と同等になったとき、ＴＧ１ Ｅ．ｃｏｌｉ細胞を感染させた。３回目のパニングから出力されたファージを、２つのアリコートに分割した。その半分を使用して、２ＹＴ培地中で成長されたＴＧ１細胞のみを感染させ、残り半分を使用して、３４ｕｇ／ｍｌクロラムフェニコールで補充された２ＹＴ培地中で成長された細胞質シャペロンＦｋｐＡ（プラスミドｐＡＲ３−ＦｋｐＡ＿ｃｙｔから）を発現するＴＧ１細胞を感染させた。

９０ｒｐｍで振盪しながら、１時間、３７°Ｃで、感染後、細胞を遠心分離し、ペレットを、１００μｇ／ｍｌアンピシリンおよび２％（ｗ／ｖ）グルコースで補充された２ＹＴ成長培地中に再懸濁させた。再懸濁された細胞を、次いで、１００μｇ／ｍｌカルベニシリンおよび２％グルコースを含有する２ＹＴ寒天プレート上に置き、一晩、３０°Ｃで、インキュベートした。同様に、シャペロンＦｋｐＡを発現する、ＴＧ１細胞を、１００ｕｇ／ｍｌカルベニシリン、３４ｕｇ／ｍｌクロラムフェニコール、および２％グルコースを伴う２ＹＴ寒天プレート上に置き、一晩、３０°Ｃで、インキュベートした。

ファージを、感染の多重度（ＭＯＩ）約２０で、ヘルパーファージＭ１３Ｋ０７でレスキューした。本目的のために、３回目の選択出力クローンを、ＯＤ_６００約０．５まで成長させた。その時点で、細胞を、１００ｒｐｍで振盪しながら、３７°Ｃで、１時間、ヘルパーファージで感染させた。細胞ペレットを、１００ｕｇ／ｍｌアンピシリンおよび５０ｕｇ／ｍｌカナマイシンで補充された２ＹＴ培地中に再懸濁させ、一晩、２５°Ｃで、成長させた。上清中のファージを、遠心分離によって回収し、次回のパニングのために使用した。ファージ選択から生じる濃縮を推定するために、入力および出力ファージの量を滴定し、適切な抗生物質で補充された２ＹＴ寒天プレート上に置いた。

ｂ．ライブラリ選択抗体クローンからの周辺質抽出物の生成
個々のＴＧ１コロニーを採取し、１００ｕｇ／ｍｌアンピシリンおよび０．１％（ｗ／ｖ）グルコースで補充された２ＹＴ中で、３７°Ｃで、成長させた。ＦａｂまたはｓｃＦｖ発現を、次いで、ＯＤ_６００が値０．５に到達したとき、１ｍＭ ＩＰＴＧで誘発した。誘発を、一晩、３０°Ｃで、継続した。

同様に、細胞質ＦｋｐＡを発現するプラスミドを持つ、個々のＴＧ１クローンを、３回目の選択出力から採取し、１００μｇ／ｍｌアンピシリン、３４μｇ／ｍｌクロラムフェニコール、および０．１％（ｗ／ｖ）グルコースで補充された２ＹＴ成長培地中で、３７°Ｃで、成長させた。ＦｋｐＡを発現させるために、アラビノースを、ＯＤ_６００が０．５に到達したとき、３０°Ｃで、添加した。アラビノースの添加から３０分後、１ｍＭ ＩＰＴＧを添加し、ＦａｂまたはｓｃＦｖの発現を誘発し、インキュベーションを、一晩、３０°Ｃで継続した。

細菌周辺質抽出物を、ＥＤＴＡ不在プロテアーゼインヒビターカクテルタブレット（Ｒｏｃｈｅ，ＩＮ）で補充された再蒸留水（ｄｄＨ２Ｏ）中で、１：４希釈（Ｔｅｋｎｏｖａ）における氷冷ＰＰＢ溶液を使用して、標準的方法に従って調製した。結果として生じる溶解物上清（周辺質抽出物）を、以下に説明されるように、ＥＬＩＳＡによってアッセイを行った。

ｃ．抗体ファージクローンのＥＬＩＳＡスクリーニング
ＥＬＩＳＡ Ｍａｘｉｓｏｒｐ（登録商標）プレートを、一晩、４°Ｃで、ＰＢＳ中の２ｕｇ／ｍｌキナーゼ試薬で被覆した。プレートを、次いで、１時間、室温で、５％乳／ＰＢＳの３５０ｕｌ／ウェルでブロッキングした。細菌周辺質抽出物を、また、１時間、５％乾燥脱脂乳でブロッキングし、次いで、ＥＬＩＳＡプレート（５０ｕｌ／ウェル）に装填し、２時間、室温で、被覆キナーゼに結合させた。抗キナーゼｍＡｂを、陽性ＥＬＩＳＡスクリーニング対照として使用した。ＥＬＩＳＡ結合抗体断片を、１時間、室温で、１：２，０００希釈でマウス抗Ｖ５抗体（Ｓｉｇｍａ）の後、１：１０，０００希釈でホースラディッシュペルオキシダーゼ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）と共役されたヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）で検出した。ＥＬＩＳＡスクリーニングの段階後、毎ＰＢＳ−０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０（Ｔｅｋｎｏｖａ）で３回洗浄を実施した。陽性対照ｍＡｂを、１時間、室温で、ホースラディッシュペルオキシダーゼと共役されたヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）によって検出した。アッセイを、ＴＢＤ可溶性基質（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ）の添加によって展開した。反応物を、５０ｕｌの４．５Ｎ Ｈ_２ＳＯ_４の添加によって急冷し、ＳＰＥＣＴＲＡｍａｘ Ｐｌｕｓマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）によって、４５０ｎｍで読み取った。

実施例２
ｉ．Ｅ．ｃｏｌｉの周辺質中のＦａｂおよびｓｃＦｖの発現の向上
Ｅ．ｃｏｌｉペプチジルプロリルｃｉｓ／ｔｒａｎｓ異性化ＦｋｐＡ、Ｅ．ｃｏｌｉ分子シャペロンＳｋｐ、および２シストロン性Ｓｋｐ−ＦｋｐＡの共発現に応じた、カッパおよびラムダ軽鎖Ｆａｂ断片の周辺質発現を調査した。Ｅ．ｃｏｌｉ周辺質または細胞質中でのシャペロンの発現を可能にするために、シャペロンをコードする遺伝子を、その未変性シグナル配列を伴う、または伴わない、ＸＬ１Ｂｌｕｅ細胞のＥ．ｃｏｌｉ染色体から、ＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲ産物を、次いで、発現ベクターｐＡＲ３中にクローン化した。周辺質および細胞質Ｓｋｐ−ＦｋｐＡ ２シストロン性産物を、重複伸長ＰＣＲによって生成し、ｐＡＲ３中にクローン化した。シャペロンプラスミドを、最初に、Ｅ．ｃｏｌｉ ＴＧ１細胞および周辺質ならびに細胞質中に電気穿孔することによって形質転換し、抽出物を、実施例１に説明されるように、生成した。ＴＧ１細胞中のシャペロンの発現を、次いで、抗Ｖ５および抗ＦＬＡＧタグ抗体を使用して、ウエスタンブロット法によって試験し、ＳｋｐおよびＦｋｐＡの存在を検出した（図２Ａ、２Ｂ参照）。Ｓｋｐ、ＦｋｐＡおよび２シストロン性Ｓｋｐ−ＦｋｐＡは、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞質抽出物中にその周辺質シグナル配列（（−）符号参照）を伴わず、かつＥ．ｃｏｌｉ周辺質抽出物中にその周辺質シグナル配列（（＋）符号参照）を伴って、正常に発現した。当然のことながら、周辺質および細胞質抽出物の調製の間、Ｅ．ｃｏｌｉ内側膜の漏出のため、そのリーダー配列を伴わない、少量のＳｋｐおよびＦｋｐＡもまた、細菌周辺質中に見出され得、かつそのリーダー配列を伴う、少量のＳｋｐおよびＦｋｐＡもまた、細胞質中に見出され得る。

ａ．カッパ軽鎖を伴うＦａｂ
最初に、ヒトカッパ軽鎖抗ＥｐＣＡＭ ＩＮＧ１ Ｆａｂを、単シストロン性または２シストロン性シャペロン構築物を伴う、あるいは伴わずに、ＴＧ１中に発現させた。周辺質中で発現したＦａｂの総量およびタンパク質ＥｐＣＡＭに結合する活性Ｆａｂの量を、それぞれ、発現および標的ＥＬＩＳＡによって査定した。発現ＥＬＩＳＡでは、抗カッパ被覆抗体を使用して、Ｆａｂ軽鎖を検出した。Ｆａｂ重鎖を、次いで、ＣＨ１のＣ−末端上のＶ５タグを認識する抗体によって検出した（図３、灰色列参照）。標的ＥＬＩＳＡでは、Ｆａｂ特異的多クローン性抗体を使用して、被覆ＥｐＣＡＭ抗原を認識可能な機能的抗体を同定した（図３、黒色列参照）。

これらのＥＬＩＳＡ結果は、ＦｋｐＡの細胞質（シグナル配列不在）バージョンと共発現されるとき、機能的ＩＮＧ１ Ｆａｂの発現が、実質的に、増加することを実証する（左から６番目の黒色列）。また、細胞質ＦｋｐＡの存在とともに発現したＦａｂ量全体が機能的であることは、興味深い（左から６番目の灰色列）。

同様に、ヒト軽カッパ鎖抗ＩＬ１β ＸＰＡ２３ Ｆａｂを、単シストロン性または２シストロン性シャペロン構築物を伴う、あるいは伴わずに、ＴＧ１中で発現させた。周辺質中で発現したＦａｂの総量およびタンパク質ＩＬ１βに結合する活性Ｆａｂ結合の量を、それぞれ、発現（図４、灰色列）および標的ＥＬＩＳＡ（図４、黒色列）によって査定した。

これらのＥＬＩＳＡ結果は、ＦｋｐＡの細胞質（シグナル配列不在）バージョンと共発現されるとき、機能的ＸＰＡ２３ Ｆａｂの発現が、実質的に、増加することを実証する（図４、左から６番目の黒色列）。これらの結果はまた、シャペロンの存在を伴って、または伴わずに、発現されたＦａｂの総量の大部分（細胞質ＦｋｐＡを除く）が、非機能的であることを示す。

マウス軽カッパ抗ヒトインスリン受容体（ｈｕＩＮＳＲ）８３−７Ｆａｂを、単シストロン性または２シストロン性シャペロン構築物を伴う、あるいは伴わずに、ＴＧ１中で発現させた。周辺質中で発現されたＦａｂの総量およびｈｕＩＮＳＲに結合する活性Ｆａｂの量を、それぞれ、発現（図５Ａ）および標的ＥＬＩＳＡ（図５Ｂ）によって査定した。連続８３−７Ｆａｂ抗体希釈を実施した。

これらの結果は、活性８３−７Ｆａｂ収率が、細胞質ＦｋｐＡの共発現のため、改善することを示す（左から５番目の積層列）。

キナーゼ標的を認識する、ヒトカッパＢＭ７−２Ｆａｂを、ＦｋｐＡおよびＳｋｐ−ＦｋｐＡの細胞質バージョンを伴って、または伴わずに、ＴＧ１中に発現させた。以前に説明されるように、総周辺質Ｆａｂおよび抗原結合活性Ｆａｂを、それぞれ、発現（図６Ａ）および標的ＥＬＩＳＡ（図６Ｂ）によって試験した。３回（図６）または５回（図６Ｂ）の抗体希釈を実施した。

これらの結果は、両細胞質ＦｋｐＡ単独との、ならびにＥ．ｃｏｌｉの細胞質中で両ＳｋｐおよびＦｋｐＡを発現する、２シストロン性構築物との、総ＢＭ７−２Ｆａｂ発現の有意な向上を実証する。しかしながら、細胞質ＦｋｐＡ単独の共発現に応じて、活性Ｆａｂの実質的増加が存在する。

抗ＴＩＥ１−Ｆｃ Ｆａｂ ＣＦ１を、単シストロン性ＦｋｐＡおよび２シストロン性Ｓｋｐ−ＦｋｐＡ細胞質構築物を伴って、または伴わずに、ＴＧ１中で共発現させた。総収率および機能的Ｆａｂ収率を、次いで、それぞれ、発現（図７、左から最初の４つの列集合）および標的ＥＬＩＳＡ（図７、左から最後の３つの列集合）によって試験した。５回の抗体希釈を実施した。

これらのＥＬＩＳＡ結果は、細胞質ＦｋｐＡが、Ｅ．ｃｏｌｉ周辺質中の機能的ＣＦ１の発現を改善することを示す。

ｂ．ラムダ軽鎖を伴うＦａｂ
細胞質ＦｋｐＡ、ＳｋｐおよびＳｋｐ−ＦｋｐＡの存在を伴う、ＴＧ１ Ｅ．ｃｏｌｉ周辺質中の総量および活性ヒト抗ガストリンラムダ軽鎖含有Ｆａｂ Ａ１０、Ｃ１０、Ｄ１、およびＥ６の発現を、ＥＬＩＳＡによって査定した。総Ｆａｂ発現を判定するために、抗ラムダ抗体を、最初に、プレート上で被覆した。続いて、Ｆａｂ重鎖を、ＣＨ１のＣ−末端上のＶ５タグを発現する抗体によってプローブした（図８Ａ参照）。機能的Ｆａｂ特異的結合ガストリンの相対量を同定するために、Ｆａｂ特異的多クローン性抗体を使用した（図８Ｂ参照）。連続Ｆａｂ希釈を、両ＥＬＩＳＡのために使用した。

プロリン残基をｃｉｓ配座に含む、カッパ軽鎖を伴うＦａｂと異なり、活性ラムダ軽鎖Ｆａｂ（ｃｉｓ Ｐｒｏ残基を有していない）の発現収率に及ぼすＦｋｐＡの影響は、あまり明白ではない。我々の結果は、Ｃ１０およびＤ１ Ｆａｂ発現のみ、過剰細胞質ＦｋｐＡの発現から、若干、恩恵を受けることが見られたことを示す。ＦｋｐＡは、Ｅ６の発現に影響を及ぼさず、シャペロンが共発現されなかったとき、検出不可能であった。興味深いことに、ＴＧ１の細胞質中のＦｋｐＡの共発現は、ＴＧ１周辺質中のＡ１０ Ｆａｂの発現を消失させた。Ｆａｂ含有ラムダ軽鎖の発現に及ぼすＦｋｐＡの分子シャペロン機能の影響は、Ｆａｂ含有カッパ軽鎖に及ぼす影響よる予測不能であると考えられる。重要なこととして、我々の研究は、Ａ１０の発現が、実質的に、改善し、Ｅ６の発現が、細胞質２シストロン性Ｓｋｐ−ＦｋｐＡの共発現後、劇的にレスキューされたことを実証した。これらの結果は、細胞質Ｓｋｐが、Ａ１０およびＥ６ Ｆａｂの活性タンパク質収率の向上の主要因であって、ＦｋｐＡは、その支援に失敗したことを示す。

Ｓｋｐ、ＦｋｐＡ、または２シストロン性Ｓｋｐ−ＦｋｐＡの共発現に応じた、実際のＦａｂタンパク質収率を計算するために、表面プラズモン共鳴を採用し、ヒトＦａｂを捕捉する、抗ヒトＦａｂセンサチップを使用した。最も顕著なタンパク質収率改善をもたらした、シャペロンバージョンと共発現されたヒトＦａｂの周辺質抽出物を、以前のＥＬＩＳＡ結果に基づいて、試験した。標準曲線を、最初に、対照ヒトＦａｂを使用して、生成し、タンパク質濃度を、次いで、ＳＰＲ応答単位（ＲＵ）に基づいて、推定した（図９参照）。

ｉｉ．ｓｃＦｖおよびＦａｂファージライブラリの発現に及ぼす細胞質ＦｋｐＡの影響
ａ．カッパＦａｂライブラリ
我々の結果は、当然ながら、細胞質ＦｋｐＡの共発現が、Ｅ．ｃｏｌｉ周辺質中の機能的カッパ軽鎖Ｆａｂ（および、あるラムダＦａｂ）の発現を向上させることを示した。続いて、我々は、ファージディスプレイによって選択されたナイーブＦａｂまたはｓｃＦｖライブラリの発現を改善するためのＦｋｐＡの能力を試験した。最初に、３回のファージパニング選択を、実施例１に説明されるように、カッパＦａｂナイーブファージディスプレイライブラリを使用して、ビオチン化キナーゼ標的に対して実施した。３回目のパニング後、９３個の出力クローンを採取し、９６−ウェルプレート中で成長させた。Ｆａｂ発現の誘発を、以前に説明されるように実施し、周辺質抽出物を、実施例１に説明されるように、ＥＬＩＳＡによって、標的抗原への結合に対して試験した（図１０Ａ参照）。全てのプレートにおいて、ウェルＡ１およびＡ２は、陰性対照とし、ウェルＨ１２は、陽性対照とした。３回目のパニング後、９３個の付加的出力クローンを採取し、細胞質ＦｋｐＡとともに、Ｆａｂ断片を発現するように誘発した。細菌周辺質中の活性Ｆａｂの発現を、ＥＬＩＳＡによって査定した（図１０Ｂ参照）。

我々は、過剰細胞質ＦｋｐＡの発現が、シャペロンの不在下では、無かったことと比較して、６つの陽性クローンが同定されたため、Ｅ．ｃｏｌｉ周辺質中のカッパ軽鎖Ｆａｂ発現収率を改善すると結論付ける。

ｂ．ラムダＦａｂライブラリ
同様に、３回目のクローンを選定し、Ｆａｂラムダ鎖ライブラリでのパニング後、試験した。ＴＧ１細胞中のＦａｂ周辺質抽出物のＥＬＩＳＡスクリーニングは、キナーゼ標的への３２個のクローン結合を同定した（図１１Ａ）。細胞質ＦｋｐＡの共発現後、２６個のバインダーが、同定された。発現レベル（図１１Ｂ参照）は、ＦｋｐＡの存在下、明らかに高かった。

ｃ．カッパＳｃＦｖライブラリ
ファージ選択もまた、ナイーブＸＯＭＡカッパｓｃＦｖライブラリを使用して、キナーゼ標的に対して実施した。ｓｃＦｖ周辺質抽出物のＥＬＩＳＡスクリーニングは、ｓｃＦｖが、細胞質ＦｋｐＡと共発現されたとき、６５個の陽性（かつより強固な）バインダーを同定した（図１２Ｂ参照）。シャペロンの不在下では、２６個のより脆弱なバインダーのみ、同定された（図１２Ａ参照）。

したがって、ＰＰＩａｓｅ ＦｋｐＡの細胞質バージョンの共発現は、カッパｓｃＦｖファージライブラリから選択された抗体候補のａ）数、およびｂ）発現を劇的に増加させる。

実施例３
ｉ．細胞質Ｆｋｐの発現は、ファージディスプレイライブラリをパニング時、ヒットの多様性および発現を増加させる
１回目のファージパニングに対して、ナイーブＦａｂライブラリを使用して、Ｆａｂラムダライブラリの１．６ｘ１０^１３ｃｆｕのファージ粒子およびＦａｂカッパライブラリの２．２ｘ１０^１３ｃｆｕのファージ粒子を、１時間、室温で、ゆっくり回転させながら、ＰＢＳ緩衝剤中の３．５ｍｌの５％乾燥脱脂乳（Ｍａｒｖｅｌ，Ｐｒｅｍｉｅｒ Ｆｏｏｄｓ（ＵＫ））中で、ブロッキングした。ブロッキングされたファージを、２回、４５分間、ストレプトアビジン被覆磁気Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｍ−２８０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｄｙｎａｌ ＡＳ（Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙ））に対して除外した。製造業者のプロトコルおよび２０倍のモル過剰のビオチン試薬を使用して、Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ（Ｐｉｅｒｃｅ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ））でビオチン化され、ＥＬＩＳＡによって確認された、ＴＩＥ２を、ビオチン−ＴＩＥ２を固定し、非ビオチン化物質を除去するために、４５分間、ゆっくり回転させながら、ブロッキングされたストレプトアビジン被覆磁気Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｍ−２８０とともにインキュベートした。ＴＩＥ２捕捉ビーズを、次いで、２回、ＰＢＳで洗浄した。１回目、２回目、および３回目の選択に対して、１００、５０、および１０ピコモルのビオチン化ＴＩＥ２を、それぞれ、使用した。１回目に対して、除外されたファージを、２つのアリコートに分割し、一方は、ＴＧ１細胞を感染させるために使用し、他方は、ｐＡＲ３−ＦｋｐＡ＿ｃｙｔを持つＴＧ１細胞感染させるために使用した。レスキューされ、除外されたファージを使用して、９０分間、室温で、ビオチン−ＴＩＥ２ストレプトアビジンビーズとのインキュベーションによって、並行して、１回目のパニングを実施した。２回目および３回目に対する入力ファージを、１回目のＴＧ１感染または１回目のｐＡＲ３−ＦｋｐＡ＿ｃｙｔを伴うＴＧ１のいずれかからの別個のレスキューによって生成した。

１回目のパニングに対して、ビーズを、５分間（すなわち、ビーズを、磁石を使用して、溶液から引き出し、１ｍｌ洗浄緩衝剤中に再懸濁させ、５分間、ゆっくりと回転させた）、３回、ＰＢＳ−０．０５％ Ｔｗｅｅｎで、その後、３回、ＰＢＳで洗浄した。２回目のパニングに対して、ビーズを、５分間、６回、ＰＢＳ−０．０５％ Ｔｗｅｅｎで洗浄し、その後、６回、５分間、ＰＢＳで洗浄した。３回目のパニングに対して、ビーズを、５分間、８回、ＰＢＳ−０．０５％ Ｔｗｅｅｎで洗浄し、その後、８回、５分間、ＰＢＳで洗浄した。ＴＩＥ２結合ファージを、３０分間、１００ｍＭトリエチルアミン（ＴＥＡ）で、室温で、インキュベーションを介して溶出し、続いて、１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）で中和した。各回のパニングから溶出されたファイージを使用して、ＯＤ_６００が０．５と同等になったとき、ＴＧ１ Ｅ．ｃｏｌｉ細胞またはｐＡＲ３−ＦｋｐＡ＿ｃｙｔを伴うＴＧ１のいずれかを感染させた。ＴＧ１細胞を、２ＹＴ培地中で成長させ、細胞質シャペロンＦｋｐＡ（プラスミドｐＡＲ３−ＦｋｐＡ＿ｃｙｔ由来）を発現する、ＴＧ１細胞を、３４μｇ／ｍｌクロラムフェニコールで補充された２ＹＴ培地中で成長させた。

１時間、３７°Ｃで、感染後、細胞を遠心分離し、ペレットを、１００μｇ／ｍｌカルベニシリンおよび２％（ｗ／ｖ）グルコースで補充された２ＹＴ成長培地中に再懸濁させた。再懸濁された細胞を、次いで、１００μｇ／ｍｌカルベニシリンおよび２％グルコースを含有する２ＹＴ寒天プレート上に置き、一晩、３０°Ｃで、インキュベートした。同様に、シャペロンＦｋｐＡを発現する、ＴＧ１細胞を、１００μｇ／ｍｌカルベニシリン、３４μｇ／ｍｌクロラムフェニコール、および２％グルコースを伴う、２ＹＴ寒天プレート上に置き、一晩、３０°Ｃで、インキュベートした。

ファージを、感染の多重度（ＭＯＩ）約２０で、ヘルパーファージＭ１３Ｋ０７でレスキューした。本目的のために、１回目および２回目の選択出力クローンを、ＯＤ_６００約０．５まで成長させた。その時点で、細胞を、１００ｒｐｍで振盪させながら、３７°Ｃで、１時間、ヘルパーファージで感染させた。細胞ペレットを、１００μｇ／ｍｌカルベニシリンおよび５０μｇ／ｍｌカナマイシンで補充された２ＹＴ培地中に再懸濁させ、一晩、２５°Ｃで、成長させた。上清中のファージを、遠心分離によって回収し、次回のパニングのために使用した。ファージ選択から生じた濃縮を推定するために、入力および出力ファージの量を滴定し、適切な抗生物質で補充された２ＹＴ寒天プレート上に置いた。

周辺質抽出物の生成およびＥＬＩＳＡスクリーニングは、ブロッキングを要求しなかった、Ｒｅａｃｔｉ−Ｂｉｎｄ（商標）ストレプトアビジン被覆９６−ウェルプレート上に被覆されたビオチン−ＴＩＥ２によって、実施例１のプロトコルに従って行った。競合ＥＬＩＳＡを、個々のクローンの親和性を概算するために実施した。競合ＥＬＩＳＡのためのプロトコルは、前述のスクリーニングＥＬＩＳＡに類似するが、非ビオチン化ＴＩＥ２を、０、１、１０、および１００ｎＭ濃度で、ブロッキングされた周辺質抽出物に添加し、ＥＬＩＳＡプレートに添加される前に、１時間、インキュベートした。ＴＩＥ２の各濃度に対する４５０ｎｍでのＯＤを、ＴＩＥ２が周辺質抽出物に添加されなかったときの４５０ｎｍでのＯＤと比較した。プレート上に被覆されたＴＩＥ２−ビオチンに対するＦａｂの結合と比較して、周辺質抽出物と混合されたＴＩＥ２の最低濃度（ＴＩＥ２を伴うＡ４５０と、ＴＩＥ２＜０．６を伴わないＡ４５０の比率）は、周辺質抽出物中の抗体断片の親和性を示した（Ｓｉｄｈｕ ｅｔ ａｌ，ＪＭＢ，３３８：２９９−３１０（２００４）、Ｄｅｓｈａｙｅｓ ｅｔ ａｌ，Ｃｈｅｍ．＆ Ｂｉｏｌ．，９：４９５−５０５（２００２））。

各パニング群、ＴＧ１または細胞質ＦｋｐＡ（ＴＧ１＋ｃｙｔＦｋｐＡ）を発現するＴＧ１から、９３個のクローンを、ＴＩＥ２への結合に対してスクリーニングした。ＴＧ１およびＴＧ１＋ｃｙｔＦｋｐＡパニングは、それぞれ、４７および４３と、ほぼ等しいヒット数（背景シグナルを３倍上回るＯＤ_４５０）をもたらした。しかしながら、ＴＧ１＋ｃｙｔＦｋｐＡパニングからのヒットは、これらのヒットのうちの４０％が、背景を１２倍上回るＯＤ_４５０を有していた一方、ＴＧ１ヒットに対しては、１５％のみ、背景を１２倍超上回ったため、より良好に発現すると考えられた。ＴＧ１＋ｃｙｔＦｋｐＡパニングはまた、より多様性を有し、４７クローン中４０が、一意の抗体断片であった一方、ＴＧ１パニングに対しては、４７クローン中１５のみであった（図１４）。

一意のクローン（ＴＧ１由来１５およびＴＧ１＋ｃｙｔＦｋｐＡ由来４０）からの周辺質抽出物を、次いで、競合ＥＬＩＳＡで使用した。ＴＧ１＋ｃｙｔＦｋｐＡでのパニングにおいて選択されたより高い割合のクローンが、依然として、周辺質抽出物と混合されたＴＩＥ２のあらゆる濃度の存在下、ＥＬＩＳＡプレートに結合可能であった（図１５）。パニングプロセスの間の細胞質ＦｋｐＡの発現は、選択されたクローンの多様性を増加させ、この多様性の増加は、選択された高親和性クローンの増加につながる。

実施例４
ｉ．Ｆｋｐの細胞質発現は、ファージ上のＦａｂ抗体断片の表示を増加させる
それぞれ、ラムダまたはカッパ軽鎖のいずれかを伴う、ＦａｂのＸＯＭＡライブラリを発現する、ファージミドも担持する、ＴＧ１またはｐＡＲ３−ＦｋｐＡ＿ｃｙｔ（ＴＧ１＋ｃｙｔＦｋｐＡ）を持つＴＧ１の１リットルの培養物を、ＯＤ_６００＝０．１で開始した。これらの４つの培養物を、ＯＤ_６００が０．５に到達するまで、２％グルコース（ｗ／ｖ）および１００μｇ／ｍｌカルベニシリンで補充された２ＹＴ培地中で、２５０ｒｐｍで振盪させながら、成長させた。クロラムフェニコール（３４μｇ／ｍｌ）もまた、ＴＧ１＋ｃｙｔＦｋｐＡに添加した。細胞を、次いで、ＭＯＩ２０で、Ｍ１３Ｋ０７ヘルパーファージで感染させた。感染は、３０分は、振盪させず、３０分は、１００ｒｐｍで振盪させながら、１時間、３７°Ｃで行った。感染後、培地を、１００μｇ／ｍｌカルベニシリン、５０μｇ／ｍｌカナマイシンで補充された２ＹＴに変更し、ＴＧ１＋ｃｙｔＦｋｐＡ培養物はまた、３４μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを有していた。試料（５０ｍｌ）を、ヘルパーファージで感染開始から、８時間および２５時間後、各培養物から採取した。これらを遠心分離し、６０°Ｃまで加熱し、細菌を除去した。ファージを１５％グリセロール中に、−８０°Ｃで保存した。

８時間および２５時間の時点で採取された試料を、ＰＥＧ沈殿させ、ファージを濃縮した。これらの試料の連続希釈を、ＰＢＳ中３％乳中で行い、一晩、４°Ｃで、ＰＢＳ中の１：１０００希釈における抗Ｍ１３（２７−９４２０−０１、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）またはＰＢＳ中１：２０００希釈における抗Ｖ５（Ｖ−８０１２、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で被覆したＭａｘｉｓｏｒｐプレートに、１時間、室温で、適用し、次いで、１時間、室温で、ＰＢＳ中３％乳でブロッキングした。ファージを、１時間、室温で、ＰＢＳ中３％乳中１：５０００希釈における抗Ｍ１３−ＨＲＰ（２７−９４２１−０１、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で検出した。アッセイを、ＴＭＢ可溶性基質（５０−７６−１１、ＫＰＬ）の添加によって展開した。反応物を、５０ｕｌの２Ｎ Ｈ_２ＳＯ_４の添加によって急冷し、ＳＰＥＣＴＲＡＭａｘ（登録商標）Ｐｌｕｓマイクロプレートリーダーによって、４５０ｎｍで読み取った。希釈集合に対するＥＣ_５０を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを使用して、シグモイド型用量反応曲線を適合することによって計算した。Ｖ５−タグが、ファージ上に表されるＦａｂ分子の存在を示す、抗Ｖ５ ＥＬＩＳＡからのＥＣ_５０の逆数を、抗Ｍ１３ ＥＬＩＳＡからのＥＣ_５０の逆数で除算し、各比率をＴＧ１細胞中のレスキューの２５時間の時点に対して計算した比率と比較することによって、Ｆａｂ表示の相対的レベルを計算した（図１６）。集菌のための通常時間である、２５時間の時点では、ＦｋｐＡの細胞質発現とともに行われたレスキューは、ＦｋｐＡ発現を伴わないライブラリレスキューの３．５倍超の表示を有していた。したがって、ファージライブラリ産生のための本シャペロンの使用は、ライブラリの質を増加させる。

実施例５
ｉ．ＩＮＧ１ Ｆａｂおよび細胞質ＦｋｐＡを発現する３シストロン性プラスミドの構築
Ｅ．ｃｏｌｉ周辺質中でＩＮＧ１（抗ＥｐＣＡＭ）Ｆａｂを発現するファージミドベクター（実施例１参照）を、Ｍ１３ファージｐＩＩＩタンパク質をコードする、遺伝子断片を細胞質発現したシャペロンｃｙｔＦｋｐＡ（その未変性シグナル配列を伴わないＦｋｐＡ）と置き換えるように修飾した。２つの非アンバー終止コドンを、トリプル検出タグ（６Ｈｉｓ−ｃｍｙｃ−Ｖ５；特許出願第ＷＯ２０１０／０４００７３Ａ１号に説明される）の下流に追加した。ｃｙｔＦｋｐＡをコードする、遺伝子断片を、エンハンサー配列およびＣ末端ＦＬＡＧタグとともに、ベクターｐＡＲ３−ＦｋｐＡ＿ｃｙｔから、ＰＣＲによって増幅し（実施例１に説明される）、ＩＮＧ１ Ｆａｂを発現する、プラスミド中にクローン化し、ＩＮＧ１ Ｆａｂおよび細胞質ＦｋｐＡを発現する、３シストロン性プラスミドを産生した（図１７Ａ）。

周辺質リーダー配列を伴わないＦｋｐＡ（（−）符号参照）を、ＩＮＧ１ ＦａｂとともにｃｙｔＦｋｐＡを共発現する３シストロン性プラスミドを持つＴＧ１細胞中で発現させた（図１７Ｂ）。周辺質抽出物を、クロラムフェニコールを伴わない（アンピシリンのみ）選択と、１ｍＭ ＩＰＴＧを使用するＩＮＧ１ ＦａｂおよびｃｙｔＦｋｐＡの同時誘発とを使用して、実施例１に説明されるように、生成した。

Ｅ．ｃｏｌｉ周辺質中のＩＮＧ１ Ｆａｂの総量および機能量を、以前に説明されるように、発現および標的ＥＬＩＳＡによって査定した。これらの結果は、ｃｙｔＦｋｐＡの共発現に応じて、総Ｆａｂレベル（図１７Ｃ参照）およびＥｐＣＡＭ結合（図１７Ｄ参照）両方の発現の実質的改善を示した。これは、単一プラスミドベクター中の単一プロモーターの制御下、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞質中のｃｙｔＦｋｐＡの異種共発現の有用性を実証する。

周辺質ＩＮＧ１ Ｆａｂ収率を、実施例１に説明されるように、ＳＰＲによって計算した。標準曲線に基づいて推定されるタンパク質収率のＳＰＲセンサーグラムおよびチャートは、それぞれ、図１８Ａおよび１８Ｂに示される。結論として、ＩＮＧ１ Ｆａｂ（１４．２μｇ／ｍｌ）の総収率は、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞質中のｃｙｔＦｋｐＡの共発現に応じて、劇的に増加した。抗原ＥｐＣＡＭに結合された活性ＩＮＧ１ Ｆａｂの量およびその特異的活性もまた、実施例１に説明されるように、計算した。図１８Ｃは、ｃｙｔＦｋｐＡの共発現が、機能的ＩＮＧ１ Ｆａｂの量を増加させたことを示す。その特異的活性は、不変のままであった。

実施例６
ｉ．「漏出」Ｅ．ｃｏｌｉ菌株ＣＹ１５０７０からのＩＮＧ１ Ｆａｂタンパク質収率に及ぼす細胞質ＦｋｐＡの影響
組換え抗体断片（または、他のタンパク質）を細胞外培地中に運ぶことを可能にする、Ｅ．ｃｏｌｉ（漏出）菌株の使用は、周辺質抽出物を生成する必要性を排除し得る。これは、高処理量スクリーニングプロセスを大幅に加速させ、コストおよび製造時間を削減し得る。ヒト軽鎖カッパ抗ＥｐＣＡＭ ＩＮＧ１ Ｆａｂを、シャペロンプラスミドｐＡＲ３−ＦｋｐＡ＿ｃｙｔを伴って、または伴わずに、漏出菌株ＣＹ１５０７０中に発現させた（Ｐａｌｕｈ ｅｔ ａｌ．、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２４；１４（２０）：７８５１−６０（１９８６））。ＣＹ１５０７０電気穿孔法適格細胞（ＡＴＣＣ＃４７０２２）を、確立されたプロトコル（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２０：４２−４４（１９９６））に従って調製し、単独で、またはシャペロン発現単シストロン性ベクターｐＡＲ３−ＦｋｐＡ＿ｃｙｔ（実施例１に説明されるベクター）とともに、またはいずれかにおいて、ＩＮＧ１ Ｆａｂを発現する、プラスミドベクターで形質転換した。Ｆａｂ単独またはｃｙｔＦｋｐＡとともに発現する、ＣＹ１５０７０細胞の周辺質抽出物を、実施例１に説明されるように、調製した。細胞上清を、細胞遠心分離後、収集した。ＩＮＧ１ ＦａｂおよびｐＡＲ３−ＦｋｐＡ＿ｃｙｔシャペロンプラスミドを持つＴＧ１細胞からの周辺質抽出物を、後続ＥＬＩＳＡアッセイのための陽性対照として使用した。周辺質中で発現したＩＮＧ１ Ｆａｂの総量およびＩＮＧ１標的抗原ＥｐＣＡＭに結合する活性ＩＮＧ１ Ｆａｂの量を、それぞれ、発現および標的ＥＬＩＳＡによって査定した。発現ＥＬＩＳＡでは、抗カッパ被覆抗体を使用して、Ｆａｂ軽鎖を検出した。Ｆａｂ重鎖を、次いで、ＣＨ１のＣ−末端上のＶ５タグを認識する抗体によって検出した（図１９Ａ参照）。標的ＥＬＩＳＡでは、Ｆａｂ特異的多クローン性抗体を使用して、被覆ＥｐＣＡＭ抗原を認識可能な機能的抗体を同定した（図１９Ｂ参照）。ＣＹ１５０７０の上清中のＦａｂの量を、実施例１に説明されるように、ＥＬＩＳＡによって試験した。発現ＥＬＩＳＡ（図１９Ａ）は、ＣＹ１５０７０の上清中に見出されるＩＮＧ１ Ｆａｂの総量が、Ｆａｂが細胞質ＦｋｐＡと共発現されるときのみ、ＴＧ１細胞の周辺質中で発現される総Ｆａｂより、若干、多くなることを実証する。本シャペロンの不在下では、Ｆａｂは、ＣＹ１０５７０の周辺質中に発現しないが、一部のＦａｂは、上清中に存在し得る。

標的ＥＬＩＳＡ結果（図１９Ｂ）は、ＣＹ１５０７０周辺質および上清中の機能的ＩＮＧ１ Ｆａｂのレベルが、細胞質ＦｋｐＡと共発現されるときのみ、ＴＧ１細胞の周辺質中に発現される活性Ｆａｂのレベルに類似することを示す。これらの見解は、ＣＹ１５０７０ Ｅ．ｃｏｌｉ細胞中のＩＮＧ１ Ｆａｂのフォールディングにおける本シャペロンの重要性を強調する。

Claims (39)

1. （ａ）（ｉ）機能的シグナル配列に連結されていないＦｋｐＡもしくはその機能的断片または（ｉｉ）機能的シグナル配列に連結されていないＳｋｐもしくはその機能的断片をコードするポリヌクレオチド、および
   （ｂ）機能的シグナル配列に連結されている異種タンパク質をコードするポリヌクレオチド
   を含む、異種タンパク質を発現する組換え生産用の原核宿主細胞。
2. 機能的シグナル配列に連結されていないＦｋｐＡまたはその機能的断片をコードするポリヌクレオチドを含む、請求項１に記載の宿主細胞。
3. 機能的シグナル配列に連結されていないＳｋｐまたはその機能的断片をコードするポリヌクレオチドを含む、請求項１に記載の宿主細胞。
4. 機能的シグナル配列に連結されていないＳｋｐまたはその機能的断片をコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項２に記載の宿主細胞。
5. エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、サルモネラ・ティフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉ）、シュードモナス・エルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、ラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ）、スタフィロコッカス・カルノーサス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｒｎｏｓｕｓ）、およびセラチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃａｎｓ）から成る群より選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の宿主細胞。
6. 前記異種タンパク質が、ＦｋｐＡおよびＳｋｐの不在下ではミスフォールディングまたは低フォールディング速度を伴う、請求項１〜５のいずれか一項に記載の宿主細胞。
7. 前記異種タンパク質のフォールディングが、プロリン異性化に依存する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の宿主細胞。
8. 前記異種タンパク質が、繊維状ファージコートタンパク質またはその断片に融合されている、請求項１〜７のいずれか一項に記載の宿主細胞。
9. 前記異種タンパク質が抗体である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の宿主細胞。
10. 前記抗体が、Ｆｖ、ジスルフィド結合Ｆｖ、ｓｃＦｖ、カッパ軽鎖断片、ラムダ軽鎖断片、ｄＡｂ、およびＦａｂ断片から成る群より選択される抗体断片である、請求項９に記載の宿主細胞。
11. 前記ＦｋｐＡの機能的断片が、シャペロンドメイン断片である、請求項１〜２および４〜１０のいずれか一項に記載の宿主細胞。
12. 前記シャペロンドメイン断片が、配列番号１のアミノ酸２６〜１４０を含む、請求項１１に記載の宿主細胞。
13. 前記シャペロンドメイン断片が、配列番号１のアミノ酸２６〜１４０のうち少なくとも１００個のアミノ酸と少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１１に記載の宿主細胞。
14. 前記ＦｋｐＡの機能的断片が、ペプチジルプロリルイソメラーゼドメイン断片である、請求項１〜２および４〜１０のいずれか一項に記載の宿主細胞。
15. 前記ペプチジルプロリルイソメラーゼドメイン断片が、配列番号１のアミノ酸１４１〜２７０を含む、請求項１４に記載の宿主細胞。
16. 前記ペプチジルプロリルイソメラーゼドメイン断片が、配列番号１のアミノ酸１４１〜２７０のうちの少なくとも１００個のアミノ酸の断片と少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１４に記載の宿主細胞。
17. 前記Ｓｋｐの機能的断片が、配列番号２のアミノ酸２１〜１６１を含む、請求項３〜１４のいずれか一項に記載の宿主細胞。
18. 請求項１〜１７のいずれか一項に記載の少なくとも１０^３個の異なる原核宿主細胞を含み、そのような宿主細胞がそれぞれ異なる異種タンパク質を発現する、複数の細胞。
19. 請求項１〜１７のいずれか一項に記載の少なくとも１０^３個の異なる原核宿主細胞を含み、そのような宿主細胞がそれぞれ異なる異種タンパク質を発現する、請求項１８に記載の複数の細胞。
20. 原核宿主細胞における機能的異種タンパク質の組換え生産を増加させる方法であって、
    （ａ）（ｉ）機能的シグナル配列に連結されていないＦｋｐＡもしくはその機能的断片または（ｉｉ）機能的シグナル配列に連結されていないＳｋｐもしくはその機能的断片をコードするポリヌクレオチド、および
    （ｂ）機能的シグナル配列に連結されている異種タンパク質をコードするポリヌクレオチド
    を共発現させる工程を含み、
    それによって、産生される機能的異種タンパク質の量が、（ａ）の不在下での（ｂ）の発現と比較して増加する、方法。
21. 前記異種タンパク質に連結されている機能的シグナル配列が、周辺質への分泌を指示する、請求項２０に記載の方法。
22. 前記宿主細胞が、（ａ）機能的シグナル配列に連結されていないＦｋｐＡまたはその機能的断片をコードするポリヌクレオチドと、（ｂ）機能的シグナル配列に連結されていないＳｋｐまたはその機能的断片をコードするポリヌクレオチドとを含む、請求項２０に記載の方法。
23. 前記原核宿主細胞が、エシェリヒア・コリ、サルモネラ・ティフィムリウム、バチルス・サブティリス、バチルス・リケニフォルミス、バチルス・メガテリウム、バチルス・ブレビス、シュードモナス・エルギノーサ、シュードモナス・フルオレッセンス、ラルストニア・ユートロファ、スタフィロコッカス・カルノーサス、およびセラチア・マルセッセンスから成る群より選択される、請求項２０〜２２のいずれか一項に記載の方法。
24. 前記異種タンパク質が、ＦｋｐＡおよびＳｋｐの不在下ではミスフォールディングまたは低フォールディング速度を伴う、請求項２０〜２３のいずれか一項に記載の方法。
25. 前記異種タンパク質のフォールディングが、プロリン異性化に依存する、請求項２０〜２３のいずれか一項に記載の方法。
26. 前記異種タンパク質が、繊維状ファージコートタンパク質またはその断片に融合されている、請求項２０〜２５のいずれか一項に記載の方法。
27. 前記異種タンパク質が抗体である、請求項２０〜２６のいずれか一項に記載の方法。
28. 前記抗体が、Ｆｖ、ジスルフィド結合Ｆｖ、ｓｃＦｖ、カッパ軽鎖断片、ラムダ軽鎖断片、ｄＡｂ、およびＦａｂ断片から成る群より選択される抗体断片である、請求項２７に記載の方法。
29. 前記ＦｋｐＡの機能的断片がシャペロンドメイン断片である、請求項２０〜２８のいずれか一項に記載の方法。
30. 前記シャペロンドメイン断片が、配列番号１のアミノ酸２６〜１４０を含む、請求項２９に記載の方法。
31. 前記シャペロンドメイン断片が、配列番号１のアミノ酸２６〜１４０のうち少なくとも１００個のアミノ酸と少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項２９に記載の方法。
32. 前記ＦｋｐＡの機能的断片が、ペプチジルプロリルイソメラーゼドメイン断片である、請求項２０〜２８のいずれか一項に記載の方法。
33. 前記ペプチジルプロリルイソメラーゼドメイン断片が、配列番号１のアミノ酸１４１〜２７０を含む、請求項３２に記載の方法。
34. 前記ペプチジルプロリルイソメラーゼドメイン断片が、配列番号１のアミノ酸１４１〜２７０のうちの少なくとも１００個のアミノ酸の断片と少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項３２に記載の方法。
35. 前記Ｓｋｐの機能的断片が、配列番号２のアミノ酸２１〜１６１を含む、請求項２０〜３４のいずれか一項に記載の方法。
36. 前記宿主細胞が漏出表現型を有する、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の宿主細胞または請求項２０〜３５のいずれか一項に記載の方法。
37. 前記（ａ）のポリヌクレオチドおよび前記（ｂ）のポリヌクレオチドが、同一の制御調節配列に、適切に作用するように連結されている、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の宿主細胞または請求項２０〜３５のいずれか一項に記載の方法。
38. 前記（ａ）のポリヌクレオチドおよび前記（ｂ）のポリヌクレオチドが、同一のプラスミド上にある、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の宿主細胞または請求項２０〜３５のいずれか一項に記載の方法。
39. 前記（ａ）のポリヌクレオチドおよび前記（ｂ）のポリヌクレオチドが、異なるプラスミド上にある、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の宿主細胞または請求項２０〜３５のいずれか一項に記載の方法。

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