CN103409437B - 一种促进乙酸分泌的溶磷基因 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种溶磷基因psa A，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。本发明通过异源表达克隆到的溶磷基因，高效产生乙酸，具有使难溶磷转化为有效磷的作用，为利用分子生物学手段提高磷肥的利用率提供基本材料。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体地说，涉及一种促进乙酸分泌的溶磷基因。
背景技术
产生有机酸是溶磷微生物释放土壤难溶磷的一种主要的方式，有机酸与土壤中铁、铝、钙等离子螯合，从而使难溶磷转化为有效磷，提高磷肥利用率。溶磷微生物产生比较常见的有机酸有琥珀酸、柠檬酸、α-酮戊二酸、苹果酸、丙酮酸、乳酸、乙酸、甲酸、丙酸、富马酸和草酸。而溶磷微生物的应用受到如菌株的退化、作物种类、土壤特性、气候条件、溶磷菌与其它微生物间的交互作用等影响而效果不稳定。高效利用溶磷微生物产生有机酸或者通过异源表达克隆到的溶磷相关基因产生有机酸是提高土壤磷素利用率最有效的一种方式，而其关键是溶磷相关基因的获得。
关于溶磷相关基因研究以细菌为主，其主要机制是将葡萄糖直接氧化产生葡萄糖酸(GA)，其中葡萄糖酸的合成是由葡萄糖脱氢酶(GDH)和协同因子吡咯喹啉奎宁（PQQ）完成（Goldstein AH，1999，FEMS Microbiology Ecology,30(4):295-300.）。目前关于真菌溶磷相关基因的克隆也有报道，主要是以黑曲霉和草酸青霉为主，但其数量非常少，主要机制也不是很明确，也有报道从草酸青霉中克隆到的基因编码合成苹果酸脱氢酶在大肠杆菌中表达，分泌苹果酸、乳酸、醋酸、柠檬酸、草酸等有机酸从而使难溶磷溶解（LüJ2011,Annals ofMicrobiology,1-8）。
目前，在ncbi数据库中发布了真菌Aspergillus niger CBS513.88（XM_001398218.2）和Aspergillus niger contig An17c0020（AM270384.1）的全基因组序列，与本发明序列同源性都为98%，但未对基因的功能进行预测与分析。与其他序列与本发明同源性较低，可能不为同一类。
在ncbi数据库中，Mikael R.Andersen等发布了Aspergillus nigerATCC1015的全基因组序列（2011，Genome Res.21(6):885–897.），与本发明基因编码的蛋白同源性为99%，对其功能也未进行预测。Futagami,T等报道从Aspergillus kawachii IFO4308克隆到的基因编码蛋白与本发明的蛋白同源性为99%，其为ubiquitin conjugating enzyme（泛素结合酶），但未报到其具有产生乙酸的功能。其它报道的都为假定蛋白，没有进行功能分析。
发明内容
本发明的目的是提供一种溶磷基因，促进乙酸分泌，具有将难溶磷转化为有效磷提高磷肥利用率的效果。
为了实现本发明目的，本发明首先提供一种溶磷基因psa A，所述溶磷基因psa A的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
本发明还提供了一种由所述溶磷基因psa A编码的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
本发明还提供了含有所述溶磷基因的载体。
作为优选，所述载体为表达载体pGEX-6P。
本发明还提供了含有所述溶磷基因的工程菌。
作为优选，所述工程菌为E.coli HST08。
本发明还提供了用于扩增溶磷基因psa A的开放阅读框序列的引物对，包括正向引物F：5'-TATTCGGAATTCATGTCTGCCAATCGAGCAAG-3'和反向引物R：5'-CAAGTACTCGAGCTACGGCTCGCCGAGGAGCCG-3'；
其中，溶磷基因psa A的开放阅读框序列为：
SEQ ID No.3所示的核苷酸序列。
本发明还提供了溶磷基因psa A在促进乙酸分泌中的应用。
本发明从黑曲霉菌H1(Aspergillus niger H1)基因组中克隆获得，其氨基酸序列通过DNAMAN分析后获得。
具体地，本发明利用SMART技术构建黑曲霉H1的初级cDNA文库，通过难溶磷培养基筛选具有溶磷透明圈的转化子，对筛选出的转化子进行测序分析，获得其cDNA序列。利用软件DNAMAN对cDNA序列结构进行分析，获得其开放阅读框，其序列如序列表SEQ ID NO.3所示，根据序列，设计并合成上下游寡核苷酸引物，以筛选的转化子携带的质粒为模板，进行扩增，将开放阅读框部分序列连接到pGEX载体上，导入大肠杆菌，在大肠杆菌中表达，分泌乙酸。
本发明还提供了溶磷基因psa A在溶解无机难溶磷中的应用。
本发明从黑曲霉H1中克隆溶磷基因，其编码的蛋白导入大肠杆菌中，在难溶磷无机盐培养基中培养36h时，促进大肠杆菌分泌乙酸，含量分别为445～544μg/m，溶液中pH值从6.18降到4.12～3.52，释放的可溶磷含量为0.10～0.12mg/mL。
本发明的有益效果在于：
1、本发明首先提供了溶磷基因psa A的核苷酸序列；
2、本发明通过异源表达克隆到的溶磷基因，利用大肠杆菌高效产生乙酸；
3、本发明通过异源表达克隆到的溶磷基因具有将难溶磷转化为有效磷的效果。
附图说明
图1为本发明黑曲霉菌H1在难溶磷无机盐培养基上培养3d的形态。
图2为本发明文库的插入片段电泳检测。
图3为本发明文库中携带溶磷基因的克隆子二次转接。
图4为本发明质粒酶切位点图。
图5为本发明pGEX-6P表达载体图谱。
图6为本发明构建表达载体后的阳性克隆筛选。
图7为本发明表达载体上目的片段扩增。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1黑曲霉菌的cDNA全长文库构建
实验所用菌株黑曲霉菌株H1为中国农业科学院农业资源与农业区划研究所农业菌种保藏中心从土壤样品中筛选，在难溶磷无机盐培养基上培养3d，取0.2g左右新鲜菌丝（如图1），液氮研磨，利用RNAisoplus试剂盒提取总RNA，取1μg RNA作为合成cDNA第一链的模板，在3’SMART CDS Primer IIA和SMARTer IIA寡核苷酸引物的引导下，通过SMARTscriptTM逆转录酶70℃2min逆转录合成第一链cDNA；以2μL第一链cDNA产物为模板，通过LD-PCR合成双链cDNA。利用CHROMA SPIN+TE-1000纯化cDNA，去除小于500bp的片段，沉淀回收cDNA片段。用T4DNA聚合酶补平cDNA的末端后，在其两端连接EcoRI/XhoI定向接头，并用EcoRI/XhoI对接头进行酶切，得到5’端为EcoRI、3’端为HindIII酶切位点的双黏性末端cDNA。纯化后的cDNA片段通过T4DNA连接酶连接到经过EcoRI/XhoI双酶切的pBluescript SK(+)载体上，将连接产物电转化到宿主菌E.coliHST08。随机挑取转化后的克隆子，在LB培养液中培养过夜，提取质粒，将质粒用EcoR I和Xho I酶切质粒，检测连接片段的大小，结果显示插入大小为600bp～3kb（图2）。将转化后的宿主菌接种在2mL LB液体培养基中37℃温浴2h，得到初级cDNA文库，4℃保存备用。
实施例2溶磷基因的筛选及生物信息学分析
将含有文库细菌的培养液稀释涂布到含有氨苄青霉素（100μg/mL）难溶磷培养基上，37℃培养3-4d，观察是否有溶磷透明圈产生，将产生透明圈的转化子转接培养，如图3所示，筛选的克隆子转接后仍能在难溶磷无机培养基上产生透明圈，说明其功能稳定，将功能稳定的菌落提质粒测序得到DNA的序列，在NCBI上通过Blast进行比对分析，并利用DNAMAN6.0进行开放阅读框分析，并将翻译蛋白在PDB数据库上比对分析。
实施例3表达载体的构建、转化宿主、阳性克隆鉴定
引物设计（Forward：5’-TATTCGGAATTCATGTCTGCCAATCGAGCAAG-3’；Reverse：5’-CAAGTACTCGAGCTACGGCTCGCCGAGGAGCCG-3’），采用高保真Taq酶扩增上述基因的ORF，反应条件：94℃5min；94℃1min，60℃1min，72℃1min循环35次72℃10min，4℃forever。用限制性核酸内切酶EcoRI和XhoI双酶切后，连接到表达载体pGEX-6p上，酶切位点序列和表达载体pGEX-6p图谱如图4、图5所示，通过电击法转化E.coli HST08，在难溶磷无机盐培养基上筛选能产生透明圈的克隆子（图6），并通过PCR鉴定挑选出转化阳性的克隆的片段大小，扩增结果如图7所示，其大小与目的基因大小一致，进一步通过测序比对，其序列与目的基因序列完全一致，说明其为阳性克隆。测序引物采用载体自身引物用T3(5’-CCCAGTCACGACGTTGTAAAACG-3’)和T7(5’-AGCGGATAATTTCACACAGG-3’)进行PCR扩增。
实施例4溶磷基因psa A对难溶磷无机盐培养液pH及可溶磷含量的影响
将上述筛选出的含有编码蛋白序列阳性克隆分别扩大培养，在150mL的三角瓶中装入50mL带抗性的难溶磷无机盐培养液，培养基配方为：葡萄糖或蔗糖10g，(NH4)2SO40.5g，NaCl0.3g，KCl0.3g，MgSO4·7H2O0.3g，FeSO4·7H2O0.03g，MnSO4·4H2O0.03g，Ca3(PO4)210.0g，蒸馏水1000mL。接种含有基因的转化子1mL，37℃，200r/min培养，同时以不含有该基因的菌作为对照，设置三个重复，分别在12h、16h、20h、24h、36h和40h测定溶液的pH值，并将溶液离心取上清，105～110℃干燥后的磷酸二氢钾作为标样，用钒钼黄比色法测定可溶磷含量。随着时间的延长，接种转化子的溶液pH值逐渐降低，在36h时，降到最低值达到3.52，溶液中可溶磷含量升到最高，达到0.11mg/mL，而不携带基因的大肠杆菌溶液pH最终降到5.6左右时不再变化，可溶磷含量没有变化。
实施例5溶磷基因psa A对大肠杆菌产酸的影响
实验设计如同实施例4，在36h取出溶液上清，20000rpm离心，离子色谱Na柱过滤，通过美国戴安公司ICS-3000离子色谱仪分析溶液中有机酸的种类和含量。保护住为IonPac AG11-HC（4×50mm），色谱柱为IonPac AS11-HC（4×250mm），淋洗液梯度洗脱程序为0～5min，1.0mmol/L KOH；5～45min，36.00mmol/L KOH；45～50，1.0mmol/L KOH。培养36h后，不含psa A的E.coli HST08只产生少量乙酸，含量分别为18.5μg/mL，而含psa A的E.coli HST08分泌大量乙酸，含量为445～544μg/mL。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (3)
1.溶磷基因psa A在促进乙酸分泌中的应用，其特征在于，将该基因导入大肠杆菌，在大肠杆菌中表达，分泌乙酸；
所述溶磷基因psa A的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；
其中，溶磷基因psa A的开放阅读框序列为：SEQ ID No.3所示的核苷酸序列；
其中，所述载体为表达载体pGEX-6P。
2.溶磷基因psa A在溶解无机难溶磷中的应用，其特征在于，从黑曲霉H1中克隆溶磷基因，将其在大肠杆菌中表达，在难溶磷无机盐培养基中培养，促进大肠杆菌分泌乙酸；
所述溶磷基因psa A的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；
其中，所述的溶磷基因psa A编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNo.2所示。
3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述大肠杆菌为E.coli HST08。
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