CN103243180A - 检测青蟹双顺反子病毒-1实时荧光定量rt-pcr的方法及其引物组、探针和试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种青蟹双顺反子病毒-1检测用引物组和Taqman探针，引物组由上游引物和下游引物组成，所述的上游引物的碱基序列如序列表中SEQ ID NO.1所示，所述的下游引物的碱基序列如序列表中SEQ ID NO.2所示，所述的Taqman探针的碱基序列如序列表中SEQ ID NO.3所示，在所述的Taqman探针的5′端标记有FAM为荧光发射基团，3′端标记有TAMRA荧光淬灭基团，所述的Taqman探针位于所述上游引物和下游引物之间。还公开了采用该引物组和探针的检测青蟹双顺反子病毒-1的方法和试剂盒，该方法成本低、耗时短、产率高，特异性高，且阴阳性结果差异显著，验证率高，更加明显可靠。

Description

检测青蟹双顺反子病毒-1实时荧光定量RT-PCR的方法及其引物组、探针和试剂盒

技术领域

本发明涉及一种检测青蟹双顺反子病毒-1实时荧光定量RT-PCR的方法及其引物组、探针和试剂盒。 

背景技术

拟穴青蟹(Scylla paramamosain)（原被鉴定为拟穴青蟹（Scylla serrata）因肉质鲜美、生长迅速、分布广泛，是我国海洋渔业重要的养殖品种。但随着养殖规模的逐步扩大，病害问题也不断严重。青蟹双顺反子病毒-1（Mud Crab Dicistrovirus-1，MCDV-1）是在近几年发病的青蟹中新发现的一种病原体。感染MCDV-1的拟穴青蟹体色没有明显变化，食欲不振，活动乏力，即使白天也不会潜入沙中，人工感染死亡率达100%。该病毒属于单正链RNA，双顺反子病毒科，能通过浸泡、禁食浸泡、投喂、共居的方式感染拟穴青蟹。到目前为止，对于MCDV-1感染还没有有效的治疗方法，杜绝传染源、防止病毒的传染和流行是能够采取的主要措施，早期快速诊断青蟹双顺反子病毒-1是减少损失的有效途径。因此，简便快速、特异性好、灵敏度高的诊断试剂盒及其检测方法对于疾病的预防具有重要意义。 

实时荧光定量Real time-PCR(Real time fluorescent quantitative polymerase chain reaction,Rea-l time PCR)，是指预先在RT-PCR反应体系中加入荧光基团，可以是荧光染料，也可以是特异性标记的荧光探针，利用相应软件实时监测整个PCR进程中的荧光信号积累情况，最后通过建立标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。其中Taqman探针技术是以Taqman荧光探针为基础，Taqman荧光探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个荧光发射基团和一个荧光淬灭基团。探针完整时，发射基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5′-3′外切酶活性将探针酶切降解，使荧光发射基团和荧光淬灭基团分离，荧光监测系统从而可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与RT-PCR产物形成完全同步，从而实现定量。 

实时荧光定量RT-PCR方法实时检测、速度快、高通量、定量准确、灵敏度高、特异性好、自动化程度高，在病原微生物检测方面已得到广泛应用。该技术应用于 病毒检测中，不仅可以对病毒定性，还能准确定量病毒核酸，使研究病毒载量的变化规律成为可能，并可对抗病毒治疗和药物筛选做出评估，为相关研究工作提供了有效的技术平台。目前尚无青蟹双顺反子病毒-1荧光定量PCR用于检测的相关报道。 

发明内容

本发明所要解决的第一个技术问题是提供一种青蟹双顺反子病毒-1检测用引物组和Taqman探针，该引物组和探针对青蟹双顺反子病毒-1具有高特异性，可用于实时荧光定量RT-PCR技术检测青蟹双顺反子病毒-1。 

本发明所要解决的第二个技术问题是提供一种对青蟹双顺反子病毒-1进行实时荧光定量RT-PCR检测的方法，该方法快速、高效，特异性高。 

本发明所要解决的第三个技术问题是提供一种对青蟹双顺反子病毒-1进行实时荧光定量RT-PCR检测的试剂盒。 

本发明所要解决的第四个技术问题是提供上述青蟹双顺反子病毒-1检测用引物组和Taqman探针在检测青蟹双顺反子病毒-1中应用。 

本发明所要解决的第五个技术问题是提供上述对青蟹双顺反子病毒-1进行实时荧光定量RT-PCR检测的试剂盒在检测青蟹双顺反子病毒-1中的应用。 

本发明所要解决的第一个技术问题是通过如下技术方案来实现的：一种青蟹双顺反子病毒-1检测用引物组和Taqman探针，所述引物组由上游引物和下游引物组成，所述的上游引物的碱基序列如序列表中SEQ ID NO.1所示，所述的下游引物的碱基序列如序列表中SEQ ID NO.2所示，所述的Taqman探针的碱基序列如序列表中SEQ ID NO.3所示，在所述的Taqman探针的5′端标记有FAM为荧光发射基团，3′端标记有TAMRA荧光淬灭基团，所述的Taqman探针位于所述上游引物和下游引物之间。 

本发明所要解决的第二个技术问题是通过如下技术方案来实现的：一种检测青蟹双顺反子病毒-1实时荧光定量RT-PCR的方法，利用上述的引物组和Taqman探针通过荧光定量RT-PCR反应对青蟹双顺反子病毒-1进行定性和定量检测。 

该方法具体包括以下步骤：一种对青蟹双顺反子病毒-1进行实时荧光定量RT-PCR检测的方法，包括待测病毒RNA的提取及其cDNA的合成，在Taqman荧光定量RT-PCR反应体系进行Taqman荧光定量RT-PCR反应，通过标准品的制备及标准曲线的建立，计算得出待测结果，Taqman荧光定量RT-PCR反应体系中含有上 述引物组和Taqman探针，可以通过荧光定量RT-PCR反应对青蟹双顺反子病毒-1进行定性和定量检测。 

作为本发明的一种具体实施方式，本发明所述引物组中上游引物和下游引物的摩尔浓度优选为0.4μmol/L，Taqman探针的摩尔浓度优选为0.2μmol/L。 

本发明对青蟹双顺反子病毒-1进行实时荧光定量RT-PCR检测的方法，具体含以下步骤： 

（1）选择MCDV-1基因的一段100～200bp长度的保守片段，利用primer premier5.0软件设计病毒特异性定量PCR引物对和探针，扩增片段大小为119bp，引物对和探针序列为： 

上游引物Dic-taqF：5′-ACGAAGAATCTATCACTGGAATTGAA-3′； 

下游引物Dic-taqR：5′-CGTCTGCTTCCCGGGTTT-3′； 

Taqman探针：5′-FAM-AATGCTCTGAACCGGAGTACGTCTGCC-TAMRA-3′，其中FAM为荧光发射基团，TAMRA为荧光淬灭基团。 

（2）构建和制备重组质粒标准品pMD

18-T-dic 

以上、下游引物进行常规PCR获得目的片段，利用DNA重组技术将包含目的片段的基因克隆到质粒载体pMD

18-T中，构建重组质粒pMD

18-T-dic作为建立荧光定量PCR标准曲线的阳性标准品。 

（3）待测样本总RNA的提取和逆转录反应，获得样本cDNA。 

（4）MCDV-1荧光定量PCR检测方法的优化和建立 

经过对反应条件的优化，对建立的方法进行灵敏度、稳定性、特异性以及对临床标本的有效性进行综合评价。 

本发明所要解决的第三个技术问题是通过如下技术方案来实现的：一种对青蟹双顺反子病毒-1进行实时荧光定量RT-PCR检测的试剂盒，含有上述的Taqman探针和引物组。 

作为本发明的一种具体实施方式，本发明上述试剂盒中还可以含有荧光定量Real time-PCR探针法反应预混液、阳性标准品（即含有目的片段基因的质粒）和无RNase水等。其中荧光定量PCR探针法反应预混液优选为iQTM Supermix（2x），购自美国BIO-RAD公司，iQTM Supermix配方如下：2×反应缓冲液（含dNTPs）、iTaq DNA聚合酶、6mM MgCl₂和稳定剂，阳性标准品的质粒浓度优选为10⁸copies/μL。 

该试剂盒在使用时，先提取待测样品RNA反转录得到cDNA，然后用上述青蟹双顺反子病毒-1检测用引物组和探针进行荧光定量PCR反应，反应结果判定： 

1）若Ct值>35，且未出现标准扩增曲线，试验结果判断为阴性； 

2）若Ct值在15～35之间且出现标准扩增曲线，试验结果判断为阳性； 

3）结果为阳性的样品，根据Ct值带入已建立的标准曲线，可计算出病毒拷贝数。 

因为本发明的青蟹双顺反子病毒-1为RNA病毒，所以在试剂盒的制备时，配置有核酸提取和逆转录（RT）的试剂，会更加方便试验进展，如Trizol(总RNA提取试剂)、氯仿（可自备）、异丙醇（可自备）、体积百分含量为75%的乙醇（可自备）、无RNase水、RT反应液和逆转录酶等，其中，RT反应液优选含有1×反应缓冲液、0.5mM dNTPs、20mg/L随机引物和200units逆转录酶，逆转录酶可选择本领域做RT实验时常用的逆转录酶，如逆转录酶M-MLV等；所述1×反应缓冲液优选含有50mM pH8.3的Tris-HCl、75mM KCl、10mM DTT和3mM MgCl₂。 

在实际操作中，该试剂盒还可以包括盒子、泡沫板等，其中泡沫板的大小与盒子的底板的大小相同，可以装在盒子中，泡沫板上有不少于用于封装反应试剂小管数量的小孔，用于封装反应试剂的小管对应置于相应的小孔中，从而使得试剂都能处于小管的下部，方便取用和吸取，也可以使取用时残留在管壁上的液体自动回到管底，节约试剂。 

上述快速诊断试剂盒的生产工艺，可以包括如下步骤： 

(1)将上下游引物及探针合成纯化后，定量配制，浓度检测，分装后抽样质检； 

(2)将Trizol分装后抽样质检； 

(3)将氯仿无菌分装，抽样质检； 

(4)将异丙醇无菌分装，抽样质检； 

(5)将体积百分含量为75%的乙醇无菌分装，抽样质检； 

(6)将无RNase水无菌分装，抽样质检； 

(7)将RT反应液无菌分装，抽样质检； 

(8)将iQTM Supermix无菌分装，抽样质检； 

(9)将逆转录酶无菌分装，抽样质检； 

(10)将阳性对照标本制备，分装，抽样质检； 

(11)准备带有小孔的泡沫板； 

(12)组装试剂盒。 

本发明所要解决的第四个技术问题是通过如下技术方案来实现的：上述的青蟹双顺反子病毒-1检测用引物组和Taqman探针在检测青蟹双顺反子病毒-1中应用。 

本发明所要解决的第五个技术问题是通过如下技术方案来实现的：上述对青蟹双顺反子病毒-1进行实时荧光定量RT-PCR检测的试剂盒在检测青蟹双顺反子病毒-1中的应用。 

与现有技术相比，本发明具有如下优点： 

（1）本发明通过构建青蟹双顺反子病毒-1检测用引物组和Taqman探针，建立实时荧光定量RT-PCR，由于Taqman法采用杂交的方式对靶基因进行甄别，准确性高，同时，因目的基因由引物组和探针双重控制，保证了特异性，降低了产生假阳性的概率； 

（2）本发明建立的基于Taqman探针的荧光定量RT-PCR方法可对待测样本进行定量检测，检测范围可达到9个数量级，在10⁸～10⁰copies范围内具有很好的线性关系（R²=0.992），其最低检测限可达到10个拷贝以下，灵敏度达到国际先进水平，适合检测低病毒含量的实验标本； 

（3）本发明检测青蟹双顺反子病毒-1实时荧光定量RT-PCR的方法重复性和稳定性高，批内重复性试验的CT值变异系数（CV）为1.11%，批间重复性试验的CT值变异系数（CV）小于1.3%； 

（4）本发明检测青蟹双顺反子病毒-1实时荧光定量RT-PCR的方法，可进行高通量检测，自动化程度高，反应过程中无需开盖，避免了污染，PCR扩增和产物检测同步完成，操作简单，易于实现自动化； 

（5）本发明建立的基于Taqman探针的荧光定量RT-PCR方法较常规RT-PCR，灵敏度和特异性均得到了很大的提高，并缩短了实验时间，简化了操作步骤，可对病毒进行定量，结果更为客观和准确，该检测试剂盒和检测方法对拟穴青蟹MCDV-1的早期诊断、临床检测及相关病毒研究的开展具有重要意义，具备广泛的适用性。 

附图说明

图1是实施例2中荧光定量RT-PCR灵敏度检测的荧光信号图； 

图2实施例2中青蟹双顺反子病毒-1绝对定量的标准曲线，Y=-3.319lgX+ 44.53（注：X表示反应体系中表示标准质粒拷贝数）。 

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明要求保护的范围。 

实施例1青蟹双顺反子病毒-1检测用引物组 

选择MCDV-1基因的一段100～200bp长度的保守片段，利用primer premier5.0软件设计病毒特异性定量PCR引物和探针，扩增片段大小为119bp，引物对和探针序列为： 

上游引物Dic-taqF：5′-ACGAAGAATCTATCACTGGAATTGAA-3′，具体如SEQ ID NO.1所示； 

下游引物Dic-taqR：5′-CGTCTGCTTCCCGGGTTT-3′，具体如SEQ ID NO.2所示； 

Taqman探针：5′-FAM-AATGCTCTGAACCGGAGTACGTCTGCC-TAMRA-3′，具体如SEQ ID NO.3所示，探针5′端标记的荧光发射基团为FAM，3′端标记的荧光淬灭基团为TAMRA。 

其中Taqman探针位于所述上游引物和下游引物之间。 

实施例2青蟹双顺反子病毒-1荧光定量RT-PCR检测方法的优化和建立 

（1）定量RT-PCR反应条件的优化 

对反应体系中引物浓度（0.1～0.5μM）、探针浓度(0.1～0.4μM)和退火延伸温度(55～64℃)进行了优化，以获得最低的Ct值和较高的荧光强度增加值作为标准，筛选出最佳的引物和探针浓度、退火延伸温度。本发明使用的荧光定量PCR仪为德国Eppendorf公司生产的Mastercyclerep realplex荧光定量PCR仪，在每个循环的第二步结束时收集荧光信号。 

经优化后的定量PCR反应体系（15μL反应体系）： 

反应体系	体积（μL）	终浓度
			iQTM Supermix（2x）	7.5	iQTM Supermix（1x）
上游引物（10μmol/L）	0.6	0.4μmol/L
			下游引物（10μmol/L）	0.6	0.4μmol/L
Taqman探针（10μmol/L）	0.3	0.2μmol/L

[0067] 

模板	2
			H2O	补水至15μL

经优化后的定量PCR反应程序： 

（2）绝对定量标准曲线的建立 

2.1定量标准品建立和制备 

利用RT-PCR法扩增得到含有靶序列的MCDV-1基因片段，重组到载体 

18-T（TaKaRa公司）中，经DNA序列测定后，将构建的重组质粒作为定量标准品，命名为

18-T-dic，将

18-T-dic用碱裂解法进行提纯，用紫外分光光度计测定其OD值，并检测质粒的纯度，质粒拷贝数计算公式如下： 

质粒浓度（μg/μL）=OD₂₆₀×稀释倍数×50/1000 

质粒拷贝数=A×N/1000M 

其中：A代表质粒浓度（μg/μL）；M代表质粒分子量；N代表阿伏伽德罗常数（6.02×10²³/mol） 

2.2标准曲线的建立 

采用灭菌超纯水10倍梯度稀释标准品

18-T-dic至10⁸～10⁰copies/μL，以稀释的标准品为模板，采用优化后的体系进行荧光定量PCR，检测结束后采用荧光定量PCR自带软件realplex根据噪声情况设定和调整基线和阈值，绘制标准曲线（图2） 

本检测方法在10⁸～10⁰copies/reaction范围内具有良好的线性关系，相关系数R²=0.992，扩增效率E=100.0%，其灵敏度可到10个拷贝以下(图1)。 

待测样本检测管中病毒cDNA拷贝数计算公式：cono=10^{(-0.301×Ct+13.417)}； 

样品中病毒浓度计算公式： 

样品病毒载量（copies/mg）=conc×样品稀释度/YM 

(注：conc代表检测体系中的病毒拷贝数；Y代表cDNA扩增效率；M代表样品质量：mg)。 

（3）稳定性分析 

批内重复试验：选取同一份模板，采用经优化的反应体系和条件设置30个平行同时进行反应，利用统计学方法检测其C_T值的变异系数。批内重复性检测的C_T值变异系数（CV）为1.11%； 

批间重复性：选取3个不同模板，重复检测4次，利用统计学方法检测其C_T值的变异系数。批间重复性检测的C_T值变异系数（CV）在0.37～1.3%之间，表明本发明建立的检测方法稳定、重复性好。 

（4）特异性分析 

本研究选择了8个样本进行检测，1份健康样本、1份MCDV-1阳性样本，其余6份样品分别为含有鲍鱼肌肉萎缩病毒（AbSV）、传染性表皮与造血组织坏死症病毒(IHHNV)、大菱鲆红体病虹彩病毒（TRBIV）、对虾白斑综合症病毒（WSSV）、神经坏死病毒（NNV）、急性病毒性坏死症病毒（AVNV）和青蟹呼肠孤病毒（MCRV）的阳性样本。该8个样本同时进行荧光定量PCR，结果显示只有MCDV-1阳性样本出现扩增曲线，其余样本均为阴性结果。 

（5）检测结果判定和病毒的定量 

1）若Ct值>35，且未出现标准扩增曲线，试验结果判断为阴性； 

2）若Ct值在15～35之间且出现标准扩增曲线，试验结果判断为阳性； 

3）结果为阳性的样品，根据Ct值带入已建立的标准曲线，可计算出病毒拷贝数，计算公式如下： 

待测样本检测管中病毒cDNA拷贝数计算公式：cono=10^{(-0.301×Ct+13.417)}； 

样品中病毒浓度计算公式： 

样品病毒载量（copies/mg）=conc×样品稀释度/YM 

(注：conc代表检测体系中的病毒拷贝数；Y代表cDNA扩增效率；M代表样品质量：mg)。 

实施例3青蟹双顺反子病毒-1快速诊断试剂盒 

本实施例的快速诊断试剂盒可用于荧光定量PCR技术快速诊断样品中是否含有青蟹双顺反子病毒-1，该试剂盒由青蟹双顺反子病毒-1检测用引物组、iQ^TM Supermix（2x）、阳性标准品、Trizol、氯仿、异丙醇、75%的乙醇、无RNase水、RT反应液、逆转录酶和泡沫板组成，该试剂盒提供了逆转录步骤的试剂。其中： 

(1)实施例1中青蟹双顺反子病毒-1检测用引物对和探针：3管，内分别装Dic- taqF、Dic-taqR和探针（以棕色管保存），引物储存浓度为10μmol/L；探针储存浓度为100μmol/L；反应终浓度为：上下游引物，探针浓度0.2μmol/L；-20℃储存；探针需避光保存； 

(2)荧光定量PCR探针法反应预混液（iQ^TM Supermix（2x），购自美国BIO-RAD公司）；0.75mL/管，-20℃储存，1管； 

(3)制备阳性标准品：提取含青蟹双顺反子病毒-1基因的质粒DNA（10⁸copies/μL），取含有青蟹双顺反子病毒-1的阳性模板，利用上下游引物进行常规PCR扩增。反应体系为20μL，含有1xPCR Mix（50mM KCl，10mM Tris-HCl，1.5mM MgCl₂，0.2mM dNTP混合物，0.1units/μL Taq DNA聚合酶，溴酚蓝，其他稳定剂和增强剂）8μL，0.4μM上、下游引物，灭菌超纯水6.8μL及1μL模板。PCR扩增程序：95℃预变性3min；94℃变性30s，55℃复性30s，72℃延伸60s，共30个循环；72℃延伸10min，产物4℃保存。反应完毕以1%琼脂糖凝胶电泳验证目的片段无误后，采用凝胶核酸回收试剂盒回收目的片段，按照使用说明书连接pMD18-T载体（购自TaKaRa公司），并转化入Top10感受态细胞（购自天根生物公司），通过蓝白斑筛选克隆阳性菌落，进一步分离后进行PCR扩增测序确认无误后，提取质粒测OD值，稀释至10⁸copies/μL，置于容器-20℃储存，50μL/管，1管； 

(4)购置Trizol，置于容器，30mL，1瓶； 

(5)购置氯仿，置于容器，6mL，1瓶； 

(6)购置异丙醇，置于容器，15mL，1瓶； 

(7)制备体积百分含量为75%的乙醇，置于容器，30mL，1瓶； 

(8)制备无RNase水，置于容器，1mL/管，2管； 

(9)合成随机引物，储存浓度100mg/L，反应终浓度20mg/L，0.2mL/管，-20℃储存，1管； 

(10)配置RT反应液：含有1×反应缓冲液、0.5mM dNTPs、25units RNA酶抑制剂，置于容器，0.4mL/管，-20℃储存，1管； 

(11)购置逆转录酶M-MLV（购自Promega公司，型号：M1701），10,000units，置于容器，-20℃储存，30μL/管，1管； 

(12)一块泡沫板，其大小与长方体盒子的底面相同，高2.4cm，有三排孔，第一排五个孔，孔径1.4cm，第二排六个孔，孔径1.1cm，第三排六个孔，孔径0.7cm。 

将上述12个小管分别对应放置于泡沫板的孔内，装于盒中即制备得到本实施例的快速诊断试剂盒。 

本实施例快速诊断试剂盒的生产工艺，包括如下步骤： 

(1)将上下游引物、探针、随机引物合成纯化后，定量配制，浓度检测，分装后抽样质检； 

(2)将Trizol分装后抽样质检； 

(3)将氯仿无菌分装，抽样质检； 

(4)将异丙醇无菌分装，抽样质检； 

(5)将体积百分含量为75%的乙醇无菌分装，抽样质检； 

(6)将无RNase水无菌分装，抽样质检； 

(7)将RT反应液无菌分装，抽样质检； 

(8)将iQ^TM Supermix无菌分装，抽样质检； 

(9)将逆转录酶无菌分装，抽样质检； 

(10)将阳性对照标本制备，分装，抽样质检； 

(11)准备带有小孔的泡沫板； 

(12)组装试剂盒。 

实施例4青蟹双顺反子病毒-1检测用引物组和Taqman探针在检测青蟹双顺反子病毒-1中应用 

青蟹双顺反子病毒-1的快速定量检测 

本实施例采用实施例1所示引物和探针、实施例2所示优化的反应体系和程序对青蟹双顺反子病毒病毒-1进行快速定量检测，具体步骤如下： 

1、模板的制备 

(1)向匀浆器中加入拟穴青蟹鳃组织0.1g，并加入约待测样品10倍体积的Trizol液稀释，冰浴匀浆，室温静置5min； 

(2)向上述匀浆液中加入200μL氯仿，上下颠倒混匀，室温静置5min； 

(3)4℃，12000r/min离心10min； 

(4)取300μL上清，加入等体积异丙醇，轻轻晃动后，室温静置10min； 

(5)4℃，12000r/min离心10min； 

(6)弃上清，用1mL预冷的75%乙醇洗涤2次，4℃，10000r/min离心5min； 

(7)空气干燥，加入20～50μL无RNase水溶解，得到RNA提取液； 

(8)将2μL上述RNA提取液与0.5μg随机引物混合后，无RNase水补至15μL，在70℃温育5min，立即置于冰上冷却； 

(9)取冷却后的混合液，1μL逆转录酶M-MLV，一起加入到9μL RT反应液中，37℃孵育1h；然后95℃处理5min，得到的cDNA即为后续反应的模板。 

2、检测 

(1)选取如上处理的模板，按照实施例2所示优化的反应体系和反应条件设置3个平行反应管同时进行反应，使用Mastercyclerep realplex荧光定量PCR仪进行检测。 

(2)检测结果判定和病毒的定量： 

经Mastercyclerep realplex荧光定量PCR仪软件分析该待测样本三个平行反应管的Ct值为33.09、33.22、32.99，Ct平均值为33.10，标准差为0.11，按照实施例2中的检测结果判定标准判定为阳性。 

根据Ct值带入实施例2建立的标准曲线，计算出待测样本检测管中病毒cDNA拷贝数为2.84×10³copies。 

实施例5对青蟹双顺反子病毒-1进行实时荧光定量RT-PCR检测的试剂盒在检测青蟹双顺反子病毒-1中的应用 

本实施例采用实施例3中的快速诊断试剂盒，通过Real time-PCR扩增和实时荧光定量PCR仪和软件分析，对待测样品含有青蟹双顺反子病毒-1的量进行检测，具体步骤如下： 

(1)向匀浆器中加入拟穴青蟹鳃组织0.1克，并加入约待测样品10倍体积的Trizol液稀释，冰浴匀浆，室温静置5min； 

(2)向上述匀浆液中加入200μL氯仿，上下颠倒混匀，室温静置5min； 

(3)4℃，12000r/min离心10min； 

(4)取300μL上清，加入等体积异丙醇，轻轻晃动后，室温静置10min； 

(5)4℃，12000r/min离心10min； 

(6)弃上清，用1mL预冷的75%乙醇洗涤2次，4℃，10000r/min离心5min； 

(7)空气干燥，加20-50μL无RNase水溶解，得到RNA提取液； 

(8)将2μL上述RNA提取液与0.5μg随机引物混合后，无RNase水补至15μL在70℃温育5min，立即置于冰上冷却； 

(9)取冷却后的混合液，1μL逆转录酶M-MLV，一起加入到9μL RT反应液中，37℃孵育1h；然后95℃处理5min，得到的cDNA即为后续反应的模板。 

(10)选取如上处理的模板，按照实施例2所示优化的反应体系和反应条件设置3个平行反应管同时进行反应，使用Mastercyclerep realplex荧光定量PCR仪进行检测。 

(11)检测结果判定和病毒的定量： 

经Mastercyclerep realplex荧光定量PCR仪软件分析该待测样本三个平行反应管的Ct值为23.60、23.89、23.48，Ct平均值为23.66，标准差为0.21，按照实施例2中的检测结果判定标准判定为阳性。 

根据Ct值带入实施例2建立的标准曲线，计算出待测样本检测管中病毒cDNA拷贝数为1.97×10⁶copies。 

以上实施例仅用于阐述本发明，而本发明的保护范围并非仅仅局限于以上实施例。所述技术领域的普通技术人员依据以上本发明公开的内容和各参数所取范围，均可实现本发明的目的。 

Claims (5)

1.一种青蟹双顺反子病毒-1检测用引物组和Taqman探针，其特征在于：所述引物组由上游引物和下游引物组成，所述的上游引物的碱基序列如序列表中SEQ IDNO.1所示，所述的下游引物的碱基序列如序列表中SEQ ID NO.2所示；所述的Taqman探针的碱基序列如序列表中SEQ ID NO.3所示；所述的Taqman探针位于所述上游引物和下游引物之间；在所述的Taqman探针的5′端标记有FAM荧光发射基团，3′端标记有TAMRA荧光淬灭基团。

2.一种检测青蟹双顺反子病毒-1实时荧光定量RT-PCR的方法，其特征是：利用权利要求1中所述的引物组和Taqman探针通过实时荧光定量RT-PCR反应对青蟹双顺反子病毒-1进行定性和定量检测。

3.一种对青蟹双顺反子病毒-1进行实时荧光定量RT-PCR检测的试剂盒，其特征是：含有权利要求1所述的引物组和Taqman探针。

4.权利要求1所述的青蟹双顺反子病毒-1检测用引物组和Taqman探针在检测青蟹双顺反子病毒-1中应用。

5.权利要求3所述的对青蟹双顺反子病毒-1进行实时荧光定量RT-PCR检测的试剂盒在检测青蟹双顺反子病毒-1中的应用。

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