CN103374051A

CN103374051A - 一种葛花鸢尾苷的制备方法与应用

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Publication number: CN103374051A
Application number: CN2012101276749A
Authority: CN
Inventors: 黄文�; 王益; 张永丹; 刘莹; 韩婷; 聂虎; 马双双
Original assignee: 黄文�
Priority date: 2012-04-27
Filing date: 2012-04-27
Publication date: 2013-10-30

Abstract

本发明提供一种葛花鸢尾苷的制备方法及其应用，属于从植物中提取功能成分的技术领域。本发明的特征在于先将干燥过的葛花进行粉碎并过筛，得到粒度均匀的葛花粉，加入溶剂n-正丁醇相/水,在一定的浸取温度下回流提取一定时间。将过滤得到的正丁醇相用旋转蒸发浓缩，得到粗产品。粗产品采用适当的溶剂重结晶，得到粗产品的晶体，热风干燥得到外观为淡黄色的葛花鸢尾苷。本发明的葛花鸢尾苷生产方法简单、快速、产量高，不需要进行柱层析，适合工业化生产。该生产方法制得的鸢尾苷纯度可达到99%。

Description

一种葛花鸢尾苷的制备方法与应用

技术领域

本发明属于从植物中提取功能成分的技术领域，具体涉及一种葛花鸢尾苷的生产方法，利用该方法生产的葛花鸢尾苷可用于饮料、果冻、口香糖等醒酒护肝保健品的加工。

背景技术

葛花为豆科植物野葛的花，异名葛条花，是我国的传统药物。长期以来被用于缓解酒后呕吐等症状，其主要有效成分是异黄酮类化合物。葛花中的异黄酮成分是葛花的主要活性成分之一，能够在乙醇的吸收和代谢两个环节中发挥其醒酒保肝的作用。近年来，科学家们相继从葛花中分离得到了二十几种异黄酮化合物，其中，鸢尾苷在葛花中的含量较高，是葛花异黄酮的代表性成分，具有醒酒、抗炎、抗肿瘤、护肝、类雌激素作用、抗氧化等诸多活性。目前保健品生产企业在异黄酮的浸取分离过程中普遍存在以下问题：（1）采用单相溶剂系统（如水、乙醇水溶液）浸取植物原料，浸取速度慢，且得到了含大量杂质的异黄酮粗提物，这样就增加了下游工序的分离难度和负荷，同时杂质中的多糖类等多种营养成分为微生物的滋生提供了便利，从而导致生产和应用过程的污染，达不到卫生标准；（2）粗提物的分离常常包括萃取、过滤、层析等，分离步骤多，操作复杂，导致异黄酮的得率低，活性降低。因此，浸取与分离过程落后的技术水平将严重影响着保健品产业的发展，必需尽快解决。

葛花鸢尾苷的制备目前都是先提取葛花中的异黄酮，再从异黄酮中分离纯化出鸢尾苷。李玉新等（李玉新等.葛花异黄酮及单体鸢尾苷和鸢尾苷元的提取方法及其应用，中国发明专利公开号CN1800172A文献）用乙醇提取葛花中的异黄酮，通过大孔树脂除去部分杂质，得到葛花异黄酮，然后在葛花异黄酮中加入去离子水，湿法上样于聚酰胺柱，乙醇梯度洗脱得到鸢尾苷。杨向东等（杨向东等.一种从葛花中提取总异黄酮的方法及用途，见中国发明专利公开号CN10112944A文献）用乙醇热回流浸提葛花中的异黄酮，浓缩之后获得葛花异黄酮提取液，提取液经聚酰胺、大孔树脂、硅胶中的任一种进行柱层析，获得葛花异黄酮。但上述葛花异黄酮和鸢尾苷的制备过程都比较复杂，不适于工业化生产。

发明内容

本发明的目的旨在改善目前葛花鸢尾苷分离步骤多，操作复杂，导致葛花鸢尾苷的得率低的缺陷，提供一种方法简单、快速、产量高的葛花鸢尾苷的制备方法。

本发明的目的还在于提供葛花鸢尾苷的应用。

本发明的目的采用n-正丁醇/水两相溶剂系统代替单相溶剂系统对葛花原料进行直接浸取，使葛花中鸢尾苷的浸出与液液萃取同步完成，然后采用乙醇重结晶，实现简单、快速、产量高的制备葛花鸢尾苷，所制备的鸢尾苷纯度大于99%。本发明的目的还包括生产葛花鸢尾苷的方法及葛花鸢尾苷的应用。其中包括在饮料、口服液等醒酒护肝保健品加工中应用，为葛花的产业化应用提供新的途径。

本发明提供的技术方案是：一种葛花鸢尾苷的工业化生产工艺，先将干燥过的葛花进行粉碎并过筛，得到粒度均匀的葛花粉，加入溶剂n-正丁醇相/水, 在一定的浸取温度下回流提取一定时间。浸取液过滤后静置平衡，分出正丁醇相。将过滤得到的正丁醇相用旋转蒸发浓缩，浓缩相在室温下放置，得到异黄酮的冷却结晶，过滤、干燥，得到粗产品。干燥的粗产品采用适当的溶剂重结晶，得到粗产品的晶体。热风干燥得到外观为淡黄色的葛花鸢尾苷。

具体步骤是：将所述的葛花粉碎后过100目筛，得到粒度均匀的葛花粉。

所述反应介质n-正丁醇相与水的体积比为1:1，加入量为葛花粉质量的8～10倍，60-70℃下回流反应1～2h。

采用旋转蒸发浓缩的方法对过滤得到的正丁醇相浓缩到80～120 mL。浓缩相在室温(20～25℃)下放置10～14 h。

重结晶使用的有机溶剂为乙醇。

所述干燥方式为40～50℃热风干燥。

本发明得到的葛花鸢尾苷经体外抗氧化试验证明具有较好的抗氧化活性。

本发明的葛花鸢尾苷可以应用于饮料、酸奶和口香糖等食品。

与现有技术相比，本发明具有以下优点。

（1）本发明的葛花鸢尾苷是先采用n-正丁醇相/水富集葛花鸢尾苷，再通过旋转蒸发结晶和重结晶的方法获得鸢尾苷晶体，该方法简单、快速、产量高，所制备的葛花鸢尾苷纯度超过99%，活性评价证明该方法生产的葛花鸢尾苷具有较高的抗氧化活性和体外激活乙醇脱氢酶活性。而现有的制备葛花鸢尾苷的方法常常包括浸提、萃取、过滤、层析等，分离步骤多，操作复杂，比较耗时也不利于资源的充分利用。

（2）本发明的葛花鸢尾苷生产的葛花醒酒饮料，具有高的醒酒活性。

附图说明

图1：葛花鸢尾苷的工艺流程图。

图2：是葛花鸢尾苷的紫外吸收光谱图。

图3：是葛花鸢尾苷的红外光谱图。

图4：是葛花鸢尾苷的HPLC-MS图。

图5：是葛花鸢尾苷的¹H NMR图。

图6：是葛花鸢尾苷的¹³C NMR图。

图7：是葛花鸢尾苷的薄层图。

图8：是葛花鸢尾苷的HPLC图。

具体实施方式

实施例1

1. 葛花鸢尾苷的制备

取葛花100 g置于三颈瓶中，加入溶剂1:1（v/v）n-正丁醇相/水1000 mL, 在浸取温度为70 °C的条件下回流提取1.5 h。浸取液过滤后静置平衡，分出正丁醇相。将过滤得到的正丁醇相用旋转蒸发到100 mL，浓缩相在室温下放置12 h, 得到异黄酮的冷却结晶，过滤干燥得粗产品。干燥的粗产品采用适当的溶剂重结晶，得到粗产品的晶体。自然晾干。所得淡黄色粉末即为葛花鸢尾苷，经检验后包装出厂。

2．葛花鸢尾苷的结构确认和纯度分析

葛花鸢尾苷为淡黄色粉末状，具有该产品特有的气味和滋味。

晶体的结构确认：

葛花鸢尾苷的紫外吸收光谱图、傅里叶红外光谱图、HPLC-MS、¹H NMR和¹³C NMR图分别如附图2、图3、图4和图5所示。

由附图2可以看出，晶体在265 nm处有强吸收，在333 nm处有弱吸收。这符合多数异黄酮类化合物在甲醇中的紫外吸收光谱由两个主要吸收带组成，出现在300 nm～350 nm之间的吸收带称为带Ⅰ，吸收较弱；出现在250 nm～270 nm之间的吸收带称为带Ⅱ，吸收很强。

由附图3可以看出，晶体的3375 cm^-1为活拨质子羟基（O-H）伸缩振动的特征宽吸收峰，1654 cm^-1为共轭酮羰基伸缩振动的特征吸收，1616、1585、1514、1462 cm^-1为黄酮芳环骨架振动的特征吸收。2933为—CH₃的吸收，1078 cm^-1为C-O-C的吸收。

附图4显示，晶体的HPLC-MS m/z 463.12 (M+H)⁺，确定其分子量为462.12。结合¹H、¹³C-NMR谱分析，推断该化合物分子式为C₂₂H₂₂O₁₁，不饱和度为12。

附图5中¹H NMR(DMSO-d₆) δ(ppm)数据显示H-2 δ 8.44(1H，s)是异黄酮类的特征化学位移。δ 12.92 (1H，s)示有C₅-OH，δ 9.58 (1H，s)示有一个酚羟基取代，可能为3′或4′上的质子信号。A环上有一个孤立的芳香质子信号δ 6.89 (1H，s)，由此可以推断在A环上有三个取代基团。B环则有AA′BB′系统的四个芳香质子信号δ 7.40 (2H，d，J=8Hz，H-2′，H-6′)和δ 6.83 (2H，d，J=8Hz，H-3′，H-5′)，可以推断为对位取代，即B环上只有4′位有取代，所以δ 9.58 (1H，S)为4′-OH质子信号。δ 3.78显示有一个甲氧基，在¹³C-NMR(DMSO-d₆)δ(ppm)中，δ60.26 也显示有-OCH₃取代，由于化学位移在较低场，因此两边都有取代，即-OCH₃不可能在4′位上，只能在6位上。¹H NMR (DMSO-d₆)还示有糖的端基质子信号δ H 5.08 (1H，d，J=8Hz)，因其偶合常数J=8Hz，示其与β构型的糖相联，且在¹³C-NMR示有6个碳原子：60.67（ C-6″），69.67，73.13，76.71，77.29（C-2″, 3″, 4″, 5″）。

附图5中¹³C-NMR(DMSO-d₆)谱数据中显示有22个碳，δ 154.62(C-2)，122.06(C-3)，180.75(C=O) 信号是异黄酮类的特征吸收，δ 180.75(C=O)说明C-5上有羟基取代。δ94.03 为8位碳信号，δ 100.19为糖的端基碳信号，δ 115.07，δ 130.13碳信号峰强是其它碳信号的2倍，进一步说明了B环上是4′位单取代。经与文献对照(Lee et al.，1989),见表3-1，3-2。其波谱数据鸢尾苷一致，确认其结构为：4’, 5, 7 –三羟基– 6 –甲氧基异黄酮– 7 – O – β – D -吡喃葡萄糖。即鸢尾苷（tectoridin）。

晶体的纯度分析：

由附图6的薄层图可以看出，晶体在绿色荧光背景下10 μg只呈现单一暗斑，而且圆整度好，并不显其他的杂质斑点。说明晶体的纯度是较高的，基本不存在杂质。

由附图6的HPLC图可以看出晶体的甲醇溶液出现三个杂质峰，用规一化法计算含量，晶体含量为99.23%（保留时间为5.543min），杂质含量为：0.11%（保留时间为2.805 min）、0.27%（保留时间为3.892 min）、0.39%（保留时间为4.728 min）。

实施例2 葛花鸢尾苷在醒酒饮料中的应用举例。

葛花鸢尾苷的制备:按照实施例1所述的方法制备。

葛花醒酒饮料的感官鉴定定：称取50 mL 样品置于无色透明玻璃容器中，在明亮处观察色泽和透明程度，并在室温下嗅其气味，偿其滋味，感官鉴定由10人组成的评定小组参加。

表16 产品感官指标及评分标准

项目	指标	评分标准
			口感	40分	酸甜适口，无异味
色泽	30分	浅黄色，无有色颗粒
			组织状态	30分	均匀细腻，无分层，无块

葛花醒酒饮料的理化成分与卫生指标测定：

可溶性固形物：GB/T 12143-2008 饮料通用分析方法

砷：GB/T 5009.11-2003 食品中总砷及无机砷的测定

铅：GB 5009.12-2010 食品中铅的测定

汞：GB/T 5009.17-2003 食品中总汞及有机汞的测定

糖精钠：GB/T 5009.28-2003 食品糖精钠的测定

山梨酸、苯甲酸：GB/T 5009.29-2003 食品中山梨酸、苯甲酸的测定

菌落总数：GB/T 4789.2-2010 菌落总数测定

大肠菌群：GB/T 4789.3-2010 大肠菌群计数

沙门氏菌：GB/T 4789.4-2010 沙门氏菌检验

志贺氏菌：GB/T 4789.5-2003 志贺氏菌检验

金黄色葡萄球菌：GB/T 4789.10-2010 金黄色葡萄球菌检验

霉菌和酵母：GB/T 4789.15-2010 霉菌和酵母计数

检测结果显示：葛花醒酒饮料的可溶性固形物为8.6%，pH：4；铅＜0.05mg/kg，砷＜0.05mg/kg，铜＜0.05mg/kg，菌落总数＜1cfu/mL，大肠菌群＜3MPN/100mL，沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌均未检出。。

葛花醒酒饮料的醒酒活性评价：

将体重为20±2g的昆明种小鼠，于室温下饲养一周后，随机分成4组，每组10只。4组分别为葛花醒酒饮料组、阳性对照组、模型组。葛花醒酒饮料组按12mL/kg.bw的剂量灌胃，阳性对照组灌解酒护肝软胶囊500mg/ kg.bw的剂量灌胃，模型组灌等量的生理盐水；30min后各组按12mL/kg.bw剂量灌胃50%乙醇。1h后眼眶取血，血液用于测定血醇浓度（BAC）。取其肝脏测定乙醇脱氢酶(ADH)活性。

ADH激活率（%）=[ADH活力cp/ADH活力control] ×100

鼠血液离心后收集血清，采用气相色谱法测定各组小鼠血清中乙醇的浓度，计算血醇清除率（%）= [ (BAC_模型组－BAC_试样组)/BAC_模型组]×100。

组别	血醇清除率（%）	ADH (U/mL)	ADH激活率（%）
				模型组	——	50.377	100
阳性对照组	35.52	64.206	127.25
				葛花醒酒饮料组	47.63	69.462	137.88

利用葛花鸢尾苷制备醒酒饮料的具体步骤：

将葛花鸢尾苷与葡萄糖、蜂蜜、维生素等其他配料进行调配，调配之后过滤，出去可能存在的沉淀物，加热至85—95℃进行热灌装，采用115℃，15min杀菌处理，检验，包装，成品。

实施例3 葛花鸢尾苷在果冻中的应用举例

葛花鸢尾苷的制备:按照实施例1所述的方法制备。

将1.5%卡拉胶缓慢加入80℃适量热水中，卡拉胶粉加入时要边溶解边搅拌，直至形成组织均一的胶溶液。取0.1%葛花鸢尾苷，在常温下溶于少量的水中，待胶液温度低于50℃时加入胶液中并搅拌均匀，用柠檬酸调味，将混合均匀的凝胶溶液倒入合适容器中，置于20℃温度条件下冷却成型。

实施例4 葛花鸢尾苷在软糖中的应用举例

取一定量明胶加入其质量1.5倍的水，在80℃水浴中加热30 min使其充分溶解。取一定量的淀粉糖浆糖、蔗糖，加入总糖浆质量0.5倍的水，加热溶解。然后加入水质量0.1%的葛花鸢尾苷，小火熬煮，待水分含量降低至15%~20%时，加入溶胶，然后继续小火熬煮。熬制过程中注意温度控制，不应超过115℃。当水分含量降低至20%~25%时达到熬制终点，停止加热。用柠檬酸调味之后趁热浇盘，在冷却过程中防止盘面倾斜震动，待充分冷却成型后，切成大小均匀的长条。

实施例5 葛花鸢尾苷在口香糖中的应用举例

将蔗糖粉碎，过200目筛后，与葛花鸢尾苷混匀后备用。胶基使用前，先置于恒温烘箱内保温软化4—5h。将软化后的胶基加入葡萄糖浆混合后，加入1/3糖粉与鸢尾苷的混合物。混合1h之后，再加入1/3糖粉与鸢尾苷的混合物。混合10min后，加入剩余的1/3糖粉与鸢尾苷的混合物及香精，充分混合均匀。将混合好的原料冷却至温度低于40℃后，投入切面机中挤压，挤出组织紧密表面光滑的带状糖胚，重复挤压两次后，成为一定厚度的糖片，进行切割成型。在温度20℃，相对湿度50%以下进行冷却老化。将制好的口香糖用涂蜡铝箔纸包装。

Claims

1.一种葛花鸢尾苷的制备方法，其特征在于它包括下列步骤：先将干燥过的葛花进行粉碎过100目筛，得到粒度均匀的茯苓粉，采用n-正丁醇相/水作为溶剂提取葛花中鸢尾苷，然后将过滤得到的正丁醇相进行旋转蒸发浓缩，得到鸢尾苷粗品。

2.根据权利要求1所述葛花鸢尾苷的制备方法，其特征在于：所述鸢尾苷粗品干燥,干燥的鸢尾苷粗产品采用适当的溶剂重结晶，得到鸢尾苷的晶体，干燥后得到浅黄色粉末。

3.根据权利要求1所述葛花鸢尾苷的制备方法，其特征在于：所述n-正丁醇相/水的体积比为1:1，加入量为葛花粉质量的8～10倍，提取时间为1～2 h，反应温度为60～70℃。

4.根据权利要求1所述葛花鸢尾苷的制备方法，其特征在于：采用旋转蒸发浓缩的方法对过滤得到的正丁醇相浓缩到80～120 mL，浓缩相在室温(20～25℃)下放置10～14 h。

5.根据权利要求1所述葛花鸢尾苷的制备方法，其特征在于：采用乙醇对鸢尾苷粗品进行重结晶，次数为3-5次。

6.根据权利要求1所述葛花鸢尾苷的制备方法，其特征在于：采用热风干燥方式对鸢尾苷结晶进行干燥，干燥温度为40～50℃。

7.一种葛花鸢尾苷在饮料、醒酒饮料、酸奶或口香糖中的应用。

8.根据权利要求1-6所生产的葛花鸢尾苷的纯度可达到99%，可以应用于醒酒护肝保健品。