CN103254130A - 吖啶衍生物及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了式I所示吖啶衍生物及其制备方法和用途。其中，式I所示化合物或其药学上可接受的盐、酯及溶剂合物，其Z为NHCH2、NHCH2CH2、NHCH2CH2CH2或OCH2。式I所示化合物具有DNA连接功能，且对拓扑异构酶有抑制活性，该化合物或其药学上可接受的盐、酯及溶剂合物，能够有效用于制备DNA连接物、拓扑异构酶抑制剂及真核生物肿瘤细胞增殖抑制剂，以及预防和/或治疗的肿瘤药物。
Description
技术领域
本发明涉及吖啶衍生物及其制备方法和用途，具体地，本发明涉及式I所示9-苄胺基（苄氧基）吖啶衍生物及其制备方法和用途。
背景技术
癌症是当今引起人类死亡的第一病因，研发高效低毒的抗肿瘤药物迫在眉睫。以DNA及相关酶为靶点设计的药物是目前研究的热点，已有部分药物用于癌症治疗或进入临床研究阶段，如蒽环类抗肿瘤药物等。作用于DNA靶点的药物可以通过与DNA相互作用，改变DNA的结构形态，如解开DNA的螺旋结构和延长DNA链等等，从而延迟或者抑制DNA的转录和翻译过程。
DNA拓扑异构酶（分为DNA拓扑异构酶I和DNA拓扑异构酶II）在DNA空间结构、复制转录方面都起着重要的作用，其能够调节DNA的拓扑异构变化，导致DNA发生异常，进而引发细胞凋亡，对于细胞生成和增殖都非常重要和必要。DNA拓扑异构酶抑制剂是抗肿瘤药物的一个重要方向。
吖啶类化合物具有三环平面芳香结构，部分吖啶类化合物可以很好的嵌入DNA链中，是DNA的嵌入剂和拓扑异构酶抑制剂。目前已报道的与DNA作用的吖啶类化合物多为苯胺基吖啶类衍生物，而对于苯环及吖啶环之间连接链对肿瘤活性的影响方面的研究鲜有报道。
因而，现阶段，能够作为拓扑异构酶抑制剂的新的吖啶衍生物的研发仍有待加强。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一类具有DNA连接功能以及对拓扑异构酶有抑制活性的苄胺基及苄氧基吖啶类化合物及其制备方法。
根据本发明的一个方面，本发明提供了式I所示化合物或其药学上可接受的盐、酯及溶剂合物，
其中，Z为NHCH2、NHCH2CH2、NHCH2CH2CH2或OCH2。发明人惊奇地发现，本发明的式I所示化合物即9-苄胺基（苄氧基）吖啶衍生物，具有DNA连接功能，且对拓扑异构酶有抑制活性。进而，本发明的式I所示化合物或其药学上可接受的盐、酯及溶剂合物，能够有效用于制备DNA连接物、拓扑异构酶抑制剂及真核生物肿瘤细胞增殖抑制剂，以及预防和/或治疗的肿瘤药物。
根据本发明的另一方面，本发明还提供了一种制备式I所示化合物的方法。根据本发明的实施例，该方法包括以下步骤：
1）将式II所示化合物与式III所示化合物接触，生成式Ⅳ所示化合物；
2）将式IV所示化合物与无水三氯氧磷接触，生成式V所示化合物；以及
3）将式V所示化合物与式VI所示化合物接触，生成式I所示化合物，
其中，式VI所示化合物为胺类化合物或苄醇类化合物，
发明人发现，利用本发明的方法，能够有效地制备式I所示的化合物即9-苄胺基（苄氧基）吖啶衍生物。根据本发明的实施例，利用该方法制备获得的式I所示的化合物，具有DNA连接功能，且对拓扑异构酶有抑制活性，进而，利用式I所示化合物或其药学上可接受的盐、酯及溶剂合物，均能够有效地制备DNA连接物、拓扑异构酶抑制剂及真核生物肿瘤细胞增殖抑制剂，以及预防和/或治疗的肿瘤药物。
由此，本发明还提供了式I所示化合物或其药学上可接受的盐、酯及溶剂合物的用途。
根据本发明的再一方面，本发明提供了式I所示化合物或其药学上可接受的盐、酯及溶剂合物，在制备DNA连接物和拓扑异构酶抑制剂中的用途。
根据本发明的又一方面，本发明提供了式I所示化合物或其药学上可接受的盐、酯及溶剂合物，在制备真核生物肿瘤细胞增殖抑制剂中的用途。
根据本发明的另一方面，本发明提供了式I所示化合物或其药学上可接受的盐、酯及溶剂合物，在制备预防和/或治疗肿瘤的药物中的用途。
进而，根据本发明的又一方面，本发明还提供了一种预防和/或治疗肿瘤的药物。根据本发明的实施例，该药物的活性成分为式I所示化合物或其药学上可接受的盐、酯及溶剂合物。利用上述药物，能够有效地预防或治疗肿瘤。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1显示了根据本发明一个实施例，本发明制备获得的化合物6-氯-2-甲氧基-9-苄氧基-吖啶的拓扑异构酶I抑制活性实验的电泳检测图；
图2显示了根据本发明一个实施例，本发明制备获得的化合物6-氯-2-甲氧基-9-苄氧基-吖啶的DNA连接实验的结果图，其中，
图2a显示了用紫外吸收光谱的方法检测获得的化合物与DNA的结合作用的结果图，
图2b显示了用荧光发射光谱的方法检测获得的化合物与DNA的结合作用的结果图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
化合物
根据本发明的一个方面，本发明提供了式I所示化合物或其药学上可接受的盐、酯及溶剂合物，
其中，Z为NHCH2、NHCH2CH2、NHCH2CH2CH2或OCH2。根据本发明的实施例，本发明的式I所示化合物能够与DNA连接，具有DNA连接功能，且对拓扑异构酶有抑制活性。进而，本发明的式I所示化合物或其药学上可接受的盐、酯及溶剂合物，能够有效用于制备DNA连接物、拓扑异构酶抑制剂及真核生物肿瘤细胞增殖抑制剂，以及预防和/或治疗的肿瘤药物。
根据本发明的实施例，上述式I所示的化合物中，当Z为NHCH2时，R1、R2、R3、R4和R5均选自下述基团中的任意一种：H、F、Br、COOH、CH3、NO2、NHCOCH3和CF3；当Z为NHCH2CH2、NHCH2CH2CH2或OCH2时，R1、R2、R3、R4和R5均选自下述基团中的任意一种：H、OH、OCH3、OC2H5、F、Cl、Br、CH3、CF3、OCF3、NH2、NO2、COOH和NHCOCH3。其中，当Z为NHCH2、NHCH2CH2或NHCH2CH2CH2时，式I所示的化合物为9-苄胺基吖啶衍生物，当Z为OCH2时，式I所示的化合物为9-苄氧基吖啶衍生物。
根据本发明的一些具体示例，当式I中R4为CF3，Z为NHCH2，R1、R2、R3和R5均为H时，式I所示的化合物为6-氯-2-甲氧基-9-(4-三氟甲基)苄胺基-吖啶；当式I中Z为NHCH2CH2，其余取代基均为H时，式I所示的化合物为6-氯-2-甲氧基-9-苯乙基-吖啶；当式I中Z为NHCH2CH2CH2，其余取代基均为H时，式I所示的化合物为6-氯-2-甲氧基-9-苯丙基-吖啶；当式I中R2为CH3，Z为NHCH2，其余取代基均为H时，式I所示的化合物为6-氯-2-甲氧基-9-(2-甲基)苄胺基-吖啶；当式I中R3为Br，Z为NHCH2，其余取代基均为H时，式I所示的化合物为6-氯-2-甲氧基-9-(3-溴)苄胺基-吖啶；当式I中R2=F，Z为NHCH2，其余取代基均为H时，式I所示的化合物为6-氯-2-甲氧基-9-(2-氟)苄胺基-吖啶；当式I中Z为OCH2，其余取代基均为H时，式I所示的化合物为6-氯-2-甲氧基-9-苄氧基-吖啶。根据本发明的实施例，上述七种吖啶衍生物均具有DNA连接功能及拓扑异构酶抑制活性。
制备方法
根据本发明的另一方面，本发明还提供了一种制备式I所示化合物的方法。根据本发明的实施例，该方法包括以下步骤：
1）将式II所示化合物与式III所示化合物接触，生成式Ⅳ所示化合物；
2）将式IV所示化合物与无水三氯氧磷接触，生成式V所示化合物；以及
3）将式V所示化合物与式VI所示化合物接触，生成式I所示化合物，
其中，式VI所示化合物为胺类化合物或苄醇类化合物，
根据本发明的实施例，利用本发明的方法，能够有效地制备式I所示的化合物即9-苄胺基（苄氧基）吖啶衍生物。此外，发明人还发现，利用该方法制备获得的式I所示的化合物，具有DNA连接功能，且对拓扑异构酶有抑制活性，进而，利用式I所示化合物或其药学上可接受的盐、酯及溶剂合物，均能够有效地制备DNA连接物、拓扑异构酶抑制剂及真核生物肿瘤细胞增殖抑制剂，以及预防和/或治疗的肿瘤药物。
需要说明的是，发明人将利用上述方法制备获得的化合物，通过高分辨质谱，核磁共振和熔点等测试进行了验证，结果证明制备的化合物正确无误，确为通式I所示化合物。根据本发明的一些具体示例，发明人通过本发明的方法制备获得了以下几种式I所示的化合物：6-氯-2-甲氧基-9-(4-三氟甲基)苄胺基-吖啶、6-氯-2-甲氧基-9-苯乙基-吖啶、6-氯-2-甲氧基-9-苯丙基-吖啶、6-氯-2-甲氧基-9-(2-甲基)苄胺基-吖啶、6-氯-2-甲氧基-9-(3-溴)苄胺基-吖啶、6-氯-2-甲氧基-9-(2-氟)苄胺基-吖啶、6-氯-2-甲氧基-9-苄氧基-吖啶。
根据本发明的实施例，在本发明的方法中，各步骤的反应条件不受特别限制，只要能够有效地生成目标化合物即可。根据本发明的一些实施例，在步骤1）中，以铜为催化剂、碳酸钾作为碱，在130-135摄氏度下，将式II所示化合物与式III所示化合物于无水二甲基甲酰胺中进行接触。根据本发明的另一些实施例，在步骤1）中，式II所示化合物与式III所示化合物的摩尔比为1.5:1，接触时间为11-13小时。由此，能够有效地生成式IV所示化合物。
根据本发明的一些实施例，在步骤2）中，将式IV所示化合物与无水三氯氧磷接触进一步包括：将式IV所示化合物与无水三氯氧磷混合，并进行加热回流。根据本发明的另一些实施例，在步骤2）中，于135-140摄氏度下进行所述加热回流3-4小时。由此，能够有效地生成式V所示化合物。
根据本发明的一些实施例，在步骤3）中，将式V所示化合物与式VI所示化合物接触，进一步包括：当式VI所示化合物的取代基，Z为NHCH2且R1、R2、R3、R4和R5均选自下述基团中的任意一种：H、F、Br、COOH、CH3、NO2、NHCOCH3和CF3，或者Z为NHCH2CH2或NHCH2CH2CH2且R1、R2、R3、R4和R5均选自下述基团中的任意一种时：H、OH、OCH3、OC2H5、F、Cl、Br、CH3、CF3、OCF3、NH2、NO2、COOH和NHCOCH3，以碘化钾为催化剂、碳酸钾为碱，将式V所示化合物与式VI所示苄胺类化合物于无水乙醇溶液中进行接触，并于85-100摄氏度下进行加热回流；当式VI所示化合物的取代基，Z为OCH2且R1、R2、R3、R4和R5均选自下述基团中的任意一种时：H、OH、OCH3、OC2H5、F、Cl、Br、CH3、CF3、OCF3、NH2、NO2、COOH和NHCOCH3，以碘化钾为催化剂、氢化钠为碱，将式V所示化合物与式VI所示苄醇类化合物于干燥的THF溶液中进行接触，并于60-65摄氏度下进行加热回流。由此，能够有效生成9-苄胺基吖啶衍生物或9-苄氧基吖啶衍生物，即式I所示化合物。
用途
进一步，发明人发现，上述式I所示化合物或其药学上可接受的盐、酯及溶剂合物，能够有效用于制备DNA连接物、拓扑异构酶抑制剂及真核生物肿瘤细胞增殖抑制剂，以及预防和/或治疗的肿瘤药物。因此，本发明还提供了本发明的式I所示化合物或其药学上可接受的盐、酯及溶剂合物的用途。具体如下所述：
根据本发明的再一方面，本发明提供了式I所示化合物或其药学上可接受的盐、酯及溶剂合物，在制备DNA连接物和拓扑异构酶抑制剂中的用途。根据本发明的一些实施例，所述拓扑异构酶为拓扑异构酶I。即本发明的式I所示化合物或其药学上可接受的盐、酯及溶剂合物，尤其适于制备拓扑异构酶I的抑制剂。
根据本发明的又一方面，本发明提供了式I所示化合物或其药学上可接受的盐、酯及溶剂合物，在制备真核生物肿瘤细胞增殖抑制剂中的用途。根据本发明的实施例，所述真核生物为哺乳动物，所述肿瘤细胞为癌细胞。根据本发明的一些实施例，所述癌细胞为白血病癌细胞、乳腺癌细胞、肝癌细胞、胰腺癌细胞、肺癌细胞、脑癌细胞、卵巢癌细胞、子宫癌细胞、睾丸癌细胞、皮肤癌细胞、胃癌细胞、鼻咽癌细胞、结肠癌细胞、膀胱癌细胞或直肠癌细胞，优选为白血病癌细胞或肝癌细胞，更优选为人慢性髓原白血病细胞K562或人肝癌细胞HepG-2。即本发明的式I所示化合物或其药学上可接受的盐、酯及溶剂合物，尤其适于制备人慢性髓原白血病细胞K562和人肝癌细胞HepG-2的增殖抑制剂。
根据本发明的另一方面，本发明提供了式I所示化合物或其药学上可接受的盐、酯及溶剂合物，在制备预防和/或治疗肿瘤的药物中的用途。根据本发明的实施例，所述肿瘤为癌，优选白血病或肝癌。即本发明的式I所示化合物或其药学上可接受的盐、酯及溶剂合物，尤其适于制备预防和/或治疗白血病和肝癌的药物。
进而，根据本发明的又一方面，本发明还提供了一种预防和/或治疗肿瘤的药物。根据本发明的实施例，该药物的活性成分为式I所示化合物或其药学上可接受的盐、酯及溶剂合物。利用上述药物，能够有效地预防或治疗肿瘤。
根据本发明的实施例，本发明的预防和/或治疗肿瘤药物的给药途径不受特别限制，可通过注射、喷射、滴鼻、滴眼、渗透、吸收、物理或化学介导的方法导入机体如肌肉、皮内、皮下、静脉、粘膜组织；或是被其他物质混合或包裹后导入机体。
根据本发明的实施例，本发明的预防和/或治疗肿瘤药物中还可以包含一种或多种药学上可接受的载体，即药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等。
根据本发明的实施例，利用式I所示化合物或其药学上可接受的盐、酯、溶剂合物制备的预防和/或治疗肿瘤药物，其剂型不受特别限制，只要适于给药即可。根据本发明的一些具体示例，本发明的预防和/或治疗肿瘤药物可以呈注射液、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、口服液、膏剂或霜剂等多种形式。其中，需要说明的是，上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。
根据本发明的实施例，本发明的预防和/或治疗肿瘤药物适用的肿瘤为癌，优选白血病或肝癌。即本发明的预防和/或治疗肿瘤药物，尤其适于预防和/或治疗白血病和肝癌。
需要说明的是，本发明的式I所示9-苄胺基（苄氧基）吖啶衍生物及其制备方法，是本申请的发明人经过艰苦的创造性劳动和不断的优化工作才完成的。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1、制备4-氯-2(4-甲氧基氨基)苯甲酸
在二甲基甲酰胺(DMF)(50.00ml)中加入2,4-二氯苯甲酸(2.00g，10.47mmol)、4-甲氧基苯胺(0.86g，6.99mmol)、碳酸钾(2.00g，14.49mmol)和铜粉(0.20g，3.15mmol)。在130℃下搅拌过夜。反应混合物冷却后加入到200ml水中，用醋酸调至pH值约为3。用乙酸乙酯萃取，有机相蒸干后用柱层析色谱分离，得到黄色固体（式IV所示化合物，4-氯-2(4-甲氧基苯氨基)苯甲酸）1.24g。产率63.9%；熔点198-201℃。
化合物结构确证数据为：
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ9.16(s,1H),δ7.93(d,J=8.6Hz,1H),δ7.17(d,J=8.7Hz,2H),δ6.95(d,J=8.8Hz,2H),δ6.87(d,J=1.8Hz,1H),δ6.64(dd,J=8.6,1.7Hz,1H),δ3.84(s,3H);13C NMR(100.6MHz,CDCl3)δ172.79,157.64,151.44,141.89,133.83,132.06,126.86,116.76,115.02,113.01,107.75,55.56。
实施例2、制备6,9-二氯-2-甲氧基吖啶
将实施例1制备获得的4-氯-2(4-甲氧基苯氨基)苯甲酸(2.00g，7.19mmol)，加入到无水三氯氧磷(25.00ml)中，140℃回流3小时。反应液冷却后缓慢加入到冰水，氨水，氯仿的混合液（体积比为1:1:1）中。分出氯仿，再用氯仿萃取，合并所有氯仿萃取液，蒸干，干燥。得到黄色固体（式V所示化合物，6,9-二氯-2-甲氧基吖啶）1.98g。产率99%；熔点160-163℃。
化合物结构确证数据为：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.34(d,J=9.2Hz,1H),δ8.20(d,J=1.9Hz,1H),δ8.09(d,J=10.2Hz,1H),δ7.56(dd,J=9.2,2.0Hz,1H),δ7.54–7.48(m,2H),δ4.04(s,3H)。
实施例3、制备6-氯-2-甲氧基-9-苄胺基-吖啶
将实施例2制备获得的6,9-二氯-2-甲氧基吖啶(50.00mg,0.18mmol)与各胺类化合物(0.97mmol)加入到无水乙醇10.00ml中，加入碳酸钾，碘化钾，于85-100摄氏度下加热回流搅拌过夜。蒸干反应液，用乙酸乙酯萃取，有机相蒸干后用柱层析色谱分离，得到所需化合物（式I所示化合物）：
1）6-氯-2-甲氧基-9-(4-三氟甲基)苄胺基-吖啶的制备（式I中R4=CF3,Z为NHCH2，其余取代基均为H）
产率81%;熔点152-154℃;高分辨质谱(ESI):计算值[C22H16ClF3N2O+H]+417.0981;实验值:417.0986。
化合物结构确证数据为：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.09(s,1H),8.00(d,J=9.4Hz,1H),7.90(d,J=9.3Hz,1H),7.63(d,J=8.1Hz,2H),7.52(d,J=8.1Hz,2H),7.40(dd,J=9.4,2.6Hz,1H),7.28(dd,J=9.3,2.1Hz,1H),7.07(d,J=2.5Hz,1H),4.97(s,1H),4.85(s,2H),3.74(s,3H);13C NMR(101MHz,CDCl3)δ156.48,148.97,148.19,143.43,134.94,130.75,130.43,130.11,129.78,127.59,126.02,125.98,125.94,125.90,125.38,124.95,123.48,122.67,118.63,116.58,98.98,58.40,55.32.
2）6-氯-2-甲氧基-9-苯乙基-吖啶的制备（式I中Z为NHCH2CH2，其余取代基均为H）
产率67%;熔点122-124℃;高分辨质谱(ESI):计算值[C22H19ClN2O+H]+363.1264;实验值:363.1263。
化合物结构确证数据为：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.06(d,J=1.9Hz,1H),7.98(d,J=9.4Hz,1H),7.86(d,J=9.3Hz,1H),7.44–7.33(m,3H),7.29(t,J=6.7Hz,3H),7.25(d,J=2.0Hz,1H),4.64(s,1H),3.96(t,J=6.4Hz,2H),3.82(s,3H),3.03(t,J=6.6Hz,2H);13C NMR(101MHz,CDCl3)δ156.26,149.27,148.42,146.84,138.12,134.74,131.64,129.01,128.98,128.38,127.07,124.73,124.70,124.17,118.53,116.46,98.53,55.46,51.10,37.24.
3)6-氯-2-甲氧基-9-苯丙基-吖啶的制备（式I中Z为NHCH2CH2CH2，其余取代基均为H）
产率78%;熔点79-81℃;高分辨质谱(ESI):计算值[C23H21ClN2O+H]+377.1420;实验值:377.1410。
化合物结构确证数据为：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.04(s,1H),7.96(d,J=9.3Hz,1H),7.81(d,J=9.2Hz,1H),7.37(d,J=8.8Hz,1H),7.19(ddd,J=38.0,13.5,6.6Hz,7H),4.67(s,1H),3.87(s,3H),3.66(t,J=6.8Hz,2H),2.71(t,J=7.2Hz,2H),2.05(dd,J=14.0,6.9Hz,2H);13C NMR(101MHz,CDCl3)δ156.04,149.47,148.34,146.81,140.91,134.72,131.51,128.65,128.35,128.27,126.30,124.52,123.88,117.99,115.92,99.25,55.52,50.03,33.29,33.18.
4）6-氯-2-甲氧基-9-(2-甲基)苄胺基-吖啶的制备（式I中R2=CH3,Z为NHCH2，其余取代基均为H）
产率56%;熔点150-151℃;高分辨质谱(ESI):计算值[C22H19ClN2O+H]+363.1264;实验值:363.1252;
化合物结构确证数据为：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.08(t,J=2.2Hz,1H),7.99(dd,J=9.4,2.4Hz,1H),7.92(dd,J=9.2,5.3Hz,1H),7.54(dd,J=5.9,2.7Hz,1H),7.39(dt,J=9.4,2.8Hz,1H),7.31–7.19(m,4H),7.10(t,J=2.4Hz,1H),4.90(s,1H),4.79(s,2H),3.70(s,3H),2.23(s,3H);13C NMR(101MHz,CDCl3)δ156.12,149.69,148.34,147.06,137.30,135.79,134.83,131.58,130.81,128.43,128.14,128.07,126.64,124.91,124.74,123.66,118.02,116.03,99.30,55.30,52.65,19.00.
5）6-氯-2-甲氧基-9-(3-溴)苄胺基-吖啶的制备（式I中R3=Br,Z为NHCH2，其余取代基均为H）
产率69%;熔点156-159℃;高分辨质谱(ESI):计算值[C21H16BrClN2O+H]+427.0213;实验值:427.0224。
化合物结构确证数据为：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.08(d,J=1.8Hz,1H),7.99(d,J=9.4Hz,1H),7.91(d,J=9.3Hz,1H),7.61(s,1H),7.45(d,J=7.8Hz,1H),7.39(dd,J=9.4,2.6Hz,1H),7.28(dd,J=6.6,2.7Hz,2H),7.22(t,J=7.7Hz,1H),7.09(d,J=2.5Hz,1H),4.76(s,2H),3.76(s,3H);13C NMR(101MHz,CDCl3)δ156.43,149.09,148.15,146.93,141.72,134.92,131.49,130.99,130.55,130.38,128.33,125.88,125.25,124.99,123.62,123.13,118.57,116.52,99.04,55.39,53.87.
6）6-氯-2-甲氧基-9-(2-氟)苄胺基-吖啶的制备（式I中R2=F,Z为NHCH2，其余取代基均为H）
产率74%;熔点170-172℃;高分辨质谱(ESI):计算值[C21H16ClFN2O+H]+367.1013;实验值:367.1021。
化合物结构确证数据为：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.09(s,1H),7.99(dd,J=9.0,7.4Hz,2H),7.40(dd,J=9.4,2.3Hz,1H),7.35–7.26(m,3H),7.18(d,J=2.3Hz,1H),7.12–7.01(m,2H),4.89(s,1H),4.80(s,2H),3.84(s,3H);13C NMR(101MHz,CDCl3)δ162.19,159.74,156.52,148.97,148.18,134.81,131.61,129.89,129.86,129.85,129.78,128.50,126.24,126.09,125.44,125.03,124.57,124.54,123.63,119.45,117.38,115.76,115.55,98.90.55.37,48.77,48.73.
实施例4、制备6-氯-2-甲氧基-9-苄氧基-吖啶
将苄醇(3.00mmol),氢化钠(3.00mmol)加入到干燥的THF(15.00ml)中，室温下搅拌1小时后。再加入将实施例2制备获得的6,9-二氯-2-甲氧基吖啶(1.00mmol)，碘化钾(0.25mmol)，并于60-65摄氏度下加热回流搅拌过夜。将反应液倒入到50毫升水中，用乙酸乙酯萃取，蒸干有机相，用柱层析色谱分离，得到最终产物6-氯-2-甲氧基-9-苄氧基-吖啶（式I中Z为OCH2，其余取代基均为H）。
产率17%;熔点128-130℃高分辨质谱(ESI):计算值[C21H16ClNO2+H]+350.0948;实验值:350.0951。
化合物结构确证数据为：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.19(d,J=1.9Hz,1H),8.14(d,J=9.2Hz,1H),8.07(d,J=9.2Hz,1H),7.53–7.37(m,7H),7.25(d,J=2.8Hz,1H),5.32(s,2H),3.83(s,3H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ158.92,157.20,148.79,148.50,136.56,135.29,131.25,128.88,128.79,128.28,127.23,126.72,126.12,123.69,121.45,119.15,98.08,55.47.
实施例5、细胞增殖抑制活性实验
采用MTT法，按照以下步骤，测定实施例3和4制备获得的式I所示化合物的体外细胞增殖抑制活性：
所用溶液配制方法如下：
1、将所有目标化合物（即实施例3和4制备获得的式I所示化合物）及阳性对照化合物（伊马替尼和秋水仙素）均利用DMSO配制成5mmol/L溶液，然后再用DMSO分别稀释为0.05mmol/L、0.1mmol/L、0.5mmol/L、1mmol/L、2.5mmol/L，待用，保存于4℃的冰箱中。
2、MTT用1×PBS溶液配成5mg/mL的浓度，用0.22μm的微孔滤器除菌，分装，4℃避光保存。配制后两周内使用。
3、1×磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffer Saline，PBS)：在800mL去离子水中溶解8gNaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4，用HCl调节溶液pH值至7.4，加水定容到1L，高压下120℃蒸汽灭菌，放于4℃的冰箱中保存。
实验采用以下两种细胞系：人慢性粒细胞白血病(CML)细胞系K562，人肝癌细胞HepG2。其中，HepG2细胞为贴壁生长细胞，用含体积分数为10%的胎牛血清的DMEM培养液，在37℃、体积分数为5%的CO2条件下常规培养。K562为悬浮细胞，用含体积分数为10%胎牛血清的RPIM-1640培养液，在37℃、体积分数为5%的CO2条件下常规培养。
取对数生长期的HepG2细胞或者K562细胞，接种于96孔板中，密度是1.5×105个/mL，99μL/孔，每孔加入样品溶液1μL，使药物作用终浓度为0.5，1，5，10，25，50μM。每种样品设三个复孔，并且设置阳性对照和空白对照。作用48h后加入MTT溶液，10μL/孔，继续培养4小时后，2000rpm，4℃，离心5分钟，吸去上清后加入DMSO，100μL/孔，37℃保温约10分钟，并用微量振荡器振荡约5分钟使结晶溶解完全，用酶标仪于490nm处测量OD值，然后按如下公式计算细胞增殖抑制率(Inhibition Rate，IR%)：
IR%＝(对照OD－样品OD)/（对照OD-空白OD）×100%
经过计算，得到实施例3和4制备获得的本发明的式I所示化合物的体外细胞增殖抑制活性，结果见表1。
表1实施例3、4制备的化合物的体外细胞增殖抑制活性
实施例6、拓扑异构酶抑制活性试验
按照以下步骤，测定实施例3和4制备获得的式I所示化合物的拓扑异构酶抑制活性：
将目标化合物用DMSO配制成5mmol/L溶液，然后再用DMSO分别稀释为0.02mmol/L，0.2mmol/L，2mmol/L，并将经过稀释的各种化合物分别加入到空的96孔板中。其中最终化合物浓度分别为0、1、10和100μM。接着，分别向各孔中添加200ng超螺旋pBR322DNA(购买自Takara)，5μl1.0单位重组人DNA拓扑异构酶I(购买自Takara)以及15μl反应缓冲液，然后于37℃下孵育30分钟。在1％的琼脂糖凝胶中电泳分离，100V电压电泳25分钟，电泳后将凝胶在溴化乙锭溶液中染色10分钟，在凝胶成像系统中，紫外透射灯下观察拍照。结果表明，具有抑制肿瘤细胞增殖活性的吖啶类衍生物也同时具有抑制拓扑异构酶的活性。
其中，图1显示了实施例4制备获得的化合物6-氯-2-甲氧基-9-苄氧基-吖啶的拓扑异构酶I抑制活性实验的电泳检测图。由图1可知，化合物6-氯-2-甲氧基-9-苄氧基-吖啶（LXL-5）对拓扑异构酶Ⅰ具有抑制活性。图1表明化合物在1μM和10μM的时候没有明显的抑制拓扑异构酶的现象，然后当浓度提高到100μM时化合物可以很好的抑制拓扑异构酶I。
实施例7、本发明所提供的化合物与DNA连接实验
按照以下步骤，对实施例3和4制备获得的式I所示化合物进行DNA连接实验：
配制ct DNA（小牛胸腺DNA）溶液：首先，将ct DNA溶解于配置好的pH7.2的Tris-HCl缓冲液中，紫外分光光度法测定其ct DNA的纯度（A260:A280=1.85），并计算此时DNA溶液的实际浓度，最后再将其稀释成1mM/L浓度的ct DNA溶液。
将待测化合物配制为浓度为5mM的化合物DMSO溶液。
紫外吸收实验：针对各待测化合物，将1微升5mM的待测化合物DMSO溶液，转移到加入了95微升缓冲液（Tris-盐酸溶液，PH=7.0）的比色皿中，并依次加入0.2微升的1mM/L浓度的ct DNA溶液，将反应液混合均匀孵育5分钟后，采用Beckman Coulter DU800紫外分光光度计进行全波长扫描，以便测定化合物与ct DNA的结合状况。
荧光发射光谱实验：针对各待测化合物，将990μL的Tris-HCl缓冲液加入到比色皿里，接着加入10μL上述配制的5mM/L的待测化合物DMSO溶液，混匀2分钟后采用荧光光谱仪（Fluorolog-3，Horiba Jobin Yvon公司）进行全波长扫描，以便测定化合物与ct DNA的结合状况。其中，将激发的波长设为380nm。然后，向比色皿中加入ct DNA并逐渐增大浓度，使得ct DNA在溶液中的浓度分别为0、1、2、4、5、7.5、10μM/L（即本试验针对各化合物均设上述7个处理），再分别于380nm的激发波长下进行全波长扫描。
其中，图2显示了实施例4制备获得的化合物6-氯-2-甲氧基-9-苄氧基-吖啶（在本文中有时也简称为“LXL-5”）的DNA连接实验的结果图。其中，图2.a显示了用紫外吸收光谱的方法检测获得的化合物与DNA的结合作用的结果图，其中横坐标为波长，纵坐标为紫外吸收的光强度。由图2.a可知，随着化合物的加入，波谱发生了减色效应，说明化合物LXL-5可以与DNA发生结合作用。图2.b显示了用荧光发射光谱的方法检测获得的化合物与DNA的结合作用的结果图，其中，横坐标为波长，纵坐标为荧光光谱的强度。由图2.b可知，随着ct DNA浓度的增加，化合物的荧光逐渐被淬灭，也表明了该化合物可以与DNA发生一定的结合作用。综上，图2的两个实验谱图均有力地说明了化合物LXL-5可以与DNA发生一定的结合作用，表明本发明的式I所示化合物具有DNA连接功能。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。
Claims (10)
1.式I所示化合物或其药学上可接受的盐、酯及溶剂合物，
其中，Z为NHCH2、NHCH2CH2、NHCH2CH2CH2或OCH2。
2.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，
当Z为NHCH2时，R1、R2、R3、R4和R5均选自下述基团中的任意一种：H、F、Br、COOH、CH3、NO2、NHCOCH3和CF3；
当Z为NHCH2CH2、NHCH2CH2CH2或OCH2时，R1、R2、R3、R4和R5均选自下述基团中的任意一种：H、OH、OCH3、OC2H5、F、Cl、Br、CH3、CF3、OCF3、NH2、NO2、COOH和NHCOCH3。
3.一种制备式I所示化合物的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）将式II所示化合物与式III所示化合物接触，生成式IV所示化合物；
2）将式IV所示化合物与无水三氯氧磷接触，生成式V所示化合物；以及
3）将式V所示化合物与式VI所示化合物接触，生成式I所示化合物，
其中，式VI所示化合物为胺类化合物或苄醇类化合物，
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，在步骤1）中，以铜为催化剂、碳酸钾作为碱，在130-135摄氏度下，将式II所示化合物与式III所示化合物于无水二甲基甲酰胺中进行接触，
任选地，在步骤1）中，式II所示化合物与式III所示化合物的摩尔比为1.5:1，接触时间为11-13小时，
任选地，在步骤2）中，将式IV所示化合物与无水三氯氧磷接触进一步包括：
将式IV所示化合物与无水三氯氧磷混合，并进行加热回流，
任选地，在步骤2）中，于135-140摄氏度下进行所述加热回流3-4小时。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，在步骤3）中，将式V所示化合物与式VI所示化合物接触，进一步包括：
当式VI所示化合物的取代基，Z为NHCH2且R1、R2、R3、R4和R5均选自下述基团中的任意一种：H、F、Br、COOH、CH3、NO2、NHCOCH3和CF3，或者Z为NHCH2CH2或NHCH2CH2CH2且R1、R2、R3、R4和R5均选自下述基团中的任意一种时：H、OH、OCH3、OC2H5、F、Cl、Br、CH3、CF3、OCF3、NH2、NO2、COOH和NHCOCH3，以碘化钾为催化剂、碳酸钾为碱，将式V所示化合物与式VI所示苄胺类化合物于无水乙醇溶液中进行接触，并于85-100摄氏度下进行加热回流；
当式VI所示化合物的取代基，Z为OCH2且R1、R2、R3、R4和R5均选自下述基团中的任意一种时：H、OH、OCH3、OC2H5、F、Cl、Br、CH3、CF3、OCF3、NH2、NO2、COOH和NHCOCH3，以碘化钾为催化剂、氢化钠为碱，将式V所示化合物与式VI所示苄醇类化合物于干燥的THF溶液中进行接触，并于60-65摄氏度下进行加热回流。
6.式I所示化合物或其药学上可接受的盐、酯及溶剂合物，在制备DNA连接物和拓扑异构酶抑制剂中的用途，
任选地，所述拓扑异构酶为拓扑异构酶I。
7.式I所示化合物或其药学上可接受的盐、酯及溶剂合物，在制备真核生物肿瘤细胞增殖抑制剂中的用途，
任选地，所述真核生物为哺乳动物，所述肿瘤细胞为癌细胞，
任选地，所述癌细胞为白血病癌细胞或肝癌细胞，
任选地，所述白血病癌细胞为人慢性髓原白血病细胞K562，所述肝癌细胞为人肝癌细胞HepG-2。
8.式I所示化合物或其药学上可接受的盐、酯及溶剂合物，在制备预防和/或治疗肿瘤的药物中的用途，
任选地，所述肿瘤为癌，优选白血病或肝癌。
9.一种预防和/或治疗肿瘤的药物，其活性成分为式I所示化合物或其药学上可接受的盐、酯及溶剂合物。
10.根据权利要求9所述的药物，其特征在于，所述肿瘤为癌，优选白血病或肝癌。
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