CN103293260B

CN103293260B - 一种食品中罗丹明b高效检测方法及快速检测试剂盒

Info

Publication number: CN103293260B
Application number: CN201210045581.1A
Authority: CN
Inventors: 李�昊
Original assignee: FUJIAN LANHAO BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: Fujian Lanhaobio Tech Co ltd
Priority date: 2012-02-25
Filing date: 2012-02-25
Publication date: 2014-12-03
Anticipated expiration: 2032-02-25
Also published as: CN103293260A

Abstract

本发明具体涉及一种食品中罗丹明B高效检测方法及快速检测试剂盒。检测方法主要分为三个步骤：第一步，提取食品中的罗丹明B；第二步，净化、富集食品中的罗丹明B；第三步，上机检测。相应试剂盒是由提取剂1、提取剂2和固相萃取柱3部分组成。应用该种方法检测食品中罗丹明B，其检测限可达0.5ppb，外标回收率达85%以上。本发明采用方法及其关键试剂提取剂1和提取剂2对食品进行前处理，使食品中罗丹明B提取更完全并且显著降低了所用试剂的毒性，大大缩短了食品中罗丹明B检测所需要的时间，并提高了检测精度，具有方便、快速、环保（避免有毒试剂的使用），具有较强的可应用和可实现性的优异特点。

Description

一种食品中罗丹明B高效检测方法及快速检测试剂盒

技术领域

本发明具体涉及一种食品中罗丹明B高效检测方法及快速检测试剂盒。

背景技术

罗丹明B，也称玫瑰红B，俗称花粉红，是一种碱性荧光染料。其作为荧光试剂已被广泛用于矿业、环保以及钢铁等领域，是荧光分析常用的试剂，但是，某些食品中却被检查出含有罗丹明B染料。由于，其具有潜在的致癌和致突变性，我国和欧盟等国都不允许在食品中添加使用。因此，对食品进行罗丹明B的检测是及其重要而势在必行的。

对食品中罗丹明B的检测，大都采用高效液相色谱法、液相色谱串联质谱法和气相色谱法，但至今还没有更高效快速的方法报道。我国于2010年颁布的出入境检验检疫行业标准“进出口食品中罗丹明B的检测方法”，就是采用液相色谱检测以及液相色谱-质谱／质谱检测，该方法充分体现出液质联用技术的优势，但是，因其在实际操作中，前处理的方法过于繁琐，特别是ＧＰＣ净化的使用，不仅增加了检测的工作量，而且效率也不很显著，还有有机溶剂的使用，如环己烷，既有毒又有害，大量使用会严重影响环境，不利于环境保护，此种方法因其自身的原因，使其在检测机构中大量的应用受到了限制。最近，还有其他方法，有报道酶联免疫吸附法可用来检测食品中的罗丹明B，此种方法虽然能够大量检测食品中的罗丹明B，但是，其准确度和灵敏度都不及高效液相色谱法、液相色谱串联质谱法和气相色谱法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种操作简单，效果好的食品中罗丹明B高效检测方法及快速检测试剂盒。

本发明首先提供了一种食品中罗丹明B的快速检测试剂盒，包括：

（1）提取剂1：由乙腈、乙酸和甲酸铵组成，其中乙腈所占体积比例为90-99%；乙酸和甲酸铵体积比为1:1；

（2）提取剂2：由中性氧化铝、酸性氧化铝、碱性氧化铝按1:1:1的质量比例组成；

（3）固相萃取柱：固相萃取柱的填料按以下方法制备：将填料PEP、PSA和C18，按质量比2:2:1的比例混合灌柱。

本发明还提供了一种食品中罗丹明B高效检测方法，利用上述的快速检测试剂盒对待测食品样品进行如下步骤检测：

1)取5 g样品于50 mL具塞塑料离心管中，加入20 mL提取剂1，以8000 rpm均质2 min，加入5-10 g提取剂2，振荡1 min，4500 rpm离心10 min；

2) 取5 mL上清液，加入10 mL水稀释，制备成15 mL 样品液；

3) 将15 mL 样品液过固相萃取柱，抽真空，用5 mL体积分数为 20%的乙腈水溶液淋洗；

4) 2 mL 含1-5%（v/v）冰醋酸的乙腈溶液洗脱，洗脱液加入0.5 mL 0.1mol/L 乙酸铵溶液，定容至2.5 mL；

5) 过滤，上机检验，采用高效液相色谱或高效液相色谱-质谱联用技术检测。

所述固相萃取柱的填料按以下方法制备：将填料PEP、PSA和C18按2:2:1的质量比混合，灌柱子60-200 mg；填料的平均粒度50μm，平均孔径60 埃。

所述高效液相色谱的条件为色谱柱：C18柱，粒度 5 μm；流动相：乙腈：5mmol/L乙酸铵水溶液按体积比=75：25；流速，0.2 mL/min；柱温，35 ℃；进样量，10 μL。

其中，提取剂1和提取剂2的联合使用尽可能地提取食品中的罗丹明B，固相萃取柱的使用，不但减少了样品液对机器的离子抑制，而且还大大提高了提取与回收，运用此柱子，可使回收率稳定在85%以上。

本发明涉及的提取剂1和提取剂2的使用，不局限于本发明给出的定量数量，只要按照此配比，可制备成不同的产品形式；固相萃取柱也不局限于本发明中涉及的灌注填料的数量。可以根据提取剂1和提取剂2的使用，配合改变柱子的规格与填料的数量。

本发明涉及的罗丹明B快速检测试剂盒包括提取剂1、提取剂2和固相萃取柱，对样品进行处理，采用该试剂盒的高效检测方法，可快速检测食品中的罗丹明B的含量，包括但不限于腊鱼、腊肉、香肠、果汁、果酱、葱头、糖果、话梅、辣椒粉及饼干等中罗丹明B的测定。其中，测定后的数据用如下方法来计算：

其中：

X 测试样品中罗丹明B的含量，μg/kg；

N 测试样品稀释倍数；

C 标准曲线中获得的样品中罗丹明B的浓度，ng/nL；

C₀标准曲线中获得的空白试验中罗丹明B的浓度，ng/nL；

V 样品溶液最终定容体积，mL；

M 试验样品的质量，g。

应用此种方法检测样品中罗丹明B 的含量，最低检测线可达到0.5 μg/kg，超过现有的其他常用的检测方法接近10倍，由此可见其意义重大。

本发明提供的是一种食品中罗丹明B高效检测方法及快速检测试剂盒，建立了全新的高效的检测食品中罗丹明B的前处理方法，相应的试剂盒大大简化了实验的步骤，只要提取剂1、提取剂2以及固相萃取住的使用，就把前处理简化成3个步骤，对后续的高效液相色谱法、液相色谱串联质谱法进行处理后样品的检测，也使其实验步骤更加简便、快捷，并且避免应用环己烷等有毒有害试剂，不仅节省检测费用，也大大提高了检测的准确性、灵敏度以及更加环保。

附图说明

图1为罗丹明B 标准品 LC-MS 检测图谱；

图2 辣椒粉1#样品中加标罗丹明B的LC-MS 检测图谱；

图3 腊鱼2#样品中加标罗丹明B的LC-MS 检测图谱；

图4 果酱3#样品中加标罗丹明B的LC-MS 检测图谱。

具体实施方式

下面结合代表性的实施例，进一步阐述本发明。这些实施举例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列所有列举实施例所涉及的检测都具有本发明涉及的快速检测方法而不限于所列举功能。

实施例1：

准确称取捣碎的辣椒粉5 g，装入50 mL具塞的塑料离心管中，采用外添加方法加入罗丹明B，浓度为14.4 ng/mL（即每毫升提取液1中添加14.4 ng的罗丹明B），然后加入20ml本发明的提取剂1，以8000 rpm均质2 min，加入5g提取剂2，振荡1 min，4500 rpm离心10 min；用移液器准确取5 mL上清液，用10 mL蒸馏水稀释，制备成15 mL 样品液，备用；将15 mL 样品液过固相萃取柱（LHSPE），抽真空，5 mL 20%乙腈/水溶液淋洗；2 mL 2% 冰醋酸/乙腈洗脱，加入0.5 mL 0.1mol/L 乙酸铵溶液，定容至2.5 mL；采用过滤膜过滤，采用高效液相色谱或高效液相色谱-质谱联用（LC-MS）技术检测，上机检验，色谱条件：C18柱，150 mm×2.1 mm（内径），粒度 5 μm；流动相，乙腈+5 mmol/L 乙酸铵（75+25，V/V）；流速，0.2 mL/min；柱温，35 ℃；进样量，10 μL。获得数据图谱如图2。图1为同样浓度的罗丹明B标准品的数据图谱。根据外标法常用峰面积比值的方法，获得该样品辣椒粉样品编号1# 中罗丹明B的回收率为88.5%。

该实验重复4次，应用同一根本发明涉及的固相萃取柱，获得同样的回收率，柱效不变。

采用的试剂盒如下：

（1）提取剂1：由乙腈、乙酸和甲酸铵组成，其中乙腈所占体积比例为90%；乙酸和甲酸铵各占体积比例为5%、5%；

（3）固相萃取柱：固相萃取柱的填料按以下方法制备：将填料PEP、PSA和C18，按质量比2:2:1的比例混合灌柱。灌柱子60 mg；填料的平均粒度50μm，平均孔径60 埃。

实施例2：

准确称取捣碎的腊鱼5 g，装入50 mL带有塞子的塑料离心管中，采用外添加方法加入罗丹明B，浓度为14.4 ng/mL，然后加入20ml本发明的提取剂1，以8000 rpm均质2 min，加入10g提取剂2，振荡1 min，4500 rpm离心10 min；用移液器准确取5 mL上清液，用10 mL蒸馏水稀释，制备成15 mL 样品液，备用；将15 mL 样品液过固相萃取柱（LHSPE），抽真空，5 mL 20%乙腈/水溶液淋洗；2 mL 2% 冰醋酸/乙腈洗脱，加入0.5 mL 0.1mol/L 乙酸铵溶液，定容至2.5 mL；采用过滤膜过滤，采用高效液相色谱或高效液相色谱-质谱联用（LC-MS）技术检测，上机检验，色谱条件：C18柱，150 mm×2.1 mm（内径），粒度 5 μm；流动相，乙腈+5 mmol/L 乙酸铵（75+25，V/V）；流速，0.2 mL/min；柱温，35 ℃；进样量，10 μL。获得数据图谱如图3。图1为同样浓度的罗丹明B标准品的数据图谱。根据外标法常用峰面积比值的方法，获得该样品腊鱼样品编号2# 中罗丹明B的回收率为90.2%。

（1）提取剂1：由乙腈、乙酸和甲酸铵组成，其中乙腈所占体积比例为99%；乙酸和甲酸铵体积比为1:1；

（3）固相萃取柱：固相萃取柱的填料按以下方法制备：将填料PEP、PSA和C18，按质量比2:2:1的比例混合灌柱。灌柱子100 mg；填料的平均粒度50μm，平均孔径60 埃。

实施例3：

准确称取草莓果酱5 g，装入50 mL带有塞子的塑料离心管中，采用外添加方法加入罗丹明B，浓度为14.4 ng/mL，然后加入20ml本发明的提取剂1，以8000 rpm均质2 min，加入7g提取剂2，振荡1 min，4500 rpm离心10 min；用移液器准确取5 mL上清液，用10 mL蒸馏水稀释，制备成15 mL 样品液，备用；将15 mL 样品液过固相萃取柱（LHSPE），抽真空，5 mL 20%乙腈/水溶液淋洗；2 mL 2% 冰醋酸/乙腈洗脱，加入0.5 mL 0.1mol/L 乙酸铵溶液，定容至2.5 mL；采用过滤膜过滤，采用高效液相色谱或高效液相色谱-质谱联用（LC-MS）技术检测，上机检验，色谱条件：C18柱，150 mm×2.1 mm（内径），粒度 5 μm；流动相，乙腈+5 mmol/L 乙酸铵（75+25，V/V）；流速，0.2 mL/min；柱温，35 ℃；进样量，10 μL。获得数据图谱如图4。图1为同样浓度的罗丹明B标准品的数据图谱。根据外标法常用峰面积比值的方法，获得该样品草莓果酱样品编号3# 中罗丹明B3的回收率为86.1%。

（1）提取剂1：由乙腈、乙酸和甲酸铵组成，其中乙腈所占体积比例为95%；乙酸和甲酸铵体积比为1:1；

（3）固相萃取柱：固相萃取柱的填料按以下方法制备：将填料PEP、PSA和C18，按质量比2:2:1的比例混合灌柱。灌柱子200 mg；填料的平均粒度50μm，平均孔径60 埃。

Claims

1.一种食品中罗丹明B的快速检测试剂盒，包括：

2.一种食品中罗丹明B高效检测方法，其特征在于：利用权利要求1所述的快速检测试剂盒对待测食品样品进行如下步骤检测：

2) 取5 mL上清液，加入10 mL水稀释，制备成15 mL 样品液；

4) 2 mL 含1-5%v/v 冰醋酸的乙腈溶液洗脱，洗脱液加入0.5 mL 0.1mol/L 乙酸铵溶液，定容至2.5 mL；

3.根据权利要求2所述的一种食品中罗丹明B高效检测方法，其特征在于：所述固相萃取柱的填料按以下方法制备：将填料PEP、PSA和C18按2:2:1的质量比混合，灌柱子60-200 mg；填料的平均粒度50μm，平均孔径60埃。

4.根据权利要求2所述的一种食品中罗丹明B高效检测方法，其特征在于：所述高效液相色谱的条件为色谱柱：C18柱，粒度 5 μm；流动相：乙腈：5mmol/L乙酸铵水溶液按体积比=75：25；流速，0.2 mL/min；柱温，35 ℃；进样量，10 μL。