CN103313613A - 作为食物、药物、化妆品、膳食补充剂和生物制品的成分的咖啡提取物 - Google Patents

Abstract

本实施方案涉及含有食物、药物、化妆品、膳食补充剂、或生物产品的物质组合物，所述产品包括从粗品咖啡因回收的植物化学级分，所述植物化学级分中多酚类物质与咖啡因的比例为约20、10-30或40，或大于10。在相关实施方案中，所述植物化学级分是粗品咖啡因水悬浮液的过滤过程的渗余物，并且其中所述粗品咖啡因是生咖啡豆脱咖啡因过程的产物。在其他相关实施方案中，所述物质组合物可用于促进神经保护、抑制COX-2或刺激葡萄糖摄取。

Description

作为食物、药物、化妆品、膳食补充剂和生物制品的成分的咖啡提取物

相关申请

本申请要求2010年10月13日提交的美国临时申请号61/392,828，本文引入其全部内容作为参考。

领域

本领域涉及作为食物、药物、化妆品、膳食补充剂、生物产品的成分的咖啡材料或咖啡提取物，及相关过程。

背景

粗品咖啡因是生咖啡豆脱咖啡因的一种主要副产品。脱咖啡因咖啡是咖啡总消费量的约10％，因此每年生产数千吨粗品咖啡因。除了咖啡因，生咖啡豆含有多种的生物活性植物化学物质，包括绿原酸（Michael, N. C., Journal of the Science of Food and Agriculture 1999, 79, 362-372）和咖啡油(Araújo, J. M. A. and Sandi, D., Food Chemistry 2007, 101, 1087-1094)。 词语植物化学（phytochemical）的“植物（phyto-）”来自希腊文字phyto，其意思是植物;因此，植物化学物质是植物的化学物质。在脱咖啡因的过程中必然会除去一些非咖啡因的植物化学物质，使粗品咖啡因的颜色呈黄绿色。

粗品咖啡因是用于制造纯咖啡因的起始原料，用于饮料、食品和药品；非咖啡因的残渣通常作为废物丢弃。鉴于许多研究已证明咖啡植物化学物质对健康的好处（Svilaas, A. et al., Journal of Nutrition 2004, 134, 562-567; Daglia, M. et al., Journal of Agricultural and Food Chemistry 2000, 48, 1449-1454），由于这些非咖啡因组分的存在，我们推知粗品咖啡因也可能发挥有益影响。

继续

我们评测粗品咖啡因的酚含量，亲水和亲脂氧自由基吸收能力（ORAC_hydro和ORAC_lipo），保护小鼠原代神经元细胞以免发生过氧化氢诱导的细胞死亡，在培养的人类骨骼肌细胞和脂肪细胞中的抗高血糖作用，和对环氧合酶-2（COX-2）的抑制作用，有效的炎症介质。为了确认粗品咖啡因中的生物活性化合物的化学结构，我们进行了抗氧化化合物的活性引导分级，然后进行液相色谱 - 质谱（LC-MS）多级反应监测(MRM)分析。

概述

第一实施方案是一种含有食物产品的物质组合物，所述食物产品包括从粗品咖啡因回收的植物化学级分，所述植物化学级分中多酚类物质与咖啡因的比例为约20、10-30或40，或大于10。

其相关实施方案是第一实施方案的物质组合物，其中所述的植物化学级分是粗品咖啡因水悬浮液的过滤过程的渗余物，并且其中所述粗品咖啡因是生咖啡豆脱咖啡因过程的产物。

另一个相关的实施方案是一种生产食物产品的方法，其包括用从粗品咖啡因中回收的植物化学级分补充食物或补充食物组分，所述植物化学级分描述于第一实施方案中或它的相关实施方案中，由此生产所述食物产品。

第二实施方案是一种含有药物产品的物质组合物，所述药物产品包括从粗品咖啡因回收的植物化学级分，所述植物化学级分中多酚类物质与咖啡因的比例为约20、10-30或40，或大于10。

其相关实施方案是第二实施方案的物质的组合物，其中所述的植物化学级分是粗品咖啡因水悬浮液的过滤过程的渗余物，并且其中所述粗品咖啡因是生咖啡豆脱咖啡因过程的产物。

另一个相关的实施方案是一种生产药物产品的方法，其包括用从粗品咖啡因中回收的植物化学级分补充药物或补充药物组分，所述植物化学级分描述于第二实施方案中或它的相关实施方案中，由此生产所述药物产品。

第三实施方案是一种含有化妆品产品的物质组合物，所述化妆品产品包括从粗品咖啡因回收的植物化学级分，所述植物化学级分中多酚类物质与咖啡因的比例为约20、10-30或40，或大于10。

其相关实施方案是第三实施方案的物质的组合物，其中所述的植物化学级分是粗品咖啡因水悬浮液的过滤过程的渗余物，并且其中所述粗品咖啡因是生咖啡豆脱咖啡因过程的产物。

另一个相关的实施方案是一种生产化妆品产品的方法，其包括用从粗品咖啡因中回收的植物化学级分补充化妆品或补充化妆品组分，所述植物化学级分描述于第三实施方案中或它的相关实施方案中，由此生产所述化妆品产品。

第四实施方案是一种含有膳食补充剂产品的物质组合物，所述膳食补充剂产品包括从粗品咖啡因回收的植物化学级分，所述植物化学级分中多酚类物质与咖啡因的比例为约20、10-30或40，或大于10。

其相关实施方案是第四实施方案的物质的组合物，其中所述的植物化学级分是粗品咖啡因水悬浮液的过滤过程的渗余物，并且其中所述粗品咖啡因是生咖啡豆脱咖啡因过程的产物。

另一个相关的实施方案是一种生产膳食补充剂产品的方法，其包括用从粗品咖啡因中回收的植物化学级分补充膳食补充剂或补充膳食补充剂组分，所述植物化学级分描述于第四实施方案中或它的相关实施方案中，由此生产所述膳食补充剂产品。

第五实施方案是一种含有生物产品的物质组合物，所述生物产品包括从粗品咖啡因回收的植物化学级分，所述植物化学级分中多酚类物质与咖啡因的比例为约20、10-30或40，或大于10。

其相关实施方案是第五实施方案的物质的组合物，其中所述的植物化学级分是粗品咖啡因水悬浮液的过滤过程的渗余物，并且其中所述粗品咖啡因是生咖啡豆脱咖啡因过程的产物。

另一个相关的实施方案是一种生产生物产品的方法，其包括用从粗品咖啡因中回收的植物化学级分补充生物制品或补充生物制品组分，所述植物化学级分描述于第五实施方案中或它的相关实施方案中，由此生产所述生物产品。

第六实施方案是用于促进神经保护的方法，所述方法包括：确定人类受试者需要神经保护；和将一定量的第一、第二、第三、第四或第五实施方案，或与其相关的任何实施方案中的组合物施用于所述受试者以有效促进神经保护。

与第六实施方案相关的一个实施方案是促进神经保护的方法，所述方法包括：将一定量的第一、第二、第三、第四或第五实施方案，或与其相关的任何实施方案中的组合物施用于人类受试者以有效促进神经保护；和检测所述受试者中的神经保护。

第七实施方案是抑制COX-2的方法，所述方法包括：确定人类受试者需要抑制COX-2；和将一定量的第一、第二、第三、第四或第五实施方案，或与其相关的任何实施方案中的组合物施用于所述受试者以有效抑制COX-2。

与第七实施方案相关的一个实施方案是抑制COX-2的方法，所述方法包括：将一定量的第一、第二、第三、第四或第五实施方案，或与其相关的任何实施方案中的组合物施用于人类受试者以有效抑制COX-2；和测试所述受试者中COX-2的抑制。

第八实施方案是一种用于刺激葡萄糖摄取的方法，所述方法包括：确定人类受试者需要刺激葡萄糖摄取；和将一定量的第一、第二、第三、第四或第五实施方案，或与其相关的任何实施方案中的组合物施用于所述受试者以有效刺激葡萄糖的摄取。

与第八实施方案相关的一个实施方案是刺激葡萄糖摄取的方法，所述方法包括：将一定量的第一、第二、第三、第四或第五实施方案，或与其相关的任何实施方案中的组合物施用于人类受试者以有效刺激葡萄糖摄取；和检测所述受试者中葡萄糖摄取的刺激。

第九实施方案是一种用于治疗痴呆或年龄相关的认知衰退的方法，所述方法包括：确定人类受试者需要治疗痴呆或年龄相关的认知衰退；和将一定量的第一、第二、第三、第四或第五实施方案，或与其相关的任何实施方案中的组合物施用于所述受试者以有效治疗痴呆或年龄相关的认知衰退。

与第九实施方案相关的一个实施方案是治疗痴呆或年龄相关的认知衰退的方法，所述方法包括：将一定量的第一、第二、第三、第四或第五实施方案，或与其相关的任何实施方案中的组合物施用于人类受试者以有效治疗痴呆或年龄相关的认知衰退；和检测所述受试者中痴呆或年龄相关的认知衰退的治疗。

第十实施方案是一种用于抑制炎症的方法，所述方法包括：确定人类受试者需要抑制炎症；和将一定量的第一、第二、第三、第四或第五实施方案，或与其相关的任何实施方案中的组合物施用于所述受试者以有效抑制炎症。

与第十实施方案相关的一个实施方案是抑制炎症的方法，所述方法包括：将一定量的第一、第二、第三、第四或第五实施方案，或与其相关的任何实施方案中的组合物施用于人类受试者以有效抑制炎症；和检测所述受试者中炎症的抑制。

第十一实施方案是一种用于治疗糖尿病的方法，所述方法包括：确定人类受试者需要治疗糖尿病；和将一定量的第一、第二、第三、第四或第五实施方案，或与其相关的任何实施方案中的组合物施用于所述受试者以有效治疗糖尿病。

与第十一实施方案相关的一个实施方案是治疗糖尿病的方法，所述方法包括：将一定量的第一、第二、第三、第四或第五实施方案，或与其相关的任何实施方案中的组合物施用于人类受试者以有效治疗糖尿病；和检测所述受试者中糖尿病的治疗。

第十二实施方案是第六或第九实施方案，或与其相关的任一实施方案的方法，其中确定步骤或检测步骤是通过神经心理测试进行的。

第十三实施方案是第七或第十实施方案，或与其相关的任一实施方案的方法，其中确定步骤或检测步骤是通过风湿病学标准进行的。

第十四实施方案是第八或第十一实施方案，或与其相关的任一实施方案的方法，其中确定步骤或检测步骤是通过血糖浓度进行的。

附图

图1.进一步加工粗品咖啡因以减少咖啡因并增加多酚类物质使得食物产品作为最终产品的流程图。

图2.进一步加工粗品咖啡因以减少咖啡因并增加多酚类物质使得药物产品作为最终产品的流程图。

图3.进一步加工粗品咖啡因以减少咖啡因并增加多酚类物质使得化妆品产品作为最终产品的流程图。

图4.进一步加工粗品咖啡因以减少咖啡因并增加多酚类物质使得膳食补充剂产品作为最终产品的流程图。

图5.进一步加工粗品咖啡因以减少咖啡因并增加多酚类物质使得生物产品作为最终产品的流程图。

图6.咖啡生产过程中获得的粗品咖啡因的生物活性化合物。

图7. 从咖啡中超临界CO₂萃取咖啡因。

图8.纯咖啡因（A）或粗品咖啡因（B）对于过氧化氢处理的小鼠原代神经元细胞的影响。

图9. 通过胰岛素、粗品咖啡因和纯咖啡因刺激人骨骼肌细胞和脂肪细胞中葡萄糖的摄取。

图10. 通过阿司匹林、普通咖啡、纯咖啡因、和粗品咖啡因抑制COX-2。

图11. 从粗品咖啡因分离水不溶性颗粒。

图12.水不溶性颗粒保护小鼠原代神经元细胞对抗过氧化氢诱导的细胞死亡。

图13.应用多级反应监测技术对水不溶性颗粒中的化学品进行液相色谱 - 质谱鉴定。 （A）咖啡酸；（B）香豆酸；（C）香草酸；（D）槲皮素；（E）儿茶素；（F）脱落酸葡萄糖酯；（G）苏氨酸。

详细说明

每年在咖啡脱咖啡因过程中获得数千吨粗品咖啡因，并且植物化学物质与咖啡因一起被移除。我们测定了由超临界二氧化碳（scCO₂）脱咖啡因生产的粗品咖啡因的以下特点：酚含量，亲水和亲脂氧自由基吸收能力（ORAC_hydro和ORAC_lipo），保护神经元细胞免受过氧化氢诱导的细胞死亡，并能够刺激葡萄糖的摄取，和抑制环氧合酶-2（COX-2）。粗品咖啡因含有10mgCE/g酚类物质，并且ORAC_hydro为145μmol TE/g和ORAC_lipo为66μmol TE/g ，但没有增加过氧化氢处理的原代神经元细胞的存活率。粗品咖啡因增加培养的人骨骼肌细胞的葡萄糖摄取1.45倍并且增加培养的人脂肪细胞的葡萄糖摄取2.20倍。另外，粗品咖啡因对COX-2的抑制作用（IC₅₀，20 μg/mL）比阿司匹林（IC₅₀，190μg/mL）更强。纯咖啡因没有刺激葡萄糖的摄取或抑制COX-2。我们设计了一个从作为水不溶性颗粒（WIP）的粗品咖啡因中分离抗氧化剂的富集方法，该抗氧化剂以剂量依赖的方式保护原代神经元细胞免受过氧化氢诱导的细胞死亡。与LC-MS/MS分析偶联的WIP的ORAC引导的分级鉴定了七个生物活性组分：咖啡酸、香豆酸、香草酸、槲皮素、儿茶素、脱落酸葡萄糖酯、和苏氨酸。我们发现与α-生育酚组合的WIP显示出协同效应。

定义

除非另外说明，本文所使用的术语与本发明所属领域中的普通技术人员所通常理解的具有相同的含义。

如联邦食品、药品和化妆品（FD＆C）法案所规定，术语“食物”的意思是，（1）用于人或其他动物的食物或饮料的物质（2）口香糖，和（3）用于任何这类物质的组分的物质。

如联邦食品、药品和化妆品法案所规定，术语“药物”的意思是，美国官方药典、美国官方类似疗法药典或国家官方处方集中确认的物质，或任意上述的任何补充文件所确认的物质，旨在用于诊断、治愈、缓解、治疗或预防人或其他动物的疾病的物质，旨在影响人或其他动物体的结构或任何功能的物质（食物除外），和旨在用作任何刚规定的物质的组分的物质。

如联邦食品、药品和化妆品法案所规定，术语“化妆品”的意思是，旨在被擦、喷、洒、或喷雾，引入，或以其他方式应用到人体或其任何部分以清洁、美容、提高吸引力，或改变外观的物质，和旨在用作任何这类物质的组分的物质。

如联邦食品、药品和化妆品法案所规定，术语“膳食补充剂”的意思是，旨在补充膳食的产品，所述产品承载或包含一种或多种以下的膳食成分：维生素、矿物质、草药或其他植物制品、氨基酸，用于通过增加总的膳食摄入量补充人体饮食的膳食物质、或浓缩物、代谢物、成分、提取物，或刚才描述的任何成分的组合。

如食品与药品管理局（FDA）所定义的，术语“生物制品”是指，由生物制造过程辨别的药物子集。

这些定义用于将药物物质与药物产品区分。药物产品是最终形式，例如，含有药物物质的药物产品的口服固体剂型。进行效力研究以提供药物具有诊断、治愈、缓解、治疗或预防疾病能力的证据。诊断、治愈、缓解、治疗或预防并不意味着100％的疗效。相反，诊断、治愈、缓解、治疗或预防是指从1％到100％之间任何位置的一些水平的疗效。

如食品与药物管理局（FDA）所定义的，食物一般包括以下的食物类：烘烤食物和烘烤的混合物，包括所有即吃和即烤的产品、面粉和使用前需要制备的混合物;含酒精的饮料，包括麦芽饮料、葡萄酒、蒸馏酒和鸡尾酒组合；无酒精的饮料和饮料基料，仅包括特制茶或五香茶、软饮料、咖啡替代品，以及水果和蔬菜味明胶饮料；早餐谷物，包括即吃和即时和常规的热谷物；奶酪，包括凝乳和乳清干酪、奶油的、天然的、碎的、加工的、涂抹的、沙司的和杂混的奶酪；口香糖，包括所有形式的口香糖；咖啡和茶，包括常规的、不含咖啡因的和即时的类型；调味品和佐料, 包括淡调味汁（plain seasoning sauces）和酱、腌橄榄、腌菜、和佐料，但不是香料或草药；蜜饯和糖霜，包括糖果和调味糖霜、棉花糖、烘焙巧克力、和红糖、块糖、冰糖、枫糖、糖粉和粗糖；乳制品类似物，包括非乳制牛奶、冷冻或液体植脂末、咖啡伴侣、配品和其他非乳制品；蛋制品，包括液体、冷冻或干燥的蛋、和从其制备的蛋制菜肴，即蛋卷、芙蓉蛋、蛋沙拉、和冷冻多道蛋餐，但不是新鲜的蛋；脂肪和油，包括人造黄油、沙拉酱、黄油、色拉油、起酥油和烹调油;鱼制品，包括所有准备的主菜、沙拉、开胃菜、冷冻多道餐、和含有鱼类，贝类和其他水生动物的酱，但不是新鲜的鱼；鲜蛋，包括煮熟的蛋和仅从新鲜壳单制备的蛋餐；鲜鱼，仅包括新鲜和冷冻鱼、贝类和其他水产动物；新鲜的水果和果汁，仅包括生水果、柑橘类、瓜、浆果和家庭自制果汁和从其制备的宾治酒;新鲜的肉类，仅包括新鲜或家庭冷冻的牛肉或小牛肉、猪肉、羔羊肉或羊肉和家庭自制的含新鲜肉的菜、沙拉、开胃菜、或从其制备的三明治酱；新鲜家禽，仅包括新鲜或家庭冷冻家禽和猎禽和家庭自制的含新鲜家禽的菜、沙拉、开胃菜、或从其制备的三明治酱；新鲜蔬菜、番茄、马铃薯，仅包括新鲜和家庭自制蔬菜；冷冻乳制品甜点和混合物，包括冰淇淋、冰牛奶、冰冻果子露和其他冷冻乳制品甜点和特制品;水果和冰糕，包括所有冷冻水果和冰糕;明胶、布丁、和馅料，包括调味的明胶甜品、布丁、蛋羹、冻糕、饼馅、明胶基沙拉;粮食产品和面食，包括通心粉及面条制品、大米菜、冷冻多道餐，没有肉或蔬菜；肉汁和酱汁，包括所有肉酱汁和肉汁，和番茄、牛奶、黄油、和特制酱汁；硬糖和止咳药片，包括所有硬块类型糖果；草药、种子、调味品、调味料、共混物、提取物和调料，包括所有天然和人造香料、共混物、和调料；家庭自制的果酱和果冻，仅包括家庭自制的果酱、果冻、果膏、蜜饯和甜酱;商业的果酱和果冻，仅包括商业加工的果酱、果冻、果膏、蜜饯和甜酱;肉制品、包括所有的肉类和含肉类的菜、沙拉、开胃菜、冷冻多道肉餐和通过商业加工或使用商业加工肉通过家庭加工的三明治成分；全脂和脱脂牛奶，仅包括全脂、低脂和脱脂液体奶;奶制品，包括调味奶和乳饮料、奶粉、配品、小吃沙司、酱、重量控制乳饮料、和其他乳源产品；坚果及坚果制品，包括整个或带壳坚果、花生、椰子、和坚果和花生酱;植物蛋白产品，包括国家科学院/国家研究理事会“再生植物蛋白”类、和肉类、家禽和鱼类的替代品、类似物和从植物蛋白制备的添加产品；家禽产品，包括所有家禽和含家禽的菜、沙拉、开胃菜、冷冻多道家禽餐、以及通过商业加工或使用商业加工家禽通过家庭加工制备的三明治成分；加工的水果和果汁，包括所有商业加工的水果、柑橘类、浆果、和混合物;沙拉、果汁和果汁宾治酒、浓缩汁、稀释汁、“果汁”、和由此制成的饮料替代品；加工蔬菜和蔬菜汁，包括所有商业加工的蔬菜、蔬菜的菜、冷冻多道菜餐、以及蔬菜汁和共混物;零食，包括薯条、咸脆饼干和其他新奇小吃;软糖，包括块状糖、巧克力、乳脂软糖、薄荷糖和其他耐嚼的糖或牛轧糖；家庭自制的汤，包括肉类、鱼类、家禽、蔬菜、和组合家庭自制汤；汤和汤粉，包括商业准备的肉类、鱼类、家禽、蔬菜、和组合汤和汤粉；白色颗粒状糖，仅包括白砂糖；糖的替代品，包括颗粒状、液体状和片状糖的替代品;甜酱汁、配品和糖浆，包括巧克力、浆果、水果、玉米糖浆和枫树甜酱汁和配品。

生咖啡豆脱咖啡因

咖啡因是咖啡中生理活性成分，这已被深入研究。它由Runge于1820年发现。该嘌呤的化学名称是1.3.7三甲基黄嘌呤。它的特点是针状结晶，熔点为236℃。咖啡豆含有0.8〜2.8％的咖啡因，取决于品种和产地。

为了减少咖啡因和仍保持咖啡饮料理想的品质，相当数量的脱咖啡因方法已被开发。为了尽量减少风味和香味的损失，目前咖啡的商业脱咖啡因在焙烧前对生咖啡豆进行。不同脱咖啡因程序可分为三大组：溶剂脱咖啡因、水脱咖啡因、和超临界CO₂脱咖啡因。

在欧盟国家中“脱咖啡因的咖啡”是指最大咖啡因浓度为0.1％，其涉及干重；在美国，这意味着小于最初存在于豆中的量的3％。

所有脱咖啡因过程主要涉及五个步骤：用水膨胀原豆以溶解咖啡因-氯原酸钾复合物，并使咖啡因可用于提取；用溶剂从豆中提取咖啡因；蒸汽汽提以除去所有来自豆的溶剂残留（如果应用）;再生吸附剂（如果应用）; 和干燥脱咖啡因的咖啡豆至其初始水分含量。

超临界CO₂脱咖啡因

超临界流体萃取的概念最早是在1879年确认的。Hannay, J.B. & Hogarth, J. (1879) Proc. Roy. Soc. London, 29, 324报道了固体化合物可以溶解在超临界流体中。超临界流体技术的几乎所有食品加工应用采用CO₂作为溶剂。高密度CO₂不仅是一个可用于食品加工中的大量目标化合物的功能强大的溶剂，而且它是相对惰性的、价格便宜、无毒、可回收再利用、不易燃的、容易获得高纯度和无残留。在临界点在31.1℃和 7.58 MPa（75.8bars）的情况下，近临界和超临界的二氧化碳可以在相对安全方便和特别适合热不稳定的化合物的提取的温度和压力下使用(Palmer, M.V. & Ting, S.S. (1995) Food Chem., 52, 345-52)。在超临界流体中的化合物的溶解度是依赖于溶剂的密度，以及溶剂中的溶质的物理化学亲和力。可通过简单的压力减小或增加温度以降低密度，或者通过在合适的吸附剂上吸附化合物来回收溶解的化合物。然而，作为这种技术的缺点，人们已经认识到高压操作导致的高的初始投资和维护成本。成本是商业化的最重要的问题。

最初是在20世纪60年代中期描述使用压缩二氧化碳进行脱咖啡因(Zosel, K. (1965) Chem. Abstr., 63, 110456)。工艺条件建议为70-90℃和160-220bar。建议了三种可能方法：（1）湿生豆在压力容器中与二氧化碳流混合。咖啡因从豆中扩散入进入洗涤塔的二氧化碳，其中咖啡因在水中被吸收。10小时回收利用后，几乎所有的咖啡因溶解在洗涤水中，可通过蒸馏将其从洗涤水中分离。（2）使用第一项建议中概述的提取条件，通过使其穿过活性炭床（其中吸附咖啡因）从二氧化碳流体除去咖啡因。（3）将生咖啡豆和活性炭颗粒混合物引入到压力容器中，其中使二氧化碳达到90℃和220bar。在5小时后，咖啡因通过二氧化碳从豆中直接扩散到活性炭上。萃取后，通过振动筛从活性炭颗粒分离咖啡豆。

基于这三种方法，已经有相当数量的涉及经济或质量方面的过程改进的进展。

自1979年以来，基于Zosel的第二过程，已报道生湿润咖啡豆的CO₂脱咖啡因由HAG公司在德国工业上应用，潮湿的超临界二氧化碳实现了定量提取咖啡因（US专利3 879 569）。

一种改进的Zosel第一过程的例子已报道由“Schoeller-Bleckmann Plant”证明 (Lack, E., Seidlitz, H. & Toro, P. ( 1989) In:Proceedings of the 13th ASIC Colloquium (Paipa) pp. 236-245, ASIC, Paris, France)。通过与蒸汽，水或它们的组合接触来实现湿润至最佳水含量为40％-45％。该装置与高压提取柱一起进行设计。含溶解咖啡因的二氧化碳流入吸附柱，其中由逆流淡水流脱咖啡因。若大于97％的脱咖啡因率是必要的（在美国），则经过洗涤塔的气体流需要通过一个活性炭吸附柱。串联提取器的级联的应用保证了洗涤水合理恒定的咖啡因浓度。

GB2235121也描述了一个过程，其中用过饱和（1 -2质量％H₂O）超临界CO₂将非润湿的生咖啡豆在高压反应器中润湿。在大约35%豆水分下，脱咖啡因在反应器中逐层发生，这被认为是最佳的脱咖啡因过程。源于咖啡因洗涤塔的水是超饱和的并且包含咖啡油和咖啡的味道。它也任选用于用水进行的豆的第二提取步骤，CO₂流逆流。

EP0482675发表的“间歇性压力系统”中，在250bar和60℃下，润湿豆在在二氧化碳气氛下在三个或更多的提取器之一中保持了几分钟到几个小时。然后，将压力迅速释放，从而导致将细胞中的水咖啡因溶液驱逐到豆表面。将反应器再加压至250 bar/60℃后，二氧化碳循环通过咖啡床并完成脱咖啡因。咖啡因吸收在洗涤塔的水中，并通过水分的蒸发分离。湿豆最终在离心机中处理，减少残留的咖啡因溶液并对咖啡豆预干燥。

根据EP0439710对此系统进行了改进。代替超临界二氧化碳，二氧化碳饱和的不含咖啡因的生咖啡提取物被用于在压力高达300bar，温度高达110℃条件下脱咖啡因达1到几个小时。快速释放压力后，咖啡豆可以用液体洗涤长达2小时。 接着CO₂饱和的含咖啡因的生咖啡提取物在洗涤塔内用超临界CO₂脱咖啡因。咖啡因在水吸收塔中与CO₂分离。

实验也已公布，采用超临界一氧化二氮代替二氧化碳作为脱咖啡因溶剂(Brunner, G. (1987) In: Proceedings of the 12th ASIC Colloquium (Montreux) pp. 294-305, ASIC, Paris, France)。它具有比CO₂高的溶剂溶解能力，因为有在给定的温度和压力条件下比CO₂更高的密度，以及相对低的临界温度（36.5℃）。如果操作不当，一氧化二氮可不受控制地分解；但在适合脱咖啡因的温度范围内，如果避免了火源，一氧化二氮可以安全地操作。

关于活性炭吸附能力依赖于比表面积的量化信息已被报道(Gabel, P.W., Sarge, S. & Camenga, H.K. (1987) In: Proceedings of the 12th ASIC Colloquium (Montreux) pp. 306-312, ASIC, Paris, France)。根据“咖啡因比表面积”的计算和吸附热的实验分析（其随咖啡因的质量增加而降低，也就是随着表面覆盖增加而降低），可以预测吸附能力。

为了应用于咖啡生产国家，Quijano-Rico, M. (1987) In: Proceedings of the 12th ASIC Colloquium (Montreux) pp. 187-193, ASIC, Paris, France推荐了新鲜生咖啡豆的脱咖啡因作为量身定制的现代技术。收获、湿法制备和脱羊皮纸状壳之后，生咖啡豆可以脱咖啡因。避免了传统的润湿和干燥步骤导致降低了经营成本并提高了杯测品质（cup quality）。可用超临界CO₂，使用程序升温提取（从60℃持续增加到85℃，从而减少“热应力”）实现脱咖啡因本身（DE3445502）。

美国专利4911941提出了第一个半连续操作过程。将基本上不含咖啡因的超临界CO₂连续供给含有生咖啡的垂直圆柱状的提取容器的一端，并且将载有咖啡因的二氧化碳从另一端连续取出。增加了水分的咖啡豆在压力（300 bar）下通过一个大球阀和锁斗装置装入提取容器（美国专利4820537）。在容器底部的脱去咖啡因的咖啡豆通过一个接一个地打开球阀排出底部锁斗。然后，关闭该阀，提取继续进行。在逆流水洗涤塔中将咖啡因从二氧化碳流中洗涤出来，利用有利的咖啡因分配系数分配到水相中。吸收器的载有丰富的咖啡因的水通过反渗透浓缩，取得97％或更高纯度的咖啡因和含有酸性非咖啡因固体的渗透物，将其加入该过程中以提高产率和增加提取率。

一种改进的CO₂脱咖啡因的过程设计是基于使用特殊的超临界CO₂萃取工艺的商业规模的咖啡脱咖啡因试验工厂的数据(Linnig, D.A., Leyers, W.E. & Novak, R.A. (1991) In: Proceedings of the 14^th ASIC Colloquium (San Francisco), pp.357-64, ASIC, Paris, France)。它是高压提取容器设计，其中在14-35 MPa和70-130℃二氧化碳连续逆流通过若干柱达6-12小时。随后在降低温度（15-50℃）和压力（5-10 MPA）下用水洗涤载有咖啡因的富集CO₂流体。含粗品咖啡因的含水流被出售作进一步处理（咖啡因回收和精炼）。

美国专利5153015已经建议了一种通过超临界CO₂从天然产物提取某些物质（如从茶或咖啡提取咖啡因）的特殊设备。该设计包括一个带有环状圆柱形穿孔筐的圆柱形的高压容器，其含有天然产物和吸附剂，其中流体从外圆柱区域流向内圆柱区域。压力降低和堵塞的风险降低，径向速度增加改善了吸附器中的质量传递并且设备非常紧凑。

WO92/03061，EP-547119描述了一种用酸的水溶液预处理后生产脱咖啡因生咖啡豆的方法。酸化，优选用1.5-2％的柠檬酸，补偿了发生在超临界脱咖啡因期间的酸度的轻微损失，从而提高了咖啡饮料的风味和香气。脱咖啡因之前，湿润步骤可以与酸化处理组合实施。

已采用咖啡豆的脱咖啡因作为应用CO₂超临界流体萃取的实例(McCoy, B.J. (1993) In: Proceedings of the 6th International Congress on Engineering and Food, Chiba, Japan, Vol. 2, Blackie, Glasgow)。检测脱咖啡因为CO₂流速、温度和压力的函数。脱咖啡因的速率随温度和压力增加而增加。数学模型描述了咖啡因在水和二氧化碳之间的外部和粒间扩散阻力和分布。分布在水和超临界CO₂之间的咖啡因的分配系数依赖于温度和压力; 脱咖啡因前将生豆浸泡在水中增强了脱咖啡因的速率。

WO94/26125公开了一个新的在常规条件下的基于超临界CO₂的脱咖啡因系统，但要在高压容器中湿润生咖啡层之上加入液体水流。所用的水的量是1-4千克每千克生咖啡（干物质）；如果用作水饱和的CO₂环境中的连续流，其提高了咖啡因从咖啡豆表面到流体中的质量转移，并减少了脱咖啡因时间约50％。如果用于脉冲约9分钟，每小时一至四个脉冲，则除去高百分比的氯原酸（认为是不期望的）并可以被吸收在二氧化碳洗涤柱的水中。

美国专利4411923建议了用离子交换剂代替活性炭以吸附离开超临界CO₂流的咖啡因。发现强酸性阳离子交换剂比活性炭显著更具选择性，它们可以用盐水溶液或无机酸再生，并且耐压。为了回收咖啡因，浓缩水性再生溶液直到咖啡因结晶出来或者例如用二氯甲烷进行液 - 液萃取。

Tokunaga, Y., Fujii, T. & Nakamura, K. (1997) Biosci. Biotech. Biochem.,61, 1024-1026,中的实验室试验已公开用沸石膜代替活性炭以从超临界流体中分离咖啡因。通过水热合成在沸石的管状氧化铝膜表面上涂薄层。该系统具有高的热压耐性和良好的咖啡因分离性能。咖啡因回收尚未见报道。

EP0151202描述了将超临界CO2脱咖啡因方法应用于焙炒咖啡（或茶叶）。在第一步中，干燥的超临界CO₂提取香气成分，并在第二步中，在普通条件下通过二氧化碳对润湿焙炒咖啡脱咖啡因。然后，水溶性成分从脱咖啡因的润湿焙炒咖啡中提取。将咖啡提取物与含香味的超临界干燥CO₂混合，由此解压后将香气成分浓缩为液体; 然后冻干提取物。

富含植物化学物质或多酚的提取物（或级分）

在一个实施方案中，参照图1至5，通过超临界二氧化碳脱咖啡因提取生咖啡以生产粗品咖啡因。粗品咖啡因，或其再悬浮在水中的真空干燥的产物，被进一步处理以通过回收粗咖啡因的水悬浮液的过滤过程中的渗余物减少咖啡因和增加多酚类物质，作为富含植物化学物质或多酚的提取物（或级分）。食物（图1）、药物（图2）、化妆品（图3）、膳食补充剂（图4）、或生物制品（图5）补充有，或食物（图1）、药物（图2）、化妆品（图3）、膳食补充剂（图4）、或生物制品（图5）的组分补充有，富含植物化学物质或多酚的提取物（或级分）以产生食物产品（图1）、药物产品（图2）、化妆品产品（图3）、膳食补充剂产品（图4）、或生物产品（图5）。在图1-5中，富含植物化学物质或多酚的提取物（或级分）充当活性成分，或者添加剂或赋形剂或惰性的（非治疗）成分。作为后者情况的一个实例，富含植物化学物质或多酚的提取物（或级分）充当抗氧化剂以提高食物产品（图1）、药物产品（图2）、化妆品产品（图3）、膳食补充剂产品（图4）、或生物产品（图5）的稳定性或保质期。作为前者情况的一个实例，富含植物化学物质或多酚的提取物（或级分）充当产品的活性成分以刺激葡萄糖的摄取、抑制COX-2，或充当神经保护剂，或者另外保护抵抗损害组织或皮肤的氧自由基。

我们设计了一个从粗品咖啡因分离抗氧化剂的富集方法。在一个实施方案中，粗品咖啡因是超临界二氧化碳(scCO₂)脱咖啡因过程中的副产物。在一个实例中，生咖啡豆在水中浸泡直到水分含量为50％。在高温（90-100℃）和高压（300atm）下在提取器中通过液态二氧化碳除去咖啡因。液态二氧化碳在提取器和洗涤器之间再循环，其中用水从液体二氧化碳中除去咖啡因。然后将所得的富含咖啡因的水溶液通过反渗透浓缩并真空干燥。

在一个实施方案中，得到粗咖啡因的近似组成。在一个实例中，发现主要组分是咖啡因（95.95％）、水分（1.10％）和脂肪（1.04％）；灰分、纤维、蛋白质和糖的量可以忽略不计。

酚类物质是生咖啡的质量的10％左右(Chu, Y. F. et al., Journal of Agricultural and Food Chemistry 2009, 57, 9801 -9808)。在一个实施方案中，通过Folin-Ciocalteu试验（在一个实例中）测定粗品咖啡因中存在酚类物质。在一个实例中，发现总酚类物质的量是10 mg CE/g，或粗品咖啡因的约1质量％。

在一个实施方案中，对粗品咖啡因的亲水性和亲脂性级分的抗氧化活性进行测定。在一个实例中，发现ORAC_hydro是145 μmol TE/g和ORAC_lipo是66 μmol TE/g，而发现纯咖啡因涉及非常低的ORAC_hydro(6 μmol TE/g)和ORAC_lipo(0 μmol TE/g)。

在一个实施方案中，对粗咖啡因的体外抗氧化活性的生物相关性进行了评价。在一个实例中，在H₂O₂诱导的氧化应激前用粗品咖啡因对原代皮质神经元细胞进行预处理。H₂O₂以剂量依赖的方式减少细胞存活。在这个实例中，纯的咖啡因被发现对原代神经元细胞是没有毒性的，但并不能防止过氧化氢诱导的细胞死亡。同样地，在这个实例中，发现粗品咖啡因对原代神经元细胞没有毒性，但并不能防止过氧化氢诱导的细胞死亡，即使粗品咖啡因的ORAC值远高于纯咖啡因。

在一个实施方案中，粗品咖啡因对人骨骼肌细胞和脂肪细胞的葡萄糖摄取的抗高血糖作用是使用胰岛素作为阳性对照测定的。在一个实例中，100 nM的胰岛素刺激人骨骼肌细胞的葡萄糖摄取增加2.06倍，且粗品咖啡因虽然效果低于胰岛素，但0.01 mg/mL的粗品咖啡因显著增加葡萄糖摄取1.45倍。相反，在这个实例中，0.01 mg/mL的纯咖啡因不会产生显著的效果。在一个实例中，粗品咖啡因比胰岛素更有效地刺激人类脂肪细胞的葡萄糖摄取：0.01 mg/mL的粗品咖啡因诱导葡萄糖摄取增加2.20倍，而100nM胰岛素诱导葡萄糖摄取增加1.6倍。在这个实例中，纯咖啡因（0.01 mg/mL）对葡萄糖摄取没有显著的影响，。

在一个实施方案中，通过确定其对炎症酶COX-2的作用评价粗品咖啡因的抗炎活性，用阿司匹林作为阳性对照。在一个实例中，粗品咖啡因抑制COX-2的活性：IC₅₀值是20μg/mL，低于阿司匹林9.5倍（IC₅₀，190μg/mL），这表明粗品咖啡因是一种比阿司匹林更有效的COX -2抑制剂。与此相反，在该实例中，普通咖啡的活性（IC₅₀，2010μg/mL）低于阿司匹林10倍左右。在该实例中，纯咖啡因没有抑制COX-2的活性。

在一个实施方案中，进一步处理粗品咖啡因以减少咖啡因和富集多酚类物质。将从超临界二氧化碳脱咖啡因或其再悬浮在水中的真空干燥产物中得到的粗品咖啡因悬浮以形成悬浮液，通过过滤收集在此悬浮液的水不溶性颗粒（WIP）。在一个实例中，该方法减少了咖啡因含量至低于5％。在一个实例中，WIP级分只含有1.6％咖啡因，小于粗品咖啡因约60倍。在一个实例中，通过Folin-Ciocalteu试验（在一个例子中）测定WIP级分中存在酚类物质。在一个实例中，发现总酚类物质的水平是313 mg CE/g，或WIP级分的约30质量％。在一个实例中，发现WIP级分的ORAC_hydro和ORAC_lipo值分别为：1321 μmol TE/g 和 332 μmol TE/g，分别比粗品咖啡因高约9倍和5倍。在一个实例中，在小鼠原代神经元细胞中评价WIP的抗氧化活性。在一个实例中，WIP显示没有毒性，并以剂量依赖的方式显著地改善过氧化氢启动氧化应激的细胞死亡。在一个实例中，WIP（1000μg/mL）使过氧化氢（250-1000μΜ）处理过的小鼠原代神经元细胞的存活率增加约3.5倍。在一个实施方案中，总酚类物质与咖啡因的比例是约20,10-30，或40，或大于10。

在一个实施方案中，进行WIP的抗氧化活性引导分级和LC-MS分析。在一个实例中，通过快速色谱法在C-l8柱上将WIP分离成多个级分，并确定各级分的ORAC_hydro。在一个实例中，对显示具有最高抗氧化能力的级分进行 LC-MS分析。

在一个实施方案中，确定了级分中具有最高的抗氧化能力的7种化学物质：咖啡酸、香豆酸、香草酸、槲皮素、儿茶素、脱落酸葡萄糖酯、和苏氨酸。其中，咖啡酸、香豆酸、香草酸、槲皮素和儿茶素是众所周知的酚类抗氧化剂。脱落酸是一种植物激素，但以葡萄糖酯共轭的形式存在时为失活的;并且苏氨酸是一种氨基酸。

在一个实施方案中，测定与其他生物抗氧化剂组合时粗品咖啡因和WIP的协同效应。一个实例中，ORAC试验适用于亚油酸盐微乳液体系(Sim, W. L. S. et al., Journal of Agricultural and Food Chemistry 2009, 57, 3409-3414)，以确定α-生育酚（维生素E的一种形式）与粗品咖啡因、WIP、抗坏血酸、儿茶素、氯原酸、WIP+儿茶素，或WIP+氯原酸的组合的抗氧化活性。在这个实例中，以相对ORAC来表示数据：100％的相对ORAC表示，该混合物的抗氧化活性等于每个组分的抗氧化活性的总和（累加效应），而大于100％的相对ORAC表示，该混合物的抗氧化活性大于每个组分的抗氧化活性的总和（协同效应）。在一个实例中，粗品咖啡因和抗坏血酸与α-生育酚的组合产生了累加的抗氧化效果。与此相反，在该实例中，WIP、儿茶素，和氯原酸与α-生育酚的组合产生了协同效应。

提取

作为药学术语使用的提取涉及使用不同的提取程序中的选择性溶剂将失活或惰性组分与植物或动物组织中的医学活性部分分离。从植物中得到的产物是相对不纯的浓缩物，其多用于口服或外用。所得到的制剂通常称为植物制剂。

药物和生物制品制造

虽然粉末也可以作为最简单的剂型给药，但最常用的药物物质是通过固体剂型口服给药，如片剂和胶囊剂。用于制备片剂和胶囊剂的大规模生产方法通常需要除了活性成分外的其它物质的存在。添加剂也可以被包括在制剂中以方便处理、增强物理外观、提高稳定性，并且有助于在给药后递送药物进入血流。

片剂可以被定义为含有或不含合适的稀释剂的含有药物物质的固体药物剂型，传统上由压缩或成型方法制备。最近，冲压层压板、电子沉积法、和立体印刷方法已用于制备片剂。

压缩片剂是通过压缩形成的，并在其最简单的形式中，不包含特殊的涂层。它们是由粉状晶体，或粒状材料制备，单独使用或与粘合剂、崩解剂、控制释放聚合物、润滑剂、稀释剂，和在许多情况下与着色剂组合使用。今天商业化的片剂的绝大多数是压缩片剂（无涂层或涂层状态）。

所有片剂压缩设备中的基本机械单元包括适合从底部进入模具的下冲头，和具有相同形状和尺寸的头的上冲头，压片材料填充模具腔后它从顶部进入模具腔。通常在冲头上施加压力形成片剂并随后从模具射出。通常有三种方法典型地用于商业片剂的制备：湿法制粒法、干法制粒法和直接压片。

除了活性或治疗成分，片剂含有许多惰性材料。后者是已知的作为添加剂或赋形剂。根据在成品片剂中所发挥作用来将它们分类。第一组包含那些有助于给予制剂令人满意的加工和压缩特性。这些包括稀释剂（例如，磷酸二钙、硫酸钙、乳糖、纤维素、高岭土、甘露醇、氯化钠、干淀粉、和糖粉）、粘合剂（例如，淀粉、明胶、糖、树胶、纤维素和聚乙烯吡咯烷酮）、助流剂（例如，胶体二氧化硅）、和润滑剂（例如，滑石、硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酸、二十二烷酸甘油酯、氢化植物油、和聚乙二醇）。第二组的添加的物质有助于给予成品片剂额外的需要的物理特性。该组包括崩解剂（例如，淀粉、粘土、纤维素、藻胶、树胶和交联聚合物）、表面活性剂、着色剂，并且对于咀嚼片是调味剂和甜味剂，并且对于控释片是聚合物或疏水性材料，如蜡或其他溶解度迟缓材料。在某些情况下，可以添加抗氧化剂或其他材料，以提高稳定性和保质期。

使用最广泛的和最常用的制备片剂的方法是湿法制粒方法。该方法的步骤包括称重、混合、制粒、湿筛、干燥、干筛、润滑和压缩。 CT抗坏血酸USP，50mg的一个湿法制粒配方是：

成分	含量
		抗坏血酸 USP	55mg
乳糖	21mg
		淀粉	13mg
乙基纤维素N100	16mg
		淀粉	7mg
滑石	6.5mg
		硬脂酸钙	1mg

用前三种成分与溶解在无水乙醇中的乙基纤维素（5％）制粒，加入额外的无水乙醇，得到湿颗粒。通过一个不锈钢筛进行湿筛并在室温下干燥。通过不锈钢筛干筛并与剩余三种成分组合。彻底混合和压缩。使用一个平坦有斜面的1/4英寸的冲头。

干法制粒包括称量、混合、重击（slugging）、干筛、润滑和压缩。CT维生素B复合物的一个干法制粒配方是：

成分	含量
		硫胺一硝酸盐	0.733mg
核黄素	0.733mg
		盐酸吡哆醇	0.333mg
泛酸钙	0.4mg
		烟酰胺	5mg
乳酸	75.2mg
		淀粉	21.9mg
滑石	20mg
		硬脂酸	0.701mg

将所有的成分混合在一起。压缩成丸。研磨和筛成目颗粒。采用1/4英寸的凹形冲头重新压缩成片。

直接压片需要直接从粉状材料压缩片剂。它是较便宜的，但并不总是与原料兼容。CT抗坏血酸USP，250mg的一个直接压缩配方是：

成分	含量
		抗坏血酸USP	255mg
微晶纤维素	159mg
		硬脂酸	9mg
胶体二氧化硅	2mg

在一个合适的混合器混合所有成分。使用1/4英寸标准凹冲压缩。

胶囊剂是固体剂型，其中药物物质被封闭在合适形式的硬质或软质的可溶性明胶壳中。与片剂相比，填充到硬明胶胶囊的粉末需要最少的制剂尝试。粉末通常含有稀释剂，如乳糖、甘露醇、碳酸钙或碳酸镁。也经常使用润滑剂如硬脂酸酯。软壳胶囊的明胶通常通过加入甘油、山梨醇或类似的多元醇塑化。

药用口香糖可以由多种混合过程制造，即将几个组分并入产品片，由此从铺开的片冲压或剪切单元。一个典型药用口香糖的配方是：

组分	浓度(%w/w)
		药物	0-40
胶基	20-45
		甜味剂	30-60
软化剂	0-10
		调味剂	1-5
着色剂	0-1

药用口香糖可以通过压缩和其他进程制备，但是目前使用的主要方法是混合，压延，冲压完成单位。

新药开发可以根据不同化合物的各种各样的途径进行，但长期以来很好地用作通用模型的发展模式已经建立。该模式大概描述了随阶段顺序（可能有重叠）进行的新药物的开发和发展。开发程序产生合成化合物，其在称为测定和动物模型的临床前试验中进行测试。临床（人体）测试通常通过三个连续阶段进行。在第一阶段，对少量通常健康的志愿者进行测试，以建立安全剂量和收集关于化合物的吸收、分布、代谢作用、排泄和毒性的信息。为了在美国进行临床试验，制造商必须首先向FDA提交研究新药申请（IND）。第二阶段试验对患有目标疾病或疾病状态的受试者进行，并设计以获取安全性的证据和初步疗效数据。在这个阶段测试的受试者的数目大于第一阶段并可达到数百人。最终批准前的临床试验阶段，第三阶段，通常由许多大型（往往是多中心）试验组成，旨在稳定确认疗效并发现很少发生的副作用。第三阶段用于试验化合物的受试者的数量数以千计。一旦药物开发商认为他们有足够的安全性和有效性证据，就会将他们的测试结果编辑在给监管部门的申请中以申请销售许可。在美国，制造商向FDA提交新药申请（NDA）或生物许可申请（BLA）申请审查和批准。

糖尿病

糖尿病（DM）由一组综合征组成，该综合征的特征为高血糖；脂质、碳水化合物和蛋白质代谢的改变;和血管疾病并发症的风险增加。大多数患者临床上可以分为1型或2型。DM或碳水化合物不耐受也与某些其他疾病状态或症状相关。 几个医疗组织已经提出了DM的诊断标准。美国糖尿病协会（ADA）标准包括摄入口服葡萄糖负载后2小时随机血浆葡萄糖浓度大于200 mg/dl，空腹血浆葡萄糖浓度大于126 mg/dl，或血浆葡萄糖浓度大于200 mg/dl。Diabetes Care 2003，26，s5-20。

事实上，所有形式的DM是由胰岛素循环浓度的减少（胰岛素缺乏）和外周组织对胰岛素的应答减少（胰岛素抵抗）引起的。这些异常导致碳水化合物、脂质、酮和氨基酸代谢改变;综合征的主要特征是高血糖。胰岛素是通过抑制肝脏葡萄糖生成和刺激肌肉和脂肪组织对葡萄糖的吸收和代谢来降低血液中的葡萄糖浓度。

使用胰岛素和口服降糖药的患者可以达到接近正常血糖。目标是实现空腹血糖浓度为90-120 mg/dl和餐后2小时值低于I5O mg/dl。对于生活较不规律或那些有反调节激素响应缺陷的患者，有必要接受较高的空腹（例如，140 mg/dl）和餐后2小时（例如，200〜250 mg/dl）血糖浓度。

粗品咖啡因刺激人体脂肪和肌肉细胞对葡萄糖的摄取。一个合适的抗糖尿病剂应具有与胰岛素类似的作用，或应避免特征为胰岛素抵抗的胰岛素作用缺陷。我们采用培养胰岛素敏感组织的两个主要人类细胞培养物：肌管和脂肪细胞，来评估粗品咖啡因的胰岛素拟态活性。FDA批准可需要动物测试来评估粗品咖啡因或其级分在降低高血糖方面如何有效，例如，在糖尿病的胰岛素缺失小鼠模型中，如C57BL/6和ob和db突变体。它可能需要进一步的试验来评价粗品咖啡因或其级分的胰岛素拟态活性，例如，利用器官培养物或胰岛素敏感组织的原代细胞培养物或细胞培养系，例如L6E9肌管和3T3-L1脂肪细胞。数据支持临床（人体）测试以确定这些提取物刺激葡萄糖的摄取并且治疗患有或处于发展糖尿病风险中的人类受试者的糖尿病的疗效和最佳剂量。

炎症

炎症过程是对伤害性刺激的反应。

前列腺素参与炎症的发病机制。阿司匹林和NSAIDS（非甾体类抗炎药）抑制前列腺素的生物合成。前列腺素合成途径的第一个酶是环氧合酶或COX。该酶将花生四烯酸转化为不稳定中间体，并导致产生血栓烷A2和各种前列腺素。治疗剂量的阿司匹林和NSAIDS抑制COX酶和前列腺素的产生。

有两种形式的环氧合酶，环氧合酶-1（COX-1）和环氧合酶-2（COX-2）。在大多数正常细胞和组织中可以找到COX-1，而伴随炎症的细胞因子和炎症介质可以诱导COX-2产生。与COX-2不同，COX-1在胃上皮细胞中表达。认为在这个位点上抑制COX-1主要是考虑到胃的不良反应，其将NSAIDS治疗复杂化，从而提供了特异性抑制COX-2的NSAIDS的发展原理。

大多数NSAIDS均能够抑制COX-1和COX-2而且选择性小。假设NSAIDS的抗炎作用将伴随较低的产生溃疡的潜在推进努力以设计与COX-1相比对COX-2具有更大选择性的药物。这些努力使例如作为选择性COX-2抑制剂的塞来昔布获得审批和销售。

阿司匹林共价修饰COX-1和COX-2，不可逆地抑制环氧合酶的活性。相比之下，绝大多数的NSAIDS充当环氧合酶活性的可逆的竞争性抑制剂。选择性COX-2抑制剂已被证明比同样有效剂量的NSAIDS更不容易诱发胃溃疡，这提供了 FDA批准例如塞来昔布的基础。

NSAIDS的主要临床应用是治疗肌肉骨骼病症的抗炎药，如关节炎。关节炎这个词实际指关节的炎症，并扩展到纤维肌痛症、痛风和狼疮。两种常见的形式中，骨关节炎比类风湿性关节炎更为普遍。

骨关节炎是一种疾病，其特征为关节内的软骨和其底层骨变性并涉及炎症。美国风湿病学院（ACR）已发表了有关手(Altman, R. et al., Arthritis Rheum 1990, 33, 1601-10)、髋(Altman, R. et al., Arthritis Rheum 1991, 34, 505-14)和膝(Altman, R. et al., Arthritis Rheum 1986, 29, 1039-49)的骨关节炎的临床分类指引。膝骨关节炎的控制方法记载在Hochberg MC et al., Arthritis Rheum 1995, 38, 1541-6，髋骨关节炎的控制方法记载在Hochberg MC et al., Arthritis Rheum 1995, 38, 1535-40。

类风湿性关节炎是一种全身性炎性疾病，其自身出现在身体多个关节，导致滑膜（关节的衬）发炎以及软骨和骨的侵蚀。1987年美国风湿病学院标准应用于类风湿性关节炎的临床诊断并在流行病学研究中定义类风湿性关节炎。人必须满足七个ACR标准中的四个；这些标准是根据临床观察（例如，受累关节数目），实验室试验（例如，阳性类风湿因子）和影像学检查（例如，关节侵蚀的X射线证据）。ArnettFC et al., Arthritis Rheum 1988, 31, 315-324。

从历史上看，药物治疗RA历来遵循金字塔方法。即从皮质类固醇/非甾体类抗炎药开始治疗，如果人体对于前面的药物无反应则再使用疾病修饰抗风湿药物，最后使用生物反应修饰剂。Arthritis Rheum 2002, 46, 328-346。

粗品咖啡因抑制炎症酶COX-2。通过测定通过向除其他外含有血红素和重组人COX-2以及测试材料的混合物中加入花生四烯酸开始的反应中的耗氧量，我们对检测的粗品咖啡因的COX-2活性进行了评估。FDA批准可需要动物试验评估粗品咖啡因或其级分在抑制COX-2方面如何有效，例如，在关节炎模型中，最广泛使用的模型为佐剂诱导的关节炎、胶原蛋白诱导的关节炎、抗原诱导关节炎和链球菌细胞壁关节炎，还有更为前沿的转基因模型。其可需要进一步的体外实验来评价粗品咖啡因或其级分的COX-2活性，例如，由人全血试验检测，其由Patrignani, P. et al., J Pharmacol Exp Ther 1994, 271, 1705-12研发并由1997年12月关于COX-2抑制作用方式的国际共识会议同意作为体外试验，其应作为评估抑制COX-2和COX-1的标准方法。数据支持临床（人体）测试以确定这些提取物抑制COX-2和治疗患有或处于发展炎症风险中的人类受试者的炎症的疗效和最佳剂量。

痴呆

在晚年生活中阿尔茨海默病是痴呆的主要病因。痴呆是一个广义的术语，是指认知功能下降到干扰日常生活和活动的程度。最被广泛接受的可能阿尔茨海默病的诊断标准是由神经和语言紊乱与中风国家研究所和阿尔茨海默病及相关疾病协会提供的那些(NINCDS-ADRDA; McKhann G. et al., Neurology 1984, 34, 939-44)。这些标准包括临床检查确立和神经心理测试证实痴呆的存在。痴呆被描述为涉及老年患者的多重进行性认知缺陷，其不存在意识紊乱，存在精神活性物质，或任何其他医学、神经学或精神病学疾病状态，其可能导致和其自身为这些进行性缺陷。美国精神病学协会的精神疾病诊断和统计手册：第四版（DSM-IV，1994年）还概述了阿尔茨海默病类型的痴呆的诊断标准，一般都是与NINCDS-ADRDA标准一致的。 DSM-IV也提供了血管性痴呆的诊断标准，以及因其他一般医学疾病状态包括HIV病、头部外伤、帕金森病、亨廷顿病、匹克病和Creutzfeldt-Jakob病以及其他一般医学疾病状态和病因导致的痴呆的诊断标准。痴呆的新病因和变体被继续阐明和痴呆病症的诊断标准也会继续加以完善。

国家衰老研究所（NIA）和阿尔茨海默病协会带头更新阿尔茨海默病的诊断标准。在阿尔茨海默病领域中最重要的进步是公布于1984年的诊断标准：（1）大脑中阿尔茨海默病驱动的变化以及伴随的认知缺陷数年来发展缓慢，痴呆表示病理学累积多年的末期;（2）早发性痴呆的预测基因表明，初始病因最终导致临床症状和大脑的病理变化，其开始于紊乱的β淀粉样蛋白代谢;（3）APOE基因的e4等位基因是已接受的作为晚发性阿尔茨海默病的主要遗传风险因子，晚发性阿尔茨海默病定义为在65岁或65岁以上发病;和（4）阿尔茨海默病的生物标志物已开发和正在验证。这些分为几类：（a） β淀粉样蛋白的生物标志物，包括淀粉样蛋白正电子发射断层扫描（PET）成像和脑脊液（CSF）中的β淀粉样蛋白的水平;（b）神经元损伤的生物标志物，包括脑脊液tau和磷酸化tau水平；（c）神经功能障碍的生物标志物，包括PET扫描上减少的氟脱氧葡萄糖（FDG）摄取;和（d）神经退行性疾病的生物标志物，包括结构磁共振成像（MRI）扫描上的大脑萎缩。

NIA/阿尔茨海默病协会的工作组正在围绕目前普遍认为存在的阿尔茨海默病的三个阶段展开工作- 这三个阶段包括临床前阿尔茨海默病、阿尔茨海默病导致的轻度认知障碍（MCI）和阿尔茨海默病痴呆。“临床前”组现正制定研究议程以确定有助于预测发展疾病的风险的评估方法。正在研究确认早期认知下降的生物标志物和其他临床评估工具以确认无明显症状人中存在阿尔茨海默病的脑部变化，并确定可最终发展该疾病的那些人。“MCI”组正制定MCI标准，这将有助于指示痴呆之前的认知改变情况，有助于更好地区分MCI和阿尔茨海默病。研究正在进行以更好地了解认知发生的变化，它们与生物标志物如何关联和这些方法中哪个最有效指示即将发展阿尔茨海默病痴呆的可能性。 “阿尔茨海默病痴呆”组正在修订现有的诊断阿尔茨海默病的标准以包括可能的生物标志物和其他可能有助于诊断的评估方法。三个工作组的报告草案定稿后，接下来的步骤是发表在同行评审期刊然后通过将标准应用至临床试验中以系统验证。

记忆和认知能力的下降实际上是人类老化的正常结果。由国家精神卫生研究所（NIMH）工作组提出了新类别“年龄相关的记忆障碍”来描述老年人患有相对于其年轻岁月的记忆衰退，但是相对于他们的同龄人认知功能是正常的(Crook, T.H. et al., Developmental Neuropsychology, 1986, 2, 261-276)。该小组建议包括明确的操作定义和心理测量学标准以帮助认定这些人。这种疾病状态的其他术语包括“年龄一致性记忆衰退”和“年龄相关的认知衰退” 。DSM-IV（1994）编纂了年龄相关的认知衰退的诊断分类。

粗品咖啡因WIP级分具有减少的咖啡因和丰富的多酚类物质，除此之外浓缩的抗氧化剂会加强神经保护活性。我们评估了粗品咖啡因的WIP级分对于小鼠原代神经元细胞的神经保护活性。FDA批准可需要动物试验以评估粗品咖啡因或其级分在神经元保护方面如何有效，例如，在阿尔茨海默病的小鼠模型中，如tau模型、APP模型、分泌酶模型、ApoE基因模型和轴突运输模型;或例如，在帕金森病的动物模型中；或者例如，在亨廷顿病的动物模型中。需要进一步的试验以评估粗品咖啡因或其级分对器官型大脑切片培养物或神经组织培养制剂的神经保护活性。数据支持临床（人体）测试以确定这些提取物用于神经保护活性和治疗患有或处于发展痴呆和年龄相关的认知衰退风险中的人类受试者的痴呆和年龄相关的认知衰退的疗效和最佳剂量。

剂量

在人群的50％中产生特定的效果所需要的药物剂量为半数有效量，简称ED₅₀。在药物的临床前研究中，在实验动物中确定的半数致死量简称LD₅₀。LD₅₀和ED₅₀的比表示治疗指数，治疗指数是药物产生希望效果与其不利影响的选择性的大小。具有高治疗指数的药物是优选的。

提取物的剂量需要考虑ED₅₀、LD₅₀和治疗指数以及要说明的下列事项。膳食酚的总摄入量为约1克/天。在消耗10-100mg的单一的酚化合物后最大血浆浓度在0.1-10 μmol/L 的范围内。

食物、药物、化妆品、膳食补充剂、或生物产品包含约0.05重量％的提取物、约0.1重量％的提取物、约1重量％的提取物、约5重量％的提取物、约10重量％的提取物、约15重量％的提取物、约20重量％的提取物、约25重量％的提取物、约30重量％的提取物、约35重量％的提取物、约40重量％的提取物、约45重量％的提取物、约50重量％的提取物、约55重量％的提取物、约60重量％的提取物、约65重量％的提取物、约70重量％的提取物、约75重量％的提取物、约80重量％的提取物、约85重量％的提取液、约90重量％的提取物、约95重量％的提取物、或约99重量％的提取物。

食品制造

根据FD＆C法案第201（s）部分定义食品添加剂为目标用途是直接或间接导致或可适度期望导致成为影响任何食物特性的成分或以其他方式影响任何食物特性的任何物质（包括旨在用于生产、制造、包装、加工、准备、处理、包封、运输、或盛装食物的任何物质；并且包括任何旨在用于任何此用途的辐射源）；如果这种物质不是GRAS或1958之前批准的或者从食品添加剂的定义中排除。

“GRAS”是公认安全的短语的首字母缩写。根据FD＆C法案的第201（s）和409部分，故意添加于食物的任何物质是上市前由FDA审查和批准的食品添加剂，除非有资格的专家普遍认可该物质在其预定用途条件下已完全显示为安全的，或者除非该物质的用途以其他方式从食品添加剂的定义中排除。

化妆品制造

根据FD＆C法案，化妆品成分由用于化妆品成分标注目的的委员会建立的名称确定，或在不存在该委员会建立的名称的情况下，由适合以下纲要版本和补充中的成分的名称确定：（a）CTFA（化妆品、盥洗品和香水协会）化妆品成分字典;（b）美国药典（c）国家处方集（d）食品化学法典；及（e）药物名称的USAN和USP药典。如果没有列出成分的名称，然后使用一般得到消费者认可的名称或化学或技术名称或说明。

膳食补充剂制造

膳食补充剂中的成分类型典型地包括其他食物成分（例如，水和糖），和技术添加剂或加工助剂（例如明胶、淀粉、色素、稳定剂、防腐剂、和调味剂）。

实施例1

化学品。除非另有规定，所有试剂均购自Sigma-Aldrich(St. Louis, MO)。 高效液相色谱（HPLC）级水购自EMD(Gibbstown, NJ)，2,2’- 偶氮双(2-脒基丙烷)二盐酸盐（ABAP）购自Wako Chemicals USA (Richmond, VA)。随机甲基化β-环糊精（RMCD; Trappsol，医药级）购自Cyclodextrin Technologies Development (High Springs, FL)。磷酸盐缓冲盐水（PBS），Williams培养基E（WME）和汉克平衡盐溶液（HBSS）均购自Gibco Life Technologies (Grand Island, NY)。胎牛血清（FBS）购自Atlanta Biologicals (Lawrenceville, GA)。花生四烯酸和COX-2酶均购自Cayman Chemical (Ann Arbor, MI)。TNF-a 购自Biomyx Technology (San Diego, CA)。必需培养基（11090081）和神经基础培养基（21103049）均购自Invitrogen (Carlsbad, CA)。粗品咖啡因购自Maximus Coffee Group (Houston, TX)。氧生物传感器系统（OBS）（特制的钌染料覆盖96孔微量板）购自BD Biosciences Discovery Labware (Bedford, MA)。

粗品咖啡因。粗品咖啡因是作为超临界二氧化碳（scCO₂）脱咖啡因过程的副产物产生的。简单地说，生咖啡豆浸泡在水中直到水分含量为50％。在高温（90-100℃）和高压（300atm）下在提取器中通过液态二氧化碳除去咖啡因。液态二氧化碳在提取器和洗涤器之间再循环，其中用水将液态二氧化碳中的咖啡因除去。然后将所得的富含咖啡因的水溶液通过反渗透浓缩并真空干燥。Silliker, Inc. (South Holland, IL)对粗品咖啡因近似组成进行了分析。

总酚类物质。根据Singleton 和 Rossi的方法测定粗品咖啡因的总多酚含量(Singleton, V. L. and Rossi, J. A., Jr., Am. J. Enol. Vitic. 1965, 16, 144-158)。1毫升的氯原酸标准品或粗品咖啡因溶液与15mL水和1.0mL Folin-Ciocalteu试剂混合，然后在室温下孵育10min。在加入20％的碳酸钠（3.0mL）并在40℃下孵育20分钟之后，用Agilent8453紫外-可见分光光度计(Waldbronn, Germany) 在755 nm处测定吸光度。用每克粗品咖啡因的氯原酸毫克当量（CE/g）来表示总多酚含量。

氧自由基吸收能力。为了确定亲水性级分的抗氧化值（ORAC_hydro），在室温下在定轨摇床上用20ml丙酮/水（50:50v/v）萃取5g粗品咖啡因1小时。混合物以1972×g在Rotanta 460R离心机(GML Ramsey, MN)中进行离心。上清液的ORAC_hydro值采用改编自Ou的方法(Ou, B. et al., Journal of Agricultural and Food Chemistry 2001, 49, 4619-4626)在由KC4 3.0软件控制的FL600荧光读板机(Bio-Tek Instruments, Inc., Winooski, VT)上进行测定。激发波长设定为485（±20）nm和发射波长设定为530（±25）nm。为了测定亲脂性级分的抗氧化值（ORAC_lipo），用10ml己烷/二氯甲烷（50:50，v/v）萃取5g粗品咖啡因2次。根据先前已经公开的方法测定合并的有机相的ORAC值(Wu, X. et al.， Journal of Agricultural and Food Chemistry 2004, 52, 4026-4037; Huang, D. et al., Journal of Agricultural and Food Chemistry 2002, 50, 1815-1821)。

原代皮质神经元培养。原代神经元细胞培养物产生自出生后0天的C57BL/6小鼠。在汉克平衡盐溶液中除去皮质，通过在37℃下在木瓜蛋白酶中孵育30分钟进行分离。将分离的细胞接种到聚-L-赖氨酸涂敷的塑料板(Corning, Corning, NY)的最小必需培养基中，并用5％CO₂在37℃下孵育4小时。然后将培养基改为用B-27和L-谷氨酰胺补充的神经基础培养基。为了减少神经胶质细胞的增殖，将1μΜ5-氟-2’-脱氧尿苷（FdU）也添加到培养基中。4天后，将培养基替换为没有FdU的神经基础培养基，并允许细胞额外生长4天。所有实验均在体外培养8天的细胞上进行。免疫细胞化学表明，大于90％的培养细胞为神经元。

细胞存活。使用3-（4,5 - 二甲基噻唑-2-基）-2,5 - 二苯基四唑鎓溴化物（MTT）试验量化细胞的存活率，其检测线粒体琥珀酸脱氢酶将MTT转变成紫色的甲臜(Mosmann, T., Journal of Immunological Methods 1983, 65, 55-63; Cheng, I. H. et al., Nature Medicine 2004, 10, 1190-1192)。将细胞接种到96孔板中（10⁵个细胞/孔），并在实验前生长24小时。用0、250、500、或1000μg/mL粗品或纯咖啡因对细胞进行预处理2小时。然后将培养基除去，并用新鲜培养基洗涤细胞。然后在37℃，5％CO₂下，用过氧化氢（H₂O₂，0-1000μΜ）处理细胞30分钟。然后在37℃下在含有MTT的培养基中(0.5 mg/mL; Genemark, Taiwan)孵育细胞4小时。除去培养基之后，向各个孔加入含有10％的SDS和20mM盐酸的100μL裂解液以溶解甲臜晶体，并在KC4 3.0软件控制的FL600读板机(Bio-Tek Instruments, Inc., Winooski, VT)上测定各个孔的吸光度（570 nm）。细胞存活百分比的计算方式是(OD_{570 经处理}/OD_{570 未经处理})xl00%。

葡萄糖摄取。使用人体脂肪细胞和骨骼肌细胞评估粗品咖啡因对葡萄糖摄取的体外影响(Zen-Bio, Research Triangle Park, NC)。简单地说，原代人类皮下脂肪细胞或原代成肌细胞在96孔微量板中进行分化。在³H-2-脱氧葡萄糖存在下，用粗品咖啡因（最终浓度0.001-0.5 mg/mL）处理所得的脂肪细胞（分化后2周）或骨骼肌细胞（分化后10天）；用胰岛素（100nM）处理过的细胞作为阳性对照使用和未经处理的细胞作为阴性对照使用。包括阳性和阴性对照的所有样品一式三份进行测试。在37℃和5％CO₂中孵育2小时后，用PBS将细胞洗涤并裂解。将细胞裂解物与闪烁液混合，以每分钟计数（CPM）测定各个孔的放射活性。

COX-2抑制作用。耗氧量是在37℃在Oxytherm的反应室(Hansatech Instrumental, Norfolk, England)测定的。将由0.5 mLTris缓冲液（0.1M，pH 8.0）、 5μl血红素[100μΜ在二甲基亚砜（DMSO）中]和10 μL COX-2酶组成的反应混合物孵育1分钟。加入5微升各样品（在DMSO或乙醇中）并将混合物另外孵育1分钟。通过加入5 μL的花生四烯酸启动试验并监测氧浓度。初始耗氧率由动力学曲线获得。用初始耗氧率减少50％（IC₅₀）的抑制剂浓度表示COX-2抑制作用。

与α-生育酚混合的生物活性化合物的协同效应。亚油酸甲酯（1.2克）、吐温20（2.9克）、正丁醇（1.5克）、和磷酸钾缓冲液（4.4克）在15毫升的测试管中涡旋直到所得溶液澄清。用Trolox溶液标准品（20 μL; 500、250、125、62.5、或31.25μM）的双份孔和稀释于磷酸盐缓冲液（20μL）中的样品的三份孔制备OBS微量板。边界孔没有用于动力学研究，以避免潜在的边缘效应。然后加入氧化物质，亚油酸甲酯微乳液（200μL）。向每孔加入20 μL 2,2’- 偶氮双（2 - 脒基丙烷）二盐酸盐（AAPH，在磷酸盐缓冲液中0.20 g/mL）之前，将板在37℃下孵育10分钟；每孔的终体积为240 μL。含200 μL微乳液和40 μL磷酸盐缓冲液的对照孔用于标准化荧光读数。在37℃下，通过Synergy HT荧光微量板读数器(Biotek Instruments Inc.)在2小时中每2分钟读数一次，对反应动力学进行监测。该微量板读数器装配有485 nm的感光滤光片，590nm的发射滤光片，和氧传感器生物系统，并且在每次读数之前板在低强度振摇20秒以确保充分混合。标准化之后，将荧光数据转换为反应中每个点的氧浓度。如前所述对样品的ORAC值进行了测定(Sim, W. L. S. et al., Journal of Agricultural and Food Chemistry 2009, 57, 3409-3414)。采用相对ORAC值表示样品的协同效应，计算方法如下：100％×[1+（混合物的ORAC -各组分的ORAC的总和）/混合物的ORAC] (Sim, W. L. S. et al., Journal of Agricultural and Food Chemistry 2009, 57, 3409-3414)。

通过液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）进行粗品咖啡因化合物的活性引导分级和结构鉴定。从超临界二氧化碳脱咖啡因获得的粗品咖啡因被进一步处理，以减少咖啡因和增加多酚类物质。由于粗品咖啡因是真空干燥的，其再悬浮于水中。 在室温下，用70mL水搅拌1 g粗品咖啡因15分钟以形成悬浮液。此悬浮液中的水不溶性颗粒（WIP）通过0.45-μm ZapCap-CR尼龙过滤器(Whatman Inc., Piscataway, NJ)过滤收集，并在室温下真空干燥。总质量产率为1.1％。如前所述对干燥WIP的近似组成、ORAC和总酚含量进行分析。

然后用Yamazen快速色谱系统AI-580 (San Bruno, CA)进行30 mg WIP的分级，该系统由梯度泵、设置在254nm的紫外检测器、级分收集器（FR340）和16×60mm LuknovaC18柱(Mansfield, MA)。用水和甲醇从柱中洗脱样品；17分钟内水/甲醇混合物的变化范围为9:1至15:85，流速为10 mL/min。收集第17级分（10 ml/级分），并真空干燥和测定ORAC值。

由具有Shimadzu HPLC系统的LC-MS(泵: LC-20AT; 自动取样器: SIL-HTC; 紫外检测器: SPD-20A; Columbia, MD)进一步分析高ORAC值的级分，所述系统装备有MAC-MOD HydroBond^TM PS-C18柱(50 x 2.1 mm, 3 μm; MAC-MOD Analytical, Chadds Ford, PA)。流动相A由0.4％甲酸水溶液组成，和流动相B为乙腈。在室温下样品（10μL）以0.6 mL/min的流速通过HPLC分离。流动相B的百分比在前3min内从0％增加至70％，在下一个0.5min内增加至95％，在下一个0.5min内增加至98％，然后维持在98％达1.5min。然后流动相B的百分比在0.1分钟内下降到0％，维持在0％达5min以使柱重新平衡。

由AB/MDS SCIEX 4000 Q-trap检测器(Foster City, CA)进行检测，其中ESI电离源为负离子模式，离子喷雾电压为4500 V并且温度为550℃。多反应监测（MRM）用于化学检测。质谱是通过将每个分子结构分裂为独特模式的碎片（化学指纹图谱）来区分具有相同的分子量的化学物质。用MRM技术，通过同时检测分子离子和碎片离子可阐明目标化学结构。

统计学分析。通过单因素方差分析（ANOVA）对数据进行分析，然后采用PASW Statistics 18(Chicago, IL)通过Tukey事后比较测试进行分析。结果表示为平均值±标准偏差（SD）。P <0.05可认为是统计学显著的。

粗品咖啡因近似组成的结果。咖啡生产过程中，生物活性化合物出现在粗品咖啡因中（图6）。通过超临界二氧化碳(_SCCO₂)萃取对咖啡进行脱咖啡因（图7）。对由_SCCO₂脱咖啡因生产的粗品咖啡因进行了评估。

表1示出粗品咖啡因的近似组成。主要成分为咖啡因（95.95％）、水分（1.10％）、和脂肪（1.04％）;灰分、纤维、蛋白质和糖的量可以忽略不计。

我们用Folin-Ciocalteu试验确定了粗品咖啡因中酚类物质的存在，并且发现总酚水平为10 mg CE/g （表2），或约粗品咖啡因的1质量％。

粗品咖啡因的抗氧化活性结果。对于粗品咖啡因的亲水性和亲脂性级分的抗氧化活性进行了评估。我们发现ORAC_hydro是145μmol TE/g和ORAC_lipo是66 μmol TE/g，而纯咖啡因则涉及极低ORAC_hydro(6 μmol TE/g)和ORAC_lipo(0 μmol TE/g)（表2 ）。

对粗品咖啡因的体外抗氧化活性的生物相关性进行了评估。在H₂O₂诱导的氧化应激前，用粗品咖啡因对原代皮质神经元细胞进行预处理。图8A表明H₂O₂以剂量依赖的方式减少细胞的存活。纯咖啡因对于原代神经元细胞没有毒性，但没有防止过氧化氢诱导的细胞死亡。类似地，图8B示出了粗品咖啡因对于原代神经元细胞是没有毒性的，但并不能防止过氧化氢诱导的细胞死亡，即使粗品咖啡因的ORAC值比纯咖啡因的ORAC值高得多（表2）。

葡萄糖摄取的结果。通过粗品咖啡因对人骨骼肌细胞和脂肪细胞的葡萄糖摄取的抗高血糖作用进行测定，使用胰岛素作为阳性对照。在人骨骼肌细胞中，100nM胰岛素刺激葡萄糖摄取增加2.06倍，虽然效果低于胰岛素，但0.01 mg/mL的粗品咖啡因显著增加葡萄糖摄取1.45倍（图9）。相比之下，0.01 mg/mL纯咖啡因没有产生显著的效果。令人惊讶的是，在人脂肪细胞中，粗品咖啡因比胰岛素更有效地刺激葡萄糖摄取：0.01 mg/mL的粗品咖啡因诱导葡萄糖摄取增加2.20倍，而100nM的胰岛素诱导增加1.6倍。纯咖啡因（0.01 mg/mL）对葡萄糖摄取没有产生显著的效果。通过单因素ANOVA分析数据，然后进行Tukey事后测试以进行多重比较来分析数据。结果表示为平均值±SD。与未处理的人骨骼肌细胞相比*P < 0.05;与未处理的人脂肪细胞相比** P <0.05。这些数据表明，粗品咖啡因会刺激人脂肪和肌肉细胞的葡萄糖摄取。

COX-2抑制的结果。通过确定粗品咖啡因对炎症酶COX-2的作用来评价粗品咖啡因的抗炎活性，用阿司匹林作为阳性对照。粗品咖啡因抑制COX-2的活性；IC₅₀值为20μg/mL，低于阿司匹林（IC₅₀，90μg/mL）9.5倍（图10），这表明与阿司匹林相比粗品咖啡因是一种更有效的COX-2抑制剂。与此相反，普通咖啡的活性（IC₅₀，2010μg/mL）比阿司匹林小10倍左右。纯咖啡因并不能抑制COX-2的活性。通过单因素ANOVA分析数据，然后进行Tukey事后测试以进行多重比较来分析数据。结果表示为平均值±SD。与阿司匹林相比，* P <0.05。这些数据表明，粗品咖啡因抑制炎症酶COX-2。

粗品咖啡因中非咖啡因生物活性物质的结果。我们观察到混合粗品咖啡因（1g）和水（70mL）产生精细的棕红色水不溶性颗粒（WIP）的水悬浮液，并可以过滤分离（图11）。该WIP级分只含有1.6％的咖啡因，小于粗品咖啡因约60倍（表2）。我们用Folin-Ciocalteu试验确定WIP级分中酚类物质的存在，发现总酚水平是313 mg CE/g（表2），或WIP级分的约30质量％。我们发现ORAC_hydro是1321μmol TE/g和ORAC_lipo为332μmol TE/g，分别高于粗品咖啡因值的约9倍和5倍（表2）。另外，WIP含有约21％的脂肪，这是它悬浮而不是溶解在水中的主要原因。更重要的是，我们评估WIP在小鼠原代神经元细胞中的抗氧化活性。我们发现，WIP显示没有毒性和以剂量依赖的方式显著改善H₂O₂引发的氧化应激的细胞死亡（图12）。WIP（1000μg/mL）提高H₂O₂（250-1000μM）处理的小鼠原代神经元细胞的存活率约3.5倍。这些数据表明，除了是浓缩抗氧化剂和增强神经保护活动之外，分离WIP减少了咖啡因和增加了多酚类物质。

活动引导的分级和生物活性化合物鉴定的结果。我们进行了WIP的抗氧化活性引导的分级和LC-MS分析。通过快速色谱在C-18柱上将WIP分离为17个级分，并测定各级分的ORAC_hydro（表3）。级分4和5表现出最高的抗氧化能力分别为总ORAC_hydro 的26.4％和41.0％（表3）;并因此进行了LC-MS分析。

在两个级分中确定了7种化学物质（表4）：咖啡酸、香豆酸、香草酸、槲皮素、儿茶素、脱落酸葡萄糖酯和苏氨酸（图13）。

协同作用的结果。我们确定了粗品咖啡因和WIP与其他的生物抗氧化剂相组合时的协同效应。使用适合亚油酸盐微乳液体系的ORAC试验(Sim, W. L. S.; et al., Journal of Agricultural and Food Chemistry 2009, 57, 3409-3414)，我们确定了α-生育酚（维生素E的一种形式）与粗品咖啡因、WIP、抗坏血酸、儿茶素、氯原酸、WIP+儿茶素或WIP+氯原酸相组合的抗氧化活性（表5）。数据表示为相对ORAC：100％的相对ORAC表示该混合物的抗氧化活性相当于每个组分的抗氧化活性的总和（累加效应），而大于100％的相对ORAC表示混合物的抗氧化活性大于每个组分的抗氧化活性的总和（协同效应）。我们发现粗品咖啡因和抗坏血酸与α-生育酚的组合产生累加抗氧化作用（表5）。与此相反，WIP、儿茶素和氯原酸与α-生育酚的组合产生了协同效应。这些数据表明，WIP与α-生育酚组合使用时产生协同效应。

这些实施例和实施方案是说明性的，不应理解为限制本发明的范围，本发明的范围由本说明书和所附的权利要求书所定义。在本说明书中引用的所有文献都引入本文作为参考。

表1. 粗品咖啡因的近似组成

表2. 咖啡因、粗品咖啡因和粗品咖啡因水溶性颗粒(WIP)之间的比较

TE，Trolox当量；CE，氯原酸当量。

表3. 通过快速色谱分离的粗品咖啡因级分的抗氧化活性

TE，Trolox当量；ORAC，氧自由基吸收能力；ND，不可检测。

表4. 级分4和5中抗氧化剂的质谱鉴定

表5. 通过相对氧自由基吸收能力量化的组合抗氧化剂的抗氧化活性

ORAC，氧自由基吸收能力；WIP，水溶性颗粒。

Claims (30)

1.一种含有食物产品的物质组合物，所述食物产品包括从粗品咖啡因回收的植物化学级分，所述植物化学级分中多酚类物质与咖啡因的比例为约20、10-30或40，或大于10。

2.如权利要求1所述的物质组合物，其中所述植物化学级分是粗品咖啡因水悬浮液的过滤过程的渗余物，并且其中所述粗品咖啡因是生咖啡豆脱咖啡因过程的产物。

3.一种生产食物产品的方法，其包括用从粗品咖啡因中回收的植物化学级分补充食物或补充食物组分，所述植物化学级分为权利要求1或2所述的植物化学级分，由此生产所述食物产品。

4.一种含有药物产品的物质组合物，所述药物产品包括从粗品咖啡因回收的植物化学级分，所述植物化学级分中多酚类物质与咖啡因的比例为约20、10-30或40，或大于10。

5.如权利要求4所述的物质组合物，其中所述植物化学级分是粗品咖啡因水悬浮液的过滤过程的渗余物，并且其中所述粗品咖啡因是生咖啡豆脱咖啡因过程的产物。

6.一种生产药物产品的方法，其包括用从粗品咖啡因中回收的植物化学级分补充药物或补充药物组分，所述植物化学级分为权利要求4或5所述的植物化学级分，由此生产所述药物产品。

7.一种含有化妆品产品的物质组合物，所述化妆品产品包括从粗品咖啡因回收的植物化学级分，所述植物化学级分中多酚类物质与咖啡因的比例为约20、10-30或40，或大于10。

8.如权利要求7所述的物质组合物，其中所述植物化学级分是粗品咖啡因水悬浮液的过滤过程的渗余物，并且其中所述粗品咖啡因是生咖啡豆脱咖啡因过程的产物。

9.一种生产化妆品产品的方法，其包括用从粗品咖啡因中回收的植物化学级分补充化妆品或补充化妆品组分，所述植物化学级分为权利要求7或8所述的植物化学级分，由此生产所述化妆品产品。

10.一种含有膳食补充剂产品的物质组合物，所述膳食补充剂产品包括从粗品咖啡因回收的植物化学级分，所述植物化学级分中多酚类物质与咖啡因的比例为约20、10-30或40，或大于10。

11.如权利要求10所述的物质组合物，其中所述植物化学级分是粗品咖啡因水悬浮液的过滤过程的渗余物，并且其中所述粗品咖啡因是生咖啡豆脱咖啡因过程的产物。

12.一种生产膳食补充剂产品的方法，其包括用从粗品咖啡因中回收的植物化学级分补充膳食补充剂或补充膳食补充剂组分，所述植物化学级分为权利要求10或11所述的植物化学级分，由此生产所述膳食补充剂产品。

13.一种含有生物产品的物质组合物，所述生物产品包括从粗品咖啡因回收的植物化学级分，所述植物化学级分中多酚类物质与咖啡因的比例为约20、10-30或40，或大于10。

14.如权利要求13所述的物质组合物，其中所述植物化学级分是粗品咖啡因水悬浮液的过滤过程的渗余物，并且其中所述粗品咖啡因是生咖啡豆脱咖啡因过程的产物。

15.一种生产生物产品的方法，其包括用从粗品咖啡因中回收的植物化学级分补充生物制品或补充生物制品组分，所述植物化学级分为权利要求13或14所述的植物化学级分，由此生产所述生物产品。

16.一种促进神经保护的方法，所述方法包括：

a. 确定人类受试者需要神经保护；和

b. 将一定量的权利要求1、2、4、5、7、8、10、11、13或14 中的组合物施用于所述受试者以有效促进神经保护。

17.一种促进神经保护的方法，所述方法包括：

a. 将一定量的权利要求1、2、4、5、7、8、10、11、13或14 中的组合物施用于人类受试者以有效促进神经保护；和

b.检测所述受试者中的神经保护。

18.一种抑制COX-2的方法，所述方法包括：

a. 确定人类受试者需要抑制COX-2；和

b. 将一定量的权利要求1、2、4、5、7、8、10、11、13或14 中的组合物施用于所述受试者以有效抑制COX-2。

19.一种抑制COX-2的方法，所述方法包括：

a. 将一定量的权利要求1、2、4、5、7、8、10、11、13或14 中的组合物施用于人类受试者以有效抑制COX-2；和

b.检测所述受试者中的COX-2的抑制。

20.一种刺激葡萄糖摄取的方法，所述方法包括：

a. 确定人类受试者需要刺激葡萄糖摄取；和

b. 将一定量的权利要求1、2、4、5、7、8、10、11、13或14 中的组合物施用于所述受试者以有效刺激葡萄糖摄取。

21.一种刺激葡萄糖摄取的方法，所述方法包括：

a. 将一定量的权利要求1、2、4、5、7、8、10、11、13或14 中的组合物施用于人类受试者以有效刺激葡萄糖摄取；和

b.检测所述受试者中的葡萄糖摄取的刺激。

22.一种治疗痴呆或年龄相关的认知衰退的方法，所述方法包括：

a. 确定人类受试者需要治疗痴呆或年龄相关的认知衰退；和

b. 将一定量的权利要求1、2、4、5、7、8、10、11、13或14 中的组合物施用于所述受试者以有效治疗痴呆或年龄相关的认知衰退。

23.一种治疗痴呆或年龄相关的认知衰退的方法，所述方法包括：

a. 将一定量的权利要求1、2、4、5、7、8、10、11、13或14 中的组合物施用于人类受试者以有效治疗痴呆或年龄相关的认知衰退；和

b. 检测所述受试者中的痴呆或年龄相关的认知衰退的治疗。

24.一种抑制炎症的方法，所述方法包括：

a. 确定人类受试者需要抑制炎症；和

b. 将一定量的权利要求1、2、4、5、7、8、10、11、13或14 中的组合物施用于所述受试者以有效抑制炎症。

25.一种抑制炎症的方法，所述方法包括：

a. 将一定量的权利要求1、2、4、5、7、8、10、11、13或14 中的组合物施用于人类受试者以有效抑制炎症；和

b. 检测所述受试者中的炎症的抑制。

26.一种治疗糖尿病的方法，所述方法包括：

a. 确定人类受试者需要治疗糖尿病；和

b. 将一定量的权利要求1、2、4、5、7、8、10、11、13或14 中的组合物施用于所述受试者以有效治疗糖尿病。

27.一种治疗糖尿病的方法，所述方法包括：

a. 将一定量的权利要求1、2、4、5、7、8、10、11、13或14 中的组合物施用于人类受试者以有效治疗糖尿病；和

b. 检测所述受试者中的糖尿病的治疗。

28.如权利要求16、17、22或23所述的方法，其中所述确定步骤或检测步骤是通过神经心理测试进行的。

29.如权利要求18、19、24或25所述的方法，其中所述确定步骤或检测步骤是通过风湿病学标准进行的。

30.如权利要求20、21、26或27所述的方法，其中所述确定步骤或检测步骤是通过血糖浓度进行的。

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