CN103239458A - 3, 20-二氧代二降木栓烷在制备治疗癌症药物中的应用 - Google Patents

3, 20-二氧代二降木栓烷在制备治疗癌症药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及3,20-二氧代二降木栓烷治疗癌症方面的用途。本发明获得的3,20-二氧代二降木栓烷对体外培养癌细胞株有细胞毒活性，是有效的抗肿瘤药物。

Description

3, 20- 二氧代二降木栓烷在制备治疗癌症药物中的应用
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体为3, 20-二氧代二降木栓烷在治疗癌症药物中的应用。
背景技术
余甘子Phyllanthus emblica L.是来源于大戟科（Euphorbiaceae）叶下珠属PhyllanthusL.植物，余甘子在热带亚热带地域都有广泛分布。在我国境内，余甘子主要分布于云南、广西、广东、福建、海南、台湾、四川、贵州8 省，其中以福建和云南两省产量最多。余甘子味酸苦，回甜，是一种具有较高食用和药用价值的野生植物资源，风味独特，营养丰富，保健功能强，含有多种对人体有益的活性物质，具有补益、抗肿瘤、抗衰老、抗炎、抗菌、抗病毒、抗突变、抗高血压、调血脂等作用。虽然目前国内外研究者对余甘子的药理活性研究较多，但是基本是对其提取物药理和生理活性进行研究。从已经分离得到的单体化合物来看，大多数单体化合物的生物活性报道较少。
3, 20-二氧代二降木栓烷是余甘子中新发现的化合物，其活性未见报道，本发明提供3, 20-二氧代二降木栓烷的新用途。
3, 20-二氧代二降木栓烷（3,20-dioxo-dinorfriedelane）的结构式如下：
Figure 2013101466273100002DEST_PATH_IMAGE002
分子式为：C28H44O2，分子量：412。
发明内容
本发明的目的是要提供具有抑制肿瘤功能的3, 20-二氧代二降木栓烷的制备方法。
3, 20- 二氧代二降木栓烷：白色固体（氯仿），HR-EI-MS m/z:412.333 8 [M]+（计算值为412.334 1），确定其分子式为 C28H44O2，不饱和度为7。IR 光谱出现1 702cm−1 较强的吸收带，提示该结构含有羰基。在1H-NMR (400 MHz, CDCl3) 高场区给出5 个季碳上的甲基氢信号δ 0.68 (3H, s), 0.88 (3H, s), 0.88 (3H,s), 0.92 (3H, s), 1.23 (3H, s) 和1 个次甲基碳上的甲基氢信号δ 0.84 (3H, d, J = 6.4 Hz)。由13C-NMR(100 MHz, CDCl3) 和DEPT 谱显示化合物存在28个碳信号。其中包括6 个甲基、11 个亚甲基、4 个次甲基、7 个季碳，由此可初步判断该化合物为萜类化合物。其中δ 214.1 和213.1 为 2 个酮羰基碳信号。在 1H-1H COSY 谱中，δH 2.22 与δH 0.85 的2个氢相关。此外，δH 2.32 与δH 1.68 相关，δH 2.45与δH 2.26 相关，δH 2.41 与δH 1.91 相关，再根据高场的次甲基碳上的甲基氢信号δH 0.85 (3H, d, J =6.4 Hz) 和DEPT 谱中处于最高场的甲基碳信号δ7.0，推断此化合物具有木栓烷型三萜的骨架结构[4]。对比文献数据[5]，与木栓酮相比，少了2 个甲基，多了1 个羰基。为进一步确定该化合物的结构，经HSQC 谱归属了该化合物的碳氢信号，并进行了该化合物的HMBC 实验。在 HMBC 谱中，观察到δC214.1 与δH 1.91 (H-18), 2.38 (H-21), 1.45 (H-22) 存在远程相关，δC 48.2 与δH 1.23 (H-28), 2.41 (H-19) 相关，δC 37.8 与δH 1.91 (H-18) 相关，可知该δC 214.1羰基位于 C-20。δC 213.1 与δH 0.85 (H-23), 2.22 (H-4)存在远程相关，δC 58.3 (C-4) 与δH 0.68 (H-24), 0.85(H-23), 2.36 (H-6) 存在远程相关，推断出δC 213.1 位于C-3。确定其化学结构为3, 20-二氧代二降木栓烷，命名为余甘酮A。
实施例1
新鲜余甘子30 kg 粉碎后用95%乙醇室温浸泡，提取液减压浓缩，干燥后得到浸膏598.0 g，将其分散于适量的蒸馏水中，依次用石油醚、醋酸乙酯、正丁醇萃取，浓缩后得到石油醚部位浸膏63.2 g、醋酸乙酯部位浸膏69.36 g、正丁醇部位浸膏112.5g。石油醚层浸膏萃取物经硅胶（200～300 目）柱色谱，依次以石油醚-醋酸乙酯（100∶0→0∶100）、醋酸乙酯-甲醇（100∶0→0∶100）梯度洗脱，TLC分析合并得到13 个组分（Fr.1～13），Fr. 3、Fr. 4、
Fr. 7、Fr. 9、Fr. 11 经醋酸乙酯重结晶得到化合物3, 20-二氧代二降木栓烷（20.5 mg）。
实施例2
研究化合物1体外对肿瘤细胞抑制作用。
材料：四甲基唑氮蓝（MTT）；化合物1（自制）。
方法与结果：试验方法为国际通用的MTT法：将处于对数生长期的要进行实验的肿瘤细胞按定量接种于96孔培养板内，培养24小时后加入药量，细胞在37℃、5%CO2条件下继续培养48小时后，加入5mg/ml的MTT液20Μl，再继续培养4小时，加入DMSO溶解后迅速用酶标仪在570nm处测定OD值，计算细胞生长抑制率，实验结果见表1。
生长抑制率（%）=（1-加药孔平均A值/空白对照孔平均A值）×100%
表 1 化合物1体外细胞毒实验结果
浓度(μM) Hela SK-OV-3 Lovo U937 jurkat HL-60
10 8.34% 0.58% 13.21% 11.64% 12.49% 82.45%
20 10.52% 1.66% 21.94% 31.33% 22.10% 20.57%
40 18.24% 13.10% 40.11% 58.02% 50.15% 60.01%
100 34.97% 29.20% 60.77% 71.01% 73.31% 93.51%
IC50(μM) >100 >100 62.61 38.57 43.27 39.18
用不同浓度的化合物1处理各肿瘤细胞，可见癌细胞的生长均受到抑制，且呈浓度和时间依赖性。结果表明，化合物1对对肿瘤细胞有较强的细胞毒作用，尤其是对白血病细胞株U937及HL-60的作用较为显著，其半数抑制浓度（IC50）分别为38.57，39.18μM。
实施例3
化合物1的体内抗肿瘤实验
目的：研究化合物1对小鼠微小残留白血病的治疗作用。
材料：DBA/2近交小鼠120只，雌雄各半，体重18~20g；环磷酰胺(Cy)；化合物1(自制)
方法与结果：微小残留白血病小鼠模型的建立：将DBA/2近交小鼠随机分为6组，每组20只。正常对照组不做任何处理，其余各组小鼠腹腔注射L7212白血病细胞1×106/只，3天后分别注射环磷酰胺（Cy）250mg/kg。模型组造模后腹腔注射生理盐水0.2ml；阳性对照组腹腔注射Cy150mg/kg，两天一次；化合物1高剂量组腹腔注射25mg/kg，1次/d，连续5d；化合物1中剂量组腹腔注射12.5mg/kg， 1次/d，连续5d；化合物1低剂量组腹腔注射6.25mg/kg，1次/d，连续5d。
外周血白细胞和血小板的变化情况：于治疗后第七天进行外周血白细胞和血小板计数，观察外周血白细胞和血小板的变化情况。结果见表2。
表2 化合物1对微小残留白血病小鼠外周血白细胞和血小板的影响（n=20）
组别 白细胞数（×103/μl） 血小板数（×105/μl）
正常对照组 15.4±2.8** 11.5±3.7*
模型组 23.6±6.4 14.9±4.3
阳性对照组 12.8±3.8** 11.1±3.2**
化合物1高剂量组 17.6±4.6** 12.4±3.2*
化合物1中剂量组 19.8±5.4* 14.8±4.3
化合物1低剂量组 21.2±6.6 14.1±3.8
注：与模型组比较：*P<0.05，**P<0.01。
结果表明：化合物1可显著地降低微小残留白血病小鼠外周血白细胞数的升高，对血小板变化有一定的影响。
小鼠生存期的观察：记录各组小鼠的生存时间。结果见表3。
表3 化合物1对微小残留白血病小鼠生存期的影响（n=20）
组别 生存天数
正常对照组 —
模型组 13.9±2.7
阳性对照组 19.5±3.0**
化合物1高剂量组 18.2±3.1**
化合物1中剂量组 16.7±2.2**
化合物1低剂量组 14.7±3.0
注：与模型组比较：*P<0.05，**P<0.01。
结果表明：化合物1可显著地延长微小残留白血病小鼠的存活时间。
T细胞亚群分布的变化：分离单个核细胞并调整细胞浓度至1×106/ml,分别加入抗CD3抗原单克隆抗体,抗 CD4抗原单克隆抗体及抗 CD8抗原单克隆抗体,4℃,45min,离心洗涤后,荧光显微镜下计数 200 个细胞,计算荧光阳性细胞百分率。结果见表4。
表4 化合物1对微小残留白血病小鼠T细胞亚群分布的影响（n=20）
组别 CD3 +(%) CD4 +(%) CD8 +(%) CD4 +/ CD8 +
正常对照组 72.4±9.4** 30.9±7.1** 24.4±5.6* 1.41±0.47**
模型组 64.0±10.2 22.0±8.4 20.4±4.9 1.00±0.20
阳性对照组 58.0±10.9 25.9±6.8 23.3±5.1 1.22±0.48
化合物1高剂量组 69.5±7.4 28.2±5.6** 24.3±6.7* 1.39±0.61*
化合物1中剂量组 62.6±10.2 23.5±6.2 21.6±4.8 1.12±0.39
化合物1低剂量组 67.7±9.6 23.8±6.8 22.0±5.0 1.15±0.54
注：与模型组比较：*P<0.05，**P<0.01。
结果表明：微小残留白血病小鼠免疫功能低下，T细胞亚群紊乱，阳性对照组虽然能延长小鼠的生存时间，但外周白血胞持续低下，免疫功能尚未能明显恢复。化合物1能明显地升高CD4 +、 CD8 +，调整紊乱的T细胞亚群，提高微小残留白血病小鼠的免疫功能。
肝脏、脾脏指数的影响：取小鼠的肝脏和脾脏称重，计算肝脏和脾脏指数。结果见表5。
肝脏指数=肝脏重量（mg）/体重（g）
脾脏指数=脾脏重量（mg）/体重（g）
表5 化合物1对微小残留白血病小鼠肝、脾指数的影响（n=20）
组别 肝脏指数 脾脏指数
正常对照组 67.8±9.3 16.3±3.5**
模型组 73.7±11.1 23.1±5.9
阳性对照组 69.8±10.4 17.3±4.7**
化合物1高剂量组 69.6±11.3 18.6±4.2**
化合物1中剂量组 70.2±9.1 20.3±4.7
化合物1低剂量组 68.4±8.4 20.1±4.8
注：与模型组比较：*P<0.05，**P<0.01。
结果表明：各组小鼠死亡后肝脏指数无明显差异；模型组小鼠的脾脏指数升高，化合物1组脾脏指数降低，说明化合物1可以减少白细胞的浸润程度。
实施例4
含本发明新生物碱单体化合物1的片剂：取化合物1 20g与乳糖200g及玉米淀粉50g混合，用适量30%乙醇做湿润剂，制成软材，常规方法制粒，加入适量硬脂酸镁混合，制成片剂1000片。每片重275mg，含化合物1 20mg。
实施例5
含本发明新生物碱单体化合物1的胶囊剂：取化合物1 10g与淀粉100g，糊精20g，糖粉20g混合，用适量30%乙醇做湿润剂，制成软材，常规方法制粒，装入2号硬胶囊中，制成1000粒，每粒150mg。本胶囊剂中每粒含化合物1 10mg。
实施例6
含本发明新生物碱单体化合物1的注射剂：取化合物1 5g 以普通注射剂制备方法，加入丙二醇和乙醇各200ml，搅拌使溶解,加注射用水稀释至10000ml，NaCl调节等张，过0.22μm的微孔滤膜，灌封，10ml/支，流通蒸汽灭菌30min，检验、包装的注射剂。本注射剂10ml含化合物1 5mg。

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1.3, 20-二氧代二降木栓烷在制备治疗癌症药物中的应用。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN110183507A (zh) * 2019-06-21 2019-08-30 华侨大学 一种三萜类化合物及其制备方法和应用

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