CN102087278A - 罗丹明b的免疫亲和柱-高效液相-质谱联用检测方法 - Google Patents
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Abstract
罗丹明B的免疫亲和柱-高效液相-质谱联用检测方法,属于免疫学检测技术领域。本发明以抗罗丹明B的抗体与四甲氧基硅烷(TMOS)偶联包埋于层析柱中,通过吸附、洗脱达到样品净化的效果,再进行高效液相-质谱联用检测。本发明方法可以简化罗丹明B残留检测的样品处理过程,同时可达到净化浓缩的效果,成本低廉,快速,便携。
Description
技术领域
罗丹明B的免疫亲和柱-高效液相-质谱联用检测方法,具体涉及到免疫层析柱的的制备及实际样品检测,属于免疫学检测技术领域。
背景技术
近年来苏丹红,孔雀石绿事件给我国食品出口贸易带来很大问题,造成我方的很大被动。像苏丹红本为工业染料,而非食品添加色素。但一些不法商人为了牟取高额利润不顾消费者的健康问题,在食品中非法添加这些成本低、色彩鲜艳的工业染料。2008年卫生部发布《食品中可能违法添加的非食用物质和易滥用的食品添加剂品种名单(第一批)》,明确规定苏丹红、碱性橙、酸性橙、罗丹明B类工业染料禁止在食品中添加。所以食品中违禁色素一直是食品安全检测的重点。目前对违禁色素的检测主要侧重在仪器分析,对免疫分析涉及很少。免疫分析基于抗原抗体免疫反应的特异性较于仪器分析其特异性强、灵敏度高,不仅可以大大简化甚至可以省去样品前处理的复杂过程,而且避免了因大量使用溶剂而对环境的污染,再而免疫分析一般不需贵重仪器,具便携性,不需要专门的技术人员,便于推广。因此对违禁色素的免疫分析研究是必不可少的。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有检测技术的缺陷,建立一种方便快速的样品处理方法,并在此基础上建立罗丹明B的检测方法。
本发明的技术方案:一种罗丹明B的免疫亲和柱-高效液相-质谱联用检测方法,以抗罗丹明B的抗体与四甲氧基硅烷TMOS偶联包埋于层析柱中,通过吸附、洗脱达到样品净化的效果,最后通过高效液相-质谱联用检测;
1、罗丹明B免疫亲和柱的制备,步骤为:
(1)取0.2mL的0.04mol/L HCl溶液,0.75mL的去离子水,3.4mL的TMOS(四甲氧基硅烷)混匀。4℃保存2-3min;取出,超声粉碎30min;
(2)取一质量已知的烧杯,吸取20μL罗丹明B抗体溶液,用PBS(0.01mol/L、pH7.4)稀释至1mL,得罗丹明B抗体溶液,4℃保存。
(3)取步骤(1)超声完全后的混合液,吸取其中1mL试样,加入罗丹明B抗体溶液中,混匀,使之凝胶。
(4)待凝胶结束后,烧杯称重,置于37℃恒温烘箱凝胶老化,待凝胶失去初重的50%时,老化过程结束,将老化后的凝胶(约1g)研磨粉碎,装柱。
(5)待柱中凝胶沉积稳定后,用5mL pH7.4、0.01mol/L的PBS预淋洗,洗去未包埋的罗丹明B抗体和其他干扰杂质,最后用5mL pH7.4、0.01mol/L的PBS平衡,即制得罗丹明B的免疫亲和柱。
2、罗丹明B免疫亲和柱的吸附、洗脱:
平衡:10mL pH7.4、0.01mol/L的PBS;
上样:待测的样品溶液;
洗涤:用5mL pH7.4、0.01mol/L的PBS洗涤,再用5mL超纯水洗涤;
洗脱:5mL甲醇洗脱,收集洗脱液待测。
3、高效液相-质谱联用检测,步骤为:
(1)以一定水平的罗丹明B加入辣椒粉样品中,在室温下至少静置15 min;
(2)取上述添加罗丹明B的辣椒粉样品1g,加入10mL含体积百分20%丙酮的正己烷,震摇10 min,静置、过滤使分离出上层清液,残渣加入10mL含体积百分20%丙酮的正己烷重复提取一次,合并2次提取液,混匀;
(3)移取提取液于氮吹仪上吹干,用0.01M PBS重溶,吹干后的样品用0.01M PBS以质量计稀释10倍;
(4)用10mL 0.01M PBS平衡免疫亲和柱;
(5)加样,用5mL 0.01M PBS洗涤,再用5mL超纯水洗涤,洗去未吸附样品;
(6)5mL甲醇溶液洗脱柱上样品,收集洗脱液;
(7)洗脱液经0.22 μm孔径的聚四氟乙烯膜过滤后进行高效液相-质谱联用检测。
本发明的有益效果:本发明方法可以简化罗丹明B残留检测的样品处理过程,同时可达到净化浓缩的效果,成本低廉,快速,便携。
附图说明
图1罗丹明B标准溶液质谱标准曲线图。
具体实施方案
1、罗丹明B免疫亲和柱的制备:
(1)取0.2mL的0.04mol/LHCl溶液,0.75mL的去离子水,3.4mL的TMOS(四甲氧基硅烷)混匀。4°C保存2-3min;取出,超声粉碎30min;
(2)取一质量已知的烧杯,吸取20μL罗丹明B抗体溶液,用PBS(0.01mol/L、pH7.4)稀释至1mL,得罗丹明B抗体溶液,4°C保存。
(3)取步骤(1)超声完全后的混合液,吸取其中1mL试样,加入罗丹明B抗体溶液中,混匀,使之凝胶。
(4)待凝胶结束后,烧杯称重,置于37°C恒温烘箱凝胶老化,待凝胶失去初重的50%时,老化过程结束,将老化后的凝胶(约1g)研磨粉碎,装柱。
(5)待柱中凝胶沉积稳定后,用5mL pH7.4、0.01mol/L的PBS预淋洗,洗去未包埋的罗丹明B抗体和其他干扰杂质,最后用5mL pH7.4、0.01mol/L的PBS平衡,即制得罗丹明B的免疫亲和柱。
2、罗丹明B免疫亲和柱的吸附、洗脱:
平衡:10mL pH7.4、0.01mol/L的PBS;
上样:待测的样品溶液;
洗涤:用5mL pH7.4、0.01mol/L的PBS洗涤,再用5mL超纯水洗涤;
洗脱:5ml甲醇洗脱,收集洗脱液待测。
3、高效液相-质谱联用检测,步骤为:
取辣椒粉1g于50mL离心管中,加一定浓度的罗丹明标准品,震荡混匀。加入10mL含20%丙酮的正己烷,震摇10min,静置或过滤使分离出上层清液,残渣加入10mL含20%丙酮的正己烷重复提取一次,合并2次提取液,混匀。于氮吹仪上吹干,用0.01M PBS重溶,样品用0.01M PBS稀释10倍,得样品提取液。用10mL PBS平衡免疫亲和柱柱后,加样,用5mL PBS洗涤,再用5mL超纯水洗涤,洗去未吸附样品。5mL甲醇溶液洗脱柱上样品,收集洗脱液,洗脱液经0.22 μm孔径的聚四氟乙烯膜过滤后进行高效液相-质谱联用检测。
4、试验结果如下:
(1)免疫亲和柱偶联率
罗丹明B多克隆抗体与四甲氧基硅烷偶联后,用PBS多次淋洗,洗去未偶联上的罗丹明B抗体,收集洗涤液,通过紫外测定计算偶联率如表1。
表1 抗体偶联率
抗体量(μg) | 偶联率(%) | |
抗体总量 | 40 | - |
偶联的抗体 | 33.1 | 82.7 |
未偶联的抗体 | 6.9 | 17.3 |
(2)柱容量及重复性绝对柱容量为免疫柱中活性抗体的总量,一般用免疫柱对抗原的最大吸附量来表示。本实施例加入的抗体量为40μg,偶联上的活性抗体量为33.1μg,抗体的相对分子量通常认为1.5×105Da,理想条件下每个抗体可以结合2个抗原,因此计算的偶联了33.1μg罗丹明B抗体的免疫亲和柱的柱容量为211ng的罗丹明B。
实施例中的洗脱液为甲醇,而甲醇对抗体有破坏作用,所以每次用完的免疫亲和柱都需要用PBS恢复,4次使用后其柱容量便降低到30ng的罗丹明B。但本施例的目的是建立罗丹明B的痕量残留检测,所以至少能够重复使用4次。
(3)添加回收
表2 添加回收率及重复性测试
Claims (1)
1.一种罗丹明B的免疫亲和柱-高效液相-质谱联用检测方法,其特征在于以抗罗丹明B的抗体与四甲氧基硅烷TMOS偶联包埋于层析柱中,通过吸附、洗脱达到样品净化的效果,最后通过高效液相-质谱联用检测;
A、罗丹明B的免疫亲和柱的制备,步骤为:
(1)取0.2mL的0.04mol/L HCl溶液,0.75mL的去离子水,3.4mL的四甲氧基硅烷TMOS混匀,4℃保存2-3min;取出,超声粉碎30min;
(2)取一质量已知的烧杯,吸取20μL罗丹明B抗体,用pH7.4、0.01mol/L PBS稀释至1mL,得罗丹明B抗体溶液,4℃保存;
(3)取步骤(1)超声完全后的混合液,吸取其中1mL试样,加入罗丹明B抗体溶液中,混匀,使之凝胶;
(4)待凝胶结束后,烧杯称重,置于37℃恒温烘箱凝胶老化,待凝胶失去初重的50%时,老化过程结束,将1g老化后的凝胶研磨粉碎,装柱;
(5)待柱中凝胶沉积稳定后,用5mL pH7.4、0.01mol/L的PBS预淋洗,洗去未包埋的罗丹明B抗体和其他干扰杂质,最后用5mL pH7.4、0.01mol/L的PBS平衡,即制得罗丹明B的免疫亲和柱;
B、罗丹明B的免疫亲和柱的吸附、洗脱:
平衡:10mL pH7.4、0.01mol/L的PBS;
上样:待测的样品溶液;
洗涤:用5mL pH7.4、0.01mol/L的PBS洗涤,再用5mL超纯水洗涤;
洗脱:5mL甲醇洗脱,收集洗脱液待测;
C、高效液相-质谱联用检测,步骤为:
(1)以一定水平的罗丹明B加入辣椒粉样品中,在室温下至少静置15 min;
(2)取上述添加罗丹明B的辣椒粉样品1g,加入10mL含体积百分20%丙酮的正己烷,震摇10 min,静置、过滤使分离出上层清液,残渣加入10mL含体积百分20%丙酮的正己烷重复提取一次,合并2次提取液,混匀;
(3)移取提取液于氮吹仪上吹干,用0.01M PBS重溶,吹干后的样品用0.01M PBS以质量计稀释10倍;
(4)用10mL 0.01M PBS平衡免疫亲和柱;
(5)加样,用5mL 0.01M PBS洗涤,再用5mL超纯水洗涤,洗去未吸附样品;
(6)5mL甲醇溶液洗脱柱上样品,收集洗脱液;
(7)洗脱液经0.22 μm孔径的聚四氟乙烯膜过滤后进行高效液相-质谱联用检测。
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