CN114605401B - 一类含氧五元杂环化合物、合成方法、药物组合物及用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一类含氧五元杂环化合物、合成方法、药物组合物及用途，属于医药及其制备和应用的技术领域。本发明含氧五元杂环具有抑制PTP1B、TCPTP的生物活性，为预防和治疗癌症、代谢与免疫疾病提供手段。

Description

一类含氧五元杂环化合物、合成方法、药物组合物及用途
本发明为申请号为202010348669.5、申请日为2020年4月28日、发明名称为“一类含氧五元杂环化合物、合成方法、药物组合物及用途”的分案。
技术领域
本发明属于医药及其制备和应用的技术领域，具体涉及一类含氧五元杂环化合物、合成方法、药物组合物及用途。
背景技术
SHP2是一个在体内广泛存在的非受体型蛋白酪氨酸磷酸酶，由两个二个SH2结构域(N-SH2和C-SH2)，一个具有催化活性的PTP结构域及富含脯氨酸基团及酪氨酸磷酸化尾巴组成。SHP2作为血小板源性生长因子(PDGF)、表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞因子(FGF)、白细胞介素-3(IL-3)、白血病抑制因子(LIF)及α-干扰素(INF-α)等生长因子的下游信号分子，参与多条信号通路(例如RAS/MARK通路、PI3K/AKT通路、JAK/STAT通路、JNK通路、NF-B通路、RHO通路、NFAT通路等)，在细胞信息传递过程中起着关键的作用。SHP2编码基因发生突变被认作是人类多种疾病的驱动力，例如在努南(NOONAN)综合征中有40-50％的患者发生了PTPN11的突变；在青少年粒单核细胞白血病(JMML)和急性髓细胞白血病(AML)中PTPN11的突变率分别达到35％和6.6％。在白血病中，SHP2突变类型主要是E76K、D61Y、E139D、Q506P等，其中E76K这个突变类型是最常见的，也是与白血病最为密切的。因此，突变型SHP2是潜在的抗肿瘤靶点。
近年来，SHP2抑制剂取得了重要的进展。在发现第一个野生型SHP2变构抑制剂SHP099之后，出现了一些基于SHP099结构改造的变构抑制剂，具体结构如下所示：
其中TNO155、RMC-4630以及JAB-3068等抑制剂处于临床研究。遗憾的是，现有的SHP2抑制剂都不是突变型SHP2抑制剂，不能满足临床药物开发的需求。因此，迫切需要发现更多结构新颖、选择性高的抑制剂，为研究突变型SHP2在白血病信号通路中的生物功能提供工具化合物，为白血病治疗提供药物。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服突变型SHP2抑制剂的稀缺性问题，提供一类含氧五元杂环全新骨架类型的突变型SHP2抑制剂、其中间体、合成方法、药物组合物及用途。该类化合物具有抑制蛋白酪氨酸磷酸酶SHP2的生物活性，尤其对E76K突变型SHP2具有高度选择性，在细胞中能有效抑制SHP2下游信号通路的磷酸化水平，对肿瘤细胞具有很好的抑制活性，可以为预防和治疗癌症、代谢与免疫疾病提供新的手段，具有广阔的药物开发前景。
本发明主要通过以下技术方案解决上述技术问题。
[化合物]
本发明提供了一种通式VI所示的一类含氧五元杂环化合物或其药学上可接受的盐：
每个R1，R2分别独立地选自未取代或取代芳环、未取代或取代杂芳环、C1-6烷基、取代烯基、取代环丙基、 其中取代芳环、取代杂芳环、取代烯基、取代环丙基上的取代基分别独立地选自-F、-Cl、-Br、-I、-CN、-NO2、-NH2、CF3、炔基、C1-7胺基、炔氨基、N,N-二乙基乙二胺基或NHCOR6的单取代或者二取代，其中R6为呋喃基，取代呋喃基，取代或者未取代的四氢呋喃基，噻吩基，氯甲基，2-苯基-环丙基。
优选地，
当R1为Ary C,R2为Ary A时，一类含氧五元杂环化合物的具体通式为VII：
其中Ary A和Ary C分别独立选
最优选地，一类含氧五元杂环化合物VII具体为：
在本发明的一种实施方式中，所述药学上可接受的盐包括：可药用的酸加成盐，如：无机酸例如盐酸、氢溴酸、磷酸、偏磷酸、硝酸和硫酸的盐，以及有机酸例如乙酸、苯磺酸、苯甲酸、柠檬酸、乙磺酸、富马酸、萄糖酸、羟乙酸、羟乙磺酸、乳酸、乳糖酸、马来酸、苹果酸、甲磺酸、琥珀酸、对甲苯磺酸和酒石酸的盐；可药用碱的盐是铵盐、碱金属盐(例如钠盐和钾盐)和碱土金属盐(例如镁盐和钙盐)以及氨基丁三醇(2-氨基-2-羟基甲基-1，3-丙二醇)、二乙醇胺、赖氨酸或乙二胺的盐。
[合成方法]
本发明还提供了一种所述通式VI化合物的合成方法，所述方法通过以下反应方案来实施：
试剂和条件：a)三甲基硅炔，双三苯基磷二氯化钯(Pd(PPh3)2Cl2)，碘化亚铜(CuI)，70℃，4h；b)异丙胺，乙腈；c)三乙胺，双三苯基磷二氯化钯(Pd(PPh3)2Cl2)，碘化亚铜(CuI)；d)二氯化钯，二甲亚砜(DMSO)，140℃，2h；e)盐酸羟胺，吡啶，100℃，24h；f)琥珀酸酐，180℃，10min
三甲基硅炔、溴化物7、Pd(PPh3)2Cl2和CuI的二异丙胺溶液在油浴锅中回流反应4h，反应完全后抽滤，滤液加入乙酸乙酯和盐酸，收集有机相，干燥，浓缩得化合物8。化合物8和异丙胺的乙腈溶液在常温下反应过夜，反应完全后抽滤，滤液加入乙酸乙酯和盐酸，萃取，收集有机相，干燥，浓缩，得化合物9。将化合物9和化合物10溶于三乙胺中搅拌均匀后，加入Pd(PPh3)2Cl2和CuI，N2保护后置于常温下反应过夜，反应完全后抽滤，滤液加入乙酸乙酯和盐酸，萃取，收集有机相，无水硫酸钠干燥，浓缩得化合物11。化合物11和二氯化钯的二甲亚砜溶液，在氮气保护下，140°反应2h，反应完全后抽滤，加入乙酸乙酯和饱和食盐水进行萃取，收集有机相，干燥，浓缩，柱层析分离，得到化合物12。将化合物12和盐酸羟胺的吡啶溶液回流反应24h，反应完全后，依次向反应液中加入冰水，加入1mol/L盐酸，抽滤，沉淀物干燥得化合物13。将化合物13和琥珀酸酐置于油浴锅中回流搅拌反应10min，反应完全后，向反应液中加入水中，固体析出，抽滤，得化合物VII。
其中Ary A和Ary C分别独立选
除特殊说明外，以上反应中所用试剂为本领域的常规试剂。例如，以上反应可以在如下溶剂中进行：N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、乙腈(CH3CN)、甲醇、二氯甲烷、四氢呋喃(THF)、水或上述溶剂的混合溶剂。有时反应还需要加入吡啶、三乙胺、二乙丙基乙基胺或N,N-二甲氨基吡啶(DMAP)等活化剂。根据具体化合物的反应情况，反应温度一般为-20℃至室温或加热温度从45℃至180℃。反应时间根据具体反应物而定。所用缩合剂为本领域中常规的缩合剂，所用碱为本领域中常规的无机碱和有机碱，所用酯化试剂和还原试剂为本领域的常规酯化试剂和还原剂。通常用TLC来跟踪测定反应的完成程度，反应完毕后一般采用的后处理方法包括抽滤、浓缩反应液除尽溶剂、萃取、柱层析分离等。最终产物用NMR或者质谱来检测证明。
[用途]
通式VI所示的化合物或其药学上可接受的盐在制备预防和治疗癌症、代谢与免疫疾病的药物中的用途。
通式VI所示的化合物或其药学上可接受的盐在制备蛋白酪氨酸磷酸酶SHP2抑制剂中的用途。
在所述用途中，通式VI所示的化合物或其药学上可接受的盐作为包括E76K突变在内的SHP2获得性突变体、野生型SHP2、SHP1、TCPTP以及PTP1B抑制剂。
[药物和药物组合物]
本发明还提供了一种药物组合物，该组合物包含治疗有效量的所述通式VI所示的化合物或其药学上可接受的盐，和任选的药学上可接受的辅料。其中，所述药物组合物用于预防和治疗癌症、代谢与免疫疾病。
本发明还提供了一种用于预防和治疗癌症、代谢与免疫疾病、心血管病或者神经性疾病的药物，所述药物包含通式VI所示的化合物或其药学上可接受的盐，和药用辅料。
所述辅料包含溶剂、抛射剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、黏合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、润湿剂、渗透压调节剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、防腐剂、助悬剂、包衣材料、芳香剂、抗黏合剂、整合剂、渗透促进剂、pH值调节剂、缓冲剂、增塑剂、表面活性剂、发泡剂、消泡剂、增稠剂、包合剂、保湿剂、吸收剂、稀释剂、絮凝剂与反絮凝剂、助滤剂以及释放阻滞剂。
所述药物或者药物组合物还可以包括载体，所述载体包括微囊、微球、纳米粒和脂质体。
所述药物的剂型包括注射液、注射用冻干粉针、控释注射剂、脂质体注射剂、混悬剂、植入剂、栓塞剂、胶囊剂、片剂、丸剂和口服液。
有效效果：
本发明含氧五元杂环具有抑制蛋白酪氨酸磷酸酶SHP2的生物活性，可以作为工具化合物研究蛋白酪氨酸磷酸酶SHP2在细胞信号转导过程中的生物学功能关联性，为预防和治疗癌症、代谢与免疫疾病提供新的手段。
具体实施方式
本申请涉及的烷基包括：甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、新戊基、异戊基、环戊基、正丁基或环丁基等。
本申请涉及的取代芳环基包括：卤素取代芳环基、CN基取代芳环基、OH基取代芳环基、NH2基取代芳环基，N3取代芳环基、NO2取代芳环基、C1-6烷氧基取代芳环基、取C1-6烷基取代芳环基、C5-18杂环基或C5-18碳环基取代芳环基。
本申请涉及的未取代或取代杂芳环基包括：5元杂芳环、6元杂芳环、7元杂芳环、8元杂芳环、5元杂环、6元杂环、7元杂环或8元杂环，其中每个环系含有1、2、3或4个杂原子，所述杂原子选自N、O或S，且每个环系任意地被取代基取代或不取代，所述取代基分别独立地选自-F、-Cl、-Br、-I、-CN、-OH、-NH2、羰基、＝O、氧代、取代或未取代的C1-3烷基、取代或未取代的C1-3烷氧基。
本申请涉及的取代烯基包括：C2-C6直链或支链烯基。
本申请涉及的取代环烷基包括：3元环、4元环、5元环、6元环、7元环、8元环，且每个环系任意地被取代基取代或不取代，所述取代基分别-OH、-NH2、羰基、＝O、氧代、取代或未取代的C1-3烷基、取代或未取代的C1-3烷氧基。
本申请涉及的烷氧基烷基包括：甲氧基乙基、乙氧基乙基、丙氧基或异丙氧基乙基、
本申请涉及的合成过程具备包括如下步骤：
反应操作：
试剂和条件：a)三甲基硅炔，双三苯基磷二氯化钯(Pd(PPh3)2Cl2)，碘化亚铜(CuI)，70℃，4h；b)异丙胺，乙腈；c)三乙胺，双三苯基磷二氯化钯(Pd(PPh3)2Cl2)，碘化亚铜(CuI)；d)二氯化钯，二甲亚砜(DMSO)，140℃，2h；e)盐酸羟胺，吡啶，100℃，24h；f)琥珀酸酐，180℃，10min
三甲基硅炔(1.2eq)、溴化物7(1.0eq)、Pd(PPh3)2Cl2(0.03eq)和CuI(0.03eq)的二异丙胺溶液在油浴锅中70℃回流反应4h，反应完全后抽滤，滤液加入乙酸乙酯和盐酸，收集有机相，干燥，浓缩，柱层析分离，得化合物8。化合物8(1.0eq)和异丙胺(2.0eq)的乙腈溶液在常温下反应过夜，反应完全后抽滤，滤液加入乙酸乙酯和盐酸，萃取，收集有机相，干燥，浓缩，得化合物9。将化合物9(1.2eq)和化合物10(1.0eq)溶于三乙胺中搅拌均匀后，加入Pd(PPh3)2Cl2(0.03eq)和CuI(0.03eq)，N2保护后置于常温下反应过夜，反应完全后抽滤，滤液加入乙酸乙酯和盐酸，萃取，收集有机相，无水硫酸钠干燥，浓缩，柱层析分离得化合物11。化合物11(10.0eq)和二氯化钯(1.0eq)的二甲亚砜溶液，在氮气保护下，140℃反应2h，反应完全后抽滤，加入乙酸乙酯和饱和食盐水进行萃取，收集有机相，干燥，浓缩，得到化合物12。将化合物12(1.0eq)和盐酸羟胺(8.0eq)的吡啶溶液100℃回流反应24h，反应完全后，依次向反应液中加入冰水，加入1mol/L盐酸，抽滤，沉淀物干燥得化合物13。将化合物13(1.0eq)和琥珀酸酐(5.0eq)置于油浴锅中180℃回流搅拌反应10min，反应完全后，向反应液中加入水中，固体析出，抽滤，用甲醇重结晶得化合物VII。
下述制备例中，1H-NMR谱采用Bruker AVⅢ-400MHz型核磁共振仪测定；质谱采用Waters Micromass Platform LCZ Mass Spectrometer型质谱仪测定；试剂主要由上海化学试剂公司提供，产品纯化主要用柱层析法，硅胶(200-300目)，柱色谱法所用的硅胶型号为粗空(ZLX－Ⅱ)，由青岛海洋化工厂分厂生产。
如未作特别说明，本发明所采用的方法和仪器等为本领域公知的技术。
实施例1含氧五元杂环化合物的合成
重要中间体的制备：
冰浴条件下，将异丙胺(2.69g，45.56mol)缓慢滴加到2-氟-5-溴硝基苯(5g，22.73mol)的乙腈(40mL)溶液中，搅拌5min后置于120℃油浴锅中回流反应1.5h，监测反应完全后，加入二氯甲烷(200mL)和盐酸(200mL，1mol/L)萃取，收集有机相，无水硫酸钠干燥，浓缩得化合物III-1(5.26g，产率90％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.16(d,J＝2.5Hz,1H),7.89(d,J＝7.7Hz,1H),7.65(dd,J＝9.3,2.5Hz,1H),7.09(d,J＝9.3Hz,1H),3.93(dq,J＝13.1,6.5Hz,1H),1.26(d,J＝6.3Hz,6H).MS(ESI):m/z calcd.For C9H12BrN2O2[M+H]+259.0,found 259.0
将含有化合物III-1(5g，0.02mol)和NH4Cl(4.28g，0.08mol)的乙醇和水(2:1，60mL)溶液置于90℃油浴锅中回流反应30min后加入铁粉(4.48g，0.08mol)，继续回流搅拌反应2h，监测反应完全后，热抽滤，滤渣用热乙醇洗涤2次，滤液冷却后，饱和NaHCO3水溶液调碱，乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，浓缩，得化合物III-2(2.28g，收率50％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ6.68(d,J＝2.4Hz,1H),6.58(dd,J＝8.3,2.4Hz,1H),6.32(d,J＝8.4Hz,1H),4.79(s,3H),3.48(q,J＝6.3Hz,1H),1.14(d,J＝6.3Hz,6H).MS(ESI):m/zcalcd.For C9H14BrN2[M+H]+229.0,found 229.0.
将化合物III-2(2g，8.77mmol)与草酸二乙酯(20mL，0.14mol)混合均匀，氮气保护后置于145℃油浴锅中回流反应过夜，监测反应完全后，加入乙醇稀释，有大量固体析出，抽滤，干燥得灰白色固体化合物III-3(1.87g，收率76％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.01(s,1H),7.51(d,J＝8.8Hz,1H),7.32–7.25(m,2H),4.97(s,1H),1.49(d,J＝6.9Hz,6H).MS(ESI):m/z calcd.For C11H12BrN2O2[M+H]+283.0,found 283.0.
除了适当替换相应的反应化合物外，以下化合物的制备参照中间体III-3的制备方法：
将2-呋喃甲酸(2g，0.018mol)的二氯甲烷(20mL)溶液用N,N’-羰基二咪唑(CDI)(3.2g，0.02mol)进行活化，监测完全活化后，加入3-溴苯胺(3.1g，0.018mol)置于常温下反应过夜，监测反应完全后，用石油醚打浆，乙酸乙酯重结晶后得白色固体产物III-4(3.6g，收率76％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.36(s,1H),8.08(m,1H),7.96(m,1H),7.75(m,1H),7.37(m,1H),7.30(m,1H),6.72(m,1H).MS(ESI):m/z calcd.For C11H9BrNO2[M+H]+265.9,found 265.9.
除了适当替换相应的反应化合物外，以下化合物的制备参照中间体III-4的制备方法：
下列为商品化的溴化物：
试剂和条件：a)三甲基硅炔，双三苯基磷二氯化钯(Pd(PPh3)2Cl2)，碘化亚铜(CuI)，70℃，4h；b)异丙胺，乙腈；c)三乙胺，双三苯基磷二氯化钯(Pd(PPh3)2Cl2)，碘化亚铜(CuI)；d)二氯化钯，二甲亚砜(DMSO)，140℃，2h；e)盐酸羟胺，吡啶，100℃，24h；f)琥珀酸酐，180℃，10min；
常温下，将三甲基硅炔(625.6mg，6.38mmol)缓慢滴加到化合物III-5(1.5g，5.32mmol)的二异丙胺(15mL)溶液中，加入Pd(PPh3)2Cl2(119.3mg，0.17mmol)和CuI(32.4mg，0.17mmol)，N2保护后置于70℃油浴锅中回流反应4h，监测反应完全后，抽滤；滤液加入乙酸乙酯(100mL)和盐酸(100mL，1mol/L)萃取，收集有机相，无水硫酸钠干燥，浓缩，柱层析分离(分离比为石油醚：乙酸乙酯＝50:1)得化合物III-6(814.3mg，产率51％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.88(s,1H),7.90–7.83(m,1H),7.80(s,1H),7.69(d,J＝9.0Hz,1H),4.13(p,J＝8.5Hz,1H),1.59(d,J＝8.6Hz,6H),0.05(s,9H).MS(ESI):m/z calcd.ForC16H21N2O2Si[M+H]+301.1,found 301.1.
将含有化合物III-6(800mg，2.67mmol)的乙腈(10mL)溶液中加入异丙胺(315.6mg，5.34mmol)置于常温下反应过夜，监测反应完全后，抽滤，滤液真空干燥后，加入乙酸乙酯(100mL)和盐酸(100mL，1mol/L)萃取，收集有机相用无水硫酸钠干燥，浓缩，得化合物III-7(500mg，收率82％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.77(s,1H),7.68(d,J＝2.4Hz,1H),7.57–7.49(m,2H),4.80(p,J＝8.6Hz,1H),3.96(s,1H),1.47(d,J＝8.6Hz,6H).MS(ESI):m/z calcd.For C13H13N2O2[M+H]+229.1,found 229.3.
将化合物III-7(500mg，2.2mmol)和化合物III-8(2g，1.8mmol)溶于三乙胺(5mL)中搅拌均匀。加入Pd(PPh3)2Cl2(42.1mg,0.06mol)和CuI(11.4mg,0.06mmol)，N2保护后置于常温下反应过夜，监测反应完全后，抽滤，滤液加入乙酸乙酯(50mL)和盐酸(50mL，1mol/L)萃取，收集有机相，无水硫酸钠干燥，浓缩,柱层析(分离比为石油醚：乙酸乙酯＝15:1)得化合物III-9(371mg，产率50％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.82(s,1H),8.09(dt,J＝9.4,2.5Hz,1H),8.00(s,1H),7.95(dd,J＝9.4,1.9Hz,1H),7.69(d,J＝2.6Hz,1H),7.58(dd,J＝9.4,2.5Hz,1H),7.48(d,J＝9.3Hz,1H),7.40–7.33(m,3H),7.29(t,J＝9.3Hz,1H),6.71(t,J＝9.4Hz,1H),4.96-4.76(m 1H),1.63(d,J＝6.9Hz,6H).MS(ESI):m/z calcd.ForC24H20N3O4[M+H]+414.1,found 414.2.
在化合物III-9(350mg，0.85mmol)的二甲亚砜(5mL)溶液中加入二氯化钯(15.1mg，0.085mmol)搅拌混合均匀，氮气保护下置于140℃油浴锅中反应2h。监测反应完全后，抽滤，加入乙酸乙酯(50mL)和饱和食盐水(50mL)进行萃取，收集有机相用无水硫酸钠干燥，浓缩得化合物III-10(283.7mg，收率75％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.79(s,1H),8.04(dt,J＝9.1,2.6Hz,1H),8.00(s,1H),7.95(dd,J＝9.4,1.9Hz,1H),7.91–7.81(m,2H),7.82–7.77(m,2H),7.60–7.49(m,2H),7.29(dd,J＝9.4,1.9Hz,1H),6.71(t,J＝9.4Hz,1H),4.96-4.76(m,1H),1.50(d,J＝8.6Hz,6H).MS(ESI):m/z calcd.For C24H20N3O6[M+H]+446.1,found 446.1.
将化合物III-10(250mg，0.56mmol)和盐酸羟胺(319.7mg，4.6mmol)加入吡啶(3mL)中混合均匀，置于100℃油浴锅中回流搅拌反应24h，监测反应完全后，向反应液中加入冰水10g，加入1mol/L盐酸进行中和，抽滤除去沉淀物。将沉淀物进行干燥得化合物III-11。将化合物III-11(100mg，0.21mmol)和琥珀酸酐(105.7mg，1.05mmol)置于180℃油浴锅中回流搅拌反应10min，监测反应完全后，将反应液加入水(10mL)中，有固体析出，抽滤，将滤渣洗涤干燥，用甲醇重结晶得化合物WJ457(50.9mg，53％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.12(s,1H),10.43(s,1H),8.10(s,1H),8.02-8.00(m,1H),7.96(s,1H),7.68-7.64(m,1H),7.51-7.45(m,1H),7.47(s,1H),7.34-7.36(m,1H),7.24-7.20(m,2H),6.74-6.72(m,1H),5.40-5.32(m,1H),1.50(d,J＝6.8Hz,6H).MS(ESI):m/z calcd.For C24H20N5O5[M+H]+458.1,found 458.1.
除了适当替换相应的反应化合物外，以下化合物的制备参照上述制备III-12的方法，得到不同含氧五元杂环化合物，结果如表1所示。
表1不同含氧五元杂环化合物的表征数据结果
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实验例2：含氧五元杂环化合物抑制SHP2活性测试
1)材料：
蛋白：SHP2全长(Met1-Arg 593)，将PTPN11基因克隆到含有N-末端6×His标签的pET-15b质粒中(Cat.No.69661-3)，通过大肠杆菌(BL21)表达系统表达得到His标签融合蛋白并借助AKTA avant25蛋白纯化系统进行分离和纯化。参考文献Nature,2016,535(7610):148-152.
2)过程:采用快速荧光定量检测法，在384孔黑色微孔微孔板(OptiPlate-384Black Opaque，Perkin Elmer)中检测酶活性。底物DiFMUP经SHP2水解得到DiFMU并产生荧光。反应溶液体系为：60mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid(HEPES),pH 7.2,75mM NaCl,75mM KCl,1mM EDTA,0.05％Tween-20,5mM dithiothreitol(DTT)，SHP2蛋白(终浓度为0.5nM)与多肽IRS1_pY1172(dPEG8)pY1222(序列：H2N-LN(pY)IDLDLV-(dPEG8)LST(pY)ASINFQK-amide，终浓度为5μM)在25℃条件下共孵育60min，加入小分子与酶共孵育20min,后加入底物DiFMUP(终浓度25μM)起始反应，反应体系终体积为50μL，DMSO[1％(v/v)]通过使用酶标仪(Envision,PerkinElmer)分别检测激发/发射波长340/450nM通道，计算得到反应初速度。实验中采用的对照化合物为SHP099。
3)样品处理：样品用DMSO溶解，-20℃保存，DMSO在最终体系中的浓度控制在不影响检测活性的范围之内。
4)数据处理及结果说明：
初筛选择单浓度条件下，例如50μM，对样品的活性进行测试。对于在一定条件下表现出活性的样品，例如抑制率％Inhibition大于50，测试活性剂量依赖关系，即IC50/EC50值，通过样品活性对样品浓度进行非线性拟和得到，计算所用软件为Graphpad Prism 6，拟合所使用的模型为四参数剂量效应积分模型(four-parameter concentration–responsemodel)(varible slope)，对于大多数抑制剂筛选模型，将拟合曲线底部和顶部设定为0和100。一般情况下，每个样品在测试中均设置复孔(n≥3)，在结果中以标准偏差(StandardDeviation,SD)或者标准误差(Standard Error,SE)表示。每次测试均以SHP099为参照(IC50＝74.1±2.5nM)。所有数据都在我们知识能力范围内尽可能做到可信，精确，正确。
实验例3：含氧五元杂环化合物抑制SHP2 E76K活性测试
一、化合物抑制SHP2 E76K活性测试
1：材料：
蛋白：SHP2 E76K全长(Met1-Arg 593)，使用分子克隆技术将SHP2氨基酸序列的第76位由Glu替换为Lys并克隆到含有N-末端6×His标签的pET15质粒中，通过大肠杆菌(BL21)表达系统表达得到His标签融合蛋白并借助AKTA avant25蛋白纯化系统进行分离和纯化。
参考文献:Nature,2016,535(7610):148-152.
2)过程:采用快速荧光定量检测法，在384孔黑色微孔微孔板(OptiPlate-384Black Opaque，Perkin Elmer)中检测酶活性。底物DiFMUP经SHP2水解得到DiFMU并产生荧光。反应溶液体系为：60mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid(HEPES),pH 7.2,75mM NaCl,75mM KCl,1mM EDTA,0.05％Tween-20,5mM dithiothreitol(DTT)，SHP2 E76K蛋白(终浓度为0.3nM)加入小分子与其共孵育20min,后加入底物DiFMUP(终浓度25μM)起始反应，反应体系终体积为50μL，DMSO[1％(v/v)]通过使用酶标仪(Envision,PerkinElmer)分别检测激发/发射波长340/450nM通道，计算得到反应初速度。实验中采用的对照化合物为SHP099。
3)样品处理：样品用DMSO溶解，-20℃保存，DMSO在最终体系中的浓度控制在不影响检测活性的范围之内。
4)数据处理及结果说明：
初筛选择单浓度条件下，例如50μM，对样品的活性进行测试。对于在一定条件下表现出活性的样品，例如抑制率％Inhibition大于50，测试活性剂量依赖关系，即IC50/EC50值，通过样品活性对样品浓度进行非线性拟和得到，计算所用软件为Graphpad Prism 6，拟合所使用的模型为四参数剂量效应积分模型(four-parameter concentration–responsemodel)(varible slope)，对于大多数抑制剂筛选模型，将拟合曲线底部和顶部设定为0和100。一般情况下，每个样品在测试中均设置复孔(n≥3)，在结果中以标准偏差(StandardDeviation,SD)或者标准误差(Standard Error,SE)表示。每次测试均以SHP099为参照(IC50＝4.98±0.26μM)。所有数据都在我们知识能力范围内尽可能做到可信，精确，正确。
实验例4：化合物抑制PTP结构域SHP2活性测试
应用大肠杆菌表达系统表达得到GST融合蛋白；荧光底物，OMFP。过程:采用荧光底物OMFP，在384黑底孔板中观察不同化合物对重组酶的活性的抑制。首先选取单点浓度50μM的化合物与酶在室温下孵育，最后迅速加入底物OMFP，OMFP水解底物OMF在被485nM激发光激发后可发射出波长为530nM的可检测的荧光信号，从而观察酶的活性变化以及化合物对其的抑制情况。如果抑制率大于50％，则选取8个浓度，50μM为首要浓度的化合物做IC50测试。实验中采用的对照化合物为Na3VO4。
实验例5：化合物抑制野生型SHP1活性测试
应用大肠杆菌表达系统表达得到GST融合蛋白；荧光底物，OMFP。过程:采用荧光底物OMFP，观察不同化合物对重组酶的活性的抑制。首先选取单点浓度50μM的化合物与酶在室温下孵育，最后迅速加入底物OMFP，OMFP水解底物OMF在被485nM激发光激发后可发射出波长为530nM的可检测的荧光信号，从而观察酶的活性变化以及化合物对其的抑制情况。如果抑制率(％inhibition)大于50％，则选取8个浓度，50μM为首要浓度的化合物做IC50测试
实验例6：化合物抑制PTP结构域PTP1B活性测试
应用大肠杆菌表达系统表达得到GST融合蛋白；荧光底物，OMFP。过程:采用荧光底物OMFP，在384黑底孔板中观察不同化合物对重组酶的活性的抑制。首先选取单点浓度50μM的化合物与酶在室温下孵育，最后迅速加入底物OMFP，OMFP水解底物OMF在被485nM激发光激发后可发射出波长为530nM的可检测的荧光信号，从而观察酶的活性变化以及化合物对其的抑制情况。如果抑制率大于50％，则选取8个浓度，50μM为首要浓度的化合物做IC50测试。实验中采用的对照化合物为Na3VO4。
实验例7：化合物抑制PTP结构域TCPTP活性测试
应用大肠杆菌表达系统表达得到GST融合蛋白；底物，pNPP。过程:采用紫外底物pNPP，观察不同化合物对活性片断的活性抑制，以初步评价化合物的作用效果。TCPTP水解底物pNPP的磷酯键得到的产物在405nM处有很强的光吸收。首先选取单点浓度50μM，2mL的化合物与88mL底物pNPP，直接加入10mL的PTP1B。因此可以直接监测405nM处光吸收的变化以观察酶的活性变化以及化合物对其的抑制情况。如果抑制率大于50％，则选取8个浓度，50μM为首要浓度的化合物做IC50测试。
实验例8：化合物抑制SHP2 E76K细胞活性测试
1)材料：
细胞株：TF-1SHP2 E76K
试剂：CellTiter-Luminescent Cell Viability Assay Reagent细胞培养基：1640完全培养基，96孔白底板；参考文献:Journal of Biological Chemistry,2007,282(50):36463-36473.
2)过程：在96孔板中接种细胞密度1000个/孔，化合物在96孔尖底板中进行梯度稀释，化合物浓度范围由20μM到0.027μM,后将化合物加入到96孔板中与细胞共培养，在CO2细胞培养箱中培养5天(37℃，5％CO2)。第5天时，在96孔板中加入30μL CellTiter-Reagent，震荡后室温孵育10min。通过使用酶标仪(Envision,PerkinElmer)检测荧光读值。
3)样品处理：样品用DMSO溶解，-20℃保存，DMSO在最终体系中的浓度控制在不影响检测活性的范围之内。
4)数据处理及结果说明：
测试活性剂量依赖关系，即IC50/EC50值，通过样品活性对样品浓度进行非线性拟和得到，计算所用软件为Graphpad Prism 6，拟合所使用的模型为四参数剂量效应积分模型(four-parameter concentration–response model)(varible slope)，对于大多数抑制剂筛选模型，将拟合曲线底部和顶部设定为0和100。一般情况下，每个样品在测试中均设置复孔(n≥3)，在结果中以标准偏差(Standard Deviation,SD)或者标准误差(StandardError,SE)表示。
所有数据都在我们知识能力范围内尽可能做到可信，精确，正确。
实施例2-8所得测试结果见表2。
表2：含氧五元杂环化合物的生物活性数据
其中，A代表IC50小于等于5μM，B代表5μM<IC50<20μM，C代表20μM<IC50<50μM，D代表IC50在50μM左右，E代表IC50>50μM，“-”代表活性未测。
本发明含氧五元杂环化合物可以作为工具化合物研究蛋白酪氨酸磷酸酶SHP2突变型在癌症相关的细胞信号转导过程中的生物学功能关联性，为预防和治疗癌症、代谢与免疫疾病提供新的手段。

Claims (5)

1.含氧五元杂环化合物或其药学上可接受的盐，所述含氧五元杂环化合物的结构选自：
2.权利要求1所述的含氧五元杂环化合物或其药学上可接受的盐在制备PTP1B抑制剂、TCPTP抑制剂中应用。
3.权利要求1所述的含氧五元杂环化合物或其药学上可接受的盐在制备用于预防和治疗由PTP1B或者TCPTP介导的癌症、代谢与免疫疾病、心血管病以及神经性疾病的药物中的应用。
4.一种药物组合物，所述药物组合物包含治疗有效量的权利要求1所述的含氧五元杂环化合物或其药学上可接受的盐，和任选的药学上可接受的辅料。
5.一种用于预防和治疗由PTP1B或者TCPTP介导的癌症、代谢与免疫疾病、心血管病或者神经性疾病的药物，所述药物包含权利要求1所述的含氧五元杂环化合物或其药学上可接受的盐，和药用辅料。
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