CN101655480A - 一种快速检测黄曲霉毒素含量的方法 - Google Patents
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Abstract
一种快速检测黄曲霉毒素含量的方法，包括农副产品的粉碎、萃取和纯化以及检测，所述的检测是色－质联用检测法，色谱条件：色谱柱：Waters Symmetry C18柱(2.1×150mm，3.5μm)；流动相A：10mM乙酸水溶液；流动相B：100％甲醇；柱温40℃；流速0.2~1ml/min；梯度程序：B在0min为50％，在0～10min增至90％，在10～15min从90％降低为50％；质谱条件：采用电喷雾(ESI)正离子模式，通过全离子扫描(Full scan)确定AFB1、AFB2的选择离子，气帘气(CUR)10～30ml/min、离子化电压(IS)4500V、雾化气(GS1)10～30ml/min、辅助雾化气(GS2)30～40ml/min、辅助加热器温度(TEM)450℃。本发明具有简便、快捷、精密、准确的特点。
Description
一、技术领域
本发明涉及一种微生物含量的测定方法，确切地说是一种农副产品中黄曲霉毒素含量的快速测定方法。
二、背景技术
黄曲霉毒素(Aflatoxin)是常见曲霉菌黄曲霉(AspergiUusflavus)和寄生曲(A.parasiticus)中产毒菌株的代谢产物。主要毒素是B1、B2、G1和G2，其中B1是毒性和危害最大的一种。黄曲霉毒素是目前所知致癌性最强的化合物，广泛存在于花生、花生油、大米、玉米、糕点等粮油食品和动物饲料中，严重影响人们的健康，甚至威胁着人们的生命安全。
我国是世界上的花生主产和出口国之一，国内的一些花生进出口企业，往往由于报检通关手续繁杂，造成成品花生在仓库积压，而在花生贮藏过程中往往由于管理不善或者天气等原因，易受到微生物污染造成质量严重下降。国外有些国家对于花生等农产品的检测标准也趋见苛刻。目前，为满足出入境检验检疫的需要，各国采取的检测黄曲霉毒素的方法主要有薄层色谱法(TLC)、高效液相色谱法(HPLC)、酶联免疫吸附法(ELISA)、免疫亲和柱净化荧光光度法、免疫亲和柱净化高效液相色谱法、多功能柱色谱净化高效液相色谱法等，这些方法一般操作比较复杂、检测时间长、检测结果不够精确。而更为快速精确的液相-串联质谱联用检测法(LC-MS/MS)却鲜有报道，本研究就利用LC-MS/MS法检测花生样品中的黄曲霉毒素含量。
三、发明内容
本发明旨在提供一种快速测定农副产品中黄曲霉毒素含量的方法。所要解决的技术问题是建立高效液相色谱和质谱串联使用系统(LC-MS/MS)。
本发明的技术方案首先将原料(农副产品)粉碎，然后萃取、过滤，滤液经纯化后进行检测，以花生为例，具体过程如下：
1、取50g粉碎后过筛样品和5g氯化钠转移到干净的均质器中，加入100ml 80％甲醇水溶液(80∶20)高速均质1min。将其过滤，至少留滤液10ml，用20ml去离子水稀释5ml萃取液并彻底混合，再用玻璃纤维滤纸过滤，取滤液。
2、将10ml无菌注射器接于免疫亲和柱上部，取10ml已稀释的萃取液以1-2滴/S的速度通过免疫亲和柱，再用2ml去离子水洗柱，最后用1ml甲醇洗脱并将洗脱液收集于干净的比色皿或其他容器中待用。
3、色谱条件的选择
色谱柱：Waters Symmetry C18柱(2.1×150mm，3.5μm)；流动相A：10mM乙酸水溶液；流动相B：100％甲醇；柱温40℃；流速0.2～1ml/min；梯度程序：B在0min为50％，在0～10min增至90％，在10～15min从90％降低为50％。
4、质谱条件的优化
本研究离子化模式采用电喷雾(ESI)正离子模式，通过全离子扫描(Full scan)确定AFB1、AFB2的选择离子，丰度最高的碎片是含Na离子的化合物：AFB1对应335.2m/z、AFB2对应337.2m/z、。对质谱条件进行优化：气帘气(CUR)10～30ml/min、离子化电压(IS)4500V、雾化气(GS1)10～30ml/min、辅助雾化气(GS2)30～40ml/min、辅助加热器温度(TEM)450℃。
本方法对5份脱皮花生仁样品进行了黄曲霉毒素含量检测，结果见表1。
Table1 LC-MS/MS测脱皮花生仁样品中黄曲霉毒素含量结果
本方法提取和净化过程使用的是甲醇，减少了对试验人员的伤害，同时检测花生中的黄曲霉毒素B1、B2，检测限分别为0.15μg/kg、0.09μg/kg回收率为84.3％～107.5％，相对标准偏差为5.3％～9.7％。本发明具有简便、快捷、精密、准确的特点，为农副产品中黄曲霉毒素含量检测提供方便可靠的检测手段。
四、附图说明
图1是黄曲霉毒素B1、B2总的离子流色谱图，在20min内出峰顺序为AFB2、AFB1，分离效果好。
图2是黄曲霉毒素B1、B2的选择离子(SIM)色谱图。就是选择离子(SIM)条件下的色谱图
图3是LC-MS/MS测黄曲霉毒素B1标准曲线。
图4是LC-MS/MS测黄曲霉毒素B2标准曲线。
五、具体实施方式
现以花生为例，非限定实施例叙述如下：
1、实验原料与试剂
1.1主要原料与试剂
花生，取自于安徽凯利粮油食品有限公司，黄曲霉毒素B1和B2，甲醇和乙腈均为色谱纯，乙酸为分析纯(AR)。
2、试验方法
2.1样品的准备
粉碎好的样品过20目筛并在取样前彻底混合，不立即分析的样品应放在冰箱中储存。取50g过筛样品和5g氯化钠转移到干净的均质器中，加入100ml80％甲醇水溶液(80∶20)高速均质1min。将其过滤，至少留滤液10ml，用20ml去离子水稀释5ml萃取液并彻底混合，再用玻璃纤维滤纸过滤，取滤液。
2.2样品预处理
将100ml无菌注射器接于免疫亲和柱上部，取10ml已稀释的萃取以1-2滴/S的速度通过免疫亲和柱，再用2ml去离子水洗柱，最后用1ml甲醇洗脱并将洗脱液收集于干净的比色皿或其他容器中待用。
2.3色谱条件的选择
色谱柱：Waters Symmetry C18柱(2.1×150mm，3.5μm)；流动相A：10mM乙酸水溶液；流动相B：100％甲醇；柱温40℃；流速0.2～1ml/min；梯度程序：B在0min为50％，在0～10min增至90％，在10～15min从90％降低为50％。
2.4质谱条件的优化
本研究离子化模式采用电喷雾(ESI)正离子模式，通过全离子扫描(Full scan)确定AFB1、AFB2的选择离子，丰度最高的碎片是含Na离子的化合物：AFB1对应335.2m/z、AFB2对应337.2m/z、。对质谱条件进行优化：气帘气(CUR)10～30ml/min、离子化电压(IS)4500V、雾化气(GS1)10～30ml/min、辅助雾化气(GS2)30～40ml/min、辅助加热器温度(TEM)450℃。
2.5精密度与回收率实验
取同一花生样品，按2.1的步骤处理样品，分析并测定其精密度及回收率。结果见表2。
表2C-MS/MS法测定黄曲霉毒素的回收率及精密度
实验结果显示其回收率在84.3％到107.5％之间，平均回收率为94.9％，其精密度为5.3％到9.8％，平均精密度为8.1％，充分表明这种方法准确可靠。
2.6标准曲线及检出限
准确吸取不同浓度的黄曲霉毒素混合标准工作溶液10μL，HPLC-MS/MS分析，分别以黄曲霉毒B1、B2、G1、G2的峰面积对样品的浓度进行线性回归分析，即得标准曲线；按信噪比S/N＞3∶1时溶液浓度计，可得黄曲霉毒B1、B2、G1、G2的检出限。结果见图3、图4和表3。
表3LC-MS/MS法黄曲霉毒素的回归方程及检出限
Claims (1)
1、一种快速检测黄曲霉毒素含量的方法，包括农副产品原料的粉碎、80％甲醇溶液萃取、过滤和免疫亲和柱纯化以及检测，其特征在于：所述的检测是液相色谱串联质谱联用检测法，液相色谱检测条件：色谱柱：Waters Symmetry C18柱(2.1×150mm，3.5μm)；流动相A：10mM乙酸水溶液；流动相B：100％甲醇；柱温40℃；流速0.2～1ml/min；梯度程序：B在0min为50％，在0～10min增至90％，在10～15min从90％降低为50％；质谱检测条件：采用电喷雾(ESI)正离子模式，通过全离子扫描(Full scan)确定AFB1、AFB2的选择离子，气帘气(CUR)10～30ml/min、离子化电压(IS)4500V、雾化气(GS1)10～30ml/min、辅助雾化气(GS2)30～40ml/min、辅助加热器温度(TEM)450℃。
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