CN103340890A - Nadph作为制备用于防治脑缺血性中风药物方面的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种NADPH作为制备用于防治脑缺血性中风药物方面的应用。经研究发现TIGAR通过增加产生NADPH和减少细胞内ROS的水平，保护神经元免受氧化应激介导的脑缺血再灌注损伤。据此给予外源性NADPH能降低脑梗死体积，显著改善脑缺血小鼠行为障碍，减轻脑水肿，提高小鼠长期生存的能力和增强神经行为功能康复。

Description

NADPH作为制备用于防治脑缺血性中风药物方面的应用

技术领域

本发明属于药物新用途技术领域，具体涉及一种NADPH作为制备用于防治脑缺血性中风的药物方面应用。

背景技术

脑卒中（Stroke），又称脑中风或脑血管意外，是一种突然起病的脑血液循环障碍性疾病，是威胁人类健康的三大疾病之一，具有发病率高、死亡率高、致残率高、复发率高的特点。脑卒中是指在脑血管疾病的病人，因各种诱发因素引起脑内动脉狭窄，闭塞或破裂，而造成急性脑血液循环障碍，临床上表现为一过性或永久性脑功能障碍的症状和体征。脑卒中分为缺血性脑卒中和出血性脑卒中。近年来，我国的脑血管疾病患者逐年上升，以缺血性脑血管病最多见。目前，我国每年新发脑中风120-150万人，死亡80-100万人，存活者中约75%致残，5年复发率高达41%。

目前我国已进入老年化社会，脑中风的发病率及对国人的影响将有进一步增加的趋势，因此研究脑中风尤其是缺血性脑中风的病理机制及治疗防护一直是医药界的重要任务。理论上，针对急性缺血或缺血再灌后细胞损伤的药物（神经保护剂）可保护脑细胞，提高对缺血缺氧损伤的耐受性，从目前的研究结果看，大多数在动物实验中具有疗效的药物，在临床试验中往往以失败告终。因此，寻找脑缺血中风新的致病机制，寻找药物作用新的靶点，对于脑缺血的防治和药物的开发具有重要现实意义。

研究表明p53下游基因——TP53诱导糖酵解和凋亡调节因子（TP53-induced glycolysis and apoptosis regulator，TIGAR）有减轻氧化应急，促进肿瘤细胞生存的作用，而氧化应激是导致脑缺血神经损伤的重要机制之一。TIGAR可抑制糖降解增加磷酸戊糖途径的流量，进而产生大量的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（triphosphopyridine nucleotide，NADPH）。NADPH作为细胞内最为重要的电子供体,在参与生化反应的过程中会产生大量氧化态的NADP+。NADPH在细胞内的主要功能是电子转移反应共同的辅酶。生物体通过体内代谢减少氧化型化合物，维持其氧化还原体系，NADPH利用解毒细胞的电子供体，在氧化防御系统发挥重要作用。NADPH是由葡糖糖经过磷酸戊糖途径（PPP）代谢产生，NADPH又是谷胱甘肽（GSH）的还原酶的辅酶，维持还原型的GSH的正常含量。而GSH则是体内重要的抗氧化剂，可保护一些含巯基的蛋白质和酶类免受氧化剂的破坏，尤其是对维持红细胞膜的完整性有重要作用。NADPH通常作为生物合成的还原剂，并不能直接进入呼吸链接受氧化。只是在特殊的酶的作用下，NADPH上的H被转移到NAD+上，然后由NAD+进入呼吸链。NADPH除了主要参与胆固醇、脂肪酸、类固醇激素等物质合成的加氢反应外，还能作为供氢体参与体内羟化反应，与药物、毒物及激素的生物转化作用有关。

而目前未有文献报道TIGAR和NADPH在脑缺血中是否起着保护作用。

发明内容

本发明目的是提供一种NADPH作为制备预防和/或治疗脑缺血性中风的药物方面的应用；证明TIGAR-NADPH通路作为治疗脑缺血性中风等缺血性疾病的靶点。采用NADPH及其制剂进行预防和治疗脑缺血性中风等缺血性疾病，发现了缺血性脑中风神经细胞损伤的新机制及药物作用的新靶点，为研究防治缺血性中风的新药提供新思路。

为了解决现有技术中的这些问题，本发明的技术方案是：

一种NADPH作为制备预防和/或治疗脑缺血性中风的药物方面的应用。

优选的，所述药物包括药学上有效量的NADPH和药学上可接受的载体。

优选的，所述载体为常用的药用辅料载体和生理盐水、蒸馏水。

优选的，所述药物中NADPH是通过TIGAR调节产生的一种内源性抗氧化物质，主要发挥抗氧化作用。所述药物中NADPH可以是内源性NADPH，也可以是外源性NADPH。所述内源性NADPH通过TIGAR调节产生，所述外源性NADPH通过外在的NADPH试剂。

优选的，所述药物的给药方式包括外用，口腔或舌下，口服，皮下或肌注，静脉注射或静脉滴注。

优选的，所述药物的口腔剂型选自口服液、胶囊剂、泡腾片和口服药膜，喷雾剂；所述药物的外用剂型选自涂剂、巴布剂，所述药物的注射剂型选自供肌肉、皮下注射给药或静脉使用的粉针剂和水针剂。

优选的，所述药学还包括作用于TIGAR-NADPH内源性抗氧化通路不同于NADPH的合成小分子药物、基因工程药物，生物制剂，基因治疗药物。

本发明人研究发现的TIGAR调节的NADPH内源性抗氧化通路在治疗脑缺血性中风中有重要应用价值，可以用于作为药物开发和治疗的靶点。本发明人还发现，NADPH是TIGAR调节的内源性抗氧化产物，其制剂可用于治疗脑缺血性中风。由于NADPH预防性给药和治疗性给药均有减轻缺血性脑损伤的作用，因此可以用于防治脑中风。

NADPH药物可采用多种给药方式包括但不限于外用，口腔或舌下，口服，皮下或肌注，静脉注射或静脉滴注。其特征在于所述口腔剂型选自口服液、胶囊剂、泡腾片和口服药膜，喷雾剂；所述外用剂型选自涂剂、巴布剂，所述注射剂型选自供肌肉、皮下注射或静脉滴注给药使用的粉针剂和水针剂。胶囊、涂剂、巴布剂、喷雾剂和注射剂的载体为常用的药用辅料载体和生理盐水、蒸馏水。

用于治疗脑缺血性中风的药物还可以包括其他作用于TIGAR-NADPH内源性抗氧化通路的合成小分子药物、基因工程药物，生物制剂，基因治疗药物等。作为单方和复方制剂使用。根据缺血损伤的相似病理机制和TIGAR-NADPH抗氧化作用的普遍性，NADPH药物可以适用于缺血性心肌损伤，肾脏损伤和肝脏损伤及脑外伤的治疗和预防。

本发明人通过研究TIGAR是否在脑缺血损伤时高表达并增加NADPH的产生；通过研究TIGAR是否通过NADPH发挥神经保护作用；通过研究给予外源性NADPH是否有治疗脑缺血性中风的作用等过程，发现了一条内源性抗氧化通路在脑缺血中的神经保护作用，从而可以作为治疗脑缺血性疾病的治疗靶点。因此，本发明提供了一种NADPH治疗脑缺血中风的新用途。具体的，本发明人经研究发现TIGAR通过增加生产NADPH和减少细胞内的ROS水平，保护神经元免受氧化应激介导的脑缺血再灌注损伤，给予外源性NADPH能降低脑梗死体积，显著改善脑缺血小鼠行为障碍，减轻脑水肿，提高小鼠长期生存的能力和增强神经行为功能康复。

本发明人研究发现脑缺血再灌时上调TIGAR，增加NADPH和还原性谷光甘肽(GSH)水平，降低ROS水平，保护神经元免受氧化应激介导的脑缺血再灌注损伤。通过脑室注射、尾静脉注射缺血前和治疗性给予外源性NADPH都可显著减轻脑缺血小鼠行为障碍，降低脑梗死体积，减轻脑水肿，提高小鼠长期生存的能力和增强神经行为功能康复，提示NADPH对脑缺血再灌注损伤起保护作用。这一发现，将为脑缺血的病理机制研究提供新的思路和策略，对于神经保护剂的新靶点的发现产生重大的影响，并发现NADPH是一个有效的治疗缺血性脑中风的药物。

相对于现有技术中的方案，本发明的优点是：

本发明发现了一个治疗脑缺血性脑中风的新的靶点。这个靶点是TIGAR通过增加NADPH的产生发挥神经保护作用，因此调节TIGAR或补充NADPH可以达到治疗脑缺血性中风的目的；本发明发现了给予外源性NADPH有很好的治疗脑缺血性中风的作用，而且在缺血发作6小时内给药有效。NADPH是一个内源性的抗氧化物质，在治疗应用时没有发现有毒副作用；具有用量小、安全、可口服、可注射、可透过口鼻粘膜和皮肤给药等优点；由于氧化应急是其它脏器缺血损伤的共同机制，推理TIGAR-NADPH通路在其它疾病中有广泛用途。

附图说明

下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：

图1为小鼠脑缺血中TIGAR蛋白水平的变化；

图2为TIGAR在脑缺血性中风小鼠脑梗死体积的影响。

图3为TIGAR在脑缺血性中风小鼠神经症状的影响。

图4为TIGAR在脑缺血性中风小鼠脑水肿的影响。

图5为TIGAR对脑缺血性中风小鼠长期存活的影响。

图6为TIGAR对脑缺血性中风小鼠协调运动的影响。

图7为TIGAR对脑缺血性中风小鼠平衡运动的影响。

图8为TIGAR对脑缺血性中风小鼠学习记忆能力的影响。

图9为缺血前给予NADPH对脑缺血性中风小鼠脑梗死体积的影响。

图10为缺血前给予NADPH对脑缺血性中风小鼠神经症状的影响。

图11为缺血前给予NADPH对脑缺血性中风小鼠脑水肿的影响。

图12为缺血前给予NADPH对脑缺血性中风小鼠长期存活的影响。

图13为缺血前给予NADPH对脑缺血性中风小鼠协调运动的影响。

图14为缺血前给予NADPH对脑缺血性中风小鼠平衡运动的影响。

图15为缺血前给予NADPH对脑缺血性中风小鼠学习记忆能力的影响。

图16为缺血前给予NADPH对脑缺血性中风小鼠大脑皮层缺血区ROS水平的影响。

图17为缺血前给予NADPH对脑缺血性中风小鼠大脑皮层缺血区GSH水平的影响。

图18为外源NADPH对缺糖缺氧的小鼠原代皮层神经元活性的影响。

图19为外源NADPH对缺糖缺氧的小鼠原代皮层神经元毒性的影响。

图20为外源NADPH对缺糖缺氧的小鼠原代皮层神经元凋亡的影响。

图21为治疗性给予NADPH对脑缺血性中风小鼠脑梗死体积的影响。

图22为治疗性给予NADPH对脑缺血性中风小鼠神经症状的影响。

图23为治疗性给予NADPH对脑缺血性中风小鼠大脑含水量的影响。

具体实施方式

以下结合具体实施例对上述方案做进一步说明。应理解，这些实施例是用于说明本发明而不限制本发明的范围。实施例中采用的实施条件可以根据具体厂家的条件做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。

实施例  TIGAR通过增加生产NADPH减少脑缺血再灌注损伤实验

（1）实验材料

清洁级雄性ICR小鼠，质量23～28g，苏州大学实验动物中心提供，实验动物生产许可证号：XCYK（苏）2002-2008，实验动物使用许可证号：SYXK（苏）2002-0037。室温22℃，湿度50-60%，通风良好，人工昼夜(12h/12h)，自由摄食摄水。实验前，将雄小鼠在饲养环境中适应2d。分5组：过表达TIGAR小鼠组（LV-TIGAR mice）、沉默TIGAR小鼠组（LV-sh_TIGAR or knockdown mice）、LV-GFP组为过表达TIGAR小鼠阴性对照组、LV-sh_TIGAR组为沉默TIGAR小鼠阴性对照组。NADPH试剂购自江苏碧云天生物试剂公司；外源性NADPH药物的来源可以通过人工合成、半合成，生物提取获得。

（2）实验过程

1）慢病毒包装的TIAGR注射脑内模型的制备：

将慢病毒过表达或沉默TIGAR脑内立体定位注射至小鼠右单侧纹状体内和侧脑室两个位置制备模型。(1)小鼠4%水合氯醛麻醉，将头固定在立体定位仪上，切开头皮暴露颅骨。(2)用骨钻针分别在侧脑室和纹状体进针处打一小孔(侧脑室：按前囟后1.0mm，侧开0.4mm,H2.5mm的坐标，纹状体：按前囟后1.8mm，侧开0.4mm，H3.5mm)。将固定于立体定位仪上的注射针按上述坐标插入相应的位置。(3)病毒液用微量注射泵推注，注射时间10min，每个点注射容积2μl。注射结束后留针2min后取出注射针头，头皮缝合。手术完毕后给予动物保温并观察小鼠直至其恢复自由行走。(4)慢病毒在小鼠脑内感染3周后，进行检测和模型手术。获得模型小鼠：过表达TIGAR小鼠（LV-TIGAR mice）、沉默TIGAR小鼠（LV-sh_TIGAR orknockdown mice）。阴性对照组小鼠：LV-GFP小鼠组为过表达TIGAR小鼠的阴性对照组，LV-sh_TIGAR小鼠组为沉默TIGAR小鼠的阴性对照组。

2）Western blot方法：

(1)配制12％SDS-PAGE，上样，电压积层胶90V、分离胶110V，电泳。(2)电泳结束后采用湿转法将样品转移至NC膜，10%的胶恒流0.5A，1.5h；14%的胶恒流0.3A，45min。(3)转膜结束后，将NC膜放入含有5％脱脂奶粉的TBS中室温下封闭2h。(4)加入含有5％脱脂奶粉和0.1%叠氮钠的TBS配置的一抗，4°C过夜。(5)TBS-T漂洗15min×3次，TBS漂洗15min×1次。(6)加入用含有5％脱脂奶粉TBS配置的二抗，室温2h。(7)TBS-T漂洗15min×3次，TBS漂洗15min×1次，将膜置于ECL显色液中（临用前A、B液等体积混匀），室温1min。压片、曝光、显影。

取ICR正常小鼠（WT）组，体重23～28g，随机分2组，每组20只，分为生理盐水组（vehicle组），NADPH(1mg/kg)剂量组；取LV-TIGAR小鼠（LV-TIGAR）组，体重23～28g，随机分2组，每组20只，分为生理盐水组（vehicle组），NADPH(1mg/kg)剂量组；取LV-sh_TIGAR小鼠（knockdown mice）组，体重23～28g，随机分2组，每组20只，分为生理盐水组（vehicle组），NADPH(1mg/kg)剂量组。NADPH在缺血前通过侧脑室注射脑内。按前囟后1.0mm，侧开0.4mm，H2.5mm的坐标，用10μl微量进样器注射。为检查侧脑室注射部位的准确性，另取一批大鼠，同法注入10μl蓝墨水，切开侧脑室检查注射部位，注射准确率为100%。DHE（1mg/kg）腹腔注射体内。缺血24h后断头取脑行TTC染色，观察脑梗塞面积。

3）小鼠短暂性大脑中动脉阻塞模型建立：

采用颈内动脉线栓法，稍加改进制备小鼠MCAO模型，小鼠以4%水合氯醛(400mg/kg)腹腔注射麻醉，我们采用线栓法制备缺血模型，分离颈总、颈外和颈内动脉，结扎劲外和颈总近心端，线栓(6023，Doccol Corporation,Redlands,USA)从颈外插入直到大脑前动脉起始端，阻断大脑中动脉供血。阻断血流2h后，拔出线栓实现再灌注。假手术组小鼠除不插线外，其余步骤均与缺血组和治疗组相同。整个手术过程中室温保持在22～25℃，采用自动控温加热垫将小鼠肛温控制在37±0.5℃。术后将动物置于放有清洁垫料的饲养盒中，自由饮水、进食。

（3）实验方法

1）脑梗死体积测定：脑缺血再灌注24h后将小鼠断头取脑，置冰箱(-20℃)数分钟，去掉嗅球、小脑和低位脑干，冠状切4刀分为5片（2mm），脑片用红四氮唑(TTC)染色，染色液组成为：1.5ml1%TTC，0.1ml1mol/LK2HPO4，3.4ml生理盐水，37℃避光染色30min，正常组织呈红色，梗死组织为白色。4%甲醛固定两天后，用滤纸吸干液体再取出脑梗死组织，以梗死脑组织重量占总大脑重量的百分比作为脑梗死体积的指标。用SigmaPro5.0软件计算脑梗塞面积所占百分比。

2）神经症状评分：小鼠脑缺血再灌注24h后，由一不了解分组情况的观察者按照五分制评分标准对小鼠进行神经行为障碍评分：0分：无神经功能缺损症状；1分：不能完全伸展对侧前肢；2分：行走时向对侧旋转，出现“追尾”现象；3分：站立不稳，向对侧倾倒；4分：不能自发行走，意识障碍。

3）大脑含水量测定：脑缺血再灌注24h后将小鼠断头取脑，去掉嗅球、小脑和低位脑干，称取大脑湿重，107℃烘烤48h后称干重，大脑含水量百分比=（湿重-干重）/湿重×100%。

4）神经功能测试：

I动物模型的制作：选取体重在23-28g的雄性ICR小鼠，作脑缺血2h再灌注手术。该动物模型脑缺血时间长，死亡率高，注意及时补足动物数。

II运动功能试验：

a转子杆测试（Rota-rod test）在转子杆上保持平衡需要本体觉、位置觉及微调运动能力。该测试要求小鼠在匀速旋转杆上保持平衡，并记录其在转棒上的运动时间及跌落时间得转棒旋转速度。测试中缓慢的加速限制了个体间表现的差异性。所需道具包括：（1）仪器：滚轮轴心的直径为5cm左右，由坚固的塑料制作而成，外面包裹灰色的橡胶泡沫。管宽约5cm。这个仪器可以在300s内从4转/min加速到40转/min；（2）秒表；（3）50%酒精；（4）纸巾。在测验的时候，把小鼠放在他们自己的笼子里，让它们在测试房间内适应15min（适应环境阶段）。整个测试是由间隔15min的三次试验组成。在测验阶段前没有训练阶段。它可以在同一次试验时直接对下一批小鼠进行操作。仪器设定为在300s内从4转/min加速到40转/min。仪器在开始前以4转/min的恒速运转。

b平衡木试验（Beam Balance test）平衡木行走测试用于评估小鼠运动的协调和整合功能的缺陷，尤其是后肢。在缺血模型建立前，用3天时间训练小鼠爬过横木，训练期结束时所有小鼠都学会此任务。平衡木行走测试在一方形横木（宽2.5cm，长122cm，高42cm）上用食物诱导让其行走训练平衡能力。

III学习记忆的行为学试验——Y迷宫实验（Y-maze test）

Y型电迷宫3条臂的尽头均有l灯，底部是电网，其中只有1条臂尽头的灯发出亮光，此时该臂底部电网无电流通过，即为安全区。另两臂的灯不亮，底部电网通电(约50V)，为非安全区。安全区与非安全区随机改变。实验开始时，将动物放入迷宫中任一臂中适应2～3min。然后将其他任一臂的信号灯打开作为条件刺激，经ls延迟后，灯不亮的两臂通电(非条件刺激)。当动物逃避电击至安全区后，灯亮持续15s，然后熄灯休息45s，即完成1次操作并记录所用时间。然后再开始下一次操作。

5）数据统计与分析：数据均以均数±SD（Mean±SD）表示，统计分析采用单因素方差分析（one-way ANOVA），p<0.05为统计学差异有显著性。

（4）实验结果

结果如下：

图1为脑缺血性中风小鼠大脑皮层缺血区TIGAR蛋白水平的变化。Western blot结果显示，脑缺血再灌注3h小鼠皮层TIGAR的表达量显著增加(p＜0.01)，而且在这个时间达到高峰，再灌注后6h开始下降。结果提示，脑缺血性中风小鼠大脑皮层缺血区激活了TIGAR蛋白表达；其中**表示p<0.01。

图2为TIGAR对脑缺血性中风小鼠脑梗死体积的影响。与模型组相比，LV-TIGAR组显著降低小鼠脑缺血再灌注24h后脑梗死体积(p<0.01)；LV-sh_TIGAR组增加了小鼠脑梗死体积(p<0.05)；LV-GFP组或LV-sh_Scramble组无显著性差异。结果提示过表达TIGAR可降低脑缺血性中风小鼠脑梗死体积，而沉默TIGAR则增加脑缺血性中风小鼠脑梗死体积；其中**表示p<0.01，*表示p<0.05。

图3为TIGAR对脑缺血性中风小鼠神经症状的影响。模型组，LV-TIGAR组显著降低小鼠脑缺血再灌注24h后神经症状评(p<0.05)；LV-sh_TIGAR组增加了小鼠神经症状评分(p<0.05)；LV-GFP组或LV-sh_Scramble组无显著性差异。结果提示过表达TIGAR可改善脑缺血性中风小鼠的神经症状，沉默TIGAR加重脑缺血性中风小鼠的神经症状；其中*表示p<0.05。

图4为TIGAR对脑缺血性中风小鼠脑水肿的影响。与模型组相比，LV-TIGAR组显著降低了小鼠脑缺血再灌注24h后的大脑含水量(p<0.05)；LV-sh_TIGAR组增加了小鼠的大脑含水量(p<0.05)；LV-GFP组或LV-sh_Scramble组无显著性差异。提示过表达TIGAR可降低脑缺血性中风小鼠的脑水肿，沉默TIGAR增加脑缺血性中风小鼠的脑水肿；其中*表示p<0.05。

图5为TIGAR对脑缺血性中风小鼠长期生存的影响。生存曲线结果显示：与模型组相比，LV-TIGAR组提高了小鼠脑缺血再灌注后28天存活率(p<0.05)；LV-sh_TIGAR组降低了小鼠的存活率(p<0.05)；提示过表达TIGAR可提高小鼠生存率，沉默TIGAR降低小鼠的生存率；其中*表示p<0.05。

图6为TIGAR对脑缺血性中风小鼠协调运动的影响。平衡木检测结果显示：与模型组相比，LV-TIGAR组显著增强了脑缺血再灌注后28天存活小鼠的平衡运动能力(p<0.05)；LV-sh_TIGAR组降低了小鼠的平衡运动能力(p<0.01)。LV-GFP组或LV-sh_Scramble组无显著性差异。提示过表达TIGAR可提高小鼠协调运动能力，沉默TIGAR却降低小鼠协调运动能力；其中**表示p<0.01，*表示p<0.05。

图7为TIGAR对脑缺血性中风小鼠平衡运动的影响。转子杆测试小鼠平衡运动能力结果显示：与模型组相比，LV-TIGAR组显著增强了脑缺血再灌注后28天存活小鼠的平衡运动能力(p<0.05)；LV-sh_TIGAR组降低了小鼠的平衡运动能力(p<0.05)。LV-GFP组或LV-sh_Scramble组无显著性差异。提示过表达TIGAR可提高小鼠平衡运动能力，沉默TIGAR却降低小鼠平衡运动能力；其中*表示p<0.05。

图8为TIGAR对脑缺血性中风小鼠平衡运动的影响。Y迷宫检测结果显示：与模型组相比，LV-TIGAR组显著提高了脑缺血再灌注后28天存活小鼠的学习记忆能力(p<0.05)；LV-sh_TIGAR组降低了小鼠的学习记忆能力(p<0.05)。LV-GFP组或LV-sh_Scramble组无显著性差异。提示过表达TIGAR可提高小鼠学习记忆能力，沉默TIGAR却降低小鼠学习记忆能力；其中*表示p<0.05。

图9为缺血前给予NADPH对脑缺血性中风小鼠脑梗死体积的影响。在野生小鼠(WT)中，与vehicle组相比，NADPH组显著地减少了小鼠的脑梗死体积(p<0.05)。在LV-TIGAR小鼠中，与vehicle组相比，NADPH组显著地减少了小鼠的脑梗死体积(p<0.05)。在TIGAR knockdown小鼠中，与vehicle组相比，NADPH组显著地减少了小鼠的脑梗死体积(p<0.01)。提示NADPH可降低脑缺血性中风小鼠脑梗死体积；其中**表示p<0.01，*表示p<0.05。

图10为缺血前给予NADPH对脑缺血性中风小鼠神经症状的影响。在野生小鼠中，与vehicle组相比，NADPH组显著地降低了小鼠脑缺血再灌注24h后神经症状评分(p<0.05)。在LV-TIGAR小鼠中，与vehicle组相比，NADPH组显著地降低了小鼠神经症状评分(p<0.05)。在TIGAR knockdown小鼠中，在LV-TIGAR小鼠中，与vehicle组相比，NADPH组显著地降低了小鼠神经症状评分(p<0.05)。结果提示NADPH可改善脑缺血性中风小鼠的神经症状；其中*表示p<0.05。

图11为缺血前给予NADPH对脑缺血性中风小鼠脑水肿的影响。在野生小鼠中，与vehicle组相比，NADPH组可显著降低小鼠的大脑含水量(p<0.05)。在LV-TIGAR小鼠中，与vehicle组相比，NADPH组没有降低小鼠的大脑含水量，无显著性差异。在TIGAR knockdown小鼠中，与vehicle组相比，NADPH组可显著降低小鼠的大脑含水量(p<0.05)。提示NADPH可降低脑缺血性中风小鼠脑含水量；其中*表示p<0.05。

图12为缺血前给予NADPH对脑缺血性中风小鼠长期存活的影响。从生存曲线上结果显示：在野生小鼠，LV-TIGAR小鼠和TIGAR knockdown小鼠中，与相应vehicle组相比(p<0.05)，NADPH组的脑缺血再灌注后28天小鼠存活率都有所提高；提示NADPH可提高小鼠生存率；其中*表示p<0.05。

图13为缺血前给予NADPH对脑缺血性中风小鼠协调运动的影响。在野生小鼠中，与vehicle组相比，NADPH组显著地增强了小鼠的协调运动能力(p<0.05)；在LV-TIGAR小鼠中,与vehicle组相比，NADPH组显著地提高了小鼠的协调运动能力(p<0.05)。在TIGAR knockdown小鼠中，与vehicle组相比，NADPH组显著地增强了小鼠的协调运动能力(p<0.05)。提示NADPH能提高小鼠协调运动能力；其中*表示p<0.05。

图14为缺血前给予NADPH对脑缺血性中风小鼠平衡运动的影响。在野生小鼠中，与vehicle组相比，NADPH组显著地提高了小鼠的平衡运动能力(p<0.05)；在LV-TIGAR小鼠中，与vehicle组相比，NADPH组显著地增强了小鼠的平衡运动能力(p<0.05)。在TIGAR knockdown小鼠中，与vehicle组相比，NADPH组显著地提高了小鼠的平衡运动能力(p<0.05)。提示NADPH可提高小鼠平衡运动能力；其中*表示p<0.05。

图15为缺血前给予NADPH对脑缺血性中风小鼠学习记忆能力的影响。在野生小鼠中，与vehicle组相比，NADPH组显著地提高了小鼠的学习记忆能力(p<0.05)；在LV-TIGAR小鼠中,与vehicle组相比，NADPH组显著地提高了小鼠的学习记忆能力(p<0.05)。在TIGAR knockdown小鼠中，与vehicle组相比，NADPH组显著地提高了小鼠的学习记忆能力(p<0.05)。提示NADPH可增强小鼠学习记忆能力；其中*表示p<0.05。

图16为缺血前给予NADPH对脑缺血性中风小鼠大脑皮层缺血区ROS水平的影响。DHE荧光结果显示：与假手术(sham)组相比，vehicle组小鼠脑缺血再灌注3h后显著提高了ROS水平(p<0.001)；缺血前应用NADPH后，与vehicle组相比，NADPH显著地抑制脑缺血性中风小鼠大脑皮层ROS水平的升高(p<0.05)。结果提示NADPH降低脑缺血性中风小鼠大脑皮层缺血区ROS水平；其中***表示p<0.001，*表示p<0.05。

图17为缺血前给予NADPH对脑缺血性中风小鼠大脑皮层缺血区GSH水平的影响。小鼠脑缺血再灌注3h后，与sham组相比，vehicle组显著地降低了GSH水平(p<0.01)；缺血前应用NADPH后，与vehicle组相比，NADPH显著地提高了脑缺血性中风小鼠大脑皮层GSH水平(p<0.05)；其中**表示p<0.01，*表示p<0.05。

实施例2  外源性NADPH对缺糖缺氧的小鼠原代皮层神经元损伤的保护作用

（1）实验材料、分组同实施例1。实验相关条件也参考实施例1。

（2）实验方案：

原代皮层神经元培养：在无菌条件下取孕17d的ICR小鼠胎鼠，剥离出大脑半球，在解剖显微镜下剥除软脑膜及血管，分离出大脑皮层组织，预冷PBS漂洗2-3次，然后用1.25%胰酶37℃消化15-30min，用含10%血清的DMEM/F12培养液终止胰酶，接着用DNase I处理细胞3min，最后用吸管将组织吹打分离成为单细胞悬液，以含有10%B27、5%Pen/Strep、25μMGlutamate的Neurobasal Medium将细胞用计数板计数后接种于板或皿中。次日，以10%B27、5%Pen/Strep、0.5mM Glutamine的Neurobasal Medium全量换液，继续培养3-4d后半量换液，加入10μM AraC抑制胶质细胞的生长。以后每3-4d半量换液。取培养11d的细胞进行实验。

慢病毒感染神经元方法：慢病毒构建的过表达或干扰TIGAR（病毒滴度1×10⁹/ml）在神经元培养第四天，回收原培养液，使用原和新的培养液1:1混合，配制病毒培养液（MOI=10）加入神经元中，在37℃，5%CO₂，95%O₂培养箱中孵育2h后换回原培液继续培养到11d。进行缺糖缺氧。

细胞缺糖缺氧（OGD）再复糖氧的模型：皮质神经元细胞培养到11d，弃去原培养液，换入不含葡萄糖且已做缺氧处理的HBSS溶液中，放入专用的OGD培养气室中，持续通入95%N₂-5%CO₂的混合气体10min以上，以保证缺氧培养室内缺氧环境的稳定和完全，之后将整个缺氧培养气室置于37℃的环境中进行缺糖缺氧4h，然后再复糖复氧继续培养0h、1h、3h、6h、12h、24h后进行相关检测。

CCK-8方法检测细胞活力：神经元原代培养时，接种于96孔板，密度1×105/ml，每孔加入100μl，设两空为空白孔对照，即仅加培养液但不含细胞；然后用OGD再复糖复氧24h；每孔100μl细胞培养液中加入CCK-810μl，放到37℃培养箱孵育4h；摇床摇动45s，490nm测光吸收值性。

LDH法检测细胞乳酸脱氢酶漏出率：神经元原代培养时，接种于96孔板，密度1×10⁵/ml，每孔加入100μl，设两空为空白孔对照，即仅加培养液但不含细胞；然后用OGD再复糖复氧24h；每孔100μl细胞培养液中按照LDH试剂盒的说明书进行操作，室温放置30min，在440nm处检测OD值；计算LDH漏出率。

TUNEL检测细胞凋亡：细胞OGD再复糖复氧24h后，收集细胞培养液中漂浮细胞和仍然贴壁的细胞以及上清液，PBS或HBSS洗涤一次，用4%多聚甲醛定细胞30-60min。为防止细胞聚集成团，宜在侧摆摇床或水平摇床上缓慢摇动的同时进行固定。用PBS或HBSS洗涤一次。用含0.1%Triton X-100的PBS重悬细胞，冰浴孵育2min。按照TUNEL试剂盒的说明书进行操作。然后用PBS或HBSS洗涤2次，加入50μl TUNEL检测液，37℃避光孵育60min，PBS或HBSS洗涤2次，用250-500μl PBS或HBSS悬浮，此时可以用流式细胞仪进行检测或涂片后在荧光显微镜下观察。Cy3的激发波长为550nm，发射波长为570nm(红色荧光)。

（3）实验结果

结果如下：

图18为外源NADPH对缺糖缺氧的小鼠原代皮层神经元活性的影响。在正常培养神经元下cont组，LV-TIGAR组，LV-TIGAR+NADPH组，LV-sh_TIGAR组，LV-sh_TIGAR+NADPH组对神经元的活性无影响。但是OGD处理神经元后，LV-TIGAR组可阻断OGD诱导细胞活性的降低，而LV-sh_TIGAR组显著加剧了OGD诱导细胞活性的降低(p<0.01)。应用NADPH后，LV-TIGAR+NADPH组增强了LV-TIGAR组的作用，LV-sh_TIGAR+NADPH组抑制了LV-sh_TIGAR组的作用。提示NADPH抑制了干扰TIGAR引起细胞活性的降低；其中**表示p<0.01，§§表示p<0.01，#表示p<0.05。

图19为外源NADPH对缺糖缺氧的小鼠原代皮层神经元毒性的影响。在正常培养神经元下cont组，LV-TIGAR组，LV-TIGAR+NADPH组，LV-sh_TIGAR组，LV-sh_TIGAR+NADPH组对神经元无毒性影响。OGD处理神经元后LV-TIGAR组抑制OGD引起的细胞毒性的增强，LV-sh_TIGAR组显著地加剧了OGD引起的细胞毒性的增加(p<0.01)。应用NADPH后，LV-TIGAR+NADPH组加强了LV-TIGAR组的作用(p<0.05)，LV-sh_TIGAR+NADPH组抑制了LV-sh_TIGAR组的作用(p<0.05)。结果提示NADPH抑制了干扰TIGAR引起细胞毒性的增强；其中**表示p<0.01，§表示p<0.05，#表示p<0.05。

图20为外源NADPH对缺糖缺氧的小鼠原代皮层神经元凋亡的影响。在正常培养神经元下cont组，LV-TIGAR组，LV-TIGAR+NADPH组，LV-sh_TIGAR组，LV-sh_TIGAR+NADPH组对神经元的凋亡无影响。OGD处理神经元24h后，与cont组相比，LV-TIGAR显著地抑制了OGD引起细胞凋亡的增加(p<0.01)；LV-sh_TIGAR则加剧了OGD引起细胞凋亡的增加(p<0.01)。应用NADPH后，LV-TIGAR+NADPH组加强了LV-TIGAR组的作用，LV-sh_TIGAR+NADPH组抑制了LV-sh_TIGAR组的作用。提示NADPH抑制了干扰TIGAR引起细胞凋亡的增加；其中**表示p<0.01，§表示p<0.05，#表示p<0.05。

实施例3  治疗性给予NADPH减少脑缺血损伤

实验材料、分组同实施例1。实验相关条件也参考实施例1。

实验方案：

取ICR小鼠，体重23～28g，随机分6组，每组20只，分别生理盐水（vehicle）组，0h组，2h组，4h组，6h组，8h组。NADPH(2.5mg/kg)在再灌注后0h，2h，4h，6h，8h，通过尾静脉注射体内。

实验结果如下：

图21为治疗性给予NADPH对脑缺血性中风小鼠脑梗死体积的影响。TTC染色结果显示：与vehicle组相比，再灌注0h，2h，4h尾静脉给予NADPH后显著地减少小鼠脑梗死体积(p<0.05，p<0.01)。而6h和8h给予NADPH无显著差异。

图22为治疗性给予NADPH对脑缺血性中风小鼠神经症状的影响。神经症状评分结果显示，与vehicle组相比，再灌注0h，2h，4h尾静脉给予NADPH后显著地降低了小鼠脑缺血再灌注24h后神经症状评分(p<0.05，p<0.01)。而6h和8h给予NADPH无显著差异。

图23治疗性给予NADPH对脑缺血性中风小鼠大脑含水量的影响。与vehicle组相比，再灌注0h，2h，4h尾静脉给予NADPH后显著降低脑缺血性中风小鼠的大脑含水量(p<0.05，p<0.01)。而6h和8h给予NADPH无显著差异。

上述实例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人是能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所做的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种NADPH作为制备用于预防和/或治疗脑缺血性中风的药物方面的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述药物包括药学上有效量的NADPH和药学上可接受的载体。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述载体为常用的药用辅料载体和生理盐水、蒸馏水。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述药物中NADPH为受TIGAR调节产生的内源性抗氧化物质，发挥内源性抗氧化作用。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述药物的给药方式包括外用，口腔或舌下，口服，皮下或肌注，静脉注射或静脉滴注。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述药物的口腔剂型选自口服液、胶囊剂、泡腾片和口服药膜，喷雾剂；所述药物的外用剂型选自涂剂、巴布剂，所述药物的注射剂型选自供肌肉、皮下注射给药或静脉滴注使用的粉针剂和水针剂。

7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述药学还包括作用于TIGAR-NADPH内源性抗氧化通路不同于NADPH的合成小分子药物、基因工程药物，生物制剂，基因治疗药物。

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