CN102824339B

CN102824339B - 丁酸钠在制备缺氧性肺动脉高压防治药物中的应用

Info

Publication number: CN102824339B
Application number: CN201210171295.XA
Authority: CN
Inventors: 谭小玲; 高钰琪; 黄小勇; 陈德伟; 冯岚
Original assignee: Third Military Medical University TMMU
Current assignee: Third Military Medical University TMMU
Priority date: 2012-05-29
Filing date: 2012-05-29
Publication date: 2015-07-22
Anticipated expiration: 2032-05-29
Also published as: CN102824339A

Abstract

本发明公开了丁酸钠在制备缺氧性肺动脉高压防治药物中的应用，丁酸钠具有抑制缺氧内皮细胞的内皮素-1分泌和促进缺氧内皮细胞的一氧化氮分泌的作用，从而达到防治缺氧性肺动脉高压疾病；丁酸钠性质稳定、易溶于水溶剂，溶解后直接口服，服用方便、便于携带，丁酸钠本身是一种无毒无害制剂且价格便宜。

Description

丁酸钠在制备缺氧性肺动脉高压防治药物中的应用

技术领域

本发明涉及丁酸钠的药物新用途，特别涉及丁酸钠在制备缺氧性肺动脉高压防治药物中的应用。

背景技术

肺动脉高压（pulmonary hypertention,PH）是以肺血管阻力进行性增高，并导致右心室衰竭及死亡为特征的一组疾病，致残和致死率很高（75%病人死于诊断后的5年内，平均生存期为1.9年，75%患者集中于20-40岁年龄段），堪称心血管病中的“癌症”。缺氧性肺动脉高压（hypoxic pulmonary hypertention HPH）是PH最常见的类型，也是我国肺动脉高压防治的重点。首先，缺氧性肺动脉高压是急、慢性高原病发病的中心环节。我国是“高原之国”，肺动脉压随着海拔高度的增加而升高。调查显示，世居高原的藏族人群高原性心脏病的患病率为1.21%；移居的汉族人群患病率为5.57%，如持续多年居住在海拔3500m以上，其患病率将为藏族人群的5倍。随着青海、西藏交通的发展、经济和国防建设发展的需要，因缺氧引起的高原性肺动脉高压和心脏病的防治任务格外重要。其次，随着社会老龄化和医疗水平的提高，肺循环障碍、慢性肺疾病等继发引起的缺氧性肺动脉高压的患者正逐年增加。

维护缺氧条件下血管内皮细胞正常的分泌功能是防治缺氧性肺动脉高压的有效途径之一。早期干预内皮细胞功能障碍是预防缺氧肺动脉高压症的有效措施，缺氧早期，因肺血管收缩引起的肺动脉高压为功能性的，经治疗可缓解，但随着病情的进展，肺动脉尤其肺小动脉结构发生改建，如血管平滑肌增殖、肥大，管腔缩小，血管壁弹性降低，从而形成持续的HPH。因此，缺氧导致的血管平滑肌细胞的异常收缩和增殖肥大是防治HPH的关键环节。平滑肌细胞的收缩、增殖受诸多因素的影响，而血管内皮细胞起了直接的调控作用。一方面，肺血管内皮细胞能分泌多种血管活性物质，包括缩血管的内皮素-1（ET-1），扩血管的一氧化氮（NO）、前列环素等。它们作用于血管平滑肌细胞，调节平滑肌的收缩状态。正常情况下，这些缩、扩血管活性物质保持稳态平衡，维持血管张力的稳态调节，然而在缺氧条件下，内皮细胞功能发生紊乱，其中最重要的改变就是血管活性物质分泌稳态的失衡，这种失衡不仅促使肺动脉收缩异常，而且对平滑肌增殖、肥大有很强的促进作用。

因此，抑制缺氧血管内皮细胞ET-1的过度增加，促进NO的分泌，从而逆转ET-1/NO失衡是防治缺氧性肺动脉高压可行的、有效的途径。ET-1是迄今发现的最强大的血管收缩物质，不仅作用持久，而且对平滑肌细胞增殖肥大有很强的促进作用。肺血管内皮细胞是ET-1分泌的主要细胞。NO是体内最重要的血管内皮依赖舒张因子，主要由内皮细胞特异表达的内皮一氧化氮合成酶（eNOS）催化L-精氨酸分解生成。NO通过激活鸟苷酸环化酶提高平滑肌细胞cGMP，诱导平滑肌舒张。正常情况下，内皮细胞分泌ET-1和NO呈稳态平衡，共同调节肺血管张力。然而，缺氧条件下，内皮细胞分泌ET-1增多，而NO减少，这种失衡状态与缺氧性肺动脉高压的发生有密切关系：①在HPH患者体内血浆ET-1水平显著升高，并且与右心房压力、肺动脉血氧饱和度及肺动脉阻力相关；肺动脉压力越高，血浆ET-1水平越高；运用ET-1受体拮抗剂可以下调肺血管张力，抑制肺血管平滑肌细胞的增殖肥大。②应用NO或NO前体能显著降低缺氧肺动脉压力增加的程度，而NOS抑制剂可显著增加缺氧肺血管收缩程度，加快肺血管结构的重建。

着眼于改善内皮细胞分泌血管活性物质的功能，防治缺氧肺动脉高压的方法包括：①直接吸入NO气体，虽然有效，但不便于携带以及随时取用；②NO前体的使用，如L-精氨酸，但研究证明缺氧能抑制内皮细胞特异表达的内皮一氧化氮合成酶（eNOS）的表达和催化活性，因此，如果不纠正缺氧条件下eNOS 的活性降低，仅增加NO前体，其效果是有限的。③ET-1受体拮抗剂的使用，但是不仅给药方式、毒负作用不明确，并且受体拮抗效率以及使用方式不明确。④基因治疗手段，通过转染eNOS表达载体和ET-1抑制载体，调节缺氧内皮细胞分泌功能，但该方法的安全性和临床应用的可行性不明确。除此之外，目前的技术手段和现有研究中均没有关注和解决内皮细胞分泌ET-1和NO的稳态平衡的调节问题。另外，目前已知的丁酸钠作用有：①提供肠上皮细胞能量，促进肠黏膜发育，修复黏膜上皮细胞，活化淋巴细胞；②调整胃肠道微生态平衡，促进有益菌群增殖；③提高肠道挥发性脂肪酸含量，降低胃肠道pH；④加强肠道非特异性免疫，维护肠道健康；⑤与抗生素有较强协同作用，抑菌促生长效果明显。但目前尚未见有关丁酸钠用于防治缺氧性肺动脉高压的报道。

丁酸钠（Sodium Butyrate，NaB）分子式为C₄H₇O₂Na，分子量为110.09，分子结构为

发明内容

鉴于此，本发明的目的是提供丁酸钠在制备缺氧性肺动脉高压防治药物中的应用。

所述的丁酸钠在用于制备缺氧性肺动脉高压防治药物的用途时，其使用剂量范围为6~48g/天，优选的使用剂量为12g/天。

本发明的另一目的是提供一种药物组合物，所述药物组合物包含丁酸钠及常规药用载体。丁酸钠可根据临床需要，加入相应药用载体，以片剂、丸剂、胶囊、溶液等制剂形式存在。

优选的，所述丁酸钠的纯度在98%以上。

优选的，所述药物组合物是通过将丁酸钠溶于生理盐水制备而成的口服途径方式给药的制剂。

本发明中，丁酸钠能抑制缺氧内皮细胞ET-1的分泌，从而防治肺血管平滑肌细胞的增殖肥大；同时丁酸钠能促进NO的分泌，从而降低缺氧肺动脉压力以及增加缺氧肺血管收缩程度，最终达到防治缺氧性肺动脉高压的目的。丁酸钠的作用机制在于其能够诱导缺氧eNOS基因表达，抑制ET-1基因的表达。另外，丁酸钠易溶于水溶剂，且性质稳定，不论干粉还是水溶液均可以在常温保存；丁酸钠能在溶解后直接口服，服用方便且便于携带，其本身是一种无毒无害制剂，能被肠道直接吸收而不存在二次降解，而且价格便宜。

附图说明

图1为本发明缺氧和常氧条件下丁酸钠处理的人脐静脉内皮细胞（HUVEC）和人肺动脉内皮细胞（HPAEC）的NO分泌水平的流式细胞学检测结果图；

图2为本发明缺氧和常氧条件下丁酸钠处理的人脐静脉内皮细胞（HUVEC）和人肺动脉内皮细胞（HPAEC）的ET-1分泌水平的放射免疫学检测结果图；

图3为本发明缺氧条件下丁酸钠处理的人脐静脉内皮细胞ET-1基因和eNOS基因的RT-PCR检测结果图；

图4为本发明缺氧和常氧条件下丁酸钠处理的人脐静脉内皮细胞ET-1蛋白和eNOS蛋白的Western Blot检测结果图；

图5为本发明缺氧和常氧条件下丁酸钠处理的人脐静脉内皮细胞eNOS基因的启动子活性检测结果图；

图6为本发明缺氧和常氧条件下丁酸钠处理的人脐静脉内皮细胞的细胞凋亡检测结果图；

图7为本发明丁酸钠对小鼠常压缺氧耐受的影响结果图。

具体实施方式

下面将结合实施例和附图来详细说明本发明，这些实施例和附图仅起说明性作用，并不局限于本发明的应用范围。本发明不限于下述实施方式或实施例，凡不违背本发明精神所做出的修改及变形，均应包括在本发明范围之内。

丁酸钠制备缺氧性肺动脉高压防治药物的药物组合物实施例：

实施例1：

将2.2g纯度为98%以上的丁酸钠溶于10mL生理盐水中制得缺氧性肺动脉高压防治药物。

实施例2：

将3.52g纯度为98%以上的丁酸钠溶于10mL生理盐水中制得缺氧性肺动脉高压防治药物。

当然，丁酸钠可根据临床需要，加入相应药用载体，以片剂、丸剂、胶囊、水溶液等制剂形式存在均可。

丁酸钠在缺氧性肺动脉高压防治的体外实验的实验例：

实验例1：丁酸钠对缺氧人脐静脉内皮细胞（HUVEC）和人肺动脉内皮细胞（HPAEC）分泌NO的影响

人脐静脉内皮细胞（HUVEC，细胞株）购自美国ATCC。细胞复苏后，PBS洗涤两次，加入完全培养基（含10%胎牛血清（购自Hyclone），青霉素和链霉素各100U/ml的高糖DMEM（购自Gibco）），细胞于普通培养孵箱（CO₂ 5%）中37℃常规培养。

人肺动脉内皮细胞（HPAEC，原代细胞）购自Invitrogen公司，加入完全培养基（由培养基M-200、50×内皮细胞营养液LSGS、青霉素和链霉素各100U/ml组成）。细胞于普通培养孵箱（CO₂ 5%）中37℃常规培养。

取生长密度达90%左右的上述HUVEC和HPAEC内皮细胞，胰酶（购自Hyclone,0.025%）消化后，加入胎牛血清至10%终止消化，玻璃吸管充分吹散细胞并计数。按每孔50万细胞接种在六孔板中，加入完全培养基，细胞培养孵箱（CO₂ 5%）中37℃培养12小时。待细胞完全贴壁，将接种细胞的六孔板分为常氧对照组和缺氧组，每块六孔板又分为六个药物处理组，即0mM,2mM,4mM,8mM,16mM和32mM组，加药方式如下所示：

将缺氧组的六孔板在加药后放入缺氧（氧浓度为1%，CO2浓度为5%，N₂浓度94%）培养箱中培养12小时，常氧对照组的六孔板放于常规（氧浓度为21%，CO₂浓度为5%）培养箱中培养12小时，然后取出细胞板进行NO荧光探针DAF-FM标记结合流式细胞学检测，方法如下：

取出细胞板后用PBS小心洗涤3次，充分吸弃PBS，加入1：1000稀释的NO荧光探针DAF-FMDA（购自碧云天公司，产品号SC0019）1ml，37℃避光孵育20分钟。吸弃NO荧光探针反应液，细胞板用PBS小心洗涤3次，充分吸弃PBS后，0.025%胰酶消化，加入胎牛血清至10%终止消化，玻璃吸管充分吹散细胞，收集细胞悬液，并以转速1000g离心5分钟，吸弃上清，PBS重悬，再1000g离心5分钟，吸弃上清，加入PBS 200μl，进行流式细胞检测，波长同FITC，流式细胞学检测结果如图1所示，其中柱状图中横坐标为处理人脐静脉内皮细胞（HUVEC）或人肺动脉内皮细胞（HPAEC）所采用的丁酸钠的浓度，单位为mM，纵坐标为荧光强度值，代表分泌NO的量，结果表明，在缺氧条件（1%O₂）下，2~32mM的丁酸钠处理均可显著提高HUVEC和HPAEC分泌NO的量。

实验例2：丁酸钠对缺氧HUVEC和HPAEC分泌ET-1的影响

将缺氧组的六孔板在加药后放入缺氧（氧浓度为1%，CO2浓度为5%，N₂浓度94%）培养箱中培养12小时，常氧对照组的六孔板放于常规（氧浓度为21%，CO₂浓度为5%）培养箱中培养12小时，然后取出细胞板进行放射免疫学方法检测HUVEC和HPAEC的细胞培养上清中ET-1的分泌水平，如图2所示，横坐标为处理人脐静脉内皮细胞（HUVEC）或人肺动脉内皮细胞（HPAEC）细胞所采用的丁酸钠的浓度，单位为mM，纵坐标为ET-1浓度，单位为pg/ml，红色折线H12h为缺氧（1%O₂）条件的结果，蓝色折线C12h为常氧条件的结果，结果表明2~32mM的丁酸钠处理均可显著降低缺氧条件下HUVEC和HPAEC分泌ET-1的量。

实验例3：丁酸钠对缺氧人脐静脉内皮细胞ET-1和eNOS基因表达的影响

取生长密度达90%左右的上述HUVEC内皮细胞，胰酶（购自Hyclone,0.025%）消化后，加入胎牛血清至10%终止消化，玻璃吸管充分吹散细胞并计数。按每孔50万细胞接种在六孔板中，加入完全培养基，细胞培养孵箱（CO₂ 5%）中37℃培养12小时。待细胞完全贴壁，将接种细胞的六孔板分为常氧对照组和缺氧组，各组又分为6h（h为小时）组，12h组和24h组。每块六孔板又分为六个药物处理组，即0mM,2mM,4mM,8mM,16mM和32mM组，加药方式如下所示：

将缺氧组的六孔板在加药后放入缺氧（氧浓度为1%，CO2浓度为5%，N₂浓度94%）培养箱中，常氧对照组的六孔板放于常规（氧浓度为21%，CO₂浓度为5%）培养箱中，细胞培养至相应时间点，取出后进行RT-PCR、Western Blot以及启动子活性分析。如图3所示的RT-PCR检测结果表明，缺氧条件下，2mM和4mM的丁酸钠处理6h和12h的人脐静脉内皮细胞的ET-1基因的表达水平降低，eNOS基因表达水平升高。如图4所示的Western Blot检测结果表明，2mM和4mM丁酸钠处理可显著提高eNOS蛋白的表达和降低ET-1蛋白的表达。如图5所示的启动子活性分析结果表明，2mM的丁酸钠处理可显著提高eNOS基因的启动子活性。

实验例4：丁酸钠对缺氧人脐静脉内皮细胞的毒性分析（细胞凋亡检测）

取生长密度达90%左右的上述HUVEC内皮细胞，胰酶（购自 Hyclone,0.025%）消化后，加入胎牛血清至10%终止消化，玻璃吸管充分吹散细胞并计数。按每孔50万细胞接种在六孔板中，加入完全培养基，细胞培养孵箱（CO₂ 5%）中37℃培养12小时。待细胞完全贴壁，将接种细胞的六孔板分为常氧对照组和缺氧组，每块六孔板又分为四个药物处理组，即0mM,2mM,4mM,和8mM组，加药方式如下所示：

将缺氧组的六孔板在加药后放入缺氧（氧浓度为1%，CO2浓度为5%，N₂浓度94%）培养箱中，常氧对照组的六孔板放于常规（氧浓度为21%，CO₂浓度为5%）培养箱中，细胞培养12小时，取出后进行Anexin-PI双标，结合流式细胞检测细胞凋亡情况，如图6所示的检测结果，其中柱状图中横坐标为丁酸钠浓度，单位为mM，纵坐标为细胞百分率，结果表明，不论在缺氧还是在常氧条件下，不同丁酸钠浓度处理对细胞调亡并没有明显的影响，说明实验中应用的丁酸钠浓度是安全的。

上述体外实验表明，丁酸钠能抑制缺氧内皮细胞ET-1的分泌，从而防治肺血管平滑肌细胞的增殖肥大；同时丁酸钠能促进NO的分泌，从而降低缺氧肺动脉压力以及增加缺氧肺血管收缩程度，最终达到防治缺氧性肺动脉高压的目的。丁酸钠的作用机制在于其能够诱导缺氧eNOS基因表达，抑制ET-1的基因表达。

丁酸钠对小鼠缺氧耐受时间的影响的实验例：

实验例：采用闷罐法，检测连续服用丁酸钠七天后，小鼠缺氧耐受时间的变化

将体重18~22g的昆明小鼠，随机分为0mg/kg、100mg/kg、200mg/kg、400mg/kg、800mg/kg服用组，连续服用7d。服用方法：分别用无菌生理盐水配制4mg/ml、8mg/ml、16mg/ml和32mg/ml丁酸钠，每天分别给100mg/kg、200mg/kg、400mg/kg、800mg/kg组口服4mg/ml、8mg/ml、16mg/ml和32mg/ml丁酸钠0.5ml，服用方法为人工灌胃，对照组服用生理盐水0.5ml。在服用6d后，第7天的早上，各组小鼠分别在服用丁酸钠后30分钟进行闷罐实验，记录各组每只动物的死亡时间。根据公式：（存活时间（min）/（容积（ml）-体重(g)/0.94））×100计算每只小鼠的缺氧标准耐受时间（min/L），如图7和表1中的结果显示丁酸钠灌胃7天，显著提高小鼠在常压缺氧条件下的标准耐受时间，其中最佳浓度为4mg/d，该喂饲量的小鼠缺氧标准耐受时间与正常对照组的差异具有显著意义（p=0.01）耐受的相当于200mg/kg的标准，说明丁酸钠具有提高缺氧耐受能力的作用。

表1不同丁酸钠喂饲量时小鼠常压缺氧条件下的标准耐受时间及增长率

剂量	标准耐受时间	增长率
			0mg/kg	10.91±0.02	0
100mg/kg	11.15±0.01	10.5%
			200mg/kg	12.72±0.02	24.9%
400mg/kg	11.92±0.02	17.6%
			800mg/kg	11.89±0.02	17.3%

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims

1.丁酸钠在制备缺氧性肺动脉高压防治药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的丁酸钠在制备缺氧性肺动脉高压防治药物中的应用，其特征在于：所述丁酸钠的使用剂量为6～48g/天。

3.根据权利要求2所述的丁酸钠在制备缺氧性肺动脉高压防治药物中的应用，其特征在于：所述丁酸钠的使用剂量优选为12g/天。