CN111057004A - 一种n-邻取代苯基苯甲酰胺-4-甲氨基吖啶类化合物及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种N‑邻取代苯基苯甲酰胺‑4‑甲氨基吖啶类化合物及其制备方法和用途，特点是该化合物为具有式I所示结构式的化合物或其药学上可接受的盐、酯或溶剂合物，其中R1为H、OCH3、OCH2CH3、F、Cl、Br、CF3、NO2或碳原子数为1‑5的直链烷基，R2为H、OCH3、OCH2CH3、F、Cl、Br、CF3、NO2或碳原子数为1‑5的直链烷基，R3为NH2、NHCH3、NHCH2CH3、OH、COOH、SH，R4为H、OCH3或碳原子数为1‑5的直链烷基等，优点是该化合物能够有效抑制DNA拓扑异构酶I、抑制I型HDAC和/或真核生物肿瘤细胞增殖、预防和/或治疗肿瘤。
Description
技术领域
本发明属于医药领域，具体涉及一种N-邻取代苯基苯甲酰胺-4-甲氨基吖啶类化合物及其制备方法和用途。
背景技术
癌症是21世纪全球第二大死因。近些年来，癌症在绝大多数国家的发病率和死亡率仍迅速上升。吖啶及其衍生物的抗癌靶点一般针对DNA相关酶如拓扑异构酶（Topo，包括I/II亚型）等，因其优异的抗癌活性，特别是抗白血病活性，在抗癌治疗领域得到了广泛的研究。因此，对吖啶类化合物的结构进行改造，有重要的研究价值。研究证实，在肿瘤细胞中组蛋白大多呈低乙酰化状态，而组蛋白去乙酰化酶（HDAC）异常导致的组蛋白乙酰化状态失衡与肿瘤的发生和发展有密切关系。早期开发的HDAC抑制剂大都缺乏亚型选择性，而具有HDAC亚型选择性的抑制剂可以降低广谱抑制剂具有的潜在毒副作用。近年来，对亚型选择性HDAC抑制剂的研发越来越重视。
Topo和HDAC都存在于细胞核内，在DNA的复制、转录、翻译、重组和修复都起着至关重要的作用。研究发现，Topo抑制剂和HDAC抑制剂联合作用可促进肿瘤细胞的凋亡，两者在肿瘤治疗上有着较好的协同作用。肿瘤具有多基因网络调控特点，针对单一靶点的抗肿瘤药物难以达到理想效果，因而针对多靶点抗肿瘤药物研究成为了药物研发的重要策略。近年来已有不少吖啶类化合物进入临床和临床前阶段。因此，以吖啶母核进行结构改造和构效研究，对于研发新型抗癌小分子药物具有重要指导意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种能够有效抑制Topo I、抑制I型HDAC、抑制真核生物肿瘤细胞增殖、预防和/或治疗肿瘤的N-邻取代苯基苯甲酰胺-4-甲氨基吖啶类化合物及其制备方法和用途。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种N-邻取代苯基苯甲酰胺-4-甲氨基吖啶类化合物，所述化合物为具有式I所示结构式的N-邻取代苯基苯甲酰胺-4-甲氨基吖啶类或具有式I所示结构式的N-邻取代苯基苯甲酰胺-4-甲氨基吖啶类化合物的药学上可接受的盐、酯或溶剂合物，
其中，R1为H、CH3、OCH3、OCH2CH3、F、Cl、Br、CF3、NO2或碳原子数为1-5的直链烷基，R2为H、CH3、OCH3、OCH2CH3、F、Cl、Br、CF3、NO2或碳原子数为1-5的直链烷基，R3为NH2、NHCH3、NHCH2CH3、NHCH2CH2CH3、OH、COOH、SH，R4为H、CH3、OCH3、OCH2CH3、F、Cl、Br、CF3、NO2或碳原子数为1-5的直链烷基，m = 0，1或2，n = 0，1，2，3或4；上述式
所示化合物药学上可接受的盐、酯或溶剂合物，其中所述的盐为无机酸盐或有机酸盐，所述的无机酸盐为盐酸、硫酸和磷酸中任意一种无机酸形成的盐；所述的有机酸盐为乙酸、三氟乙酸、丙二酸、柠檬酸和对甲苯磺酸中任意一种有机酸形成的盐。
上述N-邻取代苯基苯甲酰胺-4-甲氨基吖啶类化合物的制备方法，包括以下步骤：
（1）使式II所示化合物与式Ⅲ所示化合物反应，获得式Ⅳ所示化合物；
（2）使式Ⅳ所示化合物与三氯氧磷反应，获得式V所示化合物；
（3）使式V所示化合物与式VI所示化合物反应，获得式VII所示化合物；
（4）使式VII所示化合物与式VIII所示化合物反应，获得式I所示化合物，
其中，R1为H、CH3、OCH3、OCH2CH3、F、Cl、Br、CF3、NO2或碳原子数为1-5的直链烷基，R2为H、CH3、OCH3、OCH2CH3、F、Cl、Br、CF3、NO2或碳原子数为1-5的直链烷基，R3为NH2、NHCH3、NHCH2CH3、NHCH2CH2CH3、OH、COOH或SH，R4为H、CH3、OCH3、OCH2CH3、F、Cl、Br、CF3、NO2或碳原子数为1-5的直链烷基，m = 0，1或2，n = 0，1，2，3或4。
步骤（1）具体为：于100-130℃下，以铜为催化剂、碳酸钾作为碱，使式II所示化合物与式Ⅲ所示化合物按照摩尔比为1：1.5的比例在无水N,N-二甲基甲酰胺中反应1-12小时，即获得式IV所示化合物。
步骤（2）具体为：于50-100℃下，使式Ⅳ所示化合物与三氯氧磷反应1-5小时，即获得式Ⅴ所示化合物。
步骤（3）具体为：于25-135℃下，使式V所示化合物与式VI所示化合物，在2-乙氧基乙醇中反应10-36小时，即获得式VII所示化合物。
步骤（4）具体为：于10-70℃下，使式VII所示化合物与式VIII所示化合物以2-(7-偶氮苯并三氮唑)-四甲基脲六氟磷酸酯（HATU）作为缩合剂、N,N-二异丙基乙胺（DIPEA）为碱，在二氯甲烷和无水N,N-二甲基甲酰胺中反应10-30小时，即获得式I所示化合物。
上述N-邻取代苯基苯甲酰胺-4-甲氨基吖啶类化合物在制备预防和/或治疗肿瘤药物中的用途。
上述N-邻取代苯基苯甲酰胺-4-甲氨基吖啶类化合物在制备抑制DNA拓扑异构酶I、抑制I型HDAC和/或抑制真核生物肿瘤细胞增殖药物中的用途。
上述N-邻取代苯基苯甲酰胺-4-甲氨基吖啶类化合物在制备抑制双重抑制Topo I和I型HDAC药物中的用途。
上述真核生物为哺乳动物；所述的肿瘤细胞为癌细胞；其中癌细胞为白血病细胞、淋巴瘤细胞、乳腺癌细胞、肝癌细胞、胰腺癌细胞、肺癌细胞、脑癌细胞、卵巢癌细胞、子宫癌细胞、睾丸癌细胞、皮肤癌细胞、胃癌细胞、鼻咽癌细胞、结肠癌细胞、膀胱癌细胞或直肠癌细胞。
与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明一种N-邻取代苯基苯甲酰胺-4-甲氨基吖啶类化合物及其制备方法和用途，该化合物能够有效抑制Topo I的活性、抑制I型HDAC活性、抑制真核生物肿瘤细胞增殖、预防和/或治疗肿瘤。本发明提供的化合物经过多种肿瘤细胞系测试（包括白血病细胞和淋巴瘤细胞等）、Topo I活性抑制测试、HDAC（包括I型和II型）活性抑制测试、蛋白电泳实验检测细胞内DNA损伤标记物γ-H2AX表达的上调以及组蛋白H3乙酰化水平的上升、细胞凋亡实验检测化合物诱导肿瘤细胞凋亡等，证明本发明的化合物是一种潜在的双重抑制Topo I和I型HDAC，且有较强抗肿瘤细胞增殖活性的抗肿瘤药物。本发明提供的化合物原料易得，制备方法简单，设计并合成出一系列以Topo I和I型HDAC为靶标的结构新颖的多靶点小分子抑制剂，实验证明其有良好的抗癌效果，在抗肿瘤药物设计研发领域有着良好的应用前景。
附图说明
图1显示了根据本发明的一个实施例，化合物1、化合物2、化合物3、化合物4、化合物10、化合物13、化合物14、化合物15和化合物18的Topo I活性抑制结果；
图2显示了根据本发明的一个实施例，化合物2的蛋白质印记分析测试结果；
图3显示了根据本发明的一个实施例，化合物2的细胞凋亡检测图。
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。在本文中，“式N所示化合物”在本文中有时也称为“化合物N”，在本文中N为1-7的任意整数，例如“式2所示化合物”在本文中也可以称为“化合物2”。
具体实施例一
一种N-邻取代苯基苯甲酰胺-4-甲氨基吖啶类化合物，该化合物为具有式I所示结构式的化合物或具有式I所示结构式的化合物的药学上可接受的盐、酯或溶剂合物，
上述式
中，R1为H、CH3、OCH3、OCH2CH3、F、Cl、Br、CF3、NO2或碳原子数为1-5的直链烷基，R2为H、CH3、OCH3、OCH2CH3、F、Cl、Br、CF3、NO2或碳原子数为1-5的直链烷基，R3为NH2、NHCH3、NHCH2CH3、NHCH2CH2CH3、OH、COOH、SH，R4为H、CH3、OCH3、OCH2CH3、F、Cl、Br、CF3、NO2或碳原子数为1-5的直链烷基，m = 0，1或2，n = 0，1，2，3或4。上述式
所示化合物药学上可接受的盐、酯或溶剂合物，其中所述的盐为无机酸盐或有机酸盐，所述的无机酸盐为盐酸、硫酸和磷酸中任意一种无机酸形成的盐；所述的有机酸盐为乙酸、三氟乙酸、丙二酸、柠檬酸和对甲苯磺酸中任意一种有机酸形成的盐。
上述式
所示的N-邻取代苯基苯甲酰胺-4-甲氨基吖啶类化合物优选为下述任意一种：
该化合物能够有效抑制Topo I的活性、抑制I型HDAC活性、抑制真核生物肿瘤细胞增殖、预防和/或治疗肿瘤。本发明提供的化合物经过多种肿瘤细胞系测试（包括白血病细胞和淋巴瘤细胞等）、Topo I活性抑制测试、HDAC（I型和II型）活性抑制测试、蛋白电泳实验检测细胞内DNA损伤标记物γ-H2AX表达的上调以及组蛋白H3乙酰化水平的上升、细胞凋亡实验检测化合物诱导肿瘤细胞凋亡等，证明本发明的化合物是一种潜在的双重抑制Topo I和I型HDAC，且有较强抗肿瘤细胞增殖活性的抗肿瘤药物。
具体实施例二
上述具体实施例一中N-邻取代苯基苯甲酰胺-4-甲氨基吖啶类化合物的制备方法，包括以下步骤：
（1）使式II所示化合物与式Ⅲ所示化合物反应，以便获得式Ⅳ所示化合物；根据本发明的实施例，式II所示化合物与式Ⅲ所示化合物进行反应的条件不受特别限制，但还可以具体为：于100-130℃下，以铜为催化剂、碳酸钾作为碱，使式II所示化合物与式Ⅲ所示化合物按照摩尔比为1：1.5的比例在无水N,N-二甲基甲酰胺中反应1-12小时，即获得式IV所示化合物；由此，有利于提高反应效率，减少副反应，提高产率；
（2）使式Ⅳ所示化合物与三氯氧磷反应，以便获得式V所示化合物；还可以具体为：于50-100℃下，使式Ⅳ所示化合物与三氯氧磷反应1-5小时，即获得式Ⅴ所示化合物；由此，能够在最合适的条件下进行反应，有利于提高反应效率，减少副反应，提高产率；
（3）使式V所示化合物与式VI所示化合物反应，以便获得式VII所示化合物；还可以具体为：于25-135℃下，使式V所示化合物与式VI所示化合物，在2-乙氧基乙醇中反应10-36小时，即获得式VII所示化合物；由此，有利于提高反应效率，减少副反应，提高产率；
（4）使式VII所示化合物与式VIII所示化合物反应，以便获得式I所示化合物；还可以具体为：于10-70℃下，使式VII所示化合物与式VIII所示化合物以2-(7-偶氮苯并三氮唑)-四甲基脲六氟磷酸酯（HATU）作为缩合剂、N,N-二异丙基乙胺（DIPEA）为碱，在二氯甲烷和无水N,N-二甲基甲酰胺中反应10-30小时，即获得式I所示化合物；由此，能够在最合适的条件下进行反应，有利于提高反应效率，减少副反应，提高产率。
其中，R1为H、CH3、OCH3、OCH2CH3、F、Cl、Br、CF3、NO2或碳原子数为1-5的直链烷基，R2为H、CH3、OCH3、OCH2CH3、F、Cl、Br、CF3、NO2或碳原子数为1-5的直链烷基，R3为NH2、NHCH3、NHCH2CH3、NHCH2CH2CH3、OH、COOH或SH，R4为H、CH3、OCH3、OCH2CH3、F、Cl、Br、CF3、NO2或碳原子数为1-5的直链烷基，m = 0，1或2，n = 0，1，2，3或4。利用上述制备方法能够快速有效地制备获得前面所述的化合物，且该方法操作简单、方便快捷、适于规模化生产。
实施例1：
（化合物1）的制备
1、 制备2-（苯基氨基）苯甲酸
将2-氯苯甲酸（25.64 mmol）和苯胺（12.82 mmol）、碳酸钾（19.23 mmol）和铜粉（19.23mmol）依次加入到二甲基甲酰胺（50 mL）溶剂中，然后于130℃下加热回流搅拌过夜，TLC检测（展开剂：乙酸乙酯/石油醚乙酸=1/1）反应结束。接着将所得到的反应混合物冷却后用硅藻土过滤，所得滤液加入到200 mL水中，再用盐酸将体系调至pH值约为3，抽滤并将得到的沉淀干燥，得到墨绿色固体粉末，无需纯化，直接进行下步反应。
2、制备9-氯吖啶
将步骤1中得到的2-（苯基氨基）苯甲酸加入到三氯氧磷（10 mL）中，并于100℃加热条件下回流3-5小时，然后将所得到的反应液冷却后缓慢加入到约150-200 mL的冰水混合物中，随后用氢氧化钠溶液将体系pH 值调至约为8，混合液在室温下继续搅拌30分钟后，有大量沉淀析出，TLC检测（展开剂：乙酸乙酯/石油醚=1/1）。抽滤并将得到的沉淀干燥，得到灰色固体粉末，即9-氯吖啶，两步总产率38%，熔点119.2℃-119.8℃。化合物结构数据表征为：1HNMR (600 MHz, d6-DMSO) δ 8.22 (dd, J = 8.1, 1.1 Hz, 2H), 7.75-7.68 (m, 2H),7.64-7.56 (m, 2H), 7.24 (dd, J = 7.8, 7.1 Hz, 2H)。
3、制备4-（（吖啶-9-氨基）甲基）苯甲酸
将步骤2中得到的9-氯吖啶（1.71 mmol）和4-氨甲基苯甲酸（2.23 mmol）加入到2-乙氧基乙醇（10 mL）中加热至90-100℃搅拌过夜，TLC（展开剂：二氯甲烷/甲醇=10/1）检测反应结束。反应体系冷却至室温后，有大量沉淀析出，经抽滤，所得固体用乙酸乙酯洗涤（20 mL×2次），即得粗产物。粗品经柱层析（洗脱剂：二氯甲烷/甲醇）得黄色固体粉末0.54 g，即4-（（吖啶-9-氨基）甲基）苯甲酸，产率97%，熔点：143.4-144.5℃。化合物结构数据表征为：1HNMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 8.29 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 8.17 (d, J = 8.9 Hz, 1H),7.93 (dd, J = 8.9, 2.6 Hz, 4H), 7.65 (t, J = 7.6 Hz, 1H), 7.55 (m, 3H), 7.31(t, J = 7.6 Hz, 1H), 7.21 (dd, J = 8.7, 6.7 Hz, 1H), 5.08 (s, 2H)。
4、化合物1的制备
于室温下，将步骤3中得到的4-（（吖啶-9-氨基）甲基）苯甲酸（0.20 mmol）、邻苯二胺（0.99 mmol）和2-(7-偶氮苯并三氮唑)-四甲基脲六氟磷酸酯（HATU）（0.22 mmol）在二氯甲烷（4 mL）和无水N,N-二甲基甲酰胺（1 mL）（两者体积比为4:1）中搅拌15分钟后，向反应体系中加入N,N-二异丙基乙胺（DIPEA）（0.40 mmol），继续室温搅拌过夜，TLC（展开剂：乙酸乙酯/三乙胺=10/1）检测反应结束。反应体系加入二氯甲烷（20 mL），用水（20 mL）洗涤3-4次，饱和食盐水（20 mL）洗涤1次，收集有机相，无水硫酸镁干燥后真空旋干，得粗产物。经柱层析（洗脱剂：石油醚/乙酸乙酯/三乙胺）得黄色固体粉末31.0 mg，即化合物1，产率37%，熔点：117.4-119.4℃。化合物结构数据表征为：1H NMR (500 MHz, DMSO-d 6) δ 9.63 (s,1H), 8.27 (s, 2H), 7.97 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.60 (m, 5H), 7.23 (m, 2H), 7.17(d, J = 7.8 Hz, 1H), 6.97 (td, J = 7.6, 1.5 Hz, 1H), 6.78 (dd, J = 8.0, 1.4Hz, 1H), 6.59 (td, J = 7.5, 1.4 Hz, 1H), 5.15 (s, 2H), 4.89 (s, 2H). 13C NMR(126 MHz, DMSO-d 6) δ 165.6, 162.8, 157.3, 152.3, 143.6, 133.6, 130.7, 128.4,127.4, 127.1, 126.9, 123.9, 116.7, 116.6, 49.1. HR-MS(ESI): Calcd for [M+H]+419.1866; Found: 419.1871。
实施例2：
（化合物2）的制备
1、制备2-（（2-甲基苯基氨基）苯甲酸
按照实施例1的步骤1制备2-（（2-甲基苯基氨基）苯甲酸，不同之处在于：将实施例1中的步骤1中的苯胺换成2-甲基苯胺进行反应。所得化合物为灰色固体粉末，无需纯化，直接进行下步反应。
2、制备9-氯-4-甲基吖啶
按照实施例1的步骤2制备9-氯-4-甲基吖啶，不同之处在于：将实施例1中的步骤2中的2-（苯基氨基）苯甲酸换成2-（（2-甲基苯基氨基）苯甲酸进行反应。所得化合物即为9-氯-4-甲基吖啶，两步总产率42%，熔点126.5℃-127.9℃。化合物结构数据表征为： 1H NMR (500MHz, CDCl3) δ 8.46-8.39 (m, 1H), 8.29 (m, 2H), 7.80 (t, J = 7.3 Hz, 1H),7.69-7.60 (m, 2H), 7.53 (dd, J = 8.8, 6.8 Hz, 1H), 2.95 (s, 3H)。
3、制备4-（（4-甲基吖啶-9-氨基）甲基）苯甲酸
按照实施例1的步骤3制备4-（（4-甲基吖啶-9-氨基）甲基）苯甲酸，不同之处在于：将实施例1中的步骤3中的9-氯吖啶换成9-氯-4-甲基吖啶进行反应。得黄色固体粉末，即4-（（4-甲基吖啶-9-氨基）甲基）苯甲酸，产率92%，熔点：157.2.4-159.4℃。化合物结构数据表征为：1H NMR (500 MHz, DMSO-d 6) δ 11.06 (s, 1H), 8.32 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 8.20(d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.99 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 7.95-7.89 (m, 2H), 7.73-7.65(m, 1H), 7.61-7.51 (m, 3H), 7.36-7.27 (m, 1H), 7.22 (dd, J = 8.7, 6.8 Hz,1H), 5.12 (s, 2H), 2.70 (s, 3H)。
4、化合物2的制备
按照实施例1的步骤4制备化合物2，不同之处在于：将实施例1中的步骤4中的4-（（吖啶-9-氨基）甲基）苯甲酸换成4-（（4-甲基吖啶-9-氨基）甲基）苯甲酸进行反应。所得化合物2为黄色固体，收率32%; 熔点157.8-159.3℃。化合物结构数据表征为：1H NMR (500 MHz,DMSO-d 6) δ 9.62 (s, 1H), 8.32 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 8.24-8.15 (m, 1H), 7.95(d, J = 7.9 Hz, 2H), 7.94-7.89 (m, 1H), 7.64 (t, J = 7.6 Hz, 1H), 7.55 (d, J= 8.0 Hz, 2H), 7.54-7.49 (m, 1H), 7.31 (t, J = 7.7 Hz, 1H), 7.20 (q, J = 6.9,5.7 Hz, 1H), 7.17-7.11 (m, 1H), 6.96 (td, J = 7.7, 1.5 Hz, 1H), 6.77 (dd, J =8.0, 1.4 Hz, 1H), 6.59 (td, J = 7.5, 1.4 Hz, 1H), 5.08 (s, 2H), 4.88 (s, 2H),2.70 (s, 3H). 13C NMR (126 MHz, DMSO-d 6) δ 165.5, 152.2, 144.3, 143.6, 133.7,130.5, 130.2, 129.9, 128.5, 127.2, 127.1, 127.0, 126.9, 124.7, 124.5, 123.7,122.8, 122.7, 122.4, 122.4, 122.3, 120.8, 119.0, 116.7, 116.5, 46.1, 19.2.HR-MS(ESI): Calcd for [M+H]+ 433.2023; Found: 433.2027。
实施例3：
（化合物3）的制备
1、制备2-（（2-甲氧基苯基氨基）苯甲酸
按照实施例1的步骤1制备2-（（2-甲氧基苯基氨基）苯甲酸，不同之处在于：将实施例1中的步骤1中的苯胺换成2-甲氧基苯胺进行反应。所得化合物为灰色固体粉末，无需纯化，直接进行下步反应。
2、制备9-氯-4-甲氧基吖啶
按照实施例1的步骤2制备9-氯-4-甲氧基吖啶，不同之处在于：将实施例1中的步骤2中的2-（苯基氨基）苯甲酸换成2-（2-甲氧基苯基氨基）苯甲酸进行反应。所得化合物即为9-氯-4-甲氧基吖啶，两步总产率26%，熔点126.7℃-127.0℃。化合物结构数据表征为：1H NMR(600 MHz, DMSO-d 6) δ 8.31 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 8.22 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 7.88(dd, J = 8.2, 7.0 Hz, 1H), 7.84 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.79-7.70 (m, 1H), 7.61(t, J = 8.2 Hz, 1H), 7.22 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 4.03 (s, 3H)。
3、制备4-（（4-甲氧基吖啶-9-氨基）甲基）苯甲酸
按照实施例1的步骤3制备4-（（4-甲氧基吖啶-9-氨基）甲基）苯甲酸，不同之处在于：将实施例1中的步骤3中的9-氯吖啶换成9-氯-4-甲氧基吖啶进行反应。得黄色固体粉末，即4-（（4-甲氧基吖啶-9-氨基）甲基）苯甲酸，产率90%，熔点：165.8-167.1℃。化合物结构数据表征为：1H NMR (500 MHz, DMSO-d 6) δ 12.91 (s, 1H), 8.43 (s, 1H), 8.22 (d, J = 9.1Hz, 1H), 7.98 (dd, J = 8.4, 2.3 Hz, 3H), 7.91-7.86 (m, 1H), 7.62 (d, J = 8.2Hz, 3H), 7.50-7.36 (m, 3H), 5.34 (s, 2H), 4.11 (s, 3H)。
4、化合物3的制备
按照实施例1的步骤4制备化合物3，不同之处在于：将实施例1中的步骤4中的4-（（吖啶-9-氨基）甲基）苯甲酸换成4-（（4-甲氧基吖啶-9-氨基）甲基）苯甲酸进行反应。所得化合物3为黄色固体，收率39%; 熔点 126.9-127.6 ℃。化合物结构数据表征为：1H NMR (500MHz, DMSO-d 6) δ 9.66 (s, 1H), 8.26 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 7.98 (d, J = 8.0 Hz,2H), 7.85 (d, J = 9.2 Hz, 2H), 7.57 (dd, J = 16.8, 7.9 Hz, 3H), 7.26-7.12 (m,3H), 7.09 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 6.98 (td, J = 7.6, 1.5 Hz, 1H), 6.80 (dd, J =8.0, 1.4 Hz, 1H), 6.61 (td, J = 7.6, 1.4 Hz, 1H), 5.13 (s, 2H), 4.91 (s, 2H),3.97 (s, 3H). 13C NMR (126 MHz, DMSO-d 6) δ 172.5, 169.3, 165.7, 152.4, 145.5,143.6, 133.5, 130.4, 128.4, 127.4, 127.1, 126.9, 125.9, 125.7, 124.7, 123.9,121.9, 121.5, 116.7, 116.6, 109.1, 56.2. HR-MS(ESI): Calcd for [M+H]+449.1972; Found: 449.1977。
实施例4：
（化合物4）的制备
1、制备2-（（4-甲氧基苯基氨基）苯甲酸
按照实施例1的步骤1制备2-（（4-甲氧基苯基氨基）苯甲酸，不同之处在于：将实施例1中的步骤1中的苯胺换成4-甲氧基苯胺进行反应。所得化合物为黑色固体粉末，产率67.6%，熔点180.8℃-187.2℃。化合物结构数据表征为：1H NMR (600 MHz, d6-DMSO) δ 12.93 (s,1H), 9.42 (s, 1H), 7.86 (s, 1H), 7.30 (t, J = 7.4 Hz, 1H), 7.17 (d, J = 8.2Hz, 2H), 6.95 (d, J = 8.2 Hz, 3H), 6.68 (s, 1H), 3.75 (s, 3H)。
2、制备9-氯-2-甲氧基吖啶
按照实施例1的步骤2制备9-氯-2-甲氧基吖啶，不同之处在于：将实施例1中的步骤2中的2-（苯基氨基）苯甲酸换成2-（（4-甲氧基苯基氨基）苯甲酸进行反应。所得化合物即为9-氯-2-甲氧基吖啶，两步总产率54%，熔点151.6℃-152.8℃。化合物结构数据表征为：1H NMR(600 MHz, d6-DMSO) δ 8.35 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 8.18 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 8.12(d, J = 9.4 Hz, 1H), 7.89–7.82 (m, 1H), 7.79–7.73 (m, 1H), 7.60 (dd, J = 9.4,2.5 Hz, 1H), 7.52 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 4.01 (s, 3H)。
3、制备4-（（2-甲氧基吖啶-9-氨基）甲基）苯甲酸
按照实施例1的步骤3制备4-（（2-甲氧基吖啶-9-氨基）甲基）苯甲酸，不同之处在于：将实施例1中的步骤3中的9-氯吖啶换成9-氯-2-甲氧基吖啶进行反应。得黄色固体粉末，即4-（（4-甲氧基吖啶-9-氨基）甲基）苯甲酸，产率95%，熔点：155.7-156.2℃。化合物结构数据表征为：1H NMR (500 MHz, DMSO-d 6) δ 8.32 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.99-7.93 (m, 2H),7.88 (t, J = 9.5 Hz, 2H), 7.72 (t, J = 7.7 Hz, 1H), 7.67 (s, 1H), 7.62 (d, J= 8.0 Hz, 2H), 7.48 (d, J = 9.3 Hz, 1H), 7.35 (t, J = 7.8 Hz, 1H), 5.17 (s,2H), 3.74 (s, 3H)。
4、化合物4的制备
按照实施例1的步骤4制备化合物4，不同之处在于：将实施例1中的步骤4中的4-（（吖啶-9-氨基）甲基）苯甲酸换成4-（（2-甲氧基吖啶-9-氨基）甲基）苯甲酸进行反应。所得化合物4为黄色固体，收率56%; 熔点105.6-107.1。化合物结构数据表征为：1H NMR (500 MHz,DMSO-d 6) δ 9.63 (s, 1H), 8.29 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 7.97 (d, J = 7.9 Hz, 2H),7.84 (d, J = 14.2 Hz, 2H), 7.60 (d, J = 7.8 Hz, 4H), 7.38 (dd, J = 9.5, 2.7Hz, 1H), 7.32 (t, J = 7.8 Hz, 1H), 7.18–7.13 (m, 1H), 6.97 (td, J = 7.7, 1.6Hz, 1H), 6.78 (dd, J = 8.0, 1.4 Hz, 1H), 6.59 (td, J = 7.6, 1.5 Hz, 1H), 5.05(s, 2H), 4.88 (s, 2H), 3.78 (s, 3H). 13C NMR (126 MHz, DMSO-d 6) δ 170.8,165.5, 155.3, 150.4, 147.6, 144.6, 144.5, 143.6, 133.7, 131.0, 129.5, 128.5,127.2, 127.1, 126.9, 124.7, 124.3, 123.8, 123.1, 120.7, 117.4, 116.9, 116.7,116.6, 101.2, 55.9, 52.4. HR-MS(ESI): Calcd for [M+H]+ 449.1972; Found:449.1977。
实施例5：
（化合物5）的制备
1、按照实施例1中的步骤1制备2-（苯基氨基）苯甲酸；
2、按照实施例1中的步骤2制备9-氯吖啶；
3、按照实施例1中的步骤3制备4-（（吖啶-9-氨基）甲基）苯甲酸；
4、按照实施例1中的步骤4制备化合物5，不同之处在于：将实施例1中的步骤4中的邻苯二胺换成4,5-二氯邻苯二胺进行反应。所得化合物5为黄色固体，收率66%; 熔点> 200 ℃。化合物结构数据表征为：1H NMR (500 MHz, Methanol-d 4) δ 8.14 (dd, J = 8.9, 1.3Hz, 2H), 7.82 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.77 (dd, J = 8.8, 1.2 Hz, 2H), 7.55 (ddd,J = 8.7, 6.6, 1.3 Hz, 2H), 7.44 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 7.23 (s, 1H), 7.18 (ddd,J = 8.8, 6.6, 1.3 Hz, 2H), 6.87 (s, 1H), 5.02 (s, 2H). 13C NMR (126 MHz,Methanol-d 4) δ 171.6, 167.3, 153.1, 147.9, 144.1, 143.0, 132.9, 130.4, 129.9,127.9, 127.5, 126.8, 126.3, 123.7, 123.0, 122.4, 118.8, 117.1, 116.1, 52.4.HR-MS(ESI): Calcd for [M+H]+ 487.1087; Found: 487.1090。
实施例6：
（化合物6）的制备
1、按照实施例2中的步骤1制备2-（（2-甲基苯基氨基）苯甲酸；
2、按照实施例2中的步骤2制备9-氯-4-甲基吖啶；
3、按照实施例2中的步骤3制备4-（（4-甲基吖啶-9-氨基）甲基）苯甲酸；
4、按照实施例2中的步骤4制备化合物6，不同之处在于：将实施例2中的步骤4中的邻苯二胺换成4,5-二氯邻苯二胺进行反应。所得化合物6为黄色固体，收率46%; 熔点179.7-180.9 ℃。化合物结构数据表征为：1H NMR (500 MHz, Methanol-d 4) δ 8.23 (dd, J =8.8, 1.3 Hz, 1H), 8.11 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 8.03 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 7.92(d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.67 (ddd, J = 8.5, 6.6, 1.3 Hz, 1H), 7.56–7.50 (m, 3H),7.34 (s, 1H), 7.31 (ddd, J = 8.2, 6.7, 1.3 Hz, 1H), 7.21 (dd, J = 8.8, 6.7Hz, 1H), 6.98 (s, 1H), 5.10 (s, 2H), 2.76 (s, 3H). 13C NMR (126 MHz, Methanol-d 4) δ 171.6, 167.3, 144.2, 143.0, 132.8, 130.6, 130.2, 129.9, 128.4, 127.9,127.8, 127.5, 127.2, 126.9, 123.7, 123.0, 122.5, 122.3, 122.0, 121.7, 120.2,118.8, 117.1, 116.5, 52.9, 29.4. HR-MS(ESI): Calcd for [M+H]+ 501.1243;Found: 501.1245。
实施例7： 
（化合物7）的制备
1、按照实施例3中的步骤1制备2-（（2-甲氧基苯基氨基）苯甲酸；
2、按照实施例3中的步骤2制备9-氯-4-甲氧基吖啶；
3、按照实施例3中的步骤3制备4-（（4-甲氧基吖啶-9-氨基）甲基）苯甲酸；
4、按照实施例3中的步骤4制备化合物7，不同之处在于：将实施例3中的步骤4中的邻苯二胺换成4,5-二氯邻苯二胺进行反应。所得化合物7为黄色固体，收率30%; 熔点143.8-144.9 ℃。化合物结构数据表征为：1H NMR (500 MHz, DMSO-d 6) δ 9.66 (s, 1H), 8.25(d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.96 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 7.84 (q, J = 9.4, 7.8 Hz, 2H),7.58 (t, J = 9.9 Hz, 3H), 7.46 (s, 1H), 7.22 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 7.14 (d, J= 8.3 Hz, 1H), 7.10 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 6.98 (s, 1H), 5.42 (s, 2H), 5.13 (s,2H), 3.98 (s, 3H). 13C NMR (126 MHz, DMSO-d 6) δ 170.8, 166.0, 158.9, 152.5,144.0, 133.1, 130.4, 128.5, 128.4, 128.1, 127.6, 127.4, 123.7, 118.9, 116.5,116.4, 60.2, 56.2. HR-MS(ESI): Calcd for [M+H]+ 517.1193; Found: 517.1191。
实施例8： 
（化合物8）的制备
1、按照实施例4中的步骤1制备2-（（4-甲氧基苯基氨基）苯甲酸；
2、按照实施例4中的步骤2制备9-氯-2-甲氧基吖啶；
3、按照实施例4中的步骤3制备4-（（2-甲基吖啶-9-氨基）甲基）苯甲酸；
4、按照实施例4中的步骤4制备化合物8，不同之处在于：将实施例2中的步骤4中的邻苯二胺换成4,5-二氯邻苯二胺进行反应。所得化合物8为黄色固体，收率62%; 熔点136.1-138.2 ℃。化合物结构数据表征为：1H NMR (500 MHz, DMSO-d 6) δ 9.66 (s, 1H), 8.29(d, J = 8.7 Hz, 1H), 7.96 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 7.91–7.79 (m, 2H), 7.65–7.57(m, 4H), 7.44 (s, 1H), 7.42–7.35 (m, 1H), 7.31 (t, J = 7.8 Hz, 1H), 6.97 (s,1H), 5.41 (s, 2H), 5.05 (s, 2H), 3.79 (s, 3H). 13C NMR (126 MHz, DMSO-d 6) δ165.9, 155.3, 150.2, 144.8, 144.1, 133.3, 129.4, 128.6, 128.4, 128.2, 127.8,127.6, 127.2, 125.4, 124.2, 123.6, 123.2, 120.2, 119.9, 116.9, 116.5, 116.4,101.1, 55.9, 52.4. HR-MS(ESI): Calcd for [M+H]+ 517.1193; Found: 517.1196。
实施例9： 
（化合物9）的制备
按照实施例5的步骤制备化合物9，不同之处在于：将实施例5中的步骤4中的4,5-二氯邻苯二胺换成4-甲氧基邻苯二胺进行反应。所得化合物9为黄色固体，收率22%; 熔点123.4-125.1 ℃。化合物结构数据表征为：1H NMR (600 MHz, DMSO-d 6) δ 10.20 (s, 1H),8.30 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.94 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.76 (d, J = 8.0 Hz, 2H),7.63 (t, J = 8.8 Hz, 4H), 7.34 (t, J = 7.8 Hz, 2H), 7.26 (dd, J = 9.5, 5.2Hz, 2H), 7.09 (t, J = 7.3 Hz, 1H), 5.19 (s, 2H), 3.50 (s, 3H). HR-MS(ESI):Calcd for [M+H]+ 449.1972; Found: 449.1976。
实施例10： 
（化合物10）的制备
按照实施例6的步骤制备化合物10，不同之处在于：将实施例6中的步骤4中的4,5-二氯邻苯二胺换成4-甲氧基邻苯二胺进行反应。所得化合物10为黄色固体，收率22%; 熔点172.2-174.1 ℃。化合物结构数据表征为：1H NMR (500 MHz, DMSO-d 6) δ 9.49 (s, 1H),8.33 (s, 1H), 8.21 (s, 1H), 7.94 (d, J = 8.1 Hz, 3H), 7.68 (s, 1H), 7.54 (d,J = 8.2 Hz, 3H), 7.33 (s, 1H), 7.26 (dd, J = 8.6, 2.5 Hz, 1H), 6.98 (d, J =8.6 Hz, 1H), 6.34 (d, J = 2.8 Hz, 1H), 6.17 (dd, J = 8.7, 2.8 Hz, 1H), 5.10(s, 2H), 4.89 (s, 2H), 3.67 (s, 3H), 2.71 (s, 3H). HR-MS(ESI): Calcd for [M+H]+ 463.2129; Found: 463.2133。
实施例11： 
（化合物11）的制备
按照实施例7的步骤制备化合物11，不同之处在于：将实施例7中的步骤4中的4,5-二氯邻苯二胺换成4-甲氧基邻苯二胺进行反应。所得化合物11为黄色固体，收率18%; 熔点115.6-117.4 ℃。化合物结构数据表征为：1H NMR (600 MHz, DMSO-d 6) δ 9.47 (s, 1H),8.28-8.18 (m, 1H), 7.93 (d, J = 7.8 Hz, 2H), 7.85-7.74 (m, 2H), 7.54 (d, J =8.0 Hz, 3H), 7.25-7.16 (m, 1H), 7.12 (s, 1H), 7.07 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 6.98(d, J = 8.6 Hz, 1H), 6.33 (d, J = 2.7 Hz, 1H), 6.16 (dd, J = 8.7, 2.7 Hz,1H), 5.09 (s, 2H), 4.88 (s, 2H), 3.95 (s, 3H), 3.66 (s, 3H). 13C NMR (126 MHz,DMSO-d 6) δ 178.8, 165.8, 159.2, 158.6, 157.3, 145.0, 128.9, 128.3, 127.3,117.0, 107.2, 102.4, 101.2, 56.2, 55.3, 52.9. HR-MS(ESI): Calcd for [M+H]+479.2078; Found: 479.2079。
实施例12： 
（化合物12）的制备
按照实施例8的步骤制备化合物12，不同之处在于：将实施例8中的步骤4中的4,5-二氯邻苯二胺换成4-甲氧基邻苯二胺进行反应。所得化合物12为黄色固体，收率41%; 熔点177.3-178.9 ℃。化合物结构数据表征为：1H NMR (500 MHz, DMSO-d 6) δ 9.50 (s, 1H),8.28 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 8.01-7.93 (m, 2H), 7.85 (br, 2H), 7.60 (t, J = 6.4Hz, 4H), 7.38 (dd, J = 9.3, 2.6 Hz, 1H), 7.31 (t, J = 7.8 Hz, 1H), 7.00 (d, J= 8.6 Hz, 1H), 6.35 (d, J = 2.9 Hz, 1H), 6.18 (dd, J = 8.6, 2.8 Hz, 1H), 5.04(s, 2H), 4.90 (s, 2H), 3.78 (s, 3H), 3.68 (s, 3H). 13C NMR (126 MHz, DMSO-d 6)δ 169.2, 165.6, 159.2, 158.7, 155.3, 150.2, 145.1, 144.4, 137.2, 133.8,133.1, 131.2, 129.4, 128.4, 128.4, 127.1, 125.2, 124.2, 123.1, 117.0, 102.6,102.4, 101.2, 100.6, 55.9, 55.4, 55.3. HR-MS(ESI): Calcd for [M+H]+ 479.2078;Found: 479.2085。
实施例13： 
（化合物13）的制备
按照实施例5的步骤制备化合物13，不同之处在于：将实施例5中的步骤4中的4,5-二氯邻苯二胺换成4-氟邻苯二胺进行反应。所得化合物13为黄色固体，收率33%; 熔点167.6-168.2 ℃。化合物结构数据表征为：1H NMR (500 MHz, DMSO-d 6) δ 9.57 (s, 1H), 8.29(d, J = 15.9 Hz, 2H), 7.97 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.58 (m, 6H), 7.21 (s, 2H),7.12 (dd, J = 8.6, 6.2 Hz, 1H), 6.55 (dd, J = 11.2, 2.9 Hz, 1H), 6.36 (td, J= 8.6, 2.8 Hz, 1H), 5.23 (s, 2H), 5.15 (s, 2H). 13C NMR (126 MHz, DMSO-d 6) δ165.9, 162.8, 162.4, 160.5, 150.4, 146.0, 145.9, 145.8, 133.4, 131.2, 130.6,129.8, 129.0, 128.9, 128.5, 127.3, 126.0, 122.9, 122.2, 119.8, 113.3, 102.6,102.4, 102.0, 101.8, 46.2. HR-MS(ESI): Calcd for [M+H]+ 437.1772; Found:437.1776。
实施例14： 
（化合物14）的制备
按照实施例6的步骤制备化合物14，不同之处在于：将实施例6中的步骤4中的4,5-二氯邻苯二胺换成4-氟邻苯二胺进行反应。所得化合物14为黄色固体，收率15%; 熔点166.4-168.2 ℃。化合物结构数据表征为：1H NMR (500 MHz, DMSO-d 6) δ 9.54 (s, 1H), 8.33(br, 1H), 8.20 (br, 1H), 7.93 (d, J = 8.0 Hz, 3H), 7.65 (br, 1H), 7.54 (d, J= 7.9 Hz, 3H), 7.32 (br, 1H), 7.22 (br, 1H), 7.15-7.02 (m, 1H), 6.53 (dd, J =11.2, 2.9 Hz, 1H), 6.34 (td, J = 8.5, 2.9 Hz, 1H), 5.20 (s, 2H), 5.07 (s,2H), 2.72 (s, 3H). 13C NMR (126 MHz, DMSO-d 6) δ 165.8, 160.5, 158.6, 157.0,151.9, 146.0, 145.9, 139.6, 137.4, 133.7, 129.0, 128.9, 128.5, 127.1, 125.0,124.2, 122.6, 122.1, 119.7, 109.7, 102.5, 102.3, 101.9, 101.7, 92.9, 63.2,14.4. HR-MS(ESI): Calcd for [M+H]+ 451.1929; Found: 451.1935。
实施例15： 
（化合物15）的制备
按照实施例7的步骤制备化合物15，不同之处在于：将实施例7中的步骤4中的4,5-二氯邻苯二胺换成4-氟邻苯二胺进行反应。所得化合物15为黄色固体，收率26%; 熔点157.6-159.1 ℃。化合物结构数据表征为：1H NMR (500 MHz, DMSO-d 6) δ 9.56 (s, 1H), 8.25(d, J = 8.5 Hz, 1H), 7.96 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.84 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 7.57(d, J = 7.9 Hz, 3H), 7.23 (d, J = 15.1 Hz, 1H), 7.15 (d, J = 8.0 Hz, 1H),7.11 (dd, J = 8.4, 6.6 Hz, 2H), 6.54 (dd, J = 11.2, 2.9 Hz, 1H), 6.35 (td, J= 8.5, 2.9 Hz, 1H), 5.22 (s, 2H), 5.12 (s, 2H), 3.98 (s, 3H). 13C NMR (126MHz, DMSO-d 6) δ 169.2, 165.9, 162.4, 160.5, 152.4, 147.5, 145.9, 145.9,133.3, 130.4, 129.0, 128.9, 128.4, 127.3, 127.3, 124.7, 119.7, 102.5, 102.3,102.0, 101.8, 63.2, 56.2. HR-MS(ESI): Calcd for [M+H]+ 467.1878; Found:467.1885。
实施例16： 
（化合物16）的制备
按照实施例8的步骤制备化合物16，不同之处在于：将实施例8中的步骤4中的4,5-二氯邻苯二胺换成4-氟邻苯二胺进行反应。所得化合物16为黄色固体，收率38%; 熔点115.1-115.6 ℃。化合物结构数据表征为：1H NMR (500 MHz, DMSO-d 6) δ 9.55 (s, 1H), 8.29(d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.96 (d, J = 7.9 Hz, 2H), 7.88 (dd, J = 16.2, 9.3 Hz,2H), 7.59 (d, J = 7.6 Hz, 4H), 7.46 (s, 1H), 7.38 (d, J = 9.5 Hz, 1H), 7.33(d, J = 8.7 Hz, 1H), 7.10 (dd, J = 8.7, 6.3 Hz, 1H), 6.53 (dd, J = 11.2, 2.9Hz, 1H), 6.35 (td, J = 8.5, 2.9 Hz, 1H), 5.21 (s, 2H), 5.02 (d, J = 7.1 Hz,2H), 3.78 (s, 3H). 13C NMR (126 MHz, DMSO-d 6) δ 165.8, 162.4, 160.5, 155.4,148.2, 146.0, 145.9, 144.5, 133.6, 131.5, 129.8, 129.1, 128.9, 128.48, 127.1,124.4, 124.0, 123.3, 119.7, 117.4, 117.0, 102.6, 102.4, 102.0, 101.8, 100.9,55.9, 52.3. HR-MS(ESI): Calcd for [M+H]+ 467.1878; Found: 467.1884。
实施例17： 
（化合物17）的制备
按照实施例5的步骤制备化合物17，不同之处在于：将实施例5中的步骤4中的4,5-二氯邻苯二胺换成4-甲基邻苯二胺进行反应。所得化合物17为黄色固体，收率15%; 熔点138.6-139.9 ℃。化合物结构数据表征为：1H NMR (500 MHz, DMSO-d 6) δ 9.61 (s, 1H), 8.28(br, 2H), 7.97 (d, J = 7.9 Hz, 2H), 7.59 (d, J = 8.0 Hz, 5H), 7.36-7.08 (m,3H), 7.01 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 6.89 (dt, J = 7.4, 1.2 Hz, 1H), 6.53 (t, J =7.6 Hz, 1H), 5.15 (s, 2H), 4.61 (s, 2H), 2.13 (s, 3H). 13C NMR (126 MHz, DMSO-d 6) δ 172.5, 165.8, 155.8, 141.8, 134.9, 133.1, 130.5, 128.74, 128.6, 128.4,128.1, 127.3, 125.4, 123.7, 123.4, 123.2, 122.0, 119.6, 117.1, 116.1, 113.3,113.2, 60.2, 18.3. HR-MS(ESI): Calcd for [M+H]+ 433.2023; Found: 433.2029。
实施例18： 
（化合物18）的制备
按照实施例5的步骤制备化合物18，不同之处在于：将实施例5中的步骤4中的4,5-二氯邻苯二胺换成2-氨基苄胺进行反应。所得化合物18为黄色固体，收率17%; 熔点> 200 ℃。化合物结构数据表征为：1H NMR (600 MHz, DMSO-d 6) δ 8.90 (t, J = 6.1 Hz, 1H),8.28 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.88 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.69-7.64 (m, 3H), 7.56(d, J = 8.1 Hz, 2H), 7.26 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 7.02 (d, J = 7.4 Hz, 1H), 6.95(t, J = 7.5 Hz, 1H), 6.61 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 6.50 (t, J = 7.3 Hz, 1H), 5.16(s, 2H), 5.14 (s, 1H), 4.31 (d, J = 6.1 Hz, 2H). HR-MS(ESI): Calcd for [M+H]+433.2023; Found: 433.2029。
实施例19： 
（化合物19）的制备
按照实施例7的步骤制备化合物19，不同之处在于：将实施例7中的步骤4中的4,5-二氯邻苯二胺换成4-溴邻苯二胺进行反应。所得化合物19为黄色固体，收率36%; 熔点> 200℃。化合物结构数据表征为：1H NMR (500 MHz, DMSO-d 6) δ 9.59 (s, 1H), 8.25 (d, J =8.5 Hz, 1H), 7.95 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.83 (d, J = 7.7 Hz, 2H), 7.57 (d, J =7.9 Hz, 3H), 7.22 (s, 1H), 7.15 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.10 (dd, J = 8.4, 3.0Hz, 2H), 6.95 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 6.71 (dd, J = 8.4, 2.3 Hz, 1H), 5.22 (s,2H), 5.13 (d, J = 4.7 Hz, 2H), 3.98 (s, 3H). 13C NMR (126 MHz, DMSO-d 6) δ172.5, 170.8, 165.8, 145.5, 142.9, 138.4, 133.3, 130.5, 129.0, 128.4, 127.3,125.1, 124.7, 122.9, 119.2, 118.7, 118.1, 117.9, 106.3, 60.2, 56.2. HR-MS(ESI): Calcd for [M+H]+ 527.1077; Found: 527.1079。
实施例20： 
（化合物20）的制备
按照实施例8的步骤制备化合物20，不同之处在于：将实施例8中的步骤4中的4,5-二氯邻苯二胺换成4-溴邻苯二胺进行反应。所得化合物20为黄色固体，收率41%; 熔点121.7-124.9 ℃。化合物结构数据表征为：1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 9.60 (s, 1H), 8.28(d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.96 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.85 (br, 2H), 7.64-7.55 (m,4H), 7.37 (dd, J = 9.3, 2.8 Hz, 1H), 7.35-7.27 (m, 1H), 7.10 (d, J = 8.4 Hz,1H), 6.95 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 6.71 (dd, J = 8.4, 2.3 Hz, 1H), 5.22 (s, 2H),5.05 (s, 2H), 3.78 (s, 3H). 13C NMR (126 MHz, DMSO-d 6) δ 172.5, 170.8, 165.7,155.3, 145.6, 144.6, 133.5, 129.3, 129.0, 128.5, 127.1, 124.2, 124.2, 123.1,122.9, 119.2, 118.7, 118.1, 116.9, 60.2, 55.8. HR-MS(ESI): Calcd for [M+H]+527.1077; Found: 527.1075。
具体实施例三
上述具体实施例一或者具体实施例二制备的化合物在制备药物中的用途。所述药物是一种潜在的Topo I和I型HDAC双重抑制剂，能够用于有效抑制Topo I的活性、抑制I型HDAC活性、抑制真核生物肿瘤细胞增殖、预防和/或治疗肿瘤。
上述真核生物为哺乳动物；上述肿瘤细胞为癌细胞；其中癌细胞为白血病细胞、淋巴瘤细胞、乳腺癌细胞、肝癌细胞、胰腺癌细胞、肺癌细胞、脑癌细胞、卵巢癌细胞、子宫癌细胞、睾丸癌细胞、皮肤癌细胞、胃癌细胞、鼻咽癌细胞、结肠癌细胞、膀胱癌细胞或直肠癌细胞，其中，白血病细胞优选人慢性髓白血病细胞和人急性淋巴细胞白血病细胞，淋巴瘤细胞优选人组织细胞淋巴瘤细胞。
需要说明的是，本发明的上述药物可通过注射、喷射、滴鼻、滴眼、渗透、吸收、物理或化学介导的方法导入机体，如肌肉、皮内、皮下、静脉、粘膜组织；也可被其他物质混合或包裹后导入机体。需要的时候，在上述药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等。另外，本发明的药物可以制成注射液、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、口服液、膏剂、霜剂等多种形式。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。
实施例1
MTT法细胞增殖抑制活性筛选
通过MTT法，采用处于对数生长期的人慢性粒细胞白血病细胞系K562细胞（悬浮细胞）、人急性淋巴白血病细胞CCRF-CEM（悬浮细胞）和人组织细胞淋巴瘤细胞U937（悬浮细胞），检测上述具体实施例二中实施例1-20制备获得的化合物的体外细胞增殖抑制活性。其中，阳性对照药为：Topo抑制剂安丫啶和HDAC抑制剂西达本胺。肿瘤细胞用含体积分数为10%胎牛血清的RPIM-1640培养液，于37℃、体积分数为5%的CO2条件下常规培养；细胞增殖抑制活性测试的具体步骤为：(a)、将测试的化合物分别配制成初浓度为5 mM的二甲基亚砜DMSO溶液，再将所得初浓度溶液进行梯度稀释，得到2.5 mM，1 mM，0.5 mM，0.1 mM，0.01 mM等多个浓度梯度的化合物溶液；(b)、将肿瘤细胞以每毫升1.5×105个（悬浮细胞）的细胞密度接种于96孔板中（每孔99 μL），然后往每孔加入1 μL的测试化合物溶液，使化合物终浓度分别达到0.1 μM、1 μM、5 μM、10 μM、25 μM和50 μM。每个化合物的每个浓度均设三个复孔。另外，96孔板中设置一个空白对照，空白对照不加测试化合物；(c)、96孔板在培养箱中放置72小时后加入MTT溶液（每孔10 μL），然后继续在培养箱中培养4小时，再于4℃下，离心速度为2000 rpm的条件下离心5分钟。将上清液吸去，并加入DMSO（每孔加入100 μL），再用微量振荡器将96孔板振荡约3-5分钟；(d)、最后用酶标仪在490 nm处测量OD值，并计算出细胞增殖的抑制率（IR%）。计算公式为：IR% ＝（阳性对照OD-药物样品OD）/（阳性对照OD-空白对照OD）× 100%。实验结果见表1。
表1化合物1-20的抗增殖活性筛选结果
注： IC50表示半数抑制浓度。
表1显示的是N-邻取代苯基苯甲酰胺-4-甲氨基吖啶类化合物的MTT结果。从结果中可以看出，当吖啶母核C环上R2取代基为H或者4位取代基时，如：4-CH3或4-OCH3，化合物对白血病CCRF-CEM细胞的抗增殖活性较R2为其他取代基（如2-OCH3）时，有明显提高；另外，化合物针对白血病K562细胞的活性值较阳性药西达本胺有一定程度的提高，其中化合物2对白血病K562细胞的抑制活性最强，相比与西达本胺，其IC50值提高了13倍以上；当吖啶母核C环上R2取代基为H或者4-CH3时，化合物对淋巴瘤U937细胞的抑制活性明显优于R2为其他取代基；此外值得注意的是，当C环上R2取代基为H或者4-CH3，且D环上的R3取代基均为H或者4'-F时，化合物对三种肿瘤细胞的抑制活性均表现突出，如：化合物2对白血病CCRF-CEM细胞、K562细胞以及淋巴瘤U937细胞的IC50值分别达到0.15 μM、0.35 μM和0.12 μM。
实施例2
组蛋白去乙酰化酶（HDAC1和HDAC6）活性抑制实验
本实验检测化合物1-20对I型HDAC（HDAC1）和II型HDAC（HDAC6）活性抑制效果，具体步骤按照HDAC1和HDAC6 活性抑制检测试剂盒说明进行操作。大致步骤如下：将待测化合物加入到Tris 缓冲溶液中，加入15 μL HDAC1 或HDAC6 的酶溶液，室温下孵育15 分钟后，加入10 uL包含胰蛋白酶和乙酰化荧光蛋白的底物缓冲溶液，室温下轻轻混合并孵育1 小时。以Synergy MX 仪器检测355 nM（激发波长）和480 nM（发射波长）处荧光信号强度，并计算化合物对HDAC1、HDAC6 的抑制率，并根据浓度-抑制率曲线求得IC50 值。阳性对照药选用广谱HDAC抑制剂SAHA。实验结果见表2。
表2显示的是N-邻取代苯基苯甲酰胺-4-甲氨基吖啶类化合物对组蛋白去乙酰化酶（HDAC1和HDAC6）活性抑制结果。从表2中可以看出，化合物1、化合物2、化合物3、化合物4、化合物10、化合物13和化合物15具有明显的HDAC1抑制活性，其IC50值在248 nM-739 nM之间。此外，特别值得注意的是，与阳性对照药SAHA相比较，这些化合物对HDAC6没有抑制活性（IC50值均大于5000 nM），这说明本专利报道的此系列化合物具有很强的HDAC亚型选择性，是一种HDAC1亚型选择性抑制剂。
表2化合物1-20的HDAC1/6活性抑制筛选结果
注： IC50表示半数抑制浓度。
实施例3
拓扑异构酶I（Topo I）活性抑制实验
本实验选取了具有显著的HDAC1抑制活性的化合物，如化合物1、化合物2、化合物3、化合物4、化合物10、化合物13和化合物15，以及具有较突出的抗肿瘤细胞增殖活性但无HDAC1抑制活性的代表性化合物，如化合物14和化合物18，进行Topo I活性抑制实验，用以验证这些化合物是否具有Topo I抑制活性。具体步骤按照Topo I活性抑制检测试剂盒说明进行操作，阳性对照药选用喜树碱（CPT，Topo I抑制剂）。图1中S代表supercoil，指DNA的超螺旋状态，R代表relax，指DNA的松弛状态。实验中pHOT-1 DNA的初始状态为超螺旋，加入Topo I后会解螺旋变成松弛状态。如果加入的被测化合物能够抑制Topo I，那么pHOT-1 DNA会仍处于超螺旋状态。通过实验，我们发现这些化合物在100 μM浓度下，对Topo I均有较好的抑制活性，且比阳性对照药喜树碱抑制效果更明显。结合HDAC活性测试实验结果，表明本专利报道的此系列化合物是一种很有潜力的HDAC1和Topo I双重抑制剂。
实施例4
蛋白质印记分析实验
Topo I抑制剂能引起肿瘤细胞内DNA链断裂，造成DNA损伤进而诱导细胞凋亡。DNA损伤发生时，会促使细胞内组蛋白H2AX磷酸化从而形成γ-H2AX，所以γ-H2AX 被认为是DNA 损伤的重要生物标记物。为了验证化合物在三种肿瘤细胞（U937细胞、CCRF-CEM细胞以及K562细胞）中能否有效地造成DNA损伤，本发明选择化合物2作为测试样品进行了蛋白质印记分析实验。以淋巴瘤U937细胞为例，从图2中可以看出，随着化合物浓度从0.1 μM增加到0.4 μM时，U937细胞中γ-H2AX的表达是明显上调的。此现象说明化合物2确实是通过抑制淋巴瘤U937细胞中Topo I的活性，进而造成DNA损伤。
此外，本实验进一步探究化合物2在细胞水平对组蛋白乙酰化的影响。组蛋白H3的赖氨酸残基的乙酰化可以促进染色质的舒张和活化，从而便于转录因子与抑癌基因的启动子结合。我们测试了U937 细胞经不同浓度的化合物2处理48 小时后H3K9乙酰化水平的变化。结果如图2 所示，H3K9乙酰化水平随着化合物2浓度的增加而显著升高。因此，本实验进一步证明化合物2是有效的HDAC1 抑制剂。
实施例5
细胞凋亡检测
通过使用Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒，进一步验证化合物2是否诱导了三种肿瘤细胞（U937细胞、CCRF-CEM细胞以及K562细胞）的凋亡。测试结果如图3所示。以淋巴瘤U937细胞为例，化合物2从0 μM增加到2 μM，能显著引起U937细胞的早期和晚期凋亡（凋亡百分比从未加药时的18.78%增加至84.5%）。因此，通过以上生物学测试和机理验证，表明了化合物2是通过抑制细胞内Topo I和HDAC1的活性，诱导了肿瘤细胞的凋亡。
上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种N-邻取代苯基苯甲酰胺-4-甲氨基吖啶类化合物，其特征在于：所述化合物为具有式I所示结构式的N-邻取代苯基苯甲酰胺-4-甲氨基吖啶类或具有式I所示结构式的N-邻取代苯基苯甲酰胺-4-甲氨基吖啶类化合物的药学上可接受的盐、酯或溶剂合物，
其中，R1为H、CH3、OCH3、OCH2CH3、F、Cl、Br、CF3、NO2或碳原子数为1-5的直链烷基，R2为H、CH3、OCH3、OCH2CH3、F、Cl、Br、CF3、NO2或碳原子数为1-5的直链烷基，R3为NH2、NHCH3、NHCH2CH3、NHCH2CH2CH3、OH、COOH、SH，R4为H、CH3、OCH3、OCH2CH3、F、Cl、Br、CF3、NO2或碳原子数为1-5的直链烷基，m = 0，1或2，n = 0，1，2，3或4；上述式
所示化合物药学上可接受的盐、酯或溶剂合物，其中所述的盐为无机酸盐或有机酸盐，所述的无机酸盐为盐酸、硫酸和磷酸中任意一种无机酸形成的盐；所述的有机酸盐为乙酸、三氟乙酸、丙二酸、柠檬酸和对甲苯磺酸中任意一种有机酸形成的盐。
2.一种权利要求1所述的N-邻取代苯基苯甲酰胺-4-甲氨基吖啶类化合物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）使式II所示化合物与式Ⅲ所示化合物反应，获得式Ⅳ所示化合物；
（2）使式Ⅳ所示化合物与三氯氧磷反应，获得式V所示化合物；
（3）使式V所示化合物与式VI所示化合物反应，获得式VII所示化合物；
（4）使式VII所示化合物与式VIII所示化合物反应，获得式I所示化合物，
其中，R1为H、CH3、OCH3、OCH2CH3、F、Cl、Br、CF3、NO2或碳原子数为1-5的直链烷基，R2为H、CH3、OCH3、OCH2CH3、F、Cl、Br、CF3、NO2或碳原子数为1-5的直链烷基，R3为NH2、NHCH3、NHCH2CH3、NHCH2CH2CH3、OH、COOH或SH，R4为H、CH3、OCH3、OCH2CH3、F、Cl、Br、CF3、NO2或碳原子数为1-5的直链烷基，m = 0，1或2，n = 0，1，2，3或4。
3.根据权利要求2所述的一种N-邻取代苯基苯甲酰胺-4-甲氨基吖啶类化合物的制备方法，其特征在于步骤（1）具体为：于100-130℃下，以铜为催化剂、碳酸钾作为碱，使式II所示化合物与式Ⅲ所示化合物按照摩尔比为1：1.5的比例在无水N,N-二甲基甲酰胺中反应1-12小时，即获得式IV所示化合物。
4.根据权利要求2所述的一种N-邻取代苯基苯甲酰胺-4-甲氨基吖啶类化合物的制备方法，其特征在于步骤（2）具体为：于50-100℃下，使式Ⅳ所示化合物与三氯氧磷反应1-5小时，即获得式Ⅴ所示化合物。
5.根据权利要求2所述的一种N-邻取代苯基苯甲酰胺-4-甲氨基吖啶类化合物的制备方法，其特征在于步骤（3）具体为：于25-135℃下，使式V所示化合物与式VI所示化合物，在2-乙氧基乙醇中反应10-36小时，即获得式VII所示化合物。
6.根据权利要求2所述的一种N-邻取代苯基苯甲酰胺-4-甲氨基吖啶类化合物的制备方法，其特征在于步骤（4）具体为：于10-70℃下，使式VII所示化合物与式VIII所示化合物以2-(7-偶氮苯并三氮唑)-四甲基脲六氟磷酸酯（HATU）作为缩合剂、N,N-二异丙基乙胺（DIPEA）为碱，在二氯甲烷和无水N,N-二甲基甲酰胺中反应10-30小时，即获得式I所示化合物。
7.权利要求1-6中任一项所述的N-邻取代苯基苯甲酰胺-4-甲氨基吖啶类化合物在制备预防和/或治疗肿瘤药物中的用途。
8.权利要求1-6中任一项所述的N-邻取代苯基苯甲酰胺-4-甲氨基吖啶类化合物在制备抑制DNA拓扑异构酶I、抑制I型HDAC和/或抑制真核生物肿瘤细胞增殖药物中的用途。
9.权利要求8所述的N-邻取代苯基苯甲酰胺-4-甲氨基吖啶类化合物在制备抑制双重抑制Topo I和I型HDAC药物中的用途。
10.根据权利要求8或9所述的一种N-邻取代苯基苯甲酰胺-4-甲氨基吖啶类化合物的应用，其特征在于：所述的真核生物为哺乳动物；所述的肿瘤细胞为癌细胞；其中癌细胞为白血病细胞、淋巴瘤细胞、乳腺癌细胞、肝癌细胞、胰腺癌细胞、肺癌细胞、脑癌细胞、卵巢癌细胞、子宫癌细胞、睾丸癌细胞、皮肤癌细胞、胃癌细胞、鼻咽癌细胞、结肠癌细胞、膀胱癌细胞或直肠癌细胞。
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN111057004B (zh) | 2023-10-31 |
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