CN103316073A - 正品秦艽提取物及正品秦艽和各品种鉴别方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种正品秦艽提取物及正品秦艽的鉴别方法和药典品种鉴别方法。本发明制备得到的正品秦艽提取物，涵盖了秦艽水相中的有效活性成分，指纹特异性强，其物质基础较为明确，可以作为正品秦艽检测中一种新的标准对照物，更有利于对秦艽的质量控制。药典收载的正品秦艽的水相部位指纹图谱中，存在多个共有色谱峰，其指纹图谱相似度较高，可有效用于鉴别药材是否为药典秦艽品种；同时，药典收载的4种正品秦艽，其各自的乙酸乙酯部位指纹图谱中，含有不同保留时间的主特征峰，相同保留时间的特征峰峰面积也不同，因此，可利用正品秦艽有机相部位指纹图谱，判定秦艽是属于哪一类药典品种。上述两种鉴别方法，为规范市场提供了保障。
Description
技术领域
本发明涉及正品秦艽提取物及正品秦艽和各品种的鉴别方法。
背景技术
秦艽，是一种常用的中药材，为龙胆科植物秦艽Gentiana macrophyllaPall.、麻花秦艽Gentiana straminea Maxim.、粗茎秦艽Gentiana crassicaulisDuthie ex Burk.或小秦艽Gentiana dahurica Fisch.的干燥根。其味辛、苦，性平，归胃、肝、胆经，具有祛风湿、清湿热、止痹痛、退虚热的功效。
由于秦艽药材主要来自野生，生长周期长，价格稳步上涨，过度采挖已使法定正品秦艽药材供不应求，因此，市场上出现了较多伪品或劣品来替代正品秦艽。而秦艽更被列为国家三级保护植物。目前对正品秦艽的鉴别主要靠专家据其性状鉴别，或根据药典中的薄层色谱方法检测栎瘿酸进行鉴别。
中药指纹图谱是一种综合的，可量化的鉴定手段，它是建立在中药化学成分系统研究的基础上，主要用于评价中药材质量的真实性、优良性和稳定性。中药为多组分复杂体系，因此评价其质量应采用与之相适应的，能提供丰富鉴别信息的检测方法，建立中药指纹图谱将能较为全面地反映中药中所含化学成分的种类与数量，进而对药材质量进行整体描述和评价。
目前还未见使用HPLC指纹图谱技术对正品秦艽（粗茎秦艽、麻花秦艽、大叶秦艽和小秦艽）的品种鉴别的报道。
同时，目前在使用液相检测中药材质量时，多是采用对照品或指纹图谱进行检测，其中，采用对照品检测时，不能充分反映药材的质量；而采用指纹图谱时，虽然能够全面反应药材质量，但是，也可能因为检测仪器、流动相、环境条件等多种因素的差异，造成测量的误差。若能够提供一种药材的标准提取物，该提取物中包含了较多的有效成分，且物质基础明确，那么，将该提取物与指纹图谱检测手段联合使用后，必定能够避免或降低外界因素带来的误差，更能有效反映药材质量。
发明内容
本发明的目的在于提供一种正品秦艽的标准提取物。本发明的另一目的在于提供正品秦艽的鉴别方法以及正品秦艽中各药典品种的鉴别方法。
本发明提供了一种正品秦艽提取物，所述提取物采用HPLC检测所得色谱图与对照指纹图谱比较，相似度在0.9以上；其中，对照指纹图谱中有7个主色谱峰，各色谱峰信息如下：1号峰，相对保留时间0.48±0.01；2号峰，相对保留时间0.52±0.02；3号峰，相对保留时间0.78±0.01；4号峰，相对保留时间0.82±0.01；5号峰，即龙胆苦苷参照峰，相对保留时间1.00；6号峰，相对保留时间1.03±0.01；7号峰，相对保留时间1.52±0.01；
其中，色谱条件如下：
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；
检测波长：240±2nm；
流动相：以乙腈-0.05～1.0%v/v磷酸水溶液梯度洗脱，梯度程序如下：
。
进一步地，对照指纹图谱中的7个主色谱峰的相对峰面积如下：1号峰，相对峰面积0.02±0.03；2号峰，相对峰面积0.36±0.36；3号峰，相对峰面积0.08±0.14；4号峰，相对峰面积0.08±0.11；5号峰即参照峰，相对峰面积1.00；6号峰，相对峰面积0.03±0.1；7号峰，相对峰面积0.01±0.02。
优选地，所述对照指纹图谱如图1所示。
本发明还提供了上述正品秦艽提取物的制备方法，具体操作如下：
取正品秦艽，粉碎后，以50%～80%v/v乙醇提取，合并醇提液；取醇提液，蒸发至无醇味后，剩余物以有机溶剂-水体系萃取，取水层，干燥后即得正品秦艽提取物；有机溶剂选自乙酸乙酯、异丙醇或氯仿。
本发明提供了正品秦艽的鉴别方法，它是采用HPLC指纹图谱进行检测的，具体操作步骤如下：
（1）取待测药材，粉碎后，以50%～80%v/v乙醇提取，合并醇提液；取醇提液，蒸发至无醇味后，剩余物以有机溶剂-水体系萃取，有机溶剂选自乙酸乙酯、异丙醇或氯仿，取水层，制备供试品溶液即可；
（2）取供试品溶液，经高效液相色谱法检测，即得供试品色谱图，其中，色谱条件如下：
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；
检测波长：240±2nm；
流动相：以乙腈-0.05～1.0%v/v磷酸水溶液梯度洗脱，梯度程序如下：
；
（3）将供试品色谱图与对照指纹图谱比较，相似度在0.9以上的药材即为正品秦艽；其中，对照指纹图谱中有7个主色谱峰，以龙胆苦苷为参照品，各色谱峰信息如下：1号峰，相对保留时间0.48±0.01；2号峰，相对保留时间0.52±0.02；3号峰，相对保留时间0.78±0.01；4号峰，相对保留时间0.82±0.01；5号峰即参照峰，相对保留时间1.00；6号峰，相对保留时间1.03±0.01；7号峰，相对保留时间1.52±0.01。进一步地，步骤（1）中，所述乙醇浓度为65～75%v/v，所述有机溶剂为乙酸乙酯。
优选地，乙醇浓度为70%v/v。
进一步地，步骤（2）中，流动相梯度程序选自如下条件之一：
条件一：
；
条件二：
。
进一步地，步骤（3）中，对照指纹图谱中的7个主色谱峰的相对峰面积如下：1号峰，相对峰面积0.02±0.03；2号峰，相对峰面积0.36±0.36；3号峰，相对峰面积0.08±0.14；4号峰，相对峰面积0.08±0.11；5号峰即参照峰，相对峰面积1.00；6号峰，相对峰面积0.03±0.1；7号峰，相对峰面积0.01±0.02。
优选地，所述对照指纹图谱如图1所示。
进一步地，流动相流速为1.0ml/min，检测柱温为30℃。
本发明还提供了正品秦艽的品种鉴别方法，它包括如下操作步骤：
（1）取正品秦艽，粉碎后，以50%～80%v/v乙醇提取，合并醇提液；取醇提液，蒸发至无醇味后，剩余物以有机溶剂-水体系萃取，有机溶剂选自乙酸乙酯、异丙醇或氯仿，取有机溶剂层，除去溶剂后，制备供试品溶液即可；
（2）取供试品溶液，经高效液相色谱法检测，即得供试品色谱图，其中，色谱条件如下：
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；
检测波长：240±2nm；
流动相：以乙腈-0.05～1.0%v/v磷酸水溶液梯度洗脱，梯度程序如下：
；
（3）根据下述色谱信息鉴别秦艽品种：
A、供试品溶液色谱图中有4个主要色谱峰，以龙胆苦苷为参照品，各色谱峰信息如下，即为大叶秦艽Gentiana macrophylla Pall.：1号峰即参照峰，相对保留时间1.00；2号峰，相对保留时间1.15±0.01；3号峰，相对保留时间1.20±0.01；4号峰，相对保留时间2.04±0.01；或
B、供试品溶液色谱图中有4个主要色谱峰，以龙胆苦苷为参照品，各色谱峰信息如下，即为粗茎秦艽Gentiana crassicaulis Duthie ex Burk.：1号峰，相对保留时间0.52±0.01；2号峰即参照峰，相对保留时间1.00；3号峰，相对保留时间2.01±0.01；4号峰，相对保留时间2.18±0.01；或
C、供试品溶液色谱图中有4个主要色谱峰，以龙胆苦苷为参照品，各色谱峰信息如下，即为麻花秦艽Gentiana straminea Maxim.：1号峰，相对保留时间0.52±0.01；2号峰即参照峰，相对保留时间1.00；3号峰，相对保留时间1.59±0.01；4号峰，相对保留时间2.18±0.01；或
D、供试品溶液色谱图中有4个主要色谱峰，以龙胆苦苷为参照品，各色谱峰信息如下，即为小秦艽Gentiana dahurica Fisch.：1号峰即参照峰，相对保留时间1.00；2号峰，相对保留时间1.42±0.01；3号峰，相对保留时间1.99±0.01；4号峰，相对保留时间2.05±0.01。
进一步地，步骤（3）中，各色谱峰峰面积占总峰面积百分比例如下：
A、1号峰即参照峰13.1±2.6%；2号峰20.7±4.1%；3号峰7.1±1.4%；4号峰4.8±1.0%；或
B、1号峰3.0±0.6%；2号峰62.8±1.3%；3号峰2.4±0.5%；4号峰3.5±0.7%；或
C、1号峰4.2±0.8%；2号峰45.5±9.1%；3号峰2.6%±0.5；4号峰11.8±2.4%；或
D、1号峰14.4±2.9%；2号峰5.0±1.0%；3号峰6.2±1.2%；4号峰12.7±2.5%。
或者，各色谱峰相对保留时间如下：
A、供试品溶液色谱图中有4个主要色谱峰，以龙胆苦苷为参照品，各色谱峰信息如下，即为大叶秦艽：1号峰即参照峰，相对峰面积1.00；2号峰，相对峰面积1.58±0.32；3号峰，相对峰面积0.54±0.11；4号峰，相对峰面积0.37±0.07；或
B、供试品溶液色谱图中有4个主要色谱峰，以龙胆苦苷为参照品，各色谱峰信息如下，即为粗茎秦艽：1号峰，相对峰面积0.05±0.01；2号峰即参照峰，相对峰面积1.00；3号峰，相对峰面积0.04±0.01；4号峰，相对峰面积0.06±0.01；或
C、供试品溶液色谱图中有4个主要色谱峰，以龙胆苦苷为参照品，各色谱峰信息如下，即为麻花秦艽：1号峰，相对峰面积0.09±0.01；2号峰即参照峰，相对峰面积1.00；3号峰，相对峰面积0.06±0.01；4号峰，相对峰面积0.26±0.05；或
D、供试品溶液色谱图中有4个主要色谱峰，以龙胆苦苷为参照品，各色谱峰信息如下，即为小秦艽：1号峰即参照峰，相对峰面积1.00；2号峰，相对峰面积0.35±0.07；3号峰，相对峰面积0.43±0.09；4号峰，相对峰面积0.88±0.18。
优选地，大叶秦艽供试品溶液的色谱图如图5所示；粗茎秦艽供试品溶液的色谱图如图6所示；麻花秦艽供试品溶液的色谱图如图7所示；小秦艽供试品溶液的色谱图如图8所示。
本发明制备得到的正品秦艽提取物，涵盖了秦艽水相中的有效活性成分，指纹特异性强，其物质基础较为明确，可以作为正品秦艽检测中一种新的标准对照物，更有利于对秦艽的质量控制。
本发明研究表明，药典收载的正品秦艽的水相部位指纹图谱中，存在多个共有色谱峰，其指纹图谱相似度较高，可有效用于鉴别药材是否为正品秦艽；同时，药典收载的4种正品秦艽，其各自的乙酸乙酯部位指纹图谱中，含有不同保留时间的主特征峰，相同保留时间的特征峰峰面积也不同，因此，可利用对正品秦艽乙酸乙酯部位指纹图谱，判定正品秦艽的品种。上述两种鉴别方法，为规范市场提供了保障。
附图说明
图1正品秦艽水相提取物对照指纹图谱
图2正品秦艽水相提取物指纹图谱对比
图3假劣品秦艽与正品秦艽水相提取物指纹图谱对比图
图4正品秦艽有机相提取物指纹图谱对比
图5大叶秦艽有机相供试品溶液的色谱图
图6粗茎秦艽有机相供试品溶液的色谱图
图7麻花秦艽有机相供试品溶液的色谱图
图8小秦艽有机相供试品溶液的色谱图
图9流动相条件A的色谱图
图10流动相条件B的色谱图
具体实施方式
实施例1正品秦艽的鉴别方法
1.1仪器、试剂与材料
1.1.1仪器
Waters2695/2996型高效液相色谱仪（包括真空脱气机、四元泵、柱温箱、自动进样器，2996PDA检测器，Empower化学工作站，Waters公司，美国）；METTLER AE240电子分析天平（梅特勒-托利多仪器有限公司，瑞士）；DHG-9240A型电热恒温鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司，中国）；KQ-250B型超声（波清洗器昆山市超声仪器有限公司，中国）；Diamonsil C18（250mm×4.6mm，5μm）色谱柱。
1.1.2试剂与材料
乙腈（迪马科技，色谱纯）；甲醇、磷酸（成都市科龙化工试剂厂，分析纯）；水（乐百氏纯净水）。
对照品龙胆苦苷、马钱苷酸均购自四川维克奇生物科技有限公司，供含量测定用。不同种、不同产地秦艽实验样品均由中国医学科学院药用植物研究所林余霖教授鉴定，样品来源及编号见表1-1。其中S13～S16均为掺假或者劣品秦艽。
表1-1药材来源
1.2.1.1流动相的选择
本试验采用梯度洗脱方法，分别考察了甲醇-水、甲醇-0.04%磷酸水、甲醇-0.085%磷酸水、乙腈-0.085%磷酸水、乙腈-0.1%冰乙酸水和乙腈-0.05%磷酸水等溶液体系对样品和对照品溶液中目标峰的分离效果，试验结果表明：以甲醇为有机相的流动相体系，在图谱后段基线漂移较大，当采用乙腈体系时，基线不漂移。
以乙腈-磷酸水溶液体系进行洗脱，对洗脱程序进行选择，具体有如下三种色谱条件：
条件A：
其图谱参见图9,峰1无法分开。
条件B：
其图谱参见图10。
条件C：
经考察，采用条件B、C可以使目标峰得到较好的分离，且色谱峰峰形较好，基线较稳定，故选用B、C条件为流动相。
2色谱条件
采用Diamonsil C18（250mm×4.6mm，5μm）色谱柱，以乙腈（A）-0.05%磷酸水（B）为流动相，梯度洗脱（0～15min，8%A→11%A；15～18min，11%A→15%A；18～23min，15%A→20%A；23～40min，20%A→35%A；40～50min，35%A→85%A，流速为1.0mL·min-1，检测波长为240nm，柱温为30℃，进样量为10μL。
3对照品溶液的制备
分别取龙胆苦苷、马钱苷酸、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷、山栀苷甲酯和8-O-乙酰山栀苷甲酯对照品适量，精密称定，置于10mL棕色量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，制成混合对照品溶液。
4供试品溶液的制备
4.1秦艽渗漉的供试品溶液制备方法
取秦艽中粉，约2g，精密称定，置于蒸发皿中，加70%乙醇浸润（约6mL），用保鲜膜密封，放置24h，转移至漏斗（漏斗用2层滤纸放于底部）中，用70%乙醇渗漉，收集前50mL渗漉液，摇匀，溶液用0.45μm滤头过滤，取续滤液作为供试品溶液，待测。
4.2秦艽有机相（乙酸乙酯相）供试品溶液制备方法
取“4.1”项下秦艽渗漉液40mL，置于蒸发皿中挥至无醇味，将其转移至分液漏斗中，用乙酸乙酯萃取2次，每次25mL，合并萃取液，将乙酸乙酯挥干，残渣用20mL甲醇溶解，摇匀，溶液用0.45μm滤头过滤，取续滤液作为供试品溶液，待测。
4.3秦艽水相供试品溶液制备方法
取“4.2”项下萃取剩余水相溶液，挥干，残渣用20mL纯净水溶解，摇匀，溶液用0.45μm滤头过滤，取续滤液作为供试品溶液，待测；或取“4.2”项下萃取剩余水相溶液，过滤后，取续滤液作为供试品溶液。
5方法学考察
5.1重复性试验
精密称取秦艽样品（S4）6份，按“4”项下方法制备供试品溶液并进行测定，以S号峰为参照峰，得各共有峰相对保留时间与相对峰面积的RSD均小于3%，表明重复性良好。
5.2精密度试验
分别精密吸取“4”项下的两种同一供试品溶液，连续进样测定6次，以S号峰为参照峰，得各共有峰相对保留时间与相对峰面积的RSD均小于3%，表明仪器精密度良好。
5.3稳定性试验
分别精密吸取“4”项下的两种同一供试品溶液分别在0、4、8、12、24、36h进样测定，以S号峰为参照峰，得各共有峰相对保留时间与相对峰面积的RSD均小于3%，表明溶液在36h内稳定性良好。
6测定方法
分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，记录50min色谱图。在测定的色谱图中，同时分析16批秦艽样品（正品，S1～S12；假劣品S13～S16）的HPLC色谱行为，确定指纹区与共有峰。
采用国家药典委员会提供中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版软件自动生成对照指纹图谱，其中，水相对照指纹图谱见图1。供试品色谱中，以龙胆苦苷所对应的色谱峰为参照峰（即S峰），采用国家药典委员会提供中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004A版）分别计算共有峰的相对保留时间和相对峰面积，并得出相似度，检测结果件表1-3：
表1
注：2号峰为马钱苷酸，4号峰为獐牙菜苦苷，5号峰为龙胆苦苷，6号峰为獐牙菜苷
表2正品秦艽水相提取物与对照指纹图谱的相似度比较
表3劣品秦艽水相提取物与对照指纹图谱的相似度比较
表4正品秦艽有机相提取物与对照指纹图谱的相似度比较
由表1可知，正品秦艽的水相提取物中，有7各主要共有特征峰；由表2、3可知，正品秦艽水相提取物的色谱图与对照指纹图谱相似度均在0.9以上（见图2）而假劣品秦艽水相提取物的色谱图与对照指纹图谱相似度均低于0.9，而由表4可知，不同品种的正品秦艽的有机相提取物与对照指纹图谱相似度较差（见图4），即，不能使用有机相提取物的指纹图谱对秦艽进行正伪鉴定。
因此，由上分析可知，各种正品秦艽的水相部位具有多个共有特征峰，其指纹图谱相似度高，并且能够有效地与假劣品秦艽区分开，指纹特异性强，因此，可以将本发明制备的正品秦艽提取物作为检测秦艽药材质量的标准提取物，通过药材水相提取物的指纹图谱来鉴别药材是否为正品秦艽，当药材色谱图与对照指纹图谱相似度在0.9以上时，即为正品秦艽。
实施例2正品秦艽的品种鉴别
1、实验仪器、试剂、材料同实施例1
2、色谱条件同实施例1“2”项
3、对照品溶液的制备同实施例1“3”项
4、供试品溶液的制备
分别取正品的大叶秦艽、粗茎秦艽、麻花秦艽、小秦艽各3批，按实施例1中“4.2”项方法制备供试品溶液。
5、测定方法
分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，记录50min色谱图。经测定，各品种秦艽的色谱峰信息如下：
表5各正品秦艽品种色谱信息
注：Rt为1.00峰为龙胆苦苷峰。
由表5可知，目前药典收载的4个秦艽品种，其乙酸乙酯部位的指纹图谱中，主要特征峰的相对保留时间不同，峰面积也存在差异，因此，以本发明色谱条件对正品秦艽的乙酸乙酯部位进行检测，可以通过其色谱峰保留时间对正品秦艽品种进行鉴别区分。
实施例3正品秦艽提取物的制备
取正品秦艽，粉碎后，以70%v/v乙醇提取，合并醇提液；取醇提液，蒸发至无醇味后，剩余物以乙酸乙酯-水体系萃取，取水层，干燥后即得正品秦艽提取物。
取上述提取物，经HPLC检测，其色谱信息与对照指纹图谱1的相似度在0.9以上。
其中，色谱条件如下：
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；
检测波长：240±2nm；
流动相：以乙腈-0.05～1.0%v/v磷酸水溶液梯度洗脱，梯度程序如下：
。
本发明研究表明，药典收载的正品秦艽的水相部位指纹图谱中，存在多个共有色谱峰，其指纹图谱相似度较高，可有效用于鉴别药材是否为正品秦艽；同时，药典收载的4种正品秦艽，其各自的乙酸乙酯部位指纹图谱中，含有不同保留时间的主特征峰，相同保留时间的特征峰峰面积也不同，因此，可利用对正品秦艽乙酸乙酯部位指纹图谱，判定正品秦艽的品种。上述两种鉴别方法，为规范市场提供了保障。
Claims (10)
1.一种正品秦艽提取物，其特征在于：所述提取物采用HPLC检测所得色谱图与对照指纹图谱比较，相似度在0.9以上；其中，对照指纹图谱中有7个主色谱峰，各色谱峰信息如下：1号峰，相对保留时间0.48±0.01；2号峰，相对保留时间0.52±0.02；3号峰，相对保留时间0.78±0.01；4号峰，相对保留时间0.82±0.01；5号峰，即龙胆苦苷参照峰，相对保留时间1.00；6号峰，相对保留时间1.03±0.01；7号峰，相对保留时间1.52±0.01；
其中，色谱条件如下：
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；
检测波长：240±2nm；
流动相：以乙腈-0.05～1.0%v/v磷酸水溶液梯度洗脱，梯度程序如下：
。
2.权利要求1所述正品秦艽提取物的制备方法，其特征在于：具体操作如下：
取正品秦艽，粉碎后，以50%～80%v/v乙醇提取，合并醇提液；取醇提液，蒸发至无醇味后，剩余物以有机溶剂-水体系萃取，取水层，干燥后即得正品秦艽提取物；有机溶剂选自乙酸乙酯、异丙醇或氯仿。
3.正品秦艽的鉴别方法，其特征在于：它是采用HPLC指纹图谱进行检测的，具体操作步骤如下：
（1）取待测药材，粉碎后，以50%～80%v/v乙醇提取，合并醇提液；取醇提液，蒸发至无醇味后，剩余物以有机溶剂-水体系萃取，取水层，制备供试品溶液即可；有机溶剂选自乙酸乙酯、异丙醇或氯仿；
（2）取供试品溶液，经高效液相色谱仪检测，即得供试品色谱图，其中，色谱条件如下：
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；
检测波长：240±2nm；
流动相：以乙腈-0.05～1.0%v/v磷酸水溶液梯度洗脱，梯度程序如下：
；
（3）将供试品色谱图与对照指纹图谱比较，相似度在0.9以上的药材即为正品秦艽；其中，对照指纹图谱中有7个主色谱峰，各色谱峰信息如下：1号峰，相对保留时间0.48±0.01；2号峰，相对保留时间0.52±0.02；3号峰，相对保留时间0.78±0.01；4号峰，相对保留时间0.82±0.01；5号峰，即龙胆苦苷参照峰，相对保留时间1.00；6号峰，相对保留时间1.03±0.01；7号峰，相对保留时间1.52±0.01。
4.根据权利要求3所述的鉴别方法，其特征在于：步骤（1）中，所述乙醇浓度为65～75%v/v；优选地，乙醇浓度为70%v/v。
5.根据权利要求3所述的鉴别方法，其特征在于：步骤（2）中，流动相梯度程序选自如下条件之一：
条件一：
；
条件二：
。
6.根据权利要求3所述的鉴别方法，其特征在于：步骤（3）中，对照指纹图谱中7个主色谱峰的相对峰面积如下：1号峰，相对峰面积0.02±0.03；2号峰，相对峰面积0.36±0.36；3号峰，相对峰面积0.08±0.14；4号峰，相对峰面积0.08±0.11；5号峰即参照峰，相对峰面积1.00；6号峰，相对峰面积0.03±0.1；7号峰，相对峰面积0.01±0.02；优选地，对照指纹图谱如图1所示。
7.根据权利要求3-6任意一项所述的鉴别方法，其特征在于：流动相流速为1.0±0.2ml/min，检测柱温为30±2℃。
8.正品秦艽的品种鉴别方法，其特征在于：它包括如下操作步骤：
（1）取正品秦艽，粉碎后，以50%～80%v/v乙醇提取，合并醇提液；取醇提液，蒸发至无醇味后，剩余物以有机溶剂-水体系萃取，有机溶剂选自乙酸乙酯、异丙醇或氯仿，取有机溶剂层，除去溶剂后，制备供试品溶液即可；
（2）取供试品溶液，经高效液相色谱法检测，即得供试品色谱图，其中，色谱条件如下：
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；
检测波长：240±2nm；
流动相：以乙腈-0.05～1.0%v/v磷酸水溶液梯度洗脱，梯度程序如下：
；
（3）根据下述色谱信息鉴别秦艽品种：
A、供试品溶液色谱图中有4个主要色谱峰，以龙胆苦苷为参照品，各色谱峰信息如下，即为大叶秦艽Gentiana macrophylla Pall.：1号峰即参照峰，相对保留时间1.00；2号峰，相对保留时间1.15±0.01；3号峰，相对保留时间1.20±0.01；4号峰，相对保留时间2.04±0.01；或
B、供试品溶液色谱图中有4个主要色谱峰，以龙胆苦苷为参照品，各色谱峰信息如下，即为粗茎秦艽Gentiana crassicaulis Duthie ex Burk.：1号峰，相对保留时间0.52±0.01；2号峰即参照峰，相对保留时间1.00；3号峰，相对保留时间2.01±0.01；4号峰，相对保留时间2.18±0.01；或
C、供试品溶液色谱图中有4个主要色谱峰，以龙胆苦苷为参照品，各色谱峰信息如下，即为麻花秦艽Gentiana straminea Maxim.：1号峰，相对保留时间0.52±0.01；2号峰即参照峰，相对保留时间1.00；3号峰，相对保留时间1.59±0.01；4号峰，相对保留时间2.18±0.01；或
D、供试品溶液色谱图中有4个主要色谱峰，以龙胆苦苷为参照品，各色谱峰信息如下，即为小秦艽Gentiana dahurica Fisch.：1号峰即参照峰，相对保留时间1.00；2号峰，相对保留时间1.42±0.01；3号峰，相对保留时间1.99±0.01；4号峰，相对保留时间2.05±0.01。
9.根据权利要求8所述的鉴别方法，其特征在于：步骤（3）中，各色谱峰峰面积占总峰面积百分比例如下：
A、1号峰即参照峰13.1±2.6%；2号峰20.7±4.1%；3号峰7.1±1.4%；4号峰4.8±1.0%；或
B、1号峰3.0±0.6%；2号峰62.8±1.3%；3号峰2.4±0.5%；4号峰3.5±0.7%；或
C、1号峰4.2±0.8%；2号峰45.5±9.1%；3号峰2.6%±0.5；4号峰11.8±2.4%；或
D、1号峰14.4±2.9%；2号峰5.0±1.0%；3号峰6.2±1.2%；4号峰12.7±2.5%。
10.根据权利要求8或9任意一项所述的鉴别方法，其特征在于：大叶秦艽供试品溶液的色谱图如图5所示；粗茎秦艽供试品溶液的色谱图如图6所示；麻花秦艽供试品溶液的色谱图如图7所示；小秦艽供试品溶液的色谱图如图8所示。
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