CN101805384B - 一种新石蒜异喹诺酮类生物碱及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于天然药物技术领域，公开了从石蒜科植物葱莲中提取分离的一种新石蒜异喹诺酮类生物碱的化学结构，该化合物具有右式结构，以及该化合物的制备方法和在医药领域中的用途，尤其是在制备治疗白血病等抗肿瘤药物方面的用途。

Description

一种新石蒜异喹诺酮类生物碱及其制备方法和用途

一、技术领域：

本发明属于天然药物技术领域，具体涉及从石蒜科植物葱莲中提取分离一种新石蒜异喹诺酮类生物碱，以及该化合物的制备方法和在医药领域中的用途，尤其是在制备治疗白血病等抗肿瘤药物方面的用途。

二、技术背景：

肿瘤是一大类严重威胁人民生命和健康的多发病和常见病之一。手术治疗、放射治疗、药物治疗仍然是最常用最重要的肿瘤治疗手段。近年来，随着喜树碱、长春新碱、青蒿素、紫杉醇、鬼臼毒素、雷公藤甲素等一系列具有良好抗肿瘤活性天然产物的发现和成功应用，世界各国越来越将目光转向在天然产物中寻找新的药物来源。目前，临床应用的抗肿瘤药物中，来源于植物的约占1/3。最近，国外对目前临床试验中的抗癌新药的来源进行了总结报道，在294种正在进行临床试验的抗癌药物中，有60％来自天然产物。由于天然产物结构新颖、种类丰富，从中寻找生物活性显著、毒副作用小、新作用机制的先导物，并开发成为具有自主知识产权抗癌新药，是创新药物研制的突破口。

石蒜科(Amaryllidaceae)植物数量众多，分布于全世界热带、亚热带和温带地区。石蒜科植物含有独特的具有多种生物活性或药理活性的生物碱类化合物，并引起了世界各国药物研究人员的注意。迄今为止，已从石蒜科植物中发现生物碱500余种，并成功从中开发出石蒜内铵(治疗晚期宫颈癌、卵巢癌)，加兰他敏(治疗小儿麻痹症，老年性痴呆症)等药物。江苏省中国科学院植物研究所在对石蒜科葱莲属植物葱莲[Zephyranthes candida(Lindl.)Herb]化学成分的研究过程中，得到一种抗肿瘤活性明显的新石蒜异喹诺酮类生物碱———Dihydronarciclaside(DHN)。在目前发现的所有石蒜异喹诺酮类生物碱中，trans-dihygrona-rciclasine是抗肿瘤活性最好的化合物，但是存在水溶性不好和生物利用度差的缺点。而DHN则是trans-dihygrorciclasine的4位葡萄糖苷化产物，并且是其第一个天然的糖苷化产物，具有较好的水溶性和抗肿瘤活性，因此DHN有望开发成具有良好抗肿瘤活性的药物。

三、发明内容：

本发明公开了一种新石蒜异喹诺酮类生物碱，及其在制备抗肿瘤药物中的应用。化合物命名为Dihydronarciclaside(缩写：DHN)，分子式为：C₂₀H₂₅NO₁₂，化学名为：4-O-β-D-glucopyranosyl-trans-dihydronarciclasine，化学结构式为：

上述化合物的制备方法，其特征在于以葱莲[Zephyranthes candida(Lindl.)Herb]为原料，经甲醇、乙醇、甲醇-水混合溶液或乙醇-水混合溶液提取；甲醇、乙醇、甲醇-水混合溶液或乙醇-水混合溶液的提取液浓缩后加水溶解过大孔树脂吸附；大孔树脂吸附物经柱层析分离而得。其中，大孔树脂包括D101、AB-8或HP-20；柱层析用担体选自硅胶、凝胶和反相硅胶中的一种或几种制得。

本发明中的新石蒜异喹诺酮类生物碱DHN与医学上可接受的药用辅料组成药物组合物及其制剂。如片剂、胶囊剂、以及注射剂。

本发明提供了新石蒜异喹诺酮类生物碱DHN在制备治疗白血病等抗肿瘤药物方面的用途。DHN具有较好的水溶性，初步的体外抗肿瘤活性测试表明，DHN对肿瘤细胞有较强的细胞毒作用，尤其是对白血病细胞株U937及HL-60的作用较为显著，其半数抑制浓度(IC₅₀)分别为38.57μM，39.18μM；体内试验表明，当DHN剂量为12.5mg/kg时对小鼠微小残留白血病的有显著治疗作用，并有望开发成一类新的治疗白血病等肿瘤的药物。

四、附图说明：

以下图可作为附件材料上报。

图1、DHN的结构式

图2、DHN的MS谱

图3、DHN的¹H-NMR谱

图4、DHN的¹³C-NMR谱

图5、DHN的COSY谱

图6、DHN的HSQC谱

图7、DHN的HMBC谱

图8、DHN的ROESY谱

五、具体实施方式：

结合具体实施方式对本发明作进一步说明，但本发明的内容并不仅仅限于所列举的实施方式。

实施例1.从葱莲中分离和鉴定化合物DHN

将葱莲新鲜全草50kg，用400kg95％(体积比)乙醇-水溶液回流提取3次，每次2小时，浓缩至无醇味得浸膏(干重1.7kg)；所得浸膏加10倍体积的水溶解，滤纸过滤除去水不溶物，滤液用大孔树脂HP-20进行吸附，再以水，30％，50％，90％乙醇溶液洗脱，合并50％乙醇溶液洗脱液，浓缩得总石蒜异喹诺酮类生物碱20g。所得总石蒜异喹诺酮类生物碱进行硅胶柱层析，洗脱剂依次为氯仿-甲醇-水(17∶3∶0.2→4∶1∶0.1→7∶3∶0.5→3∶3∶0.5)、甲醇；其中氯仿-甲醇-水(4∶1∶0.1)部分进行反复反相硅胶C-18柱层析(洗脱剂为40％乙醇-水溶液)分离及凝胶Sephdex LH-20柱层析纯化(洗脱剂为35％乙醇-水溶液)得到化合物DHN 1.2g，得率为0.0024％，纯度为97％(HPLC面积归一化法)。

化合物DHN的鉴定，白色粉末，Molish反应阳性。难溶于氯仿，甲醇，易溶于DMSO溶液。化合物结构经MS、¹H、¹³C-NMR、2D-NMR等图谱确定。化合物核磁信号归属见表1，经CA网络版检索为新化合物。

表1化合物DHN的苷元与糖链部分的NMR数据(δ，ppm，0＝TMS，DMSO-d6)

实施例2、用甲醇冷浸提取法从葱莲中制备DHN

葱莲新鲜全草10Kg，用甲醇冷浸提取三次，甲醇用量为100升，提取时间为20天，提取温度为室温，提取液浓缩至无醇味得浸膏(干重为80g)；所得浸膏加10倍体积的水溶解，滤纸过滤除去水不溶物，滤液用大孔树脂AB-8进行吸附，再以水，10％，60％，90％乙醇溶液洗脱，合并60％乙醇溶液洗脱液，浓缩得总生物碱8g。所得总碱部位再经柱层析(硅胶柱层析：氯仿-甲醇-水梯度洗脱系统，RP-C18柱层析：水-甲醇系统，凝胶柱层析：水-甲醇系统)分离后，得到化合物DHN 0.5克，纯度为98％(外标法)。

实施例3、用甲醇加热回流提取法从葱莲中制备DHN

葱莲新鲜全草10Kg，用80kg甲醇回流提取3次，每次2小时，提取液浓缩至无醇味得浸膏(干重为120g)；所得浸膏加10倍体积的水溶解，滤纸过滤除去水不溶物，滤液用大孔树脂D101进行吸附，再以水，10％，75％乙醇溶液洗脱，合并75％乙醇溶液洗脱液，浓缩得总生物89g。所得总碱部位再经柱层析(硅胶柱层析：氯仿-甲醇-水梯度洗脱系统，RP-C18柱层析：水-甲醇系统，凝胶柱层析：水-甲醇系统)分离后，得到化合物DHN 0.6克，纯度为96％(外标法)。

实施例4、用高浓度的甲醇-水混合溶液提取法从葱莲中制备DHN

葱莲新鲜全草10Kg，用100kg 95％(体积比)甲醇-水的混合溶液回流提取3次，每次2小时，提取液浓缩至无醇味得浸膏(干重为150g)；所得浸膏加9倍体积的水溶解，滤纸过滤除去水不溶物，滤液用大孔树脂HP-20进行吸附，再以水，10％，75％乙醇溶液洗脱，合并75％乙醇溶液洗脱液，浓缩得总生物碱91g。所得总碱部位再经柱层析(硅胶柱层析：氯仿-甲醇-水梯度洗脱系统，RP-C8柱层析：水-甲醇系统，凝胶柱层析：水-甲醇系统)分离后，得到化合物DHN 0.65克，纯度为97％(外标法)。

实施例5、DHN的体外抗肿瘤活性评价实验

5.1目的：研究DHN对肿瘤细胞抑制作用。

5.2材料：四甲基唑氮蓝(MTT)；DHN(自制)。

5.3方法与结果：试验方法为国际通用的MTT法：将处于对数生长期的要进行实验的肿瘤细胞按定量接种于96孔培养板内，培养24小时后加入药量，细胞在37℃、5％CO₂条件下继续培养48小时后，加入5mg/ml的MTT液20Ml，再继续培养4小时，加入DMSO溶解后迅速用酶标仪在570nm处测定OD值，计算细胞生长抑制率，实验结果见表2。

生长抑制率(％)＝(1-加药孔平均A值/空白对照孔平均A值)×100％

表2DHN体外细胞毒实验结果

用不同浓度的DHN处理各肿瘤细胞，可见癌细胞的生长均受到抑制，且呈浓度和时间依赖性。结果表明，DHN对对肿瘤细胞有较强的细胞毒作用，尤其是对白血病细胞株U937及HL-60的作用较为显著，其半数抑制浓度(IC₅₀)分别为38.57，39.18μM。

实施例6.DHN的体内抗肿瘤实验

6.1目的：研究DHN对小鼠微小残留白血病的治疗作用。

6.2材料：DBA/2近交小鼠120只，雌雄各半，体重18～20g；环磷酰胺(Cy)；DHN(自制)

6.3方法与结果：

6.3.1微小残留白血病小鼠模型的建立：将DBA/2近交小鼠随机分为6组，每组20只。正常对照组不做任何处理，其余各组小鼠腹腔注射L7212白血病细胞1×10⁶/只，3天后分别注射环磷酰胺(Cy)250mg/kg。模型组造模后腹腔注射生理盐水0.2ml；阳性对照组腹腔注射Cy150mg/kg，两天一次；DHN高剂量组腹腔注射25mg/kg，1次/d，连续5d；DHN中剂量组腹腔注射12.5mg/kg，1次/d，连续5d；DHN低剂量组腹腔注射6.25mg/kg，1次/d，连续5d。

6.3.2外周血白细胞和血小板的变化情况：于治疗后第七天进行外周血白细胞和血小板计数，观察外周血白细胞和血小板的变化情况。结果见表3。

表3DHN对微小残留白血病小鼠外周血白细胞和血小板的影响(n＝20)

注：与模型组比较：^*P＜0.05，^**P＜0.01。

结果表明：DHN可显著地降低微小残留白血病小鼠外周血白细胞数的升高，对血小板变化有一定的影响。

6.3.3小鼠生存期的观察：记录各组小鼠的生存时间。结果见表4。

表4DHN对微小残留白血病小鼠生存期的影响(n＝20)

组别                   生存天数

正常对照组             -

模型组                 13.9±2.7

阳性对照组             19.5±3.0^**

DHN高剂量组            18.2±3.1^**

DHN中剂量组            16.7±2.2^**

DHN低剂量组            14.7±3.0

注：与模型组比较：^*P＜0.05，^**P＜0.01。

结果表明：DHN可显著地延长微小残留白血病小鼠的存活时间。

6.3.4T细胞亚群分布的变化：分离单个核细胞并调整细胞浓度至1×10⁶/ml，分别加入抗CD₃抗原单克隆抗体，抗CD₄抗原单克隆抗体及抗CD₈抗原单克隆抗体，4℃，45min，离心洗涤后，荧光显微镜下计数200个细胞，计算荧光阳性细胞百分率。结果见表5。

表5DHN对微小残留白血病小鼠T细胞亚群分布的影响(n＝20)

注：与模型组比较：^*P＜0.05，^**P＜0.01。

结果表明：微小残留白血病小鼠免疫功能低下，T细胞亚群紊乱，阳性对照组虽然能延长小鼠的生存时间，但外周白血胞持续低下，免疫功能尚未能明显恢复。DHN能明显地升高CD₄ ⁺、CD₈ ⁺，调整紊乱的T细胞亚群，提高微小残留白血病小鼠的免疫功能。

6.3.5肝脏、脾脏指数的影响：取小鼠的肝脏和脾脏称重，计算肝脏和脾脏指数。结果见表6。

肝脏指数＝肝脏重量(mg)/体重(g)

脾脏指数＝脾脏重量(mg)/体重(g)

表6DHN对微小残留白血病小鼠肝、脾指数的影响(n＝20)

注：与模型组比较：^*P＜0.05，^**P＜0.01。

结果表明：各组小鼠死亡后肝脏指数无明显差异；模型组小鼠的脾脏指数升高，DHN组脾脏指数降低，说明DHN可以减少白细胞的浸润程度。

实施例7、含本发明新生物碱单体DHN的片剂

取DHN20g与乳糖200g及玉米淀粉50g混合，用适量30％乙醇做湿润剂，制成软材，常规方法制粒，加入适量硬脂酸镁混合，制成片剂1000片。每片重275mg，含DHN 20mg。

实施例8、含本发明新生物碱单体DHN的胶囊剂

取DHN10g与淀粉100g，糊精20g，糖粉20g混合，用适量30％乙醇做湿润剂，制成软材，常规方法制粒，装入2号硬胶囊中，制成1000粒，每粒150mg。本胶囊剂中每粒含DHN 10mg。

实施例9、含本发明新生物碱单体DHN的注射剂

取DHN 5g以普通注射剂制备方法，加入丙二醇和乙醇各200ml，搅拌使溶解，加注射用水稀释至10000ml，NaCl调节等张，过0.22μm的微孔滤膜，灌封，10ml/支，流通蒸汽灭菌30min，检验、包装的注射剂。本注射剂10ml含DHN 5mg。

Claims (6)

1.一种石蒜异喹诺酮类生物碱，其特征在于化学名为4-O-β-D-glueopyranosyl-trans-dihydronarciclasine，化学结构式为：

2.制备权利要求1所述石蒜异喹诺酮类生物碱的方法，其特征在于以石蒜科植物葱莲[Zephyranthes candida(Lindl.)Herb]为原料，经甲醇、乙醇或者甲醇-水、乙醇-水的混合溶液提取；甲醇、乙醇或者甲醇-水、乙醇-水的混合溶液的提取液浓缩后加水溶解过大孔树脂吸附；大孔树脂吸附物经柱层析分离而得。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述的大孔树脂为D101、AB-8、HP-20中的一种；柱层析用担体选自硅胶、凝胶中的一种或几种。

4.权利要求1所述的石蒜异喹诺酮类生物碱与医学上可接受的药用辅料组成的药物制剂。

5.根据权利要求4所述的制剂，其特征在于剂型是片剂、胶囊剂和注射剂。

6.权利要求1所述的石蒜异喹诺酮类生物碱在制备抗肿瘤药物方面的用途。