CN103477267A

CN103477267A - 可变取向照明模式旋转器

Info

Publication number: CN103477267A
Application number: CN2011800688162A
Authority: CN
Inventors: J.R.库珀
Original assignee: Applied Precision Inc
Current assignee: Leica Microsystems CMS GmbH
Priority date: 2011-03-01
Filing date: 2011-10-31
Publication date: 2013-12-25
Anticipated expiration: 2031-10-31
Also published as: WO2012118530A1; JP5907998B2; EP2681606A1; US20130342886A1; EP2681606B1; EP2681606A4; US9753265B2; JP2014514592A; CN103477267B

Abstract

公开了可变取向照明模式旋转器（“IPR”），其可以并入构造的照明显微镜仪器来使干涉模式快速旋转。IPR包括旋转选择器和至少一个镜群。该旋转选择器持续简短时段地将光束引导到镜群中的每一个内。每个镜群在束上给予特定的预定旋转角。因此，从IPR输出的束旋转通过由镜群中的每个所给予的旋转角中的每个。旋转选择器使IPR能够使束在大约5毫秒或更快地旋转通过每个预定旋转角。

Description

可变取向照明模式旋转器

相关申请的相交引用

该申请要求2011年3月1日提交的美国临时专利申请号61/447,708的权益；其的公开通过引用而全部合并于此。

技术领域

本公开涉及荧光显微镜，并且特别地涉及改变用于照亮标本样本的干涉条纹模式的取向的系统。

背景技术

与在细胞生物学中使用的常规宽场荧光显微镜相比，三维构造的照明显微镜（“3D-SIM”）在横向和轴向分辨率上实现提高了1/2。与某些竞争超分辨率技术不同，3D-SIM不需要专门的荧光染料或蛋白质。生物学家用3D-SIM实现高的分辨率，但保留方便且熟悉的荧光标记技术。利用移位和旋转照明模式来做出对象的多个图像。更高的分辨率可以通过对方程组求解来恢复通常由衍射而模糊的细微空间细节而实现。

当前可用的商业3D-SIM仪器使用线性偏振激光束，其通过二进制相位光栅而分裂成三个或以上的束。每个束对应于不同的衍射级，其中光功率中的大部分集中在前三个衍射级（分别是第0和第±1）上。第0和第±1级束聚焦到显微镜物镜的后焦面上并且组合以在标本体积中形成三维干涉条纹模式。通过获取由条纹模式激发的荧光图像、使光栅移动五分之一周期（近似五微米）、然后获取另一个图像并且对总共五个图像重复这些步骤来采集3D-SIM数据。光栅然后旋转60度，并且重复五图像过程，接着是另一旋转和另外的五个图像（对于每z步骤总共15个图像），其中z步骤是z轴上的固定点（与穿过物镜的光轴一致）。典型地，对于每栈总共120个图像，期望至少八个z步骤。这些图像用于对线性方程组求解来恢复3D可选分段的图像，其中获得的分辨率是常规宽场显微镜的近似两倍。牵涉的图像采集时间是可预见的。激光暴露可跨越5-100ms，摄像机读出可跨越每全帧约50ms，光栅运动和安置可跨越几十毫秒，并且光栅/偏振板组装件的旋转可大体上跨越整一秒；从而导致10-20秒的3D-SIM栈采集时间。由于上文描述的原因，工程师、科学家和显微镜制造商一直在搜寻用于使干涉模式旋转的更快速系统和方法。

发明内容

公开了可变取向照明模式旋转器（“IPR”），其可以并入构造的照明显微镜仪器来使干涉模式快速旋转。IPR包括旋转选择器和至少一个镜群。该旋转选择器持续简短时段地将入射在扫描镜上的光束引导到镜群中的每一个内。每个镜群在束上给予特定旋转角。因此，从IPR输出的束旋转通过由镜群中的每个所给予的旋转角中的每个。旋转选择器使IPR能够使束在大约5毫秒或更快地旋转通过每个旋转角，这明显快于使光栅/偏振板旋转的常规技术。

附图说明

图1示出常规构造的照明显微镜仪器的示意表示。

图2A-2B示出使用三个相干束生成三维构造的照明模式。

图3示出示例构造的照明显微镜仪器。

图4A-4C示出使三个独立的光束旋转的照明模式旋转器。

图5示出示例照明模式旋转器的轴测图。

图6A-6C示出与示例照明模式旋转器关联的镜群的特定布置的轴测图。

图7示出示例照明模式旋转器的轴测图。

图8A-8C示出照明模式旋转器的三个示例的示意表示。

具体实施方式

在构造的照明显微镜（“SIM”）中，干涉模式投影到标本上并且旋转。为了生成高对比度干涉模式，形成干涉模式的束的偏振也旋转来匹配干涉模式的旋转角。公开了可变取向照明模式旋转器（“IPR”），其可以用于使干涉模式快速旋转并且使偏振旋转来匹配干涉模式的旋转角。

图1示出常规SIM仪器100的示意表示。相干光从光源102（例如激光器）输出，并且传输通过透镜104和偏振板106。透镜104使光准直成束，并且偏振板106仅传递特定偏振的光同时阻挡其他偏振。从偏振板106输出的偏振束穿过一维透射衍射光栅108，其使光分裂成三个发散的、共面（即，xz平面）的相干束110-112，分别称为第0、第+1和第-1级衍射束。三个束110-112穿过一系列透镜，例如透镜114和115，其使束110-112取向使得第+1和第-1级衍射束111和112几乎平行于第0级衍射束110。束110-112从二向色镜116反射出以进入物镜118。束110-112聚焦在位于标本120内的物镜118的焦面处，其中束彼此干涉以在标本120的体积内生成构造的照明模式。

图2A-2B示出使用三个相干束生成三维构造的照明模式。如在图2A中示出的，这三个相干束110-112被传输到物镜118的背面。因为束110-112源于相干光源102，束110-112具有平面波，其中束的分波的相位跨与束方向正交的任何平面（例如平面202）相同。尽管这三个束110-112相干，每个束可具有与其他两个束不同的相位移。物镜128使入射束聚焦到焦点204，其改变两个非轴向束111和112的方向，如在图2A中示出的。因此，由于相长干涉，三个平面波不再与波矢量k（其具有不同的方向）平行并且三组平面波相交来形成由暗区（由于相消干涉而引起）环绕的类似网格的亮线模式。也就是说，如在图2B的示例中示出的，固定干涉模式206定位在物镜128的焦面中。线208代表由干涉模式206的较暗区分开的亮线。

回到图1，包括干涉模式的光的栅格促使来自标本120中的荧光团的荧光发射光。物镜118捕获荧光的一部分并且使其准直和将其引导到二向色镜116。荧光穿过二向色镜116并且由透镜124聚焦在光敏检测器122上，例如光电倍增器、光电二极管或固态带电耦合装置（“CCD”）。

在常规的SIM中，干涉模式206的取向可以通过使光栅108物理旋转而确定。偏振也旋转来匹配光栅108的取向，这可以通过也使偏振板106物理旋转而实现。在图1的示例中，光栅108和偏振板106连接到马达125，其使光栅108和偏振板106绕中心第0级衍射束轴（即，z轴）物理旋转通过期望的角度。图1还包括光栅108和偏振板106的轴测图126-128，用于图示三个不同的旋转取向。在图126-128中，方向箭头（例如图126中的方向箭头130-132）代表由偏振板106选择的电场分量，或偏振方向。在图126中，使光栅108和偏振板106取向使得束110-112位于xz平面内并且与每个束关联的偏振平行于x轴。在图127中，光栅108和偏振板106绕中心第0级衍射束轴（即，z轴）旋转通过角度-α。因此，束111和112绕第0级衍射束轴旋转通过角度-α并且偏振板106选择束的偏振分量，其近似匹配角度-α。在图128中，光栅108和偏振板106绕中心第0级束轴（即，z轴）旋转通过角度+α。因此，束111和112绕第0级衍射束轴旋转通过角度+α并且偏振板106选择束的偏振分量，其近似匹配角度+α。

尽管使光栅108和偏振板106旋转是用于使标本120中的干涉模式旋转的有效技术，上文描述的操作缓慢，其中转换时间在大约几十毫秒或更长。现在描述的各种实施例针对照明模式旋转器（“IPR”），其可以并入SIM仪器以便使干涉模式在大约5毫秒或更快地旋转。因为IPR用平面镜实现来确定干涉模式的旋转角，IPR还使偏振旋转来匹配干涉模式旋转通过的角度，由此消除了对额外偏振板的需要。

图3示出SIM仪器300的示例。该仪器300与上文描述的常规SIM仪器100相似，不同的是IPR 302定位在透镜116与二向色镜116之间的束110-112的路径中，并且仪器100的马达125、偏振板106和光栅108被分裂器304所取代。IPR 302不限于定位在透镜116与二向色镜116之间。实际上，IPR 302可以定位在分裂器304与二向色镜116之间的任何地方。分裂器304可以是多个不同类型的透射光栅中的任一个。例如，分裂器304可以是一维透射光栅，其由透明玻璃板（其中在光栅的一个表面中形成一系列大致上平行的凹槽）组成或分裂器304可以是具有一系列大致上平行的薄缝的不透明板。备选地，分裂器304可以用二维透射光栅来取代以在标本120的焦面中创建不同的干涉模式。例如，分裂器304可以是透明板（其中在板的一个表面中形成凹槽网格），或分裂器304可以是具有微小孔阵列的不透明板。备选地，分裂器304可以是一个或多个分束器，其布置成将从透镜104输出的光束分裂成两个或以上独立的相干束。在图3的示例中，因为光输出102可以配置成输出偏振光，省略了偏振板106。

存在许多不同类型的SIM仪器和对应的光路。仪器300不意在代表在SIM显微镜中使用的仪器的所有不同的众所周知的变化形式内的光路，而是意在图示包括IPC的SIM的一般原理。对于与仪器300相似的SIM仪器的一个备选配置是用传输束110-112的二向色镜来取代二向色镜116并且反射通过物镜118而收集和准直的荧光束。在该备选实施例中，透镜124和检测器122的位点用IPR 302、透镜115和116、分裂器304、透镜204和光源102来转换。

图4A-4C示出IPR 302如何使束110-112以及与束中的每个关联的偏振旋转。在图4A中，IPR 302保持束110-112的取向使得束110-112在具有与平行于x轴而取向的每个束关联的偏振的xz平面中行进。在图4B中，IPR 302使束110-112绕中心第0级衍射束轴（即，z轴）旋转通过角度Φ并且使与每个束关联的偏振旋转通过相同的角度。在图4C中，IPR 302使束110-112绕中心第0级衍射束轴旋转通过角度θ并且使与每个束关联的偏振旋转通过相同的角度。

图5示出示例IPR 500的轴测图。该IPR 500包括扫描镜502和三个独立的镜群504-506。图5示出扫描镜502的示例，该扫描镜502包括附连到马达512的可旋转轴的平面镜510。马达512可以是检流计，在该情况下，扫描镜502是检流计镜，或马达512可以是将镜510的旋转划分成一系列旋转步骤的步进马达，或给予镜510精确旋转的任何其他种类的马达。备选地，扫描镜可以是压电控制的镜。如在图5中示出的，镜510的反射表面使用马达512而旋转以进而面向镜群504-506中的每个。三个平行线514代表从光栅（例如上文描述的分裂器304）输出的第0级和第±1级衍射束。如在图5中示出的，识别镜510的三个旋转位置1、2和3。位置1、2和3对应于镜510相对于镜群1、2和3的特定旋转位置。镜群中的每个给予束514不同的旋转角并且匹配与束关联的偏振中的旋转角。如下操作IPR 500。当镜510旋转到位置1中时，束514从镜510反射出、朝向镜群1 504，如由方向箭头516表示的。镜群1 504使束以及关联的束偏振旋转通过第一旋转角并且使束反射回到镜510，如由方向箭头517表示的。当镜510旋转到位置2中时，束514从镜510反射出、朝向镜群2 505，如由方向箭头518表示的。镜群2 505使束旋转通过第二旋转角并且使束反射回到镜510，如由方向箭头519表示的。当镜510旋转到位置3中时，束514从镜510反射出、朝向镜群3 506，如由方向箭头520表示的。镜群3 506使束旋转通过第三旋转角并且使束反射回到镜510，如由方向箭头521表示的。方向箭头522代表从镜510反射出的旋转束。图5包括镜510的反射表面的图524，其代表从镜510的表面反射出的旋转束的调准装置。虚线526-528代表当从镜510的反射表面查看时由镜群504-506在三个束上给予的三个不同的旋转。虚线526代表由镜群1 504产生的束的取向，虚线527代表由镜群2 505产生的束的取向，并且虚线528代表由镜群3 506产生的束的取向。在备选实施例中，IPR 500和在下文描述的其他IPR可包括退出路径镜，其定位在束522的路径中以在束从IPR 500输出所在的方向上提供额外的控制。

图6A-6C示出与示例IPR 600关联的镜群的特定布置的轴测图。该IPR 600与IPR 500的相似之处在于IPR 600包括扫描镜602，其由附连到马达606的可旋转轴的平面镜604组成。IPR 600包括三个独立的镜群1、2和3，其每个参考分别图6A、6B和6C来独立描述。在图6A-6C中，虚线610代表从光栅（例如上文描述的分裂器304）输出的第0和第±1级衍射束。在图6A中，镜群1 612由安置在三维空间中并且在其中取向的三个平面镜614-616组成。虚线组618-622代表在束从镜604、镜群614-616反射出并且再次从镜604反射出时三个束行进的路径。镜604的反射表面的图624表明镜群612使三个束相对于轴626旋转通过-χ的角度。在图6B中，镜群2 628由也安置在三维空间中并且在其中取向的三个平面镜630-632组成。虚线组634-638代表在束从镜604、镜群630-632反射出并且再次从镜604反射出时三个束行进的路径。镜604的反射表面的图624表明从镜群628反射出使三个束相对于轴626旋转通过χ的角度。在图6C中，镜群3 640由安置在三维空间中并且在其中取向的两个平面镜642和643组成。虚线组642和643代表在束从镜604、镜群642和643反射出并且再次从镜604反射出时三个束行进的路径。镜604的反射表面的图624表明镜群649使三个束与轴626对齐。

在图6A-6C中表示的示例中，输入束610可以与轴626对齐。包括镜群640的镜可以取向使得从退出路径镜608反射出的束的角度大致上匹配输入束610的角度并且包括镜群612和628的镜可以取向使得χ~60°。而且，用于形成镜群的镜的数量不限于两个或三个镜。根据期望的旋转角，适当地安置在二维或三维空间中并且在其中取向的任何适合数量的镜可以用于形成镜群以在束上给予期望的旋转角。

IPR不意在局限于仅具有使干涉模式取向的三个镜群。备选地，IPR可以具有少至一个镜群或多至四个或以上的镜群。图7示出示例IPR 700的轴测图。该IPR 700与IPR 500相似，不同的是IPR 700包括额外的镜群4 702。在图7的示例中，识别镜510的四个旋转位置1、2、3和4。位置1、2、3和4对应于镜510相对于镜群1、2、3和4的特定旋转位置，其中镜群504-506中的每个给予束514和偏振不同的旋转来匹配束的旋转，如在上文参考图5描述的。镜群4 702也在束上给予与由镜群504-506给予的旋转不同的旋转。当镜510旋转到位置4中时，束514从镜510反射出、朝向镜群4 702，如由方向箭头704表示的。镜群4 702使束以及关联的束偏振旋转通过第四旋转角并且使束反射回到镜510，如由方向箭头706表示的。束然后从镜510反射出，如在上文参考图5描述的。

图8A-8C示出IPR的备选实现的三个示例的示意表示。在图8A中，IPR 800包括三个镜群801-803和两个扫描镜805和806。方向箭头808代表光束沿其行进至第一扫描镜805的路径。方向箭头811-813代表第一扫描镜805沿其将束引导到镜群801-803中的每个的三个独立的路径。镜群801-803每个包括两个或以上的平面镜，其布置在三维空间中以在束上给予特定旋转角，如上文描述的。方向箭头815-817代表镜群801-803中的每个使旋转束沿其反射至第二扫描镜806的独立路径。第二扫描镜806使旋转束沿由方向箭头820表示的相同路径反射离开IPR 800。如下对扫描镜805和806定时。当第一扫描镜805使束808朝向镜群801反射时，第二扫描镜806使旋转束815沿路径820反射离开IPR 800。当第一扫描镜805使束808朝向镜群802反射时，第二扫描镜806使旋转束816沿路径820反射离开IPR 800。当第一扫描镜805使束808朝向镜群803反射时，第二扫描镜806使旋转束817沿路径820反射离开IPR 800。

注意扫描镜502、602和805是旋转选择器的示例，因为扫描镜操作成将束引导到镜群中的一个，其中给予束特定的预定旋转角。然而，IPR实施例不意在局限于特定类型的旋转选择器。图8B和8C代表两个其他类型的旋转选择器的示例。

在图8B中，IPR 830包括1/3:2/3分束器831、1/2:1/2分束器832、镜833和三个快门834-836。方向箭头832代表光束沿其行进至分束器831的路径。分束器831将光功率的近似1/3反射到快门834并且将光功率的近似2/3传输到分束器832，其将光功率的近似1/2反射到快门835并且将光功率的近似1/2传输到镜833。因此，快门834-836中的每个接收具有近似1/3光功率的光束。镜群841-843每个包括两个或以上的平面镜，其布置在三维空间中以在穿过快门的束上给予特定旋转角，如由方向箭头844-846表示的。快门中仅一个在一定时间打开并且快门的打开如下那样利用扫描镜847的操作来定时。当快门834打开时，扫描镜847使旋转束844沿路径848反射离开IPR 830。当快门835打开时，扫描镜847使旋转束845沿路径848反射离开IPR 830。当快门836打开时，扫描镜847使旋转束846沿路径848反射离开IPR 830。在图8C中，IPR 850与IPR 800相似，不同的是用声光调制器（“AOM”）852来取代第一扫描镜805。方向箭头854代表光束沿其行进至AOM 852的路径。方向箭头853-854代表衍射束沿其行进至镜群801-803的三个独立路径。束沿哪个衍射路径行进至镜群中的一个由在AOM 852内生成的声的强度确定，如上文描述的那样利用扫描镜806的操作来对该AOM 852定时。

注意分束器/快门和AOM意在结合扫描镜来实现，如在上文参考图8B和8C描述的，以便确保旋转束沿相同的路径行进离开IPR 830和850。

前面的描述为了说明的目的使用特定命名法来提供本公开的全面理解。然而，为了实践本文描述的系统和方法而不需要特定细节，这对于本领域内技术人员将是明显的。为了图示和描述的目的呈现特定示例的前面的描述。它们不意在为全面的或将本公开局限于描述的确切形式。明显地，鉴于上文的教导，许多修改和变化是可能的。示出并且描述这些示例以便最大程度地说明本公开的原理和实际应用，由此使本领域内其他技术人员能够最大程度地利用本公开和具有如适合于预想的特定使用的各种修改的各种示例。规定本公开的范围由随附权利要求和它们的等同物限定。

Claims

1.一种照明模式旋转器，用于使至少一个输入光束选择性旋转，其包括：

旋转选择器，用于接收至少一个光束；和

至少一个镜群，每个镜群用于接收从所述旋转选择器反射的至少一个束并且使所述至少一个束旋转预定义的旋转角。

2.如权利要求1所述的旋转器，其中，所述旋转选择器进一步包括扫描镜。

3.如权利要求1所述的旋转器，其中，每个镜群进一步包括两个或以上的平面镜。

4.如权利要求1所述的旋转器，其中，每个镜群进一步包括安置在三维空间中并且在其中取向的两个或以上的镜。

5.如权利要求1所述的旋转器，其中，每个镜群进一步包括至少两个镜，其安置并且取向成使旋转的至少一个束反射回到具有不同旋转角的所述旋转选择器。

6.如权利要求1所述的旋转器，其中，每个镜群用于使与所述至少一个束关联的偏振旋转来匹配所述镜群要使所述至少一个束旋转通过的角度。

7.如权利要求1所述的旋转器，其中，所述至少一个镜群使旋转的至少一个束反射回到所述旋转选择器来使所述旋转的至少一个束反射远离所述旋转器。

8.如权利要求1所述的旋转器，其中，每个镜群使所述旋转的至少一个束反射到所述旋转选择器，其进而使所述旋转的至少一个束反射远离所述旋转器。

9.如权利要求1所述的旋转器，进一步包括扫描镜，其中所述至少一个镜群中的每个使所述旋转的至少一个束反射到所述扫描镜，其进而使所述旋转的至少一个束反射远离所述旋转器。

10.如权利要求1或9所述的旋转器，其中，所述旋转选择器包括至少一个分束器、镜和至少两个快门，其中所述至少一个分束器和镜布置成使所述至少一个束分裂并且使其朝向所述至少一个镜群中的每个反射，其中每个快门位于每个反射束的路径中。

11.如权利要求1或9所述的旋转器，其中，所述旋转选择器是声光调制器。

12.一种构造的照明显微镜仪器，包括：

分裂器，用于接收从光源输出的相干光束并且使其分裂成至少三个束；

旋转选择器，用于接收所述束；

至少一个镜群，每个镜群用于接收从所述旋转选择器反射的束并且使所述束旋转预定义的旋转角；以及

物镜，用于接收旋转束并且使所述旋转束聚焦以在所述物镜的焦面中形成干涉模式。

13.如权利要求11所述的仪器，其中，所述分裂器包括光栅。

14.如权利要求11所述的仪器，其中，每个镜群进一步包括安置在三维空间中并且在其中取向的两个或以上的镜。

15.如权利要求11所述的仪器，其中，每个镜群进一步包括至少两个镜，其安置并且取向成使所述旋转束反射回到具有不同旋转角的所述旋转选择器。

16.如权利要求11所述的仪器，其中，每个镜群使与所述束关联的偏振旋转来匹配所述镜群要使所述束旋转通过的角度。

17.如权利要求11所述的仪器，其中，每个镜群使所述旋转束反射到所述旋转选择器。

18.如权利要求11所述的仪器，进一步包括扫描镜，其中每个镜群使所述旋转束反射到所述扫描镜。

19.如权利要求11或18所述的仪器，其中，所述旋转选择器包括至少一个分束器、镜和至少两个快门，其中所述至少一个分束器和镜布置成使所述束分裂并且使其朝向所述至少一个镜群中的每个反射，其中每个快门位于每个反射束的路径中。

20.如权利要求11或18所述的仪器，其中，所述旋转选择器是声光调制器。