CN103221067A

CN103221067A - 磷脂药物类似物

Info

Publication number: CN103221067A
Application number: CN2011800326443A
Authority: CN
Inventors: R·马吉; F·帕塔里诺; E·穆拉; A·巴贝里斯
Original assignee: Telormedix SA
Current assignee: Urogenital Pharmaceutical Co.,Ltd.
Priority date: 2010-04-30
Filing date: 2011-04-29
Publication date: 2013-07-24
Anticipated expiration: 2031-04-29
Also published as: NZ603155A; CA2797315C; US20130267481A1; KR20130056249A; US20130266635A1; US9173935B2; US9173936B2; US20120009247A1; AU2011247358A1; EP2563404A1; JP6026405B2; CA2797315A1; US9540407B2; JP2013525390A; US20160090395A1; EP2563404B1; WO2011134668A1; AU2011247358B2; US9180183B2; CN103221067B

Abstract

在一些实施方式中，提供组合物，所述组合物包含具有式A或式B所示结构的化合物：

或其药学上可接受盐、互变异构体或水合物，其中X²是键或接头，X³是键或-PO₄-，且X¹、R¹、R²、R³和n如本说明书所述。在一些实施方式中，还提供制备和使用这些化合物及组合物的方法。

Description

磷脂药物类似物

相关专利申请

本发明要求2010年4月30日提交的题为“Phospholipid Drug Analogs（磷脂药物类似物）”的美国临时专利申请序列号61/330,151的优先权，所述申请通过引用全文纳入本文。

技术领域

本发明部分涉及磷脂药物类似物，和其生产及使用方法。

背景技术

药效团通常是能在对象中发挥治疗作用的分子。例如，药效团有时能产生抗细胞增殖作用，可用于治疗细胞增生病症如癌。药效团有时能刺激对象的免疫系统，从而可产生或增强针对特定抗原的免疫应答。

药效团可偶联（例如连接）磷脂药物类似物中磷脂或磷脂样分子。磷脂或磷脂样组分能赋予类似物不同于未偶联药效团作用的功能。

发明内容

在一些实施方式中，提供的组合物包含具有式A或式B所示结构的化合物：

式A

式B

或其药学上可接受盐、互变异构体或水合物，其中：

X¹是-O-、-S-、或-NR^a-；

R^a是氢、C1-C10烷基、或取代的C1-C10烷基，或R^a和R¹可与氮原子一起形成杂环或取代的杂环，其中烷基或杂环基团上的取代基是羟基、C1-C10烷基、羟基C1-C10烯基、C1-C6烷氧基、C3-C6环烷基、C1-C6烷氧基C1-C6亚烷基、氨基、氰基、卤素或芳基；

R¹是氢、C1-C10烷基、取代的C1-C10烷基、C1-C10烷氧基、取代的C1-C10烷氧基、C3-C9环烷基、取代的C3-C9环烷基、C5-C10芳基、取代的C5-C10芳基、C5-C9杂环、取代的C5-C9杂环、C1-C6烷酰基、Het、Het C1-C6烷基、或C1-C6烷氧羰基，其中烷基、环烷基、烷酰基、烷氧羰基、Het、芳基或杂环基团上的取代基是羟基、C1-C10烷基、羟基C1-C10亚烷基、C1-C6烷氧基、C3-C9环烷基、C5-C9杂环、C1-6烷氧基C1-6烯基、氨基、氰基、卤素或芳基；

各R²独立地是氢、-OH、C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、取代的C1-C6烷氧基、-C(O)-C1-C6烷基(烷酰基)、取代的-C(O)-C1-C6烷基、-C(O)-C6-C10芳基(芳酰基)、取代的-C(O)-C6-C10芳基、-C(O)OH(羧基)、-C(O)O-C1-C6烷基(烷氧羰基)、取代的-C(O)O-C1-C6烷基、-NR^aR^b、-C(O)NR^bR^c(氨基甲酰基)、取代的C(O)NR^bR^c、C5-C9环、取代的C5-C9环、C5-C9杂环、取代的C5-C9杂环、卤素、硝基或氰基，其中烷基、环、芳基或杂环基团上的取代基是羟基、C1-C10烷基、羟基C1-C10亚烷基、C1-C6烷氧基、C3-C6环烷基、C1-C6烷氧基C1-C6亚烷基、氨基、氰基、卤素或芳基；

各R^b和R^c独立地是氢、C1-C10烷基、取代的C1-C10烷基、C1-C10烷氧基、取代的C1-C10烷氧基、C3-C9环烷基、取代的C3-C9环烷基、C5-C10芳基、取代的C5-C10芳基、C5-C9杂环、取代的C5-C9杂环、C1-C6烷酰基、Het、Het C1-C6烷基、或C1-C6烷氧羰基，其中烷基、环烷基、烷酰基、烷氧羰基、Het、芳基或杂环基团上的取代基是羟基、C1-C10烷基、羟基C1-C10亚烷基、C1-C6烷氧基、C3-C9环烷基、C5-C9杂环、C1-6烷氧基C1-6烯基、氨基、氰基、卤素或芳基；

X²是键或连接基团；n是0、1、2、3或4；和

X³是键或–PO₄-；

R³是取代有–OC(O)-R^d和–OC(O)-R^e的C1-C6烷基；取代有–OC(O)-R^d,–OC(O)-R^e和一个或多个其他取代基的C1-C6烷基；取代有–OC(O)-R^d和–OC(O)-R^e的C1-C6烯基；或取代有–OC(O)-R^d、–OC(O)-R^e和一个或多个其他取代基的C1-C6烯基；其中所述一个或多个其他取代基独立地是羟基、C1-C10烷基、羟基C1-C10亚烷基、C1-C6烷氧基、C3-C9环烷基、C5-C9杂环、C1-C6烷氧基C1-C6亚烷基、氨基、氰基、卤素或芳基；

各R^d和R^e独立地是C6-C30烷基或取代有一个或多个羟基、C1-C10烷基、羟基C1-C10亚烷基、C1-C6烷氧基、C3-C6环烷基、C1-C6烷氧基C1-C6亚烷基、氨基、氰基、环氧基、卤素或芳基的C6-C30烷基。

在某些实施方式中，R^d和R^e独立地是线性及饱和C6-C30烷基，在一些实施方式中，R^d和R^e相同或不同。-OC(O)-R^d和–OC(O)-R^e的非限制性示例独立包括正己酰(C6,-OC(O)-(CH₂)₄CH₃)、正辛酰(C8,-OC(O)-(CH₂)₆CH₃)、正癸酰(C10,-OC(O)-(CH₂)₈CH₃)、正十二酰(C12,月桂酰,-OC(O)-(CH₂)₁₀CH₃)、正十四酰(C14,肉豆蔻酰,-OC(O)-(CH₂)₁₂CH₃)、正十六酰(C16,棕榈酰,-OC(O)-(CH₂)₁₄CH₃)、正十八酰(C18,硬脂酰,-OC(O)-(CH₂)₁₆CH₃))、正二十酰(C20,花生酰,-OC(O)-(CH₂)₁₈CH₃))、正二十二酰(C22,山嵛酰,-OC(O)-(CH₂)₂₀CH₃))和正二十四酰(C24,木蜡酰,-OC(O)-(CH₂)₂₂CH₃))。在一些实施方式中，R^d和R^e独立地是线性及饱和C8-C18烷基，且有时R^d和R^e独立是线性及饱和C8、C12或C18烷基。在一些实施方式中，R^d和R^e是线性及饱和C6-C30烷基，或取代有一个或多个羟基、C1-C10烷基、羟基C1-C10亚烷基、C1-C6烷氧基、C3-C6环烷基、C1-C6烷氧基C1-C6亚烷基、氨基、氰基、环氧基、卤素或芳基的线性C6-C30烷基。在一些实施方式中，R^d和R^e为线性及饱和（例如SC12），在一些实施方式中，R^d和R^e为线性及非饱和（例如化合物A）。

在特定实施方式中，各R^d和R^e是线性及饱和C12烷基。在一些实施方式中，R^d和R^e不由环氧基部分取代，且有时R^d和R^e不由羟基部分取代。在特定实施方式中，R^d和R^e不由环氧基部分或羟基部分取代。在多个实施方式中，R^d和R^e不包括双键（例如不饱和）。

在一些实施方式中，–X²-X³-R³一起形成式C所示结构：

式C

在某些实施方式中，–X²-X³-R³一起形成式D所示结构：

式D

在一些实施方式中，X¹是O，且有时R¹是取代有C1-6烷氧基的C1-C10烷基。在某些实施方式中，n是0且X²是–C(O)NH-(CH₂)₂-。有时R³是取代有-OC(O)-R^d和–OC(O)-R^e的C3烷基，在某些实施方式中，R³C3烷基在C3烷基的位置3处取代有-OC(O)-R^d且位置2处取代有-OC(O)-R^e（例如参见式C，其中-PO₄-部分连接C3烷基的位置1，–OC(O)-R^e部分在位置2且–OC(O)-R^d部分在位置3）。在特定实施方式中，X¹是O，R¹是-(CH₂)₂-OCH₃，n是0，X²是-C(O)NH-(CH₂)₂-，X³是–PO₄-，R³是取代有–OC(O)-R^d和–OC(O)-R^e的C3烷基，且R^d和R^e是线性及饱和C12烷基。

在一些实施方式中，式A或式B的苯环用非芳环、杂环非芳环或杂环芳环取代。这些环的示例包括例如本文所列的环。例如，非芳环示例包括如任意5或6元的，例如环烷基。杂环非芳环示例包括例如哌啶和哌嗪。杂环芳环示例包括例如吡啶、吡嗪、嘧啶、哒嗪和三嗪。

在某些实施方式中，组合物包括脂质体。在一些实施方式中，组合物包括抗原。

在一些实施方式中，还提供包含具有本文所述结构的化合物的免疫刺激组合物。在某些实施方式中，所述化合物起佐剂功能，有时免疫刺激组合物包括抗原（例如所述组合物起疫苗作用）。免疫刺激组合物在一些实施方式中包括疫苗，且在某些实施方式中构成主要疫苗或疫苗组合。

还提供诱导免疫应答的方法，所述方法包括给予对象具有本文所提供结构的化合物。诱导免疫应答指诱导对特异性抗原的免疫应答，诱导一般免疫应答（没有特异性抗原时）。在一个实施方式中，所述化合物作为佐剂并因而与特异性而不是一般免疫应答相关。在一个实施方式中，所述化合物作为一般免疫刺激物。在一个实施方式中，所述方法包括将一定量的抗原和具有本文所提供结构的化合物给予需要的哺乳动物，所述量有效预防、抑制或治疗疾病，所述疾病包括但不限于膀胱癌或皮肤癌。因此，在某些实施方式中，所述免疫应答是抗原特异性免疫应答。在一些实施方式中，所述免疫应答是抗体反应，有时是例如IgG1或IgG2a抗体反应。在一些实施方式中，所述抗原是微生物抗原，例如可给予疟疾抗原，在一些实施方式中，所述抗原是大肠杆菌（E.coli）抗原。所述抗原和化合物有时在一个组合物中，在一些实施方式中，所述抗原和化合物在不同组合物中。在某些实施方式中，所述化合物和/或抗原结合脂质体。所述抗原和化合物可同时或在不同时间给予。在一些实施方式中，所述抗原在所述化合物之前给予，在其他实施方式中，所述抗原与所述化合物同时给予，在其他实施方式中，所述抗原在所述化合物之后给予。

在某些实施方式中，所述免疫应答是抗原特异性免疫应答。在一些实施方式中，所述免疫应答是抗体反应，有时是IgG2a抗体反应。

在一些实施方式中，所述对象是哺乳动物，例如人。在某些实施方式中，将所述化合物给予膀胱，例如在非限制性实施方式中通过膀胱内灌注/局部递送。

在一些实施方式中，将所述化合物给予皮肤，例如通过局部递送。

在某些实施方式中，提供治疗对象病症的方法，所述方法包括以治疗病症的有效量将本文所述组合物给予需要的对象。在一些实施方式中，还提供治疗对象病症的方法，所述方法包括以治疗病症的有效量将本文所述免疫刺激组合物给予需要的对象。所述对象有时是哺乳动物，在某些实施方式中可以是人。所述病症有时是癌病症，所述病症可以是微生物感染。在特定实施方式中，所述病症是膀胱癌病症，在某些实施方式中，所述组合物可通过膀胱内灌注/局部递送给予膀胱。在一些实施方式中，所述癌症是皮肤癌，所述化合物可局部和/或外部给予，例如以乳膏、油膏、凝胶、洗剂或其他合适载剂通过局部递送给皮肤。可治疗的皮肤癌前病症和皮肤癌包括例如光化性角化病(AK)、基底细胞癌(BCC)、鳞状细胞癌(SCC)、黑色素和非黑色素皮肤癌。

下列描述、示例、权利要求和附图进一步描述了某些实施方式。

附图简要说明

所述图描述技术实施方式且非限制性。为清楚起见和便于说明，图不按比例绘制，在一些情况中，可夸张或扩大显示多个部分以促进对具体实施方式的理解。

图1显示Raw264.7小鼠巨噬细胞系研究中就化合物而言的细胞因子生成。

图2显示Raw264.7小鼠巨噬细胞系研究中就化合物而言的细胞因子生成。

图3显示Raw264.7小鼠巨噬细胞系研究的存活数据。

图4是供体1的PBMC研究中就化合物而言的IL-6生产图。

图5是供体2的PBMC研究中就化合物而言的IL-6生产图。

图6是供体3的PBMC研究中就化合物而言的IL-6生产图。

图7是供体1的PBMC研究中就化合物而言的TNF-α生产图。

图8是供体2的PBMC研究中就化合物而言的TNF-α生产图。

图9是供体3的PBMC研究中就化合物而言的TNF-α生产图。

图10提供PBMC研究的存活数据。

图11显示磷脂类似物SC8、SC12和SC18的结构和分子量。

图12显示双阳性HLA-DR+/CD20+B细胞在用所示检测试剂孵育24小时后CD40表达的MFI值，对来自3个供体的全血进行测试。

图13显示HLA-DR+/CD11c+/CD123-mDC在用所示检测试剂孵育24小时后CD80、CD86和CCR7表达的MFI值，对来自供体1的全血进行测试。

图14显示HLA-DR+/CD11c+/CD123-mDC在用所示检测试剂孵育24小时后CD80、CD86和CCR7表达的MFI值，对来自供体2的全血进行测试。

图15显示HLA-DR+/CD11c+/CD123-mDC在用所示检测试剂孵育24小时后CD80、CD86和CCR7表达的MFI值，对来自供体3的全血进行测试。

图16显示HLA-DR+/CD11c-/CD123+pDC在用所示检测试剂孵育24小时后CD80、CD86和CCR7表达的MFI值，对来自3个供体（D1-D3）的全血进行测试。

图17是SC12和咪喹莫特对细胞的细胞毒性效果的条形图集合。皮肤SCC细胞系用于连续监控微量滴定板孔（E板，罗氏公司（Roche））中的电导，其对应于细胞数目。TMX指示图表中的SC12。

图18是接触SC12或咪喹莫特的细胞的照片集合。SC12和咪喹莫特诱导相似的形态变化。在第3天，可在用SC12或咪喹莫特处理的SCC细胞中观察到细胞脱离、形态变化和增殖抑制。

图19显示针对溃疡分枝杆菌（M.ulcerans）抗原的IgG效价发展（左：化合物A，右：SC12）。

图20提供合成化合物A和SC12的合成方案的一种示例。

图21提供合成化合物A和SC12的合成方案的一种示例。

图22提供合成化合物A和SC12的合成方案的一种示例。

图23提供合成化合物A和SC12的合成方案的一种示例。

发明详述

本文提供的组合物可用于治疗某些病症，如细胞增生病症。存在多种细胞增生病症，表浅性膀胱癌是一种类型的示例。本文提供的组合物还可用作疫苗，所述化合物可促进免疫应答和提供佐剂活性。

本文提供的组合物包括某些实施方式中的磷脂类似物。磷脂类似物通常包括药效团部分和经接头偶联该药效团部分的磷脂、或磷脂样部分。

不受理论约束，本文所述组合物可调节一种或多种toll样受体的活性（例如所述偶联物是激动剂、拮抗剂或两者）。术语“toll样受体”（TLR）指结合病原体相关分子模式（PAMP）并促进哺乳动物免疫应答的的受体家族成员。已知10个哺乳动物TLR，例如TLR1-10。术语“toll样受体激动剂”（TLR激动剂）指与TLR相互作用并刺激受体活性的分子。合成TLR激动剂是设计成与TLR相互作用并刺激受体活性的化学化合物。术语“toll样受体拮抗剂”（TLR拮抗剂）指与TLR相互作用并抑制或中和受体信号传导活性的分子。合成TLR拮抗剂是设计成与TLR相互作用并干扰受体活性的化学化合物。TLR的激动剂和/或拮抗剂有时调节TLR-7、TLR-3或TLR-9的活性。TLR的局部激活可破坏恶性肿瘤细胞生长和存活所需的癌细胞-基质相互作用并可诱导细胞凋亡。

同样，不受理论约束，本文提供的化合物可鉴定为具有有利的稳定性。例如，本文所述某些化合物可鉴定为在生理条件下具有有利的化学稳定性和/或代谢稳定性。

化合物

本文所用的术语“烷基”、“烯基”和“炔基”包括直链（本文中称为“线性”）、支链（本文中称为“非线性”）、环单价烃基和其组合，它们在未取代时仅包含C和H原子。烷基部分的非限制性示例包括甲基、乙基、异丁基、环己基、环戊基乙基、2-丙烯基、3-丁炔等。各个这种基团中的碳原子总数有时在本文中描述，例如基团包含多至10个碳原子时，可表示为1-10C或C1-C10或C1-10。当杂原子（通常为N、O和S）能取代碳原子时，如在杂烷基中，描述基团的数字尽管仍写为如C1-C6，其代表基团中碳原子数目加上所述杂原子数目之和，所述杂原子纳入以取代所述环或链骨架中的碳原子。仅含C和H原子且未取代的烷基有时称为“饱和”。烯基或炔基一般为“未饱和”，因为其分别包含一个或多个双键或三键。烯基可包括任何数目的双键，如1、2、3、4或5个双键。炔基可包括任何数目的三键，如1、2、3、4或5个三键。

烷基、烯基和炔基取代基有时包含1-10C（烷基）或2-10C（烯基或炔基）。一些实施方式中，它们可包含1-8C（烷基）或2-8C（烯基或炔基）。有时它们包含1-4C（烷基）或2-4C（烯基或炔基）。单一基团可包括一种类型以上的多重键，或一个以上的多重键。所述基团含有至少一个碳-碳双键时包括在术语“烯基”定义内，含有至少一个碳-碳三键时包括在术语“炔基”内。

烷基、烯基和炔基通常可选取代到所述取代能合成并存在的程度。常见的取代包括但不限于卤素、=O、＝N-CN、=N-OR、=NR、OR、NR₂、SR、SO₂R、SO₂NR₂、NRSO₂R、NRCONR₂、NRCOOR、NRCOR、CN、COOR、CONR₂、OOCR、COR和NO₂，其中各R独立地是H、C1-C8烷基、C2-C8杂烷基、C1-C8酰基、C2-C8杂酰基、C2-C8烯基、C2-C8杂烯基、C2-C8炔基、C2-C8杂炔基、C6-C10芳基或C5-C10杂芳基，各R可选取代有卤素、=O、=N-CN、=N-OR’、=NR’、OR’、NR’₂、SR’、SO₂R’、SO₂NR’₂、NR’SO₂R’、NR’CONR’₂、NR’COOR’、NR’COR’、CN、COOR’、CONR’₂、OOCR’、COR’和NO₂，其中各R’独立地是H、C1-C8烷基、C2-C8杂烷基、C1-C8酰基、C2-C8杂酰基、C6-C10芳基或C5-C10杂芳基。烷基、烯基和炔基还可由C1-C8酰基、C2-C8杂酰基、C6-C10芳基或C5-C10杂芳基取代，其各自可由对特定基团合适的取代基来取代。

“乙炔”取代基是可选取代的2-10C炔基，通常具有式-C≡C-Ri，其中Ri是H或C1-C8烷基、C2-C8杂烷基、C2-C8烯基、C2-C8杂烯基、C2-C8炔基、C2-C8杂炔基、C1-C8酰基、C2-C8杂酰基、C6-C10芳基、C5-C10杂芳基、C7-C12芳基烷基或C6-C12杂芳基烷基，各Ri基团可选取代有一个或多个选自卤素、=O、=N-CN、＝N-OR’、=NR’、OR’、NR’2、SR’、SO₂R’、SO₂NR’₂、NR’SO₂R’、NR’CONR’₂、NR’COOR’、NR’COR’、CN、COOR’、CONR’₂、OOCR’、COR’和NO₂的取代基，其中各R’独立地是H、C1-C6烷基、C2-C6杂烷基、C1-C6酰基、C2-C6杂酰基、C6-C10芳基、C5-C10杂芳基、C7-12芳基烷基或C6-12杂芳基烷基，各自可选取代有一个或多个选自卤素、C1-C4烷基、C1-C4杂烷基、C1-C6酰基、C1-C6杂酰基、羟基、氨基和=O的基团；其中2个R’能连接形成3-7元环，所述环可选包含选自N、O和S的多至3个杂原子。在一些实施方式中，-C≡C-Ri的Ri是H或Me。

“杂烷基”、“杂烯基”和“杂炔基”等与对应烃基（烷基、烯基和炔基）基团类似定义，但术语‘杂’指主链残基内含有1-3个O、S或N杂原子或其组合的基团；因此对应烷基、烯基或炔基的至少一个碳原子由特定杂原子之一取代以形成杂烷基、杂烯基或杂炔基。烷基、烯基和炔基的典型和优选杂合形式大小一般与对应烃基相同，可存在于杂形式上的取代基与上述用于烃基的那些相同。出于化学稳定性原因，还应理解除非另有说明，所述基团不包括2个以上的连续杂原子，除非N或S上存在氧基团如硝基或磺酰基。

本文所用的“烷基”包括环烷基和环烷基烷基时，术语“环烷基”在本文中可用于描述经环碳原子连接的碳环非芳族基团，“环烷基烷基”可用于描述经烷基接头连接分子的碳环非芳族基团。类似地，“杂环”可用于描述包含至少一个杂原子作为环成员且经环原子连接分子的非芳族环基团，所述环原子可以是C或N；“杂环基烷基”可用于描述经接头连接另一分子的所述基团。适用于环烷基、环烷基烷基、杂环基和杂环基烷基的大小和取代基与上述用于烷基的那些相同。本文所用的这些术语还包括含有一个或二个双键的环，只要所述环不是芳环。

本文所用的“酰基”涵盖包括在羰基碳原子中2个可用的价位置之一结合烷基、烯基、炔基、芳基或芳基烷基的基团，杂酰基指其中羰基碳以外的至少一个碳由选自N、O和S的杂原子取代的对应基团。因此，杂酰基包括例如-C(=O)OR和-C(=O)NR₂以及-C(=O)-杂酰基。

酰基和杂酰基键合到任何基团或分子，它们经羰基碳原子的开放原子价与其结合。通常，其是C1-C8酰基，包括甲酰基、乙酰基、新戊酰基、和苯甲酰基以及C2-C8杂酰基，所述C2-C8杂酰基包括甲氧基乙酰基、乙氧羰基和4-吡啶甲酰基。含有酰基和杂酰基的所述基团的烃基、芳基和杂合形式可取代有本文所述取代基，所述取代基就酰基和杂酰基的各对应组分而言是普遍合适的取代基。

“芳族”部分或“芳基”部分指具有熟知的芳香性特征的单环或融合双环部分；示例包括苯基和萘基。类似地，“杂芳族”和“杂芳基”指包含一个或多个选自O、S和N的杂原子作为环成员的所述单环或融合双环系统。包含杂原子赋予5元环以及6元环的芳香性。典型的杂芳族系统包括单环C5-C6芳族基团如吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、噻吩基、呋喃基、吡咯基、吡唑基、噻唑基、

唑基、和咪唑基以及融合双环部分，所述双环部分的形成是通过融合这些单环基团之一与苯基环或任何杂芳族单环基团形成C8-C10双环基团如吲哚基、苯并咪唑基、吲唑基、苯并三唑基、异喹啉基、喹啉基、苯并噻唑基、苯并呋喃基、吡唑吡啶基、喹唑啉基、喹喔啉基、噌啉基等。在环系统中电子分布方面具有芳香性特征的任何单环或融合环双环系统包括在此定义内。其还包括双环基团，其中至少那种直接结合分子剩余部分的环具有芳香性特征。通常，所述环系统包含5-12个环成员原子。单环杂芳基有时包含5-6个环成员，双环杂芳基有时包含8-10个环成员。

芳基和杂芳基部分可取代有多个取代基，包括C1-C8烷基、C2-C8烯基、C2-C8炔基、C5-C12芳基、C1-C8酰基和其杂合形式，其各自可本身进一步被取代；用于芳基和杂芳基部分的其他取代基包括卤素、OR、NR₂、SR、SO₂R、SO₂NR₂、NRSO₂R、NRCONR₂、NRCOOR、NRCOR、CN、COOR、CONR₂、OOCR、COR和NO₂，其中各R独立地是H、C1-C8烷基、C2-C8杂烷基、C2-C8烯基、C2-C8杂烯基、C2-C8炔基、C2-C8杂炔基、C6-C10芳基、C5-C10杂芳基、C7-C12芳基烷基、或C6-C12杂芳基烷基，且各R可选如上就烷基所述进行取代。芳基或杂芳基上的取代基可进一步用本文描述为适用于各取代基类型或各取代基组分的基团取代。因此，例如，芳基烷基取代基可在芳基部分上用就芳基而言典型的取代基来取代，其可进一步在烷基部分上用就烷基而言典型或适合的取代基来取代。

类似地，“芳基烷基”和“杂芳基烷基”指经连接基团如亚烷基与其结合点键合的芳环和杂芳环系统，包括取代或未取代、饱和或未饱和、环或无环接头。接头通常是C1-C8烷基或其杂合形式。这些接头还可包括羰基，因此使它们能提供取代基作为酰基或杂酰基部分。芳基烷基或杂芳基烷基中的芳基或杂芳基环可取代有上面就芳基所述相同的取代基。芳基烷基有时包括苯环和C1-C4亚烷基，所述苯基环可选取代有上面就芳基所定义的基团，所述C1-C4亚烷基未取代或取代有1或2个C1-C4烷基或杂烷基，其中烷基或杂烷基能任选环化形成环如环丙烷、二

烷或氧杂环戊烷。类似地，杂芳基烷基通常包括C5-C6单环杂芳基和未取代的C1-C4亚烷基，所述单环杂芳基可选取代有一个或多个上述作为芳基上典型取代基的基团。杂芳基烷基有时取代有1或2个C1-C4烷基或杂烷基，或包括可选取代的苯环或C5-C6单环杂芳基以及未取代或取代有1或2个C1-C4烷基或杂烷基的C1-C4杂亚烷基，其中烷基或杂烷基能任选环化形成环如环丙烷、二

烷或氧杂环戊烷。

芳基烷基或杂芳基烷基描述为可选取代时，所述取代基可以在该基团的烷基或杂烷基部分上或者芳基或杂芳基部分上。烷基或杂烷基部分上的取代基有时与上面就烷基所述的那些相同，可选存在于芳基或杂芳基部分上的取代基通常与上面一般就芳基所述的那些相同。

本文所用的“芳基烷基”在未取代时是烃基，且通过环和亚烷基或类似接头中的碳原子总数来描述。因此，苄基是C7-芳基烷基，苯基乙基苯乙基是C8-芳基烷基。

上述“杂芳基烷基”指包含经连接基团结合的芳基的部分，与“芳基烷基”的差异在于芳基部分的至少一个环原子或连接基团的一个原子是选自N、O和S的杂原子。杂芳基烷基在本文中根据组合的环和接头中的原子总数来描述，包括经杂烷基接头连接的芳基；经烃基接头连接的杂芳基如亚烷基；经杂烷基接头连接的杂芳基。因此，例如，C7-芳基烷基包括吡啶甲基、苯氧基和N-吡咯甲氧基。

本文所用的“亚烷基”指二价烃基。由于亚烷基为二价，其可将2个其他基团连接在一起。亚烷基通常称为–(CH₂)_n-，其中n可以是1-20、1-10、1-8或1-4，尽管特定时亚烷基还可由其他基团取代且能具有其他长度，开放的原子价不需位于链的两端。因此，-CH(Me)-和-C(Me)₂-还可称为亚烷基，如环基例如环丙-1,1-二基。亚烷基被取代时，取代基包括本文所述烷基上通常存在的那些。

合适接头能用于构建磷脂类似物（例如X²），且已知多个接头。接头的非限制性示例包括–(Y)_y-,–(Y)_y-C(O)N-(Z)_z-,-(CH₂)_y-C(O)N-(CH₂)_z-,–(Y)_y-NC(O)-(Z)_z-,-(CH₂)_y-NC(O)-(CH₂)_z-，其中各y（下标）和z（下标）独立地是0-20，各Y和Z独立地是C1-C10烷基、取代的C1-C10烷基、C1-C10烷氧基、取代的C1-C10烷氧基、C3-C9环烷基、取代的C3-C9环烷基、C5-C10芳基、取代的C5-C10芳基、C5-C9杂环、取代的C5-C9杂环、C1-C6烷酰基、Het、Het C1-C6烷基或C1-C6烷氧羰基，其中烷基、环烷基、烷酰基、烷氧羰基、Het、芳基或杂环基上的取代基是羟基、C1-C10烷基、羟基C1-C10亚烷基、C1-C6烷氧基、C3-C9环烷基、C5-C9杂环、C1-C6烷氧基C1-C6烯基、氨基、氰基、卤素或芳基。在某些实施方式中，接头有时是-C(Y')(Z′)-C(Y")(Z")-接头，其中各Y'、Y"、Z'和Z"独立地是氢C1-C10烷基、取代的C1-C10烷基、C1-C10烷氧基、取代的C1-C10烷氧基、C3-C9环烷基、取代的C3-C9环烷基、C5-C10芳基、取代的C5-C10芳基、C5-C9杂环、取代的C5-C9杂环、C1-C6烷酰基、Het、Het C1-C6烷基、或C1-C6烷氧羰基，其中烷基、环烷基、烷酰基、烷氧羰基、Het、芳基或杂环基上的取代基是羟基、C1-C10烷基、羟基C1-C10亚烷基、C1-C6烷氧基、C3-C9环烷基、C5-C9杂环、C1-C6烷氧基C1-C6烯基、氨基、氰基、卤素或芳基。可使用的某些非限制性接头示例包括下列：

在一些实施方式中，选择产生合适血浆稳定性的接头。合适稳定性有时为与人血浆接触约300分钟后出现的偶联类似物的约60%或更高（例如约65%、70%、75%、80%、85%、90%）。

一般，取代基中包含的任何烷基、烯基、炔基、酰基、或芳基或芳基烷基、或这些基团之一的任何杂合形式本身可任选由额外取代基来取代。如果取代基未另外描述，这些取代基的性质与涉及初级取代基本身所列举的那些相似。因此，例如在R¹为烷基的实施方式中，此烷基可选由R1实施方式中所列的剩余取代基来取代，这样化学上有意义且不破坏烷基本身所提供的大小限制；例如，由烷基或烯基取代的烷基会简单延伸这些实施方式的碳原子上限，且未包括在内。然而，由芳基、氨基、烷氧基、=O等取代的烷基会包括在本发明范围内，这些取代基的原子不计数，所述数字用于描述烷基、烯基等所述基团。取代基数字未指定时，各所述烷基、烯基、炔基、酰基、或芳基可用一些取代基根据其可用价来取代；特定地，任何这些基团可用例如氟原子以任何或所有其可用价来取代。

本文所用的“杂合形式”指诸如烷基、芳基或酰基的基团衍生物，其中指定碳环基团的至少一个碳原子由选自N、O和S的杂原子取代。因此，烷基、烯基、炔基、酰基、芳基和芳基烷基的杂原子分别是杂烷基、杂烯基、杂炔基、杂酰基、杂芳基合杂芳基烷基。应理解不超过2个N、O或S原子一般顺序相连，除了氧基团结合N或S形成硝基或磺酰基。杂合形式部分有时在本文中称为“Het”。

本文所用的“卤”或“卤素”包括氟、氯、溴和碘。通常优选氟和氯。本文所用的“氨基”指NH₂，但氨基描述为“取代”或“可选取代”时，所述术语包括NR’R”，其中各R’和R”独立地是H，或是烷基、烯基、炔基、酰基、芳基或芳基烷基或者这些基团之一的杂合形式，各烷基、烯基、炔基、酰基、芳基或芳基烷基或者这些基团之一的杂合形式可选用本文描述为适用于对应基团的取代基来取代。术语也包括R’和R”连在一起形成3-8元环的形式，所述环可为饱和、不饱和或芳族且包含1-3个独立选自N、O和S的杂原子作为环成员，可选用描述为适用于烷基的取代基来取代，或如果NR’R”是芳族基团，可选用描述为杂芳基的典型取代基来取代。

本文所用的术语“碳环”指环中仅含有一个碳原子的环状化合物，而“杂环”指含有杂原子的环状化合物。碳环和杂环结构覆盖具有单环、双环或多环系统的化合物。本文所用的术语“杂原子”指不是碳或氢的任何原子，如氮、氧或硫。杂环的说明性示例包括但不限于四氢呋喃、1,3二烷、2,3二氢呋喃、吡喃、四氢吡喃、苯并呋喃、异苯并呋喃、1,3二氢异苯并呋喃、异

唑、4,5二氢异

唑、哌啶、吡咯烷、吡咯烷2酮、吡咯、吡啶、嘧啶、八氢吡咯[3,4b]吡啶、哌嗪、吡嗪、吗啉、硫代吗啉、咪唑、咪唑烷2,4二酮、1,3二氢苯并咪唑2酮、吲哚、噻唑、苯并噻唑、噻重氮、噻吩、1,1二氧化四氢噻吩、二氮杂草、三唑、胍、二氮杂双环[2.2.1]庚烷、2,5二氮杂双环[2.2.1]庚烷、2,3,4,4a,9,9a六氢1Hβ咔啉、环氧乙烷、氧杂环丁烷、四氢吡喃、二

烷、内酯、氮杂环丙烷、氮杂环丁烷、哌啶、内酰胺，且还可涵盖杂芳基。杂芳基的其他说明性示例包括但不限于呋喃、吡咯、吡啶、嘧啶、咪唑、苯并咪唑和三唑。

一些情况中，本文所述化合物包含一个或多个手性中心。所述技术包括各分离的立体异构形式以及手性纯度程度不同的立体异构体混合物，包括外消旋混合物。其还涵盖能形成的各个非对映异构体和互变异构体。本文所述化合物还可以一种或多种互变异构形式存在。例如，R是-OH时，本文所述化合物可以一种或多种互变异构形式存在。本文所述化合物可作为特定盐存在。本文描述了药学上可接受盐的非限制性示例。

本文所用的术语“可选取代”表明所述特定一个或多个基团可不具有非氢取代基，或所述一个或多个基团可具有一个或多个非氢取代基。如果没有另外指定，可存在的所述取代基总数等于所述基团未取代形式上存在的H原子数目。可选取代基经双键结合时，如羰基氧（=O），所述基团占据2个可用价，因此可纳入的取代基总数根据可用价数目而减少。

磷脂类似物药效团

在某些实施方式中，提供的组合物包括式E所示化合物：

P¹-X²-X³-R³ 式E

或其药学上可接受的盐或水合物，其中X²、X³和R³如上所述，P¹是药效团。

在一些实施方式中，还提供的组合物包括式F或式G所示化合物：

式F

式G

或其药学上可接受的盐或水合物，其中X²、X³、R³、R^d和R^e如上所述，P¹是药效团。

涉及具有式E、F或G所示结构的化合物时，R^d和R^e在某些实施方式中独立地是线性及饱和C6-C30烷基。在一些实施方式中，R^d和R^e相同或不同。在一些实施方式中，R^d和R^e独立地包括1、2、3、4或5个双键（如不饱和）。在某些实施方式中，R^d和R^e不由环氧基部分取代，R^d和R^e有时不由羟基部分取代。在特定实施方式中，R^d和R^e不由环氧基部分或羟基部分取代。在多个实施方式中，R^d和R^e不包括双键（如无不饱和）。

涉及具有式E、F或G所示结构的化合物时，药效团P1可以是显示免疫刺激活性的任何分子。在某些实施方式中，药效团P1具有式H所示结构：

式H

或其药学上可接受的盐或水合物，其中磷脂、或磷脂样结构在任何合适连接点与药效团相连，且其中：

式H的R¹⁰、R²⁰和R³⁰各独立是氢；3、4或5个碳原子的环烷基；含1-约10个碳原子的直链或支链烷基以及含1-约10个碳原子的取代直链或支链烷基，其中取代基选自下组：含3-约6个碳原子的环烷基和由含1-约4个碳原子的直链或支链烷基取代的含3-约6个碳原子的环烷基；含1-约10个碳原子和一个或多个氟或氯原子的氟烷基或氯烷基；含2-约10个碳原子的直链或支链烯基和含2-约10个碳原子的取代直链或支链烯基，其中取代基选自含3-约6个碳原子的环烷基和由含1-约4个碳原子的直链或支链烷基取代的含3-约6个碳原子的环烷基；具有1-约6个碳原子的羟烷基；烷氧基烷基，其中烷氧基部分包含1-约4个碳原子且烷基部分包含1-约6个碳原子；酰氧基烷基，其中酰氧基部分是具有2-约4个碳原子的烷酰氧基或苯甲酰氧基，烷基部分包含1-约6个碳原子，前提是任何所述烷基、取代烷基、烯基、取代烯基、羟烷基、烷氧基烷基或酰氧基烷基没有充分碳取代碳原子直接键合氮原子；苄基；(苯基)乙基；和苯基；苯环上可选由1或2个部分取代的所述苄基、(苯基)乙基或苯基取代基，所述部分独立选自1-约4个碳原子的烷基、自1-约4个碳原子的烷氧基、和卤素，前提是所述苯环由2个所述部分取代，然后该部分共包含不超过6个碳原子；-CHR_xR_y，其中R_y是氢或碳-碳键，前提是R_y为氢时，R_x为1-约4个碳原子的烷氧基、1-约4个碳原子的羟基烷氧基、2-约10个碳原子的1-炔基、四氢吡喃、烷氧基烷基，其中烷氧基部分包含1-约4个碳原子且烷基部分包含1-约4个碳原子、2-,3-,或4-吡啶，进一步的前提是Ry为碳-碳键时，R_y和R_x一起形成可选取代有一个或多个取代基的四氢呋喃基团，所述取代基独立选自1-约4个碳原子的羟基或羟烷基；含1-约8个碳原子的直链或支链烷基、含1-约6个碳原子的直链或支链羟烷基、吗啉甲基、苄基、(苯基)乙基和苯基，苯环上由选自甲基、甲氧基或卤素的部分可选取代的苄基、(苯基)乙基或苯基取代基；或

-C(R_S)(R_T)(X)，其中R_S和R_T独立选自卤素、1-约4个碳原子的烷基、苯基、和取代苯基，其中取代基选自1-约4个碳原子的烷基、1-约4个碳原子的烷氧基、和卤素；和

X是含1-约4个碳原子的烷氧基、烷氧基烷基（其中烷氧基部分包含1-约4个碳原子且烷基部分包含1-约4个碳原子）、1-约4个碳原子的卤代烷基、烷基酰胺基（其中烷基包含1-约4个碳原子）、氨基、取代氨基（其中取代基是1-约4个碳原子的烷基或羟烷基）、叠氮基、1-约4个碳原子的烷硫基、或吗啉烷基（其中烷基部分包含1-约4个碳原子）；

式H的R⁴⁰是氢、C1-8烷基、C1-8烷氧基或卤素；

式H的nn是1、2、3或4；

式H的R^aa和R^bb各独立是氢、(C1-C6)烷基、羟基(C1-C6)烷基、金刚烷基、金刚烷基(C1-C6)烷基、氨基(C1-C6)烷基、氨基磺酰基、(C1-C6)链酰基、芳基、或苄基；或R^aa和R^bb与结合的氮一起形成吡咯、哌啶或吗啉基团；和

式H中5元环的虚线表示连接5元环的氮与该5元环的2个氮之间碳的可选键，所述键存在时，没有R¹⁰或R³⁰。

在一些实施方式中，式H的R^aa或R^bb之一独立地是–X²-X³-R³，或具有式C或式D所示结构，另一R^aa或R^bb是氢、C1-C6烷基或C1-C6烷氧基。

在某些实施方式中，药效团P¹具有式I所示结构：

式I

或其药学上可接受的盐，其中磷脂、或磷脂样结构在任何合适连接点与药效团相连，R^aa和R^bb如上所定义。在一些实施方式中，式I的R^aa或R^bb之一是–X²-X³-R³，或具有式C或式D所示结构，另一R^aa或R^bb是氢、C1-C6烷基或C1-C6烷氧基。

同样在涉及具有式E、F或G所示结构的化合物时，在某些实施方中，药效团P¹具有式J或式K所示结构：

式J

式K

或其药学上可接受的盐，其中磷脂、或磷脂样结构在任何合适连接点与药效团相连，R⁴⁰、nn、R^aa和R^bb如上所定义，R^cc是氢、C1-C6烷基或C1-C6烷氧基。在一些实施方式中，式J或式K的R^aa或R^bb之一是–X²-X³-R³，或具有式C或式D所示结构，另一R^aa或R^bb是氢、C1-C6烷基或C1-C6烷氧基。在后面的实施方式中，R^cc有时是氢。在某些实施方中，式J或式K的R^cc是–X²-X³-R³，或具有式C或式D所示结构。在后面的实施方式中，R^aa或R^bb独立地是氢、C1-C6烷基或C1-C6烷氧基。

药物组合物和制剂

本文所述化合物可制备为药学上可接受的盐。本文所用的术语“药学上可接受的盐”指所公开化合物的衍生物，其中母体化合物通过制备其酸或碱盐来修饰。药学上可接受的盐示例包括但不限于碱性残基如胺的无机或有机酸盐；酸性残基如羧酸的碱或有机盐；等等。药学上可接受的盐包括母体化合物的常规无毒盐或季铵盐，所述化合物例如形成自无毒无机或有机酸。例如，常规无毒盐包括无机酸如盐酸、氢溴酸、硫酸、氨基磺酸、磷酸、硝酸等的衍生物；制备自有机酸如乙酸、丙酸、琥珀酸、乙醇酸、硬脂酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、双羟萘酸、马来酸、羟基马来酸、苯乙酸、谷氨酸、苯甲酸、水杨酸、磺胺酸、2-邻乙酰基水杨酸、富马酸、甲苯磺酸、甲磺酸、乙烷二磺酸、草酸、羟乙磺酸等的盐。其他示例中，常规无毒盐包括碱如氢氧化钾、氢氧化钠、氢氧化钠、咖啡因、多种胺等的衍生物。药学上可接受的盐能通过传统化学方法合成自母体化合物，包含碱性或酸性部分。一般，所述盐通过使这些化合物的游离酸或碱形式与化学计量量的合适碱或酸（溶于水或溶于有机溶剂）或两者的混合物反应来制备；一般，优选非水性介质如乙醚、乙酸乙酯、乙醇、异丁醇、或乙腈。合适盐的列表参见Remington′sPharmaceutical Sciences（《雷明顿药物科学》），第17版，宾夕法尼亚州伊斯顿的马克出版公司（Mack Publishing Company），第1418页（1985），其公开内容通过引用纳入本文。

本文所用的术语“药学上可接受”指化合物、材料、组合物、和/或剂型，其在足够医疗判断范围内适用于接触人和动物的组织而没有过度毒性、刺激、过敏反应、或与合理效益/风险比相当的其他问题或并发症。

术语“稳定化合物”和“稳定结构”指某种化合物，其足够稳固以从反应混合物中分离为有用的纯化程度并配制成有效治疗剂。稳定化合物在本文中考虑用于所述治疗方法。

本文所述化合物能与一种或多种其他试剂组合配制。一种或多种试剂包括但不限于另一本文所述化合物、抗细胞增生剂（如化疗）、抗炎剂和抗原。

本文所述化合物能配制为药物组合物并以适于选定给药途径的多个形式给予哺乳动物宿主，如人患者或非人动物。给药途径的非限制性示例包括口腔、胃肠外、静脉内、肌肉内、局部、灌注（如膀胱灌注）、皮下、皮内途径。在某些实施方式中，组合物局部给予，如囊内。组合物有时包括稀释剂且有时包括佐剂、载体（如可吸收，可修改）、缓冲液、防腐剂等。在某些实施方式中，化合物还可在脂质体组合物中或作为微乳液给予。还设计了用于药物的多个缓释系统，可应用于本文所述化合物。参见例如美国专利号5,624,677，其方法通过引用纳入本文。

对于对象膀胱给药，在一些实施方式中，可递送约10nM-约1000nM、或约100nM-约10,000nM浓度的化合物。在某些实施方式中，本文所述组合物结合局部应用的超声、电磁辐射或电穿孔或其他基于电的药物递送技术、局部化学磨损或局部物理磨损给予。在一些实施方式中，本文所述组合物包括或用表面活性剂给予（例如局部应用）以增强本文所述化合物跨膀胱粘膜的通透性。在某些实施方式中，本文所述组合物提供增强的内涵体摄入，其可由例如颗粒大小、受体多聚化或缓释产生。

本文所述化合物可封闭于硬或软壳明胶胶囊，可压成片剂，或可随患者饮食食物直接纳入。对于口服治疗给予，活性化合物可联合一种或多种赋形剂并以可吸收片剂、口含片、锭剂、胶囊剂、酏剂、混悬剂、糖浆剂、薄片剂等形式使用。这种组合物和制品有时包含至少0.1%的活性化合物。所述组合物和制品的百分数可变且有时为约2%-约60%重量的给定单位剂型。这种治疗有效组合物中活性化合物的量可产生有效剂量水平。

片剂、锭剂、丸剂、胶囊剂等还可包含下列：粘合剂如黄蓍胶、阿拉伯树胶、玉米淀粉或明胶；赋形剂如磷酸氢钙；崩解剂如玉米淀粉、马铃薯淀粉、藻酸等；润滑剂如硬脂酸镁；甜味剂如蔗糖、果糖、乳糖或阿斯巴甜或者增味剂如胡椒薄荷、冬青油，或者可添加樱桃香剂。单位剂型是胶囊时，可包含上述类型材料以外的液体载体如植物油或聚乙二醇。多个其他材料可作为包被存在或另外修饰物质量形态的固体单位剂型。例如，片剂、丸剂或胶囊剂可包被有明胶、蜡、虫胶或糖等。糖浆剂或酏剂可包含活性化合物，作为甜味剂的蔗糖或果糖，作为防腐剂的甲基和尼泊金丙酯，染料和香剂如樱桃或橘子香精。当然，用于制备任何单位剂型的任意材料应是药学上可接受的且以基本无毒量使用。另外，活性化合物可纳入缓释制品和装置。

活性化合物可通过输注或注射给予。活性化合物或其药学上可接受盐的溶液可在水中制备，可选混合有无毒表面活性剂。分散液还可在甘油、液体聚乙二醇、三醋精和其混合物以及在油中制备。在普通贮存和使用条件下，这些制品有时包含防腐剂以防止微生物生长。

药物剂型可包括含有活性成分的无菌水溶液或分散液或无菌粉末，其适于临时制备无菌溶液或分散液，可选包封于脂质体中。最终剂型有时是无菌液体且在生产和贮存条件下稳定。液体载体或载剂可以是溶剂或液体分散介质，包括例如

水、乙醇、多元醇（例如甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等）、植物油、无毒甘油酯和其合适混合物。可维持合适流动相，例如通过形成脂质体，通过在分散液情况中维持所需颗粒大小，或通过使用表面活性剂。防止微生物作用可通过各种抗细菌和抗真菌剂产生，例如对羟苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等。一些实施方式中包括等张剂，例如糖、缓冲液或氯化钠。注射组合物的延长吸收可通过延缓吸收剂如单硬脂酸铝和明胶在组合物中的应用来产生。制备无菌溶液通常是通过纳入溶于合适溶剂的所需量活性化合物，有时有一种或多种上面所列举其他成分，然后过滤除菌。在用于制备无菌注射溶液的无菌粉末情况中，有时采用的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，在上面无菌过滤溶液中出现的任何额外所需成分以外产生活性成分粉末。

对于局部给予，本文的化合物可以纯化形式应用，如液体形式中。然而，一般需要给予化合物作为组合物或制剂，联合可为固体或液体的可接受载体。有用的固体载体包括细粒固体如滑石、粘土、微晶纤维素、硅石、氧化铝等。有用的液体载体包括水、醇或乙二醇或水-醇/乙二醇混合物，或丙二醇/乙二醇中的磷脂，其中存在的化合物能以有效水平溶解或分散，可选借助无毒表面活性剂。可添加佐剂如芳香剂和其他抗微生物剂以就给定应用优化性质。得到的液体组合物可从吸收垫应用，用于浸透绷带和其他敷料，或用泵式或气雾剂喷雾器在受影响区域上喷射。

增稠剂如合成聚合物、脂肪酸、脂肪酸盐及酯、脂肪醇、改性纤维素或改性矿物材料还可与液体载体一起使用以形成可涂布糊剂、凝胶、油膏、皂等，直接应用于用户皮肤。

本文化合物作为TLR激动剂或TLR拮抗剂的能力可用已知的药理学模型测定，包括Lee等,PNAS,100:6646(2003)公开的方法。

化合物的有用剂量可通过比较其在动物模型中的体外活性与体内活性来测定。在小鼠和其他动物中研究对人有效剂量的方法为本领域已知。在一些实施方式中，本文所述化合物在液体组合物中的浓度为约0.1-25重量%，有时约0.5-10重量%。半固体或固体组合物如凝胶或粉末中的浓度有时为约0.1-5重量%，有时约0.5-2.5重量%。

治疗应用所需的化合物或其活性盐或衍生物的量不仅随着具体选定盐变化，也随着给药途径、所治疗病症的性质和患者年龄及病症而变化，并最终由巡诊医生或临床医师决定。一般，合适剂量范围有时为约0.5-约100mg/kg，例如约10-约75mg/kg体重/天，如3-约50毫克/千克受体体重/天，且通常范围为6-90mg/kg/天，或约15-60mg/kg/天。一般，合适剂量范围有时为约1-150mg/kg受体体重/天，例如约10-约130mg/kg，约40-约120mg/kg，约50-约100mg/kg，约60-90mg/kg，约65-85mg/kg，或例如约80mg/kg/天。化合物可以单位剂型方便地给予，且例如包含每单位剂型5-1000mg、或10-750mg、或50-500mg活性成分。可给予活性成分以达到约0.01-约100pM，约0.5-约75pM，约1-50pM，或约2-约30pM的活性化合物峰值血浆浓度。例如，通过静脉内注射0.05-5%活性成分溶液（可选在盐水中）或作为含约1-100mg活性成分的大药丸口服给予，可达到所述浓度。维持所需血液水平可通过连续输注以提供约0.01-5.0mg/kg/hr（小时）或通过含约0.4-15mg/kg活性成分的间断输注。所需剂量可方便地在单个剂量中提供或作为分开剂量以合适间隔给予，例如每天2、3、4或更多个亚剂量。亚剂量本身可进一步细分，例如分成一些独立松散间隔的给药；如来自吹入器的多次吸入或通过应用多滴到眼内。

治疗

提供的组合物可用于治疗或预防对象中的某些病症。这种病症包括例如增生性病症如癌症、微生物感染、心脏病症和肥胖病症；某些实施方式中的炎性病症和自身免疫病症。

本文所用的术语“治疗”和“处理”指(i)防止病理情况发生（例如预防）；(ii)抑制病理情况或阻滞其发展；(iii)缓解病理情况；和/或(iv)改善、缓和、减轻和去除疾病或病症的症状。本文所述的候选分子或化合物可以是制剂或药物中的治疗有效量，例如，所述量能引起生物学效果（例如抑制炎症）或引起改善、缓和、减轻、减少或去除疾病或病症的症状。所述术语还可指降低或终止细胞增殖速率（例如使肿瘤生长减缓或停止）或者减少增殖癌细胞数目（例如去除部分或所有肿瘤）。本文所述分子可给予需要的对象以潜在治疗黑素瘤。在这类治疗中，术语“处理”、“治疗”和“治疗效果”可指降低或终止细胞增殖速率（例如使肿瘤生长减缓或停止），减少增殖癌细胞数目（例如消除部分或所有肿瘤）和完全或部分缓解黑素瘤病症。

药物可以是预防或治疗剂，可给予本文所述有黑素瘤的任何合适对象。对象的非限制性示例包括哺乳动物、人、猿、猴、有蹄类动物（例如马、牛、山羊、绵羊、猪、水牛、骆驼等）、犬、猫科动物、啮齿类动物（例如鼠、小鼠、大鼠）等。对象可以是雄性或雌性，药物可给予特定年龄组的对象，包括例如少年、儿童、青少年、成人等。

本文所用的术语“治疗有效量”指本文提供的化合物含量，或本文提供的化合物组合含量，以在对象中治疗或预防疾病或紊乱，或者治疗疾病或紊乱的症状。本文所用的术语“对象”和“患者”一般指根据本文所述方法会接受或已接受治疗（例如给予本文所述的化合物）的个体。

增生性病症有时是癌症。癌症和相关紊乱有时具有上皮细胞来源。在一些实施方式中，增生性病症与血液相关，如白血病。白血病和其他血液病症的非限制性示例包括急性白血病、急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病（例如原始粒细胞性白血病、早幼粒细胞性白血病、慢性骨髓单核细胞性白血病、单核细胞性白血病和红白血病）和骨髓增生异常综合征；慢性白血病，例如但不限于慢性骨髓细胞性白血病（粒细胞性）、慢性淋巴细胞白血病、毛细胞白血病；和红细胞增多症。

在某些实施方式中，增生性病症表现为淋巴瘤。淋巴瘤的非限制性示例包括霍奇金病和非霍奇金病。增生性病症有时是多发性骨髓瘤，其非限制性示例包括焖燃型骨髓瘤、非分泌性骨髓瘤、骨硬化性骨髓瘤、浆细胞白血病、孤立性浆细胞瘤和髓外浆细胞瘤。在一些实施方式中，增生性病症表现为瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症；未明的单克隆丙球病；良性单克隆丙种球蛋白病；或重链病。

在一些实施方式中，增生性病症表现为肉瘤（例如在骨和结缔组织中）。肉瘤的非限制性示例包括骨肉瘤、成骨肉瘤、软骨肉瘤、尤因氏肉瘤、恶性巨细胞瘤、骨纤维肉瘤、脊索瘤、骨膜肉瘤、软组织肉瘤、血管肉瘤（血管内皮瘤）、纤维肉瘤、卡波济氏肉瘤、平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤、淋巴管肉瘤、神经鞘膜瘤、横纹肌肉瘤、滑膜肉瘤。

在一些实施方式中，增生性病症表现为脑部病症（例如脑肿瘤）。脑增生性病症的非限制性示例包括胶质瘤、星形细胞瘤、脑干胶质细胞瘤、室管膜瘤、少突神经胶质瘤、非胶质瘤、听神经瘤、颅咽管瘤、成神经管细胞瘤、脑膜瘤、成松果体细胞瘤、松果体母细胞瘤、脑原发性淋巴瘤。

在一些实施方式中，增生性病症是乳腺癌。非限制性乳腺癌包括导管癌、腺癌、小叶（小细胞）癌、管内癌、乳房髓样癌、乳腺粘液癌、乳腺小管癌、乳腺乳头状癌、佩吉特氏病和炎性乳腺癌。在某些实施方式中，增生性病症表现为肾上腺癌。肾上腺癌的非限制性示例包括嗜铬细胞瘤和肾上腺皮质癌。增生性病症有时表现为甲状腺癌，包括但不限于乳头状或滤泡性甲状腺癌、甲状腺髓样癌和未分化甲状腺癌。

在某些实施方式中，增生性病症表现为胰腺癌，包括但不限于胰岛瘤、胃泌素瘤、胰高血糖素瘤、血管活性肠肽瘤、生长抑素分泌肿瘤、和良性肿瘤或胰岛细胞瘤。在一些实施方式中，增生性病症表现为垂体癌，其非限制性示例包括库兴氏病、PRL瘤、肢端肥大症和尿崩症（diabetes insipius）。在一些实施方式中，增生性病症表现为眼癌，包括但不限于葡萄膜恶性黑色素瘤如虹膜黑色素瘤、脉络膜黑色素瘤、和睫状体黑色素瘤和成视网膜细胞瘤。

在一些实施方式中，增生性病症表现为阴道癌或外阴癌，可包括但不限于鳞状细胞癌、腺癌、黑素瘤、鳞状细胞癌、黑素瘤、腺癌、基底细胞癌、肉瘤和佩吉特氏病。在一些实施方式中，增生性病症表现为宫颈癌，可包括但不限于鳞状细胞癌和腺癌。子宫癌还是某些增生性病症的形式，包括但不限于子宫内膜癌和子宫肉瘤。增生性病症有时是卵巢癌，其非限制性示例包括卵巢上皮癌、交界性肿瘤、生殖细胞瘤和间质瘤。

在一些实施方式中，增生性病症是食管癌，其非限制性示例包括鳞癌、腺癌、腺样囊性癌、粘液表皮样癌、腺鳞癌、肉瘤、黑素瘤、浆细胞瘤、疣状癌和燕麦（小细胞）细胞癌。增生性病症有时表现为胃癌，包括但不限于腺癌、蕈样癌（息肉型癌）、溃疡性癌、表面扩散型癌、漫射扩散性癌（diffusely spreading）、恶性淋巴瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤和癌肉瘤。增生性病症有时表现为结肠癌或直肠癌。在一些实施方式中，增生性病症是肝癌，其非限制性示例包括肝细胞癌和肝母细胞癌。在某些实施方式中，增生性病症表现为胆囊癌，包括但不限于腺癌。在某些实施方式中，增生性病症表现为胆管癌，如胆管细胞癌（例如乳头状、结节性和弥漫性）。

在一些实施方式中，增生性病症是肺癌。肺癌的非限制性示例包括非小细胞肺癌、鳞状细胞癌（表皮样癌）、腺癌、大细胞癌和小细胞肺癌。在某些实施方式中，增生性病症表现为睾丸癌，如胚组织瘤、精原细胞瘤、未分化癌、经典（典型）癌、生殖细胞瘤、非精原细胞瘤、胚胎性癌、畸胎瘤或绒毛膜癌（卵黄囊瘤）。在一些实施方式中，增生性病症是前列腺癌，包括但不限于前列腺上皮内瘤、腺癌、平滑肌肉瘤和横纹肌肉瘤。在某些实施方式中，增生性病症是阴茎癌(penal cancer)。

增生性病症有时是口腔癌，其非限制性示例包括鳞状细胞癌；基底细胞癌；唾液腺癌，例如但不限于腺癌、粘液表皮样癌和囊腺癌。在一些实施方式中，增生性病症是咽癌，包括但不限于鳞状细胞癌和疣状癌。增生性病症有时表现为皮肤癌，其非限制性示例包括基底细胞癌、鳞状细胞癌、黑素瘤、浅表扩散性黑素瘤、结节性黑素瘤、恶性雀斑痣样黑素瘤和肢端雀斑样黑色素瘤。

在一些实施方式中，增生性病症是肾癌如肾细胞癌、腺癌、肾上腺样瘤、纤维肉瘤、移行细胞癌（肾盂和/或输尿管）、和维尔姆斯瘤。在某些实施方式中，增生性病症是膀胱癌，其非限制性示例包括表浅性膀胱癌、移行细胞癌、鳞状细胞癌、腺癌和癌肉瘤。

在某些实施方式中，增生性病症是选自下述的癌症：粘液肉瘤、骨原性肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、间皮瘤、滑膜瘤、成血管细胞瘤、上皮癌、囊腺癌、支气管癌、汗腺瘤、皮脂腺癌、乳头状癌和乳头状腺癌；癌，包括膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、肾癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、子宫颈癌、甲状腺和皮肤癌（例如鳞状细胞癌）；淋巴祖细胞的造血系统肿瘤，包括白血病、急性淋巴细胞白血病、急性成淋巴细胞性白血病、B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤；骨髓祖细胞的造血系统肿瘤，包括急性和慢性髓细胞性白血病以及早幼粒细胞白血病；中枢和外周神经系统肿瘤，包括星形细胞瘤、神经母细胞瘤、胶质瘤和神经鞘瘤；间充质源性肿瘤，包括纤维肉瘤、横纹肌肉瘤和骨肉瘤；和其他肿瘤，包括黑素瘤、着色性干皮症、角化棘皮瘤（keratoactanthoma）、精原细胞瘤、甲状腺滤泡癌和畸胎癌。还考虑到本文所述组合物可针对细胞凋亡畸变引起的癌症。这种癌症包括但不限于滤泡性淋巴瘤，p53突变的癌，乳腺、前列腺和卵巢的激素依赖性肿瘤和癌前期病变如家族性腺瘤性息肉病和骨髓增生异常综合征。在特定实施方式中，可治疗或预防皮肤、肺、结肠、乳腺、前列腺、膀胱、肾、胰腺、卵巢或子宫中的恶性肿瘤或增殖异常变化（如组织转化和发育不良）、或过度增殖性疾病。

细胞增生性病症还包括病毒性疾病，包括例如获得性免疫缺陷综合征、腺病毒科感染、甲病毒感染、虫媒病毒感染、博纳病、本雅病毒感染、杯状病毒感染、水痘、冠状病毒感染、柯萨奇病毒感染、巨细胞病毒感染、登革热、DNA病毒感染、脓疮、接触传染病、脑炎、虫媒病毒、爱泼斯坦巴尔病毒感染、传染性红斑、汉坦病毒感染、出血热、病毒性肝炎、病毒和人疱疹病毒、带状疱疹、耳带状疱疹、疱疹病毒科感染、传染性单核细胞增多、流感，例如鸟或人中，拉沙热、麻疹、接触传染性软疣、流行性腮腺炎、副粘液病毒科感染、白蛉热、多瘤病毒科感染、狂犬病、呼吸道合胞体病毒感染、里夫特裂谷热、RNA病毒感染、风疹、慢病毒病、天花、亚急性硬化性全脑炎、肿瘤病毒感染、疣、西尼罗热、病毒病和黄热病。例如，SV40转化病毒的大T抗原作用于UBF，将其激活并募集其他病毒蛋白到PolI复合物，从而刺激细胞增殖以确保病毒传播。细胞增生性病症还包括涉及血管生成的病症（例如癌症）以及由脂细胞和其他脂肪细胞增殖引起的肥胖。

细胞增生性病症包括微生物感染。微生物的非限制性示例包括病毒、细菌、酵母和真菌。可由所述组合物治疗的某些微生物示例在本文中列出。

细胞增生性病症还包括心脏应激引起的心脏病，如高血压、气囊血管成形术、瓣膜病和心肌梗塞。例如，心肌细胞是心脏中的分化肌细胞，所述细胞构成大量室壁，血管平滑肌细胞排列于血管上。尽管2种都是肌细胞类型，心肌细胞和血管平滑肌细胞的收缩、生长和分化机制不同。心肌细胞在心脏形成后不久发生终末分化并因此释放分裂的能力，而血管平滑肌细胞持续接受从收缩到增殖表型的调节。例如，在多种病理生理压力如高血压、气囊血管成形术、瓣膜病和心肌梗塞下，心脏和血管经历生长相关的形态改变，可降低心脏功能并最终表现为心力衰竭。因此，本文提供了治疗心脏细胞增生性病症的方法，通过给予有效量的本文所述化合物以治疗心脏病。化合物可在心脏应激发生或检测之前或之后给予，例如，所述化合物或核酸可在高血压、气囊血管成形术、瓣膜病或心肌梗塞发生或检测之后给予。给予所述化合物可减少血管肌细胞和/或平滑肌细胞增殖。

细胞增生性病症还可涉及肥胖。在一些实施方式中，细胞增生性病症是脂细胞的异常增殖。

本文所述化合物可给予需要的对象以诱导对象中的免疫应答。在某些实施方式中，免疫应答可由对象针对外来抗原（例如病原体感染）自动产生。在一些实施方式中，抗原与本文所述化合物共给予，其中免疫应答在对象中针对所述抗原产生。在某些实施方式中，抗原可特异于具体细胞增生性病症（例如特异性癌抗原）或具体病原体（例如革兰氏阳性菌细胞壁抗原；金黄色葡萄球菌（S.aureus）抗原）。在一些实施方式中，免疫刺激性组合物可在疫苗或组合疫苗中给予。免疫刺激性组合物在某些实施方式中可作为佐剂组合物给予，在某些实施方式中可与抗原联合给予（例如与抗原依序给予或共给予）。

本文所述化合物可给予需要的对象以潜在预防、抑制或治疗一种或多种炎性疾病。本文所用的术语“处理”、“治疗”和“治疗效果”可指降低、抑制或终止（防止）炎症反应（例如使抗体生成或特异抗原的抗体量减少或停滞），减少发炎组织量和完全或部分缓解炎性病症。炎性疾病包括但不限于过敏、哮喘、自身免疫病、慢性炎症、慢性前列腺炎、肾小球性肾炎、过敏症、炎性肠疾病、肌病（例如联合系统性硬化、皮肌炎、多肌炎、和/或包涵体肌炎）、盆腔炎、再灌注损伤、风湿性关节炎、移植排斥、血管炎和白细胞疾病（例如切—东综合征、慢性肉芽肿性疾病)。某些自身免疫病还是炎性疾病（例如风湿性关节炎）。在一些实施方式中，炎性疾病选自慢性炎症、慢性前列腺炎、肾小球性肾炎、过敏症、肌病、盆腔炎、再灌注损伤、移植排斥、血管炎和白细胞疾病。在某些实施方式中，炎性病症包括但不限于支气管扩张、细支气管炎、囊胞性纤维症、急性肺损伤、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、动脉粥样硬化和感染性休克（例如败血症与多器官功能衰竭）。在一些实施方式中，炎性疾病不是选自过敏、哮喘、ARDS和自身免疫病的病症。在某些实施方式中，炎性疾病不是选自胃肠道炎症、脑部炎症、皮肤炎症和关节炎症的病症。在某些实施方式中，炎性疾病是嗜中性粒细胞介导的疾病。在一些实施方式中，炎性病症还是细胞增生性病症，例如皮肤炎性病症（例如湿疹）、盘状红斑性狼疮、扁平苔癣、硬化性苔癣、蕈样真菌病、光照性皮肤病、玫瑰糠疹和牛皮癣。

本文所述化合物可给予需要的患者以潜在治疗一种或多种自身免疫病。这种治疗中，术语“处理”、“治疗”和“治疗效果”可指降低、抑制或终止自身免疫反应（例如使抗体生成或特异抗原的抗体量减少或停滞），减少发炎组织量和完全或部分缓解自身免疫病症。自身免疫病包括但不限于自身免疫性脑脊髓炎、结肠炎、自身免疫胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)、和韦格纳肉芽肿病及大动脉炎。就所述疾病测试化合物的模型包括但不限于(a)(i)由寡树突胶质细胞糖蛋白(MOG)肽诱导的C5BL/6，(ii)SJL小鼠PLP139-151或178-191EAE，和(iii)用于自身免疫性脑脊髓炎的MOG或PLP肽所诱导EAE的过继转移模型；(b)用于自身免疫IDDM的非糖尿病(NOD)小鼠；(c)用于结肠炎的葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的结肠炎模型和三硝基苯磺酸(TNBS)诱导的结肠炎模型；和(d)作为韦格纳肉芽肿病和大动脉炎模型的系统性小血管炎。本文所述化合物可给予对象以潜在治疗一种或多种下列疾病：急性播散性脑脊髓炎(ADEM);爱迪生氏病;斑秃;强直性脊柱炎;抗磷脂抗体综合征(APS);自身免疫性溶血性贫血;自身免疫性肝炎;自身免疫性内耳病;大疱性类天疱疮;乳糜泻;查加斯病;慢性阻塞性肺病;克罗恩病（两种特发性炎症性肠病“IBD”类型之一）;皮肌炎;1型糖尿病;子宫内膜异位;肺出血肾炎综合症;格雷夫斯氏病;格林-巴利综合征(GBS);桥本氏病;化脓性汗腺炎;特发性血小板减少性紫癜;间质性膀胱炎;红斑狼疮;混合性结缔组织病;硬斑病;多发性硬化(MS);重症肌无力;嗜眠发作;神经性肌强直;寻常天疱疮;恶性贫血;多肌炎;原发性胆汁性肝硬化;风湿性关节炎;精神分裂症;硬皮病;肖格伦综合征;颞动脉炎（也称为“巨细胞动脉炎”）;溃疡性结肠炎（两种特发性炎症性肠病“IBD”类型之一）;血管炎;白癜风;和韦格纳氏肉芽肿病。在一些实施方式中，自身免疫病不是选自克罗恩病（或克罗恩氏病）、风湿性关节炎、狼疮和多发性硬化的病症。

在一些实施方式中，联用本文所述化合物与一种或多种其他疗法给予，所述疗法包括但不限于化疗、放射治疗、激素治疗、和/或生物治疗（例如免疫治疗）。能与本文所述化合物联用的试剂包括但不限于蛋白质分子，包括但不限于肽、多肽、蛋白，包括翻译后修饰蛋白、抗体等；小分子（小于1000道尔顿）；无机或有机化合物；核酸分子，包括但不限于双链或单链DNA、或双链或单链RNA和三螺旋核酸分子。与本文所述化合物联用的试剂可获自任何已知生物体（包括但不限于动物、植物、细菌、真菌、和原生生物、或病毒）或来自合成分子库。可与本文所述化合物联用的试剂包括蛋白激酶抑制剂（例如受体蛋白激酶抑制剂）和血管生成抑制剂。

免疫刺激组合物

本文所述化合物可具有免疫刺激活性，且能提高针对抗原的免疫应答水平。因此，本文所述化合物可用作佐剂，能与抗原联合给予。因此，本文所述化合物在一些实施方式中能作为含有抗原的疫苗组合物一部分纳入，且在某些实施方式中能与佐剂组合物中的抗原分开给予。疫苗组合物和佐剂组合物在本文中统称为“免疫刺激组合物”。

免疫刺激组合物组分

本文所述化合物能以任何有效量用于免疫刺激组合物。在某些实施方式中，本文所述化合物能以每剂量约1微克-约100,000微克的量使用。本文所述化合物还能以每剂量约1微克-约50,000微克、每剂量约1微克-约25,000微克、每剂量约1微克-约5,000微克、每剂量约1微克-约4,000微克、每剂量约1微克-约3,000微克、每剂量约1微克-约2,000微克、每剂量约1微克-约1,000微克的量使用。在一些实施方式中，本文所述化合物还能以每剂量约5微克-约750微克、每剂量约5微克-约500微克、每剂量约5微克-约200微克、每剂量约5微克-约100微克、每剂量约15微克-约100微克、每剂量约30微克-约75微克的量使用。

除了本文所述化合物以外，免疫刺激组合物可包括一种或多种组分。例如，免疫刺激组合物可包括三萜系化合物。适用于免疫刺激组合物的三萜系化合物可来自许多来源（例如植物源性或合成等价物），包括但不限于皂皮树、番茄苷、人参提取物、蘑菇和结构类似甾体皂苷的生物碱苷。因此，适用于免疫刺激组合物的三萜系化合物包括皂苷、鲨烯和羊毛甾醇。适用于免疫刺激组合物的三萜系化合物含量取决于所用三萜系化合物的性质。然而，它们一般以每剂量约1微克-约5,000微克的量使用。它们还以每剂量约1微克-约4,000微克、每剂量约1微克-约3,000微克、每剂量约1微克-约2,000微克、每剂量约1微克-约1,000微克的量使用。它们还能以每剂量约5微克-约750微克、每剂量约5微克-约500微克、每剂量约5微克-约200微克、每剂量约5微克-约100微克、每剂量约15微克-约100微克、每剂量约30微克-约75微克的量使用。

如果使用皂苷，免疫刺激组合物通常包含来自皂皮树树皮的免疫学活性皂苷。所述皂苷可以是例如Quil A或者另一纯化或部分纯化的皂苷制品，其可市售获得。因此，皂苷提取物可用作混合物或纯化的单独组分如QS-7、QS-17、QS-18和QS-21。在一些实施方式中，Quil A为至少85%纯。在其他实施方式中，Quil A为至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%纯。

CpG寡聚脱氧核酸的特征是在特异性碱基序列环境中出现未甲基化CG二核苷酸（CpG基序），且可赋予免疫刺激性质。这些免疫刺激性质包括诱导Th1型反应，显著释放IFN-、IL-12和IL-18。CpG ODN（18-24bp长度）。载体如QCDC、QCDCR和其他组合可促进CpG寡聚脱氧核酸的吸收。用于免疫刺激组合物的CpG量取决于所用CpG的性质和预期种类。然而，它们通常以每剂量约1微克-约20毫克的量使用。它们还能以每剂量约1微克-约10毫克、每剂量约1微克-约5毫克、每剂量约1微克-约4毫克、每剂量约1微克-约3毫克、每剂量约1微克-约2毫克、每剂量约1微克-约1毫克的量使用。它们还能以每剂量约5微克-约750微克、每剂量约5微克-约500微克、每剂量约5微克-约200微克、每剂量约5微克-约100微克、每剂量10微克-约100微克、每剂量约15微克-约100微克的量，以及以每剂量约30微克-约75微克的量使用。

甾醇还可用于免疫刺激组合物，适合使用的甾醇包括β-谷固醇、豆甾醇、麦角固醇、钙化醇和胆固醇。这些甾醇在本领域已知且能市售购买。适用于免疫刺激组合物的甾醇量取决于所用甾醇的性质。然而，它们通常以每剂量约1微克-约5,000微克的量使用。它们还能以每剂量约1微克-约4,000微克、每剂量约1微克-约3,000微克、每剂量约1微克-约2,000微克、每剂量约1微克-约1,000微克的量使用。它们还能以每剂量约5微克-约750微克、每剂量约5微克-约500微克、每剂量约5微克-约200微克、每剂量约5微克-约100微克、每剂量约15微克-约100微克、每剂量约30微克-约75微克的量使用。

免疫刺激组合物还可包括一种或多种免疫调节剂，其非限制性示例包括季铵化合物（例如DDA）和白介素、干扰素或其他细胞因子。这些材料可市售购买。适用于免疫刺激组合物的免疫调节剂含量取决于所用免疫调节剂的性质和对象。然而，它们通常以每剂量约1微克-约5,000微克的量使用。它们还能以每剂量约1微克-约4,000微克、每剂量约1微克-约3,000微克、每剂量约1微克-约2,000微克、每剂量约1微克-约1,000微克的量使用。它们还能以每剂量约5微克-约750微克、每剂量约5微克-约500微克、每剂量约5微克-约200微克、每剂量约5微克-约100微克、每剂量约15微克-约100微克的量，以及每剂量约30微克-约75微克的量使用。在一个特定示例中，含有DDA的免疫刺激组合物可通过简单混合抗原溶液与新鲜配制的DDA溶液来制备。

免疫刺激组合物还可包括一种或多种聚合物，其非限制性示例包括DEAE葡聚糖、聚乙二醇、聚丙烯酸和聚甲基丙烯酸（例如CARBOPOL.RTM.）。适用于免疫刺激组合物的聚合物量取决于所用聚合物的性质。然而，它们通常以约0.0001%体积对体积（v/v）-约75%v/v的量使用。在一些实施方式中，它们以约0.001%v/v-约50%v/v、约0.005%v/v-约25%v/v、约0.01%v/v-约10%v/v、0.05%v/v-约2%v/v、0.1%v/v-约0.75%v/v的量使用。在某些实施方式中，它们以约0.02v/v-约0.4%v/v的量使用。DEAE-葡聚糖的分子量范围可为50,000Da-5,000,000Da，或其可为500,000Da-2,000,000Da。所述材料可市售购买或制备自葡聚糖。

在一些实施方式中，所用聚合物是聚丙烯酸（例如CARBOPOL.RTM.聚合物），平均当量为76。聚丙烯酸通常生成自平均直径为约0.2-6.0微米的主要聚合物颗粒。CARBOPOL.RTM.聚合物在水中溶胀到其原始体积的1000倍和其原始直径的10倍以在暴露于高于羧酸盐基团pKa的pH环境时形成凝胶。pH高于羧酸盐基团的pKa时，羧酸盐基团电离产生负电荷间的排斥，其加入聚合物溶胀。

免疫刺激组合物还可包括一种或多种Th2刺激剂例如Bay R1005.RTM.和铝。适用于免疫刺激组合物的Th2刺激剂含量取决于所用Th2刺激剂的性质。然而，Th2刺激剂通常以每剂量约0.01mg-约10mg的量使用。在一些实施方式中，这种刺激剂以每剂量约0.05mg-约7.5mg、每剂量约0.1mg-约5mg、每剂量约0.5mg-约2.5mg、每剂量约1mg-约2mg的量使用。一个特定示例是糖脂Bay R1005.RTM.，化学名为“N-(2-脱氧-2-L-亮氨酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)-N-十八月桂酰-胺乙酸酯”。其根据本领域已知过程合成。通常在2-8摄氏度于密封容器中保存。其化学或物理性质为难吸湿，不形成多晶型物，在高至50摄氏度的温度于空气和光下以及在环境温度pH 2-12的水溶剂中化学稳定。其是在水溶液中形成胶束的两性分子。

抗原

免疫刺激组合物可包含一种或多种抗原。所述抗原可以是能在对象中生成所需免疫应答的广泛物质中任何一种。尽管单独Quil A为杀病毒性，Quil A在形成螺旋胶束时通过加入胆固醇来脱毒。免疫刺激组合物可以是非杀病毒、非溶血性或溶膜性。因此，与免疫刺激组合物一起使用的抗原可以是一种或多种病毒（灭活病毒、减毒病毒和改性活病毒）、细菌、寄生虫、核苷酸、多核苷酸、肽、多肽、重组蛋白、合成肽、蛋白提取物、细胞（包括肿瘤细胞）、组织、多糖、碳水化合物、脂肪酸、磷壁酸（teichioc acid）、肽聚糖、脂质、或糖脂，单独或采用其任何组合。抗原还可包括核苷酸、多核苷酸、肽、多肽的免疫原性片段，其能从本文所述生物体中分离。在一些实施方式中，抗原是癌特异性分子，如蛋白、肽、脂质、核酸、碳水化合物等。

不引起对象疾病的活、改良活和减毒病毒株可分离为非杀病毒形式，或能用本领域已知方法减毒，所述方法包括在合适细胞系中连续传代或暴露于紫外线或化学诱变剂。灭活或杀死的病毒株是通过本领域已知方法灭活的那些，所述方法包括用福尔马林、β-丙内酯（BPL）、乙烯亚胺（BEI）、辐照杀菌、热等处理。

两种或更多抗原可组合生成多价组合物，能保护对象抵御病原体引起的广泛疾病。在一些实施方式中，抗原可在含本文所述化合物的单一组合物中合并。在某些实施方式中，含多种抗原的组合物与含本文所述化合物的单独佐剂组合物联合给予（例如同时或依序）。

免疫刺激组合物可包括微生物或微生物组分作为抗原（例如灭活或减毒细菌、病毒）。能选择的细菌非限制性示例包括醋酸钙不动杆菌（Aceinetobactercalcoaceticus）、巴氏醋杆菌（Acetobacter paseruianus）、胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae）、嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）、酸热脂环酸芽孢杆菌（Alicyclobacillus acidocaldarius）、古细菌硫细菌（Arhaeglobusfulgidus）、炭疽杆菌（Bacillus anthracis）、短小芽胞杆菌（Bacillus pumilus）、嗜热脂肪芽孢杆菌（Bacillus stearothermophillus）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、嗜热芽孢杆菌（Bacillus thermocatenulatus）、支气管炎博尔德氏杆菌（Bordetellabronchiseptica）、洋葱伯克霍尔德菌（Burkholderia cepacia）、荚壳伯克霍尔德氏菌（Burkholderia glumae）、大肠弯曲杆菌（Campylobacter coli）、胎儿弯曲杆菌（Campylobacter fetus）、空肠弯曲杆菌（Campylobacter jejuni）、豚肠弯曲杆菌（Campylobacter hyointestinalis）、鹦鹉热衣原体（Chlamydia psittaci）、沙眼衣原体（Chlamydia trachomatis）、嗜衣体属（Chlamydophila spp.）、粘色素细菌（Chromobacterium viscosum）、红斑丹毒丝菌（Erysipelothrix rhusiopathieae）、单核细胞增多性李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）、犬埃立克体（Ehrlichiacanis）、大肠杆菌（Escherichia coli）、流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae）、睡眠嗜血杆菌（Haemophilus somnus）、猪螺杆菌（Helicobacter suis）、胞内劳森氏菌（Lawsonia intracellularis）、嗜肺军团菌（Legionella pneumophilia）、莫拉克斯氏菌属（Moraxellsa sp.）、牛型结核分枝杆菌（Mycobactrium bovis）、猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae）、丝状支原体丝状亚种LC型（Mycoplasmamycoides subsp.mycoides LC）、产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）、犬齿臭味杆菌（Odoribacter denticanis）、溶血巴斯德菌（溶血曼海姆菌）（Pasteurella(Mannheimia)haemolytica）、多杀巴斯德菌（Pasteurella multocida）、发光杆菌（Photorhabdus luminescens）、卟啉单胞菌gu/ae（Porphyromonas gu/ae）、牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis）、唾液卟啉单胞菌（Porphyromonas salivosa）、疮疱丙酸杆菌（Propionibacterium acnes）、普通变形杆菌（Proteus vulgaris）、威州假单胞菌（Pseudomonas wisconsinensis）、绿脓假单胞菌（Pseudomonasaeruginosa）、荧光假单胞菌C9（Pseudomonas fluorescens C9）、荧光假单胞菌SIKW1（Pseudomonas fluorescens SIKW 1）、莓实假单胞菌（Pseudomonas fragi）、浅黄假单胞菌（Pseudomonas luteola）、食油假单胞菌（Pseudomonas oleovorans）、假单胞菌属B11-1（Pseudomonas sp B11-1）、真养产碱杆菌（Alcaliges eutrophus）、静止嗜冷杆菌（Psychrobacter immobilis）、普氏立克次体（Rickettsia prowazekii）、立克次体（Rickettsia rickettsia）、鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）、邦戈尔沙门氏菌（Salmonella bongori）、肠道沙门氏菌（Salmonella enterica）、都柏林沙门氏菌（Salmonella dublin）、鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）、霍乱沙门氏菌（Salmonella choleraseuis）、牛波特沙门菌（Salmonella newport）、粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）、钝顶螺旋藻（Spirlina platensis）、金黄色葡萄球菌(Staphlyoccocus aureus)、表皮葡萄球菌（Staphyloccoccus epidermidis）、猪葡萄球菌（Staphylococcus hyicus）、白色链霉菌（Streptomyces albus）、肉桂链霉菌（Streptomyces cinnamoneus）、猪链球菌（Streptococcus suis）、脱叶链霉菌（Streptomyces exfoliates）、疮痂病链霉菌（Streptomyces scabies）、嗜酸热硫化叶菌（Sulfolobus acidocaldarius）、集胞藻属（Syechocystis sp.）、霍乱弧菌（Vibriocholerae）、伯氏疏螺旋体（Borrelia burgdorferi）、齿垢密螺旋体（Treponemadenticola）、微小螺旋体（Treponema minutum）、梅毒螺旋体（Treponema phagedenis）、屈折密螺旋体（Treponema refringens）、奋森密螺旋体（Treponema vincentii）、苍白密螺旋体（Treponema palladium）、和钩端螺旋体（Leptospira）种，如已知病原体犬型钩端螺旋体（Leptospira canicola）、感冒伤寒型钩螺旋体感染（Leptospiragrippotyposa）、哈尔乔型钩端螺旋体（Leptospira hardjo）、哈尔乔型-牛型博氏钩端螺旋体（Leptospira borgpetersenii hardjo-bovis）、哈尔乔型-普拉基通型博氏钩端螺旋体（Leptospira borgpetersenii hardjo-prajitno）、肾脏钩端螺旋体（Leptospirainterrogans）、黄疸出血螺旋体（Leptospira icterohaemorrhagiae）、波蒙那钩端螺旋体（Leptospira pomona）和布拉迪斯拉发钩端螺旋体（Leptospira bratislava），和其组合。

灭活病毒、减毒活病毒、和/或病毒部分可用于免疫刺激组合物。能用于抗原生产的一些病毒示例包括但不限于禽疱疹病毒、牛疱疹病毒、犬疱疹病毒、马疱疹病毒、猫病毒性鼻气管炎病毒、马立克氏病病毒、绵羊疱疹病毒、猪疱疹病毒、伪狂犬病病毒、禽副粘病毒、牛呼吸道合胞体病毒、犬瘟热病毒、犬副流感病毒、犬腺病毒、犬细小病毒、牛副流感病毒3型、绵羊副流感病毒3型、牛瘟病毒、边界病毒、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、I型BVDV、II型BVDV、猪瘟病毒、禽白血病病毒、牛免疫缺陷病毒、牛白血病病毒、牛结核病、马传染性贫血病毒、猫免疫缺陷病毒、猫白血病病毒(FeLV)、新城鸡瘟病毒、绵羊进行性肺炎病毒、绵羊肺腺瘤病毒、犬冠状病毒(CCV)、泛嗜性CCV、呼吸道型犬冠状病毒、牛冠状病毒、猫杯状病毒、猫肠道冠状病毒、猫传染性腹膜炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪血凝性脑脊髓炎病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒(PCV)I型、PCV II型、猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)病毒、猪传染性胃肠炎病毒、火鸡冠状病毒、牛流行热病毒、狂犬病、轮状病毒、水泡性口炎病毒、慢病毒、禽流感、鼻病毒、马流感病毒、猪流感病毒、犬流感病毒、猫流感病毒、人流感病毒、东部马脑炎病毒(EEE)、委内瑞拉马脑炎病毒、西尼罗病毒、西部马脑炎病毒、人免疫缺陷病毒、人乳头状瘤病毒、水痘-带状疱疹病毒、乙肝病毒、鼻病毒和麻疹病毒，和其组合。

肽抗原的非限制性示例包括支气管炎博德特菌p68、GnRH、IgE肽、Fel d1、癌抗原，和其组合。其他抗原示例包括核苷酸、碳水化合物、脂质、糖脂、肽、脂肪酸、磷壁酸和肽聚糖，和其组合。

能用于制备抗原与免疫刺激组合物的寄生虫的非限制性示例包括红孢子虫属（Anaplasma）、肝片吸虫（Fasciola hepatica）（肝吸虫）、球虫（Coccidia）、艾美球虫属（Eimeria spp.）、犬新孢子虫（Neospora caninum）、刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）、贾第虫属（Giardia）、恶丝虫属（Dirofilaria）（犬恶丝虫）、钩虫属（Ancylostoma）（十二指肠虫）、锥体虫属（Trypanosoma spp.）、利什曼虫属（Leishmania spp.）、毛滴虫属（Trichomonas spp.）、微小隐孢子虫（Cryptosporidium parvum）、巴贝西虫（Babesia）、裂体吸虫属（Schistosoma,Taenia）、类圆线虫属（Strongyloides）、蛔虫属（Ascaris）、旋毛虫（Trichinella）、肉孢子虫属（Sarcocystis）、哈蒙德虫属（Hammondia）和等孢子球虫属（Isopsora），和其组合。还考虑外部寄生虫，包括但不限于扁虱（包括硬蜱属（Ixodes））、扇头蜱属（Rhipicephalus）、矩头蝉属（Dermacentor）、花蜱属（Amblyomma）、牛蜱属（Boophilus）、璃眼蜱属（Hyalomma）和血蜱属（Haemaphysalis）种，和其组合。

用于诱导免疫应答的抗原量可根据所用抗原、对象和所需反应水平而显著变化，并能如本领域已知进行测定。对于含改良活病毒或减毒病毒的疫苗，抗原的治疗有效量有时范围为约10²组织培养感染量(TCID)₅₀-约10¹⁰TCID₅₀（包含端值）。对于许多这类病毒，治疗有效剂量有时范围为约10² TCID₅₀-约10⁸ TCID₅₀（包含端值）。在一些实施方式中，治疗有效剂量范围是约10³ TCID₅₀-约10⁶ TCID₅₀（包含端值）。在某些实施方式中，治疗有效剂量范围是约10⁴ TCID₅₀–约10⁵TCID₅₀（包含端值）。

对于含灭活病毒的疫苗，抗原的治疗有效量有时为每剂量约100相对单位，且通常范围为每剂量约1,000-约4,500相对单位（包含端值）。在一些实施方式中，抗原的治疗有效量范围为每剂量约250-约4,000相对单位（包含端值）、每剂量约500-约3,000相对单位（包含端值）、每剂量约750-约2,000相对单位（包含端值）、或每剂量约1,000-约1,500相对单位（包含端值）。

含灭活病毒的疫苗中抗原的治疗有效量还可根据每ml相对效力(RP)测量。治疗有效量通常范围为每ml约0.1-约50RP（包含端值）。在一些实施方式中，抗原的治疗有效量范围为每ml约0.5-约30RP（包含端值）、每ml约1-约25RP（包含端值）、每ml约2-约20RP（包含端值）、每ml约3-约15RP（包含端值）、或每ml约5-约10RP（包含端值）。

在某些实施方式中，就在疫苗中给予的某些细菌抗原而言，细胞数目范围为约1倍10⁶-约5倍10¹⁰菌落形成单位(CFU)/剂（包含端值）。在一些实施方式中，细胞数目范围为约1倍10⁷-5倍10¹⁰CFU/剂（包含端值），或约1倍10⁸-5倍10¹⁰CFU/剂（包含端值）。在多个实施方式中，细胞数目范围为约1倍10²-5倍10¹⁰CFU/剂（包含端值），或约1倍10⁴-5倍10⁹CFU/剂（包含端值），或约1倍10⁵-5倍10⁹CFU/剂（包含端值），或约1倍10⁶-5倍10⁹CFU/剂（包含端值），或约1倍10⁶-5倍10⁸CFU/剂（包含端值），或约1倍10⁷-5倍10⁹CFU/剂（包含端值）。

在某些实施方式中，就在疫苗中给予的某些寄生虫抗原而言，细胞数目范围为每剂量约1倍l0²-约1倍l0¹⁰（包含端值）。在一些实施方式中，细胞数目范围为每剂量约1倍10³-约1倍10⁹（包含端值），或每剂量约1倍10⁴-约1倍10⁸（包含端值），或每剂量约1倍10⁵-约1倍10⁷（包含端值），或每剂量约1倍10⁶-约1倍10⁸（包含端值）。

赋形剂

水性免疫刺激组合物可提供某些优势。它们易于配制和给予，且可诱导少或较少严重注射位点反应。然而，有抗原的水性免疫刺激组合物往往从注射位点扩散，由对象的肝清除，产生不需要的非特异性免疫应答。

油在作为佐剂组分加入时一般提供长且缓慢释放分布。可使用的油是代谢油或非代谢油。油可采用水包油、油包水、或水包油包水乳剂形式。水包油乳剂可在一些实施方式中提供，能由AMPHIGEN.RTM.制剂构成。此制剂包括水性组分、卵磷脂、矿物油和表面活性剂。描述制剂组分的专利包括美国专利号5,084,269和美国专利号6,572,861。油组分可存在的量为1%-50%（体积），或10%-45%；或在一些实施方式中，量为20%-40%。

合适油可包括烷烃、烯烃、炔烃，和其对应酸及醇、其醚和酯、和其混合物。油的单独化合物通常是轻质烃化合物，即所述组分通常具有6-30个碳原子。所述油可从石油产品合成制备或纯化。所述部分可具有直链或支链结构。其可完全饱和或有一个或多个双或三键。用于本发明的一些非代谢油包括例如矿物油、石蜡油和环烷烃。可选择“轻质矿物油”用于免疫刺激组合物。一种所用油通过蒸馏凡士林油获得，且比重稍低于白矿物油。

代谢油包括可代谢、无毒油。此类油可以是任何植物油、鱼油、动物油或合成制备油，所述油可由给予免疫刺激组合物的对象身体代谢且对该对象无毒。植物油的来源包括坚果、种子和谷物。

免疫刺激组合物的其他组分可包括药学上可接受的赋形剂如载体、溶剂和稀释剂，等张剂，缓冲剂，稳定剂，防腐剂，血管收缩剂，抗细菌剂，抗真菌剂等。载体、溶剂和稀释剂的非限制性示例包括水、盐水、葡聚糖、乙醇、甘油、油等。等张剂的示例包括氯化钠、葡聚糖、甘露醇、山梨醇、乳糖等。有用的稳定剂包括明胶、白蛋白等。

表面活性剂可用于协助乳剂稳定并能选定以作为佐剂和/或抗原的载体。在一些实施方式中，适合使用的表面活性剂包括天然生物学相容表面活性剂和非天然合成表面活性剂。生物学相容表面活性剂包括磷脂化合物或磷脂混合物。磷脂示例是磷脂酰胆碱（卵磷脂），如大豆或蛋黄卵磷脂。卵磷脂可作为磷脂与甘油三脂的混合物获得，这是通过水洗粗植物油，分离和干燥得到的水合胶。通过丙酮洗涤移出甘油三脂和植物油后就丙酮不溶性磷脂和糖脂来分馏混合物，可获得精制产品。或者，卵磷脂可从各个商业来源获得。其他合适磷脂包括磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇,磷脂酰丝氨酸、磷脂酸、心磷脂和磷脂酰乙醇胺。所述磷脂可分离自天然来源或常规合成。

可使用的非天然、合成表面活性剂包括但不限于基于山梨聚糖的非离子型表面活性剂，例如脂肪酸取代的山梨聚糖表面活性剂（以名称SPAN.RTM.或ARLACEL.RTM.市售可得）;聚乙氧基化山梨糖醇的脂肪酸酯(TWEEN.RTM.);来自诸如篦麻油等来源的脂肪酸的聚乙二醇酯(EMULFOR.RTM.);聚乙氧基化脂肪酸（例如以名称SIMULSOL M-53.RTM.可用的硬脂酸）;聚乙二醇异辛基酚/甲醛聚合物（TYLOXAPOL.RTM.）;肪醇聚氧乙烯醚（BRIJ.RTM.）;聚氧乙烯壬基苯基醚（TRITON.RTM.N）,聚氧乙烯辛基苯基醚（TRITON.RTM.X）。在一些实施方式中，表面活性剂或表面活性剂组合存在于乳剂中的量为0.01%-10%（体积），有时为0.1%-6.0%，偶尔为0.2%-5.0%。

药学上可接受的载体包括任何和所有溶剂、分散介质、包被、稳定剂、稀释剂、防腐剂、抗细菌和抗真菌剂、等张剂、吸收延迟剂等。载体在给予时一般与免疫刺激组合物的其他组分相容且对对象无害。载体通常无菌且无热原，根据所用给药模式选择，所用载体通常由监控药物开发和应用的合适政府机构批准，或将批准。

在某些实施方式中，免疫刺激组合物可包括相容性药学上可接受（即无菌或无毒）液体、半固体、或固体稀释剂，用作药物载剂、赋形剂或介质。稀释剂可包括例如水、盐水、葡聚糖、乙醇、甘油、油等。等张剂可包括氯化钠、葡聚糖、甘露醇、山梨醇和乳糖等。稳定剂可包括白蛋白等。在一些实施方式中，免疫刺激组合物可包括抗生素或防腐剂，包括例如庆大霉素、硫柳汞或氯甲酚。

免疫刺激组合物的制备

本文所述化合物可用于制造免疫刺激组合物。各剂量可包含治疗有效量的一种或多种抗原（例如疫苗），能根据对象的年龄和整体情况、给药途径、抗原性质和其他因素变化。免疫刺激组合物中其他组分的量和浓度可调整以改良组合物的物理和化学性质，并能测定。免疫刺激组合物可如下所述匀化或微流化。

免疫刺激组合物可制备为免疫刺激复合物（ISCOM）。ISCOM可通过组合皂苷、甾醇和磷脂来制备。例如，ISCOM能包含5%-10%重量的Quil A，1%-5%胆固醇和磷脂，和剩余蛋白。佐剂制剂中皂苷与甾醇之比有时为1:100（重量）(w/w)-5:1w/w级别。在一些实施方式中，存在过量甾醇且皂苷与甾醇之比可为至少1:2w/w或1:5w/w。在某些实施方式中，皂苷相对甾醇过量，使用约5:1w/w的皂苷与甾醇之比。ISCOM和ISCOMATRIX市售可得（例如IsconovaAB公司(瑞典)）。

在一些实施方式中，CARBOPOL.RTM.与DDA联用，量为至少0.1重量份的CARBOPOL.RTM/DDA重量份。在某些实施方式中，使用至少0.5重量份的CARBOPOL.RTM/DDA重量份。在多个实施方式中，使用至少1重量份的CARBOPOL.RTM/DDA重量份。CARBOPOL.RTM.和DDA的组合通常形成复合物，其中DDA叔胺官能团使聚合物的羧酸侧基免疫功能化。此复合物使特异性免疫细胞能同时靶向抗原和佐剂并在最优时间和浓度将该抗原和佐剂共递送给所述细胞。

在一些实施方式中，本文所述化合物不用特定载体配制，有时在水性或其他药学上可接受缓冲液中配制以制备免疫刺激组合物。在一些实施方式中，免疫刺激组合物在合适载剂中提供，例如额外脂质体、微球或包封抗原粒子。抗原存在于免疫刺激组合物中时，可包含于囊泡膜内或囊泡膜外。合适抗原通常位于内部且疏水或脂化抗原通常包含在膜内。

免疫刺激组合物可根据给药途径、储存要求等以多种形式制备。例如，它们可制备成适于注射应用的无菌水溶液或分散液形式，或用冷冻干燥、真空干燥或喷雾干燥技术制备成冷冻形式。冷冻组合物可在用于稳定溶液前重建，例如盐水或HEPES。因此，免疫刺激组合物可作为固体、半固体或液体剂型使用。

磷酸盐缓冲盐水（PBS）可用作水性缓冲介质，其中缓冲液的pH可为中性或弱碱性或弱酸性。因此，pH范围可为pH 6-8，在某些实施方式中，能使用约7.0-约7.3的pH。需要时可用碱（例如NaOH）或酸（base）（例如HCl）调节pH。例如，常用浓度包括1N-10N HCl和1N-10N NaOH。在一些实施方式中，缓冲液强度可为10-50mM P0₄和10-150mM PO₄。在某些实施方式中，组合物形成颗粒，例如约10纳米-约1000纳米的纳米粒子，有时组合物形成均值、平均或标称尺寸为约100纳米-约400纳米的颗粒。

在一些实施方式中，免疫刺激组合物可匀化或微流化。在某些实施方式中，免疫刺激组合物进行初级混合过程，如一次或多次通过一个或多个均质器。任何市售可得均质机可用于此目的，例如Ross乳化器（纽约哈帕克）、Gaulin均质机（马萨诸塞州埃弗雷特）、或Microfluidics（马萨诸塞州牛顿市）。在一些实施方式中，免疫刺激组合物以10,000rpm匀化3分钟。通过使用市售微射流机如获自Microfluidics（马萨诸塞州牛顿市）的11OY型号；Gaulin 30CD型（马萨诸塞州埃弗雷特的高林公司（Gaulin,Inc.））；和Rainnie Minilab 8.30H型（威斯康辛州哈德逊的尼罗公司（Miro Atomizer Food and Dairy,Inc.）），可实现微流化。这些微射流机通过迫使流体在高压下经过小孔操作，从而2股液流以高速在交互室内相互作用以形成有亚微米尺寸液滴的组合物。在某些实施方式中，制剂通过在10,000.+/-.500psi经过200微米极限尺寸室来微流化。

免疫刺激组合物的给予

免疫刺激组合物的剂量大小范围根据对象和抗原可为约1mL-约5mL（包含端值）。例如，对于犬或猫，常使用约1mL的剂量，而对牛常使用约2-5mL的剂量。然而，免疫刺激组合物可制成微剂量，其中能使用约100微升的剂量。

给予免疫刺激组合物的非限制性途径包括胃肠外、口腔、口鼻、鼻内、气管内、局部、注射和皮内。任何合适的装置可用于给予组合物，包括注射器、滴管、无针注射装置、贴片、泵、颗粒（例如金微粒）、电转导、电穿孔等。如本领域已知，选择使用的途径和装置取决于佐剂组成、抗原、和对象。在一些实施方式中，免疫刺激组合物通过膀胱灌注给予。

在给予对象免疫刺激组合物后监控免疫应答。评价免疫应答的方法为本领域已知，包括本文提供的方法，例如测定特异或非特异性抗体效价和测定血清细胞因子水平。在一些实施方式中，在递送免疫刺激组合物后评价抗原特异性免疫应答（例如抗原特异性抗体、抗原特异性细胞毒性T细胞（CTL））。在一些实施方式中，诱导IgG1和/或IgG2（例如IgG2a）抗体反应。在递送免疫刺激组合物后可评价免疫应答。在一些实施方式中，本文所述组合物在给予对象时引起较少或没有副作用（例如脾肿大）。

实施例

下述实施例阐明某些实施方式且不限制技术。

实施例1：合成4-((6-氨基-2-(2-甲氧基乙氧基)-8-氧-7H-嘌呤-9(8H)-基)甲基)苯甲酸（化合物7）

此实施例详细描述可制备化合物A和SC12的方法，包括下列方法和数据：

-制备4-((6-氨基-2-(2-甲氧基乙氧基)-8-氧-7H-嘌呤-9(8H)-基)甲基)苯甲酸（化合物7）和其偶联1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺（DOPE）的方法

-制备化合物7和在多克规模上扩大制备的条件

-偶联化合物7和1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺（DOPE）获得化合物A的方法

-在多克规模上制备化合物A的方法

-中间物和偶联化合物的分析方法

-化合物A的稳定性研究

-制备化合物8的方法，所述化合物8也称为SC12，是7与1,2-二月桂酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺（DLPE）的偶联衍生物

-SC12的稳定性研究

下列方案提出可用于制备化合物A和SC12的方法示例。其他合成方法可用于制备化合物A和SC12，这些其他合成方法的示例在图20-23中提供。

方案1

化合物A

A.制备4-((6-氨基-2-(2-甲氧基乙氧基)-8-氧-7H-嘌呤-9(8H)-基)甲基)苯甲酸7

化合物2

2,6-二氯嘌呤（100g,0.53mol）装入3L的四颈圆底烧瓶，配有机械搅拌器、油浴、温度计、滴液漏斗、回流冷凝器和氮气进口。加入N,N-甲基乙酰胺（1L），然后是固体溴甲基-苯甲腈（114.6g,0.58mol,1.1当量）和碳酸钾（109.7g,0.79mol,1.5当量）。剧烈搅拌混合物并在85-90°C加热3小时，然后可冷却至室温并加入水（2L）。立即形成黄色的丰富固体；搅拌混合物30分钟，然后在布氏漏斗中过滤，用水（2x200mL）和乙酸乙酯洗涤并65°C真空干燥直到观察到恒重（约5小时）。获得浅黄色固体的中间物2,批次CH730/2/1，具有下列样品量和纯度：160g；99%Y;90.2%HPLC纯度。NMR和MS分析符合所述结构。

扩大反应并从600g 2,6-二氯嘌呤开始重复。获得中间物2,批次CH730/3/1，具有下列样品量和纯度：950g；98.3%Y;92%HPLC纯度。

化合物3

中间物2（100g,0.33mol）装入3L的四颈圆底烧瓶，配有机械搅拌器、油浴、温度计、滴液漏斗、回流冷凝器和氮气进口。加入干燥二甲基甲酰胺（700mL），然后是含氨溶液7N的甲醇（100mL,0.66mol,2当量）。混合物在室温剧烈搅拌。2小时后获得棕色溶液，然后有丰富固体沉淀。混合物再搅拌12小时，然后固体在布氏漏斗上过滤并用乙酸乙酯（200mL）洗。产物在65°C真空干燥直到观察到恒重（约6小时）。获得白色固体的中间物3,批次CH730/3/2，具有下列样品量和纯度：66g；71%Y;92.9%HPLC纯度，NMR和MS分析符合所述结构。

扩大反应并在900g中间物2上重复。获得中间物3,批次CH730/3/2，具有下列样品量和纯度：680g;77%Y;91%HPLC纯度。

化合物4

配有机械搅拌器、油浴、温度计、滴液漏斗、回流冷凝器和氮气进口的1L四颈圆底烧瓶装入2-甲氧基乙醇（500mL）。钠（6g,0.26mol,1.5当量）在室温和氩气氛下少量加入。中间物3（50g,0.175mol）在一部分中加入。搅拌反应混合物并加热至100°C持续6小时，然后可冷却至室温。加入水（1L）且混合物在室温搅拌30分钟。固体在布氏漏斗上过滤，用水（200mL）洗并在65°C真空干燥直到恒重（约8小时）。获得白色固体的中间物4,批次CH730/2/3，具有下列样品量和纯度：40g；70%Y;95% %HPLC纯度，NMR和MS分析符合所述结构。

扩大反应并在550g中间物3上重复。获得中间物4,批次CH730/6/3，具有下列样品量和纯度：532g；78%Y.94%HPLC纯度。

化合物5

中间物4（100g,0.3mol）装入2L的四颈圆底烧瓶，配有机械搅拌器、油浴、温度计、滴液漏斗、回流冷凝器和氮气进口。加入二氯甲烷（1.5L）且混合物在室温剧烈搅拌。室温逐滴加入溴（19mL,0.37mol,1.2当量）。搅拌8小时后，过滤固体并用二氯甲烷（300mL）洗涤以产生黄色固体的粗化合物5。用丙酮（500mL）结晶产生浅黄色固体的中间物5，具有下列样品量和纯度：批次CH730/3/4;109g；88%Y.82%HPLC纯度。

反应在150g化合物4上重复；获得中间物5,批次CH730/4/4；具有下列样品量和纯度：170g;92%Y;81%HPLC纯度。生成第三制品；获得中间物5,批次CH730/11/4；具有下列样品量和纯度：80g;91%HPLC纯度。

化合物7

配有机械搅拌器、油浴、温度计、滴液漏斗、回流冷凝器和氮气进口的3L四颈圆底烧瓶装入甲醇（700mL）。少量加入钠（11.9g,0.52mol,3当量）。中间物5（70g,0.17mol）在一部分中加入溶液。悬液在回流下剧烈搅拌，直到获得澄清溶液（约6小时）。混合物可冷却至室温，然后加入水（500mL），接着是氢氧化钠（34g,0.85mol）。混合物再加热至回流8小时，然后冷却至室温。加入浓盐酸（120mL）；白色固体从反应混合物中沉淀。搅拌1小时后，固体在布氏漏斗上过滤。65°C真空干燥（约8小时）后，获得粗化合物6（50g）。其悬于乙腈（500mL）并加入碘化钠（奥德里奇公司（Aldrich）,34g,0.23mol）。逐滴加入三甲基氯硅烷（奥德里奇公司,29mL,0.23mol）后，剧烈搅拌混合物并加热至50°C持续3小时。冷却至室温后，将碳酸氢钠的饱和溶液加入反应混合物，获得pH 6。沉淀的固体在布氏漏斗上过滤，先用水（100mL）然后用甲醇（50mL）洗涤。获得浅黄色固体的粗化合物7；批次CH730/18/6b，具有下列样品量和纯度：40g,HPLC纯度89%

用冰醋酸（每次600mL）结晶2次。65°C真空干燥8小时后，获得化合物7批次CH730/18/6c；具有下列样品量和纯度：34g；来自5的55%Y；93.6%HPLC纯度。

反应在70g中间物5上重复；获得化合物7,批次CH730/16/6b；具有下列样品量和纯度：38g;61%Y;92%HPLC纯度。反应再次在30g化合物5上重复；获得化合物7,批次CH730/21/6d；具有下列样品量和纯度：18g;62%Y;92.2%HPLC纯度。

酸7不溶于大部分普通溶剂（甲醇、乙醇、二氯甲烷、乙酸乙酯、乙腈、丙酮、氯仿）。进行许多尝试以结晶酸7；测试二甲基甲酰胺、二甲基甲酰胺/水、DMSO/水、甲醇、丙酮，但在所有情况中，结晶后的产物具有与结晶前相同的纯度。冰醋酸可有效提高7的纯度。纯度在首次结晶后增加，但重复处理时维持不变。未实现目标值（98%HPLC）。

制备化合物A

化合物A

进行多次尝试以制备有良好产率和纯度的化合物A。首先，尝试酸7与DOPE的直接偶联（方法A和方法B）。然后，酸7在偶联DOPE前激活（方法C和方法D）。虽然用方法A和方法D都获得合理结果，在建立反应混合物期间和纯化阶段中可能产生问题。

方法A：酸7（2.6g,7.2mmol）在氩气氛下悬于干燥二甲基甲酰胺（10mL）。HATU(O-7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N,N-四甲基脲六氟磷酸盐;2.94g,7.6mmol,1.05当量)在一部分中加入，然后是三乙胺（2mL,14.4mmol,2当量）。混合物室温搅拌15分钟，然后逐滴加入含DOPE（1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺,5.37g,7.2mmol,1当量）的干燥二氯甲烷（150mL）。得到的溶液搅拌12小时，直到试剂完全转化。HPLC分析显示化合物A在粗反应混合物为约85%。二氯甲烷在减少的压力下蒸发且剩余物逐滴加入水（150mL）。从反应混合物中分离固体。由于产物不是晶体且滤器被阻断，尝试在真空下过滤可能失败。

此时加入二氯甲烷（150mL）且所述相留待分离。形成乳状悬液且两相分离不可能。在过滤和提取过程失败的情况中，通过真空蒸馏完全移除溶剂并由快速色谱纯化剩余物，用二氯甲烷/甲醇/乙酸8/2/0.1洗脱。获得白色无定形固体的化合物A，一个HPLC纯度示例为94.6%（0.5g）。

反应从15g酸7开始重复。反应结果与前面的运行类似。粗产物通过色谱纯化，但目标产物以低产率获得（7.2g；16%Y）。用于纯化的硅胶用甲醇/乙酸7/3洗涤时，回收剩余产物。再次通过色谱尝试纯化。色谱纯化在1-2克规模上有效；增加柱上加载的化合物A的量，通过硅胶保持大量产物且回收较低。甲醇和乙酸的量必须提高，此时定量回收产物以及其杂质。

结晶技术还尝试纯化化合物A。测试二乙醚、己烷、丙酮、丙酮/水和其他溶剂。甲醇有效降低一些杂质，但在甲醇中延长加热后，检测到新的杂质（多至20%）。

此时，研究反应条件以使反应粗产物中的杂质最少。降低温度产生更好的分布且在反应混合物中获得有88%HPLC纯度的化合物A。

方法B：用二环己基碳二亚胺（DCC）和1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺（EDCI）作为偶联剂尝试酸7与DOPE的反应。在2种情况中，不发生反应且起始材料的回收不变。

方法C：用含1-吡咯烷醇的二氯甲烷作为溶剂尝试酸7的激活。由于7不溶于二氯甲烷，反应失败。

方法D：酸7（10g,0.028mol）在室温和氩气氛下溶于乙腈（60mL）和二甲亚砜（DMSO）（60mL）的混合物。加入羰基二咪唑（4.55g,0.028mol,1当量）且得到的溶液搅拌1小时。逐滴加入溶于干燥二氯甲烷的DOPE溶液（NOF公司（NOF Corp.）>99%;20.8g,0.028mol,1当量）。反应混合物搅拌16小时，直到试剂完全转化。真空蒸馏移除丙酮；加入水（200mL）到剩余物；分离白色固体，但不能过滤。混合物离心30分钟；弃去溶剂并获得25g固体的化合物A批次CH730/16/8。其迅速通过硅胶，用二氯甲烷/异丙醇/乙酸7/2/1（CH730/16/8c，具有下列样品量和纯度：21g；89.6%HPLC纯度）洗脱然后用甲醇室温处理30分钟并在布氏漏斗上过滤。获得19g固体的化合物A，HPLC纯度94.5%。反应在20g酸7上重复，获得类似结果。

比较方法A和D，获得类似结果，只要粗化合物A的产率和纯度而不是杂质分布不同。确定了用方法A获得的样品在多克规模上纯化不可行。酸7与DOPE的偶联反应重复数次，纯度>90%的化合物A的分离不易完成。

合成方法

图20显示能用于生产具有式A或式B结构的某些化合物的其他合成方法实施方式示例。图20特定显示生产化合物A和SC12的合成方法。这些方法实施方式包括具有式A或式B结构的中间物，除了与融合环部分(8-羟基)结合的羟基部分是-O-(C 1-C6烷基)部分。然后，此-O-(C 1-C6烷基)部分转变成式A或式B所示羟基部分。-O-(C1-C6烷基)部分有时是图20的中间物9中特定显示的-OCH3部分（即-OMe部分）。-O-(C1-C6烷基)部分能通过本领域已知方法转变成羟基部分，如TMSCl/NaI水解方法（例如Carey,Advanced Organic Chemistry IV Ed.-Part B:Reaction and Synthesis（《高等有机化学第IV版-B部分：反应和合成》）第163页）和/或甲基烯醇醚水解（例如Bioorganic & Medicinal Chemistry 12(2004)1091-1099）。

图21和22显示能用于生产具有式A或式B结构的某些化合物的其他合成方法实施方式示例。图21和22特定显示生产化合物A和SC12的合成方法。这些方法实施方式包括上述具有方案1的中间物7结构的中间物，除了方案1的中间物7的伯胺部分是具有结构-NH-(prot)的仲胺，其中prot部分是保护基团（例如图21的中间物13和图22的中间物17）。这些方法实施方式还包括具有式A或式B结构的中间物，除了式A或式B的伯胺部分是具有结构-NH-(prot)的仲胺（例如图21的中间物14和图22的中间物18）。可使用本领域已知的任何合适保护基团，所述保护基团有时是图21举例所示的叔丁氧羰基（Boc）保护基团（例如图21的中间物13和14），或图22举例所示的苄基保护基团（例如图22的中间物17和18）。某些保护基团适于生成化合物，其中Rd和Re是饱和烷基部分（例如Boc和苄基），某些保护基团适于生成化合物，其中Rd和Re是包括一个或多个不饱和的烷基部分（例如Boc）。

图23显示能用于生产具有式A或式B结构的某些化合物的其他合成方法实施方式示例。图23特定显示生产SC12的合成方法。此方法实施方式包括上述具有方案1的中间物7结构的中间物，除了中间物7的伯胺部分是具有结构-NH-(prot)的仲胺，其中prot部分是保护基团（例如图23的中间物17）。此方法实施方式还包括具有式A或式B结构的中间物，除了式A或式B的伯胺部分是具有结构-NH-(prot)的仲胺（例如图23的中间物18）。此方法实施方式进一步包括上述具有方案1的中间物6结构的中间物，除了中间物6的伯胺部分是具有结构-NH-(prot)的仲胺（例如图23的中间物21）。可使用本领域已知的任何合适保护基团，所述保护基团有时是图23举例所示的苄基保护基团。

图20-23中，用于合成方案中各个化合物的数字标号可能不对应其他图所用的数字，或此实施例1所用的数字。

用于HPLC的样品制备：

中间物编号5：约10mg精确称重的样品在10ml A级容量瓶中溶于有数滴二甲亚砜（约1mg/ml终浓度）的甲醇。中间物编号7：约5mg精确称重的样品在10ml A级容量瓶中溶于有数滴二甲亚砜（约0.5mg/ml终浓度）的甲醇。

化合物A的分馏（顶部化合物如下所示）

X射线衍射（XRD）

测定化合物A的样品为无定形。

干重和化学组成（CHN）

实验值是根据化合物A的结构。

旋光度

样品制备：20mg化合物A溶于氯仿并分析。[α]D=-37.08（分析偏差：43%）。确定所述高偏差值可能是由于溶液的呈乳白色性质。

重复分析，将5mg化合物A溶于氯仿。发现[α]D=-8.7（分析偏差s：16%）。

溶解性

使用European Pharmacopoeia（《欧洲药典》）6.0报道的方法。

化合物A不溶于水。

化合物A不溶于乙腈。

化合物A溶于氯仿（100mg/mL）。

化合物A溶于DMSO。

化合物A在DMSO中的溶解度用3个不同批次的产物测定：

-CH730/16/8c(HPLC纯度59%)

-CH730/16/8g(HPLC纯度71.5%)

-CH730/23/8e(HPLC纯度95.6%)

批次CH730/16/8g根据E.Ph所述方法测试：DMSO在0.1mL部分中加入103.7mg产物，悬液在每次添加后用涡旋振荡器（Vortex instrument）振荡3分钟。发现化合物A批次Ch730/16/8g在DMSO中的溶解度为259mg/mL。然后测试批次CH730/16/8c、CH730/16/8g和CH730/23/8e，搅拌各悬液一段较长的时间；100mg各批次在搅拌30分钟后完全溶于0.2mL DMSO。根据此方法，化合物A在DMSO中的溶解度为500mg/mL。

化合物A的稳定性

一些化合物A样品通过HPLC重测试，发现其纯度在几天内减少。结果报告于下表A：

表A

经历降解的样品在自然光下室温保存于结晶容器。在RRT 1.1和RRT 1.2的2种主要杂质总是存在。因此，测定化合物A在室温和/或光存在下不是稳定化合物。此时，对批次CH730/16/8g进行稳定性研究。测试下列储存条件：

-室温（约25°C）和光存在下的固体

-外部温度（28-35°C）日光下的固体

-+4°C下的固体

-室温和光存在下的氯仿中溶液

-+4°C下的氯仿溶液

-外部温度（28-35°C）日光下的氯仿中溶液

所得结果报告于下表B。

表B:CH730/16/8G的稳定性

固体样品在数天后几乎完全降解。化合物A显示在溶液中更稳定。由于化合物A批次CH730/16/8g在t=0具有低纯度，对新鲜制备的样品,批次CH730/23/8e重复稳定性研究。所得结果报告于下表C。

表C:CH730/23/8E的稳定性

HPLC分析确认化合物A在T>25°C和光存在下经历快速降解。证明了所述化合物在溶液中更稳定。

化合物A压力样品的HPLC-MS分析。

化合物A批次CH730/16/8g的样品在外部温度（28-35°C;HPLC纯度35.4%;报告编号#0112）于日光下保存6天，通过HPLC-MS分析并与新鲜制备的批次CH730/23/8e作比较。此研究的目标是证明所述稳定性研究中由HPLC检测的杂质不是分析的人造制品，但其实际通过热和光作用形成。

HPLC方法

样品制备

溶液a：样品溶于二甲亚砜-异丙醇20:80以具有2mg/ml浓度

溶液b：“溶液a”用甲醇:异丙醇:水50:20:30+0.1%甲醇1:5稀释

实施例2：SC12的合成

以下描述制备(2-4-((6-氨基-2-(2-甲氧基乙氧基)-8-氧-7H-嘌呤-9(8H)-基)甲基)苯甲酰胺)乙基2,3-二(油酰氧基)磷酸丙酯)。

对化合物A批次CH730/16/8g进行的HPLC-MS分析证明所述化合物降解形成的主要杂质是氧化衍生物。酸7（化合物7）与1,2-二月桂酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺（DLPE）偶联并研究其稳定性。产物称为化合物8和SC12。化合物SC8和SC18以类似方式合成，除了化合物7分别与1,2-二辛酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺或1,2-二硬酯酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺偶联，而不是DLPE。

A.SC12（化合物8）的制备

在此制备SC12的方法示例中，酸7（化合物7）（批次CH730/18/6d;1g,0.0028mol）在室温和氩气氛下溶于乙腈（6mL）和DMSO（6mL）的混合物。加入羰基二咪唑（455mg,0.0028mol,1当量）且得到的溶液搅拌1小时。逐滴加入溶于干燥二氯甲烷的DLPE溶液（>99%;1.78g,0.0028mol,1当量）。反应混合物搅拌16小时，直到试剂完全转化。真空蒸馏移除丙酮；加入水（200mL）到剩余物；分离白色固体。固体在布氏漏斗上过滤并用甲醇（5mL）洗涤。35°C真空干燥后，获得白色固体的SC12;1.8g,Y 65%,HPLC纯度90.3%,HPLC报告编号0121。

B SC12的分析鉴定

SC12的结构通过1H-NMR、13C-NMR和MS确认。

C.SC12的稳定性

对SC12进行稳定性研究并测试下列条件：

-室温（约25°C）和光存在下的氯仿中溶液。

-室温和光存在下的固体。

-外部温度（28-35°C）和日光下的固体。

在t=0和20天后分析样品。

结果报告于下表1，列出形成的主要杂质与其RRT。

表1

所得数据显示SC12比化合物A更稳定。此外，表2显示化合物A和SC12关于热方面的稳定性比较。各化合物的固体样品维持于80°C并通过HPLC分析。

表2

实施例3：化合物的效力

通过检测促炎细胞因子IL-6和TNF-α的剂量依赖性刺激，测定5个有TLR7激活剂活性的样品在PBMC模型和小鼠巨噬细胞系Raw264.7中的效力。

方法和实验设置

研究设置为如下概括的2个模型：

-模型1：在小鼠巨噬细胞系模型Raw264.7中测试5个TLR7激动剂。终点是IL-6和TNF-α的测量。

-模型2：在PBMC模型中测试5个TLR7激动剂。终点是分泌的IL-6和TNF-α的测量。

模型1

5个TLR7激动剂的效力相较Raw264.7细胞系中的阳性对照（咪喹莫特）进行评价。就对照以及IL-6和TNF-α分泌的各药物候选物测定EC50值。

方法：根据供应商提供的条件用RPMI培养基和10%FCS培养Raw264.7细胞。细胞接种于96孔板并用TLR7激动剂以7个剂量处理24小时。24小时后移除条件培养基以用于ELISA分析。随后用XTT测定根据供应商指南分析细胞活力。

实验设置：

1.未处理细胞

2.咪喹莫特

3.TLR7激动剂1

4.TLR7激动剂2

5.TLR7激动剂3

6.TLR7激动剂4

7.TLR7激动剂5

以7个剂量（0,003-0,01,03-0,1-0,5-2,0-10,0微摩尔）测试化合物。就各测试系列在四重孔中进行实验，收集上清并通过ELISA一式三份测量。

模型2

5个TLR7激动剂的效力基于刺激IL-6和TNF-α分泌的能力进行评价，所述效力与PBMC模型中的阳性对照（咪喹莫特）作比较。就对照以及IL-6和TNF-α分泌的各药物候选物测定EC50值。

方法：PBMC纯化自3个供体并以2x10⁵细胞/孔接种于96孔板中的RPMI培养基，所述培养基包括人2%热灭活AB血清、谷氨酰胺、青霉素-链霉素（Pen-strep）和β-巯基乙醇。细胞用TLR7激动剂以7个剂量处理24小时。移除条件培养基以用于IL-6和TNF-α的ELISA分析，并用XTT方法根据供应商的操作方案测定细胞存活。

实验设置：

1.未处理细胞

2.咪喹莫特

3.TLR7激动剂1

4.TLR7激动剂2

5.TLR7激动剂3

6.TLR7激动剂4

7.TLR7激动剂5

以7个剂量（0,003-0,01,03-0,1-0,5-2,0-10,0微摩尔）测试化合物。

数据处理：

IL-6和TNF-α的浓度通过安迪生物（R&D Systems）的ELISA用MicrosoftExcel软件测定。结果用Graph Pad Prism分析以绘制剂量响应曲线，并用于测定EC50值。

统计分析：

鉴于供体数量，个体EC50值之间的统计学评价不相关。

结果和讨论

模型1中，IL-6和TNF-α的分泌由所有化合物剂量依赖性诱导，但不是DMSO本身（图1-2）。化合物达到不同水平的最高细胞因子水平，还显示不同EC50值。效力顺序如下，从最大效力开始：化合物A<SC12<SC18<SC8=游离药效团<咪喹莫特（表3）。游离药效团（“游离ph”）具有以下结构：

XTT测定（图3，其中Y轴=相对存活，x轴=处理浓度）显示细胞略受到高浓度化合物影响，就某些化合物而言由细胞因子生成在最高浓度时减少来反映（特定是化合物A、SC12和SC18;图1和2）。由于剂量响应曲线的最大平稳区段是基于最高浓度诱导的细胞因子水平而测定，若不考虑最高化合物浓度，此平稳区段可略有增加。然而，动态范围中的剂量不受此影响，意味着EC50值受到最小影响。

表3.Raw264.7细胞系中基于各化合物的7个测试剂量测定的EC50值。

Raw 264.7	咪喹莫特	游离ph	化合物A	SC 12	SC18	SC8
							EC 50IL 6mM	2,005	0,531	0,006	0,042	0,310	0,669
EC 50 TNF-α	2,156	0,707	0,009	0,041	0,499	0,603

模型1的结论中，化合物A是最有效的TLR7激动剂，然后是SC12、SC18、SC8和游离药效团，最后是咪喹莫特。此方面中，所有5种化合物在所述模型中效力高于咪喹莫特。

对于模型2，PBMC获自健康匿名成年人供体的血沉棕黄层。IL-6和TNF-α的分泌在3个供体中由大部分化合物剂量依赖性诱导。一些化合物如咪喹莫特、SC8和游离药效团显示在一些供体中诱导细胞因子的能力弱，其中仅最高剂量诱导细胞因子生成。化合物A是所有3个供体中用于IL-6分泌的最有效化合物。SC12在供体2中与化合物A效力相同，而SC12是供体1和3中次最有效化合物，见表4。所述化合物平均显示如下效力顺序：化合物A<SC12<游离药效团<咪喹莫特<SC18<SC8。SC8显示没有固体剂量响应曲线的细胞因子水平。对于TNF-α分泌，根据表4的3个供体结果，SC12效力平均略高于化合物A。效力顺序如下：SC12<化合物A<游离药效团<SC18<SC8<咪喹莫特，图7-9。然而，咪喹莫特和SC8的数据不明确，在所有3个供体中仅诱导弱TNF-α分泌。存活试验显示细胞在整个研究中于所有测试浓度总体上良好存活，没有观察到显著细胞毒性。用SC12处理的2号供体具有增加的存活反应（图10），但不反映细胞因子响应的差异（图5和8）。

表4.在来自3个供体的PBMC中就指示平均效力的6个TLR7激动剂测定的EC50值。

模型2的结论中，化合物A和SC12是最有效的TLR7激动剂。化合物A是IL-6的最有效刺激剂，就TNF-α分泌而言，SC12效力略高于化合物A。其他化合物显示从不同供体的PBMC诱导IL-6和TNF-α的能力不同，其效力不能一般排序。咪喹莫特和SC8显示最高测试浓度的细胞因子诱导和低水平的分泌细胞因子。因此，不能就咪喹莫特和SC8测定EC50值。SC18和游离药效团显示对IL-6和TNF-α分泌的反应类似，其达到的水平高于咪喹莫特和SC8，但值高于Raw264.7模型。

Raw264.7细胞系响应所有测试的化合物，化合物A最有效，然后是SC12。之后是SC18、SC8和游离药效团且显示类似效力，咪喹莫特显示最弱的IL-6和TNF-α诱导。

PBMC实验显示化合物A和SC12是2个最有效的TLR7激动剂，然后是SC18和游离药效团，但在用咪喹莫特和SC8处理后测量到低细胞因子分泌。

实施例4：人PBMC中2个不同批次化合物A和SC12的TLR7激动剂效力测试

目标

为了测定人PBMC中2个不同批次产生的2种TLR7激动剂诱导IL-6分泌的效力。

方法和实验设置

PBMC纯化自2个供体并以2x10⁵细胞/孔接种于96孔板中的RPMI培养基，所述培养基包括人2%热灭活AB血清、谷氨酰胺、青霉素-链霉素和β-巯基乙醇。细胞用TLR7激动剂以4个剂量处理24小时。移除条件培养基以用于IL-6的ELISA分析，就各化合物和各批次测定EC50值。

实验设置：

1.未处理细胞

2.未处理细胞（载剂对照）

3.咪喹莫特

4.化合物A（新批次#20289）

5.化合物A（旧批次CH730/25/8）

6.SC12（新批次#20288）

7.SC12（旧批次#CH730/2/13D）

所有化合物以4个浓度（10-1-0,1-0,01微摩尔）测试。在条件培养基中孵育24小时后通过ELISA测定IL6（IL6在最后的实验中产生最相当的剂量响应结果）。

数据处理：

IL-6的浓度通过安迪生物的ELISA用Microsoft Excel软件测定。结果用GraphPad Prism分析以绘制剂量响应曲线，并用于测定EC50值。

统计分析：

鉴于低供体数量，不测定个体EC50值之间的统计学评价。

结果和讨论

IL-6由所有化合物剂量依赖性诱导，除了咪喹莫特，其仅在最高浓度（10μM）时活性诱导IL-6。结果的概括示于表5，指示2个测试供体的EC50值（顶部2行），并与对3个供体进行的2种化合物的第一次实验值作比较（底部3行）。此实验中咪喹莫特的EC50值看来稍高于上一次实验。这可由以下解释：4°C储存，使用前加热过程可用于完全溶解化合物。测试批次CH730/2/13D时比较本实验与前面的实验，SC12显示相似的EC50值。旧SC12批次（CH730/2/13D）还显示与新批次（#20288）相比类似的EC50值。测试批次（CH730/25/8）时，化合物A在本实验和先前实验中还显示相似的EC50值。新化合物A批次#20289与旧批次相比还显示类似的EC50值。由于上次实验在所有测试浓度都不显示细胞毒性活性，不进行细胞存活的测试。

表5：5个不同供体的PBMC中在不同时间点测定的EC50值，用不同批次的SC12和化合物A。

结论

2个TLR7激动剂SC12和化合物A在本实验中显示相似EC50，表明其含有相同量的活性化合物。这进一步表明所述化合物（CH730/2/13D和CH730/25/8）在DMSO中4°C储存5个月期间没有丧失活性。

实施例5：研究化合物A在大鼠、兔子、小型猪和人血浆中的代谢稳定性以及在兔子和人血浆中的代谢概况；比较化合物A和SC12在人血浆中的稳定性

缩写：

2-哌啶乙基4-氨基-5-氯-2-甲氧基苯甲酸酯-M7319

乙腈-ACN

大气压化学电离-APCI

二甲亚砜-DMSO

电喷雾电离–ESI

甲酸-HCOOH

液相色谱/质谱-LC/MS

甲醇-MeOH

多反应模型–MRM

保留时间-R.T.

超高效液相色谱–UPLC

摘要

化合物A*（另一批化合物A）在大鼠、兔子、小型猪和人血浆中测试稳定性，在兔子和人血浆中评价代谢概况。化合物A*在兔子和人中由酯酶高度代谢，在小型猪和大鼠种中程度较低。研究兔子中30和120分钟以及人中60和300分钟的代谢，2个物种中亲体的剩余百分数保持大致恒定。在兔子中发现3种代谢物且其中2个在人中发现。

兔子中，主要代谢物是单酯和酸性代谢物，仅观察到二水解代谢物的踪迹。人血浆中，只有先前兔中检测到的前2个主要代谢物在选定时间点鉴定到且酸性产物是120分钟处的主要代谢物。

此研究发现人和兔子物种中有相当的清除概况和代谢概况，仅形成2个主要代谢物，其中限速步骤是导致单酯形成的水解，所述代谢物迅速转变成酸性衍生物。

用第二批化合物A（批次20289）相较SC12在人血浆中进行第二实验，表明SC12比化合物A更稳定，因为其不代谢多至120分钟，且大于70%化合物在300分钟处仍存在。相反，化合物A在孵育60分钟后显示不稳定性。

引言

血浆中存在的水解酶很有助于化合物代谢。许多含有酯键的药物用作前药以增加通透性或溶解度或者减少全身毒性作用。酯酶存在许多种类，物种差异可能一般是由于生物介质中存在不同类型和其底物特异性不同。其他生物转化可受到多种因素如年龄、性别和疾病影响。

目的

试验目的是比较不同时间点数个血浆种类中的稳定性，如亲体剩余百分数。在兔子和人血浆中完成2个时间点的血浆孵育后所形成主要代谢物的分布。

使用不同批次的人血浆并与SC12作比较，进行不同批化合物A的第二实验。

血浆稳定性和代谢研究

材料

下列物质获自所述来源：ACN来自德国JB公司（J.T Baker），利多卡因、异搏定和M7319来自西格玛-奥德里奇公司（Sigma-Aldrich）。HCOOH来自弗卢卡公司（Fluka）。去离子来自MilliQ仪器（MilliQ apparatus）（密理博（Millipore））。

血浆样品获自所述来源：

大鼠血浆来自意大利卡尔科的查尔斯河公司（Charles River）。小型猪、人和兔子血浆来自法国雷恩的生物预测公司（Biopredic）。

化合物A 2-4-((6-氨基-2-(2-甲氧基乙氧基)-8-氧-7H-嘌呤-9(8H)-基)甲基)苯甲酰胺)乙基2,3-二(油酰氧基)磷酸丙酯

批号：化合物A*（第一次实验），20289（第二次实验）。

储存条件：4°C为粉末，-20°C为DMSO中储液

化合物SC-12：

2-4-((6-氨基-2-(2-甲氧基乙氧基)-8-氧-7H-嘌呤-9(8H)-基)甲基)苯甲酰胺)乙基2,3-二(油酰氧基)磷酸丙酯

批号：20288

储存条件：4°C粉末，干燥保存并避开直接光照

仪器

UPLC（沃特世（Waters））接口Premiere XE三重四极杆质谱（沃特世）用于清除测定，以及UPLC（沃特世）接口离子阱HCTultra（道尔顿公司（BrukerDaltonics））用于代谢分布。

方法

第一次实验：测试化合物（50mM DMSO）用ACN稀释在终浓度250μM稀释（双份）。向不同种类的血浆（1ml）加入10μl 250μM化合物溶液且在0、15、30、60、120分钟和5小时取50μl体积等分样品，立即用200μl异搏定250ng/ml（内标，I.S.）的ACN溶液淬灭。加入10μl MeOH以提高稳定性。然后，样品在13000rpm离心5分钟并分析，如下所报告。利多卡因和M7319用作参考标准并如上所述孵育。通过LC/MS/MS分析上清部分。零时间孵育用作100%值。测定孵育中的底物损失百分数以估计测试化合物的体外半衰期。

对50μM终浓度的测试化合物和根据该化合物半衰期确立的2个时间点收集的样品进行代谢实验，加入ACN和内标后通过LC/MS/MS分析。

第二次实验：测试化合物（DMSO中5mM）用ACN-MeOH 1:1稀释在终浓度250μM稀释。

人血浆（1.180ml）中加入20μl 250μM化合物溶液（4.16μM终浓度）且在0、15、30、60、120分钟和5小时取50μl体积等分样品，立即用200μl异搏定250ng/ml（内标，I.S.）的ACN-MeOH 95:5溶液淬灭。然后，样品在3000rpm 10°C离心20分钟并分析，如下所报告。利多卡因和M7319用作参考标准并如上所述孵育。通过LC/MS/MS分析上清部分。零时间孵育用作100%值。

样品分析

用于血浆稳定性测定的样品分析（第一次实验）

样品在连接Premiere XE三重四极杆质谱（沃特世）的UPLC（沃特世）上分析。

洗脱剂为：

A相：95% H2O,5% MeOH,0.1% HCOOH

B相：5% H2O,95% MeOH,0.1% HCOOH

柱：Acquity BEH C8,2.1x5mm 1.7um，55°C

注射体积：5μl。

色谱方法报告于下表6。

表6.用于清除测定的色谱方法

时间(分钟)	流动(毫升/分钟)	%A	%B
				0	1	90	10
0.2	1	90	10
				0.3	1	0	100
4.0	0.6	0	100

ESI pos,毛细管3.4kV,提取器5V,源T 115°C,脱溶剂T 450°C锥孔气L/h 98,倍增器630V。

表7中报告了应用于化合物A的转换。

表7.MRM转换和应用参数

用于代谢分布的样品分析

用偶联布鲁克道尔顿（Bruker Daltonics）

离子阱质谱的沃特世UPLC色谱系统分析样品。分析孵育样品前，手动注入化合物A以理解亲体裂解。通过用ACN/MeOH 1/1稀释DMSO中50mM溶液到1μM，进行灌注。样品溶液以4微升/分钟流速输入离子阱源。

通过T-union 75微升/分钟H₂O/ACN 1/1+0.1%甲酸（来自UPLC系统）混合所述化合物溶液流体以稳定流速和信号。

将下列条件应用于离子阱：ESI正,毛细管电压-4KV,毛细管出口电压164.3V,取样锥孔电压40V,阱驱动参数88.4,雾化气压力70psi,干燥气流速10升/分钟,干燥气温度350°C。

样品在接口离子阱HCT ultra（布鲁克道尔顿公司（Bruker Daltonics））的UPLC（沃特世）上分析。

洗脱剂为：

A相：95% H2O,5% MeOH,0.1% HCOOH

B相：5% H2O,95% MeOH,0.1% HCOOH

柱：Acquity BEH C8,2.1x5mm 1.7um，55°C

注射体积：5μl。

色谱方法报告于下表8。

表8.用于代谢分布的色谱方法

时间(分钟)	流动(毫升/分钟)	%A	%B
				0	1	90	10
0.2	1	90	10
				7	1	0	100
12	1	0	100

样品分析（第二次实验）

用偶联布鲁克道尔顿

离子阱质谱的沃特世UPLC色谱系统分析化合物A和SC12。

洗脱剂为：

A相：95% H2O,5% MeOH,0.1% HCOOH

B相：5% H2O,95% MeOH,0.1% HCOOH

流动0.6毫升/分钟。柱：色谱科（Supelco）,Discovery HS F5,3.3cmx2.1mm;55°C。

注射体积：10μl。

色谱方法报告于下表9。

表9.色谱方法

时间(分钟)	%A	%B
			0	90	10
0.5	90	10
			1	0	100
3	0	100
			3.1	90	10
3.5	90	10

将下列条件应用于离子阱：

-对于化合物A：ESI正,毛细管电压-4KV,毛细管出口电压164.3V,取样锥孔电压40V,阱驱动参数88.4,雾化气压力70PSI,干燥气流速10升/分钟,干燥气温度350°C。

-对于SC12：ESI正,毛细管管电压-4KV,毛细管出口电压200V,取样锥孔电压49.5V,阱驱动参数85.0,雾化气压力70PSI,干燥气流速10升/分钟,干燥气温度350°C。

用于定量的MRM转换报告于表10。

表10.MRM转换

化合物	[MH]+	转换
			化合物A	1085.6	603.6→385.23
SC12	921.6	439.45→385.23

数据分析

稳定性计算为各时间点的面积比化合物/I.S相比0分钟时面积比化合物/I.S的剩余百分数。一般稳定性分类报告于表11。

表11.孵育1小时的一般稳定性分类

%剩余	>80	80-60	60-30	<30
					分类	稳定	稍不稳定	不稳定	不稳定

研究人血浆中60分钟和300分钟以及兔子血浆中30和120分钟的代谢，即在所述时间点时2个种类显示相似的亲体化合物剩余百分数。通过比较所述谱与亲体谱的MS/MS分析来完成结构赋值。

结果

血浆稳定性（第一次实验）

血浆稳定性实验所得结果示于表12。

化合物A在所有测试物种中不稳定；兔子是具有最高清除的物种，然后是人和大鼠种；小型猪显示最低清除。兔子、大鼠和人血浆中，多至30分钟的曲线第一部分较陡，而剩余部分倾斜度较缓和。标准与文献数据一致。

表12.化合物A在大鼠、兔子、小型猪和人血浆中的剩余百分数（%剩余-均值±S.D.）

时间(分钟)	大鼠	兔子	小型猪	人
					0	100	100	100	100
15	73.8±4.5	38.7±3.4	102.4±3.3	99.7(*)
					30	67.1±8.8	10.2±1.0	73.3±5.0	40.4±15.5
60	25.2±0.5	7.4±0.1	78.6±2.9	36.1±7.6
					120	21.4±1.9	4.4±0.7	33.7±2.3	17.4±2.6
300	15.3±1.0	1.9±0.1	10.8±0.3	7.8±3.3

数据表示为均值±S.D.,n=2,除了n=1的(*)以外

血浆稳定性（第二次实验）

化合物A和SC12的人血浆稳定性实验结果示于表13。对于化合物A，60分钟孵育后观察到不稳定性（约80%剩余）在300分钟达到56%剩余。所述第二次实验中，使用不同批的化合物A以及与第一次实验不同的分析条件和人血浆批次：这能解释所得剩余百分数间观察到的一些差异。

SC12在人血浆中稳定多至120分钟。大于70%化合物在300分钟孵育后仍存在。此数据与先前实验所发现的一致（数据未显示）。同一实验中测试的标准化合物与文献数据一致（表14）。

表13.化合物A和SC12在人血浆中的剩余百分数

数据表示为均值±S.D.,n=2;除了n=1的(*)以外

表14.标准化合物在人血浆中的剩余百分数

代谢分布

亲体破裂：主要片段属性如来自MS/MS谱的表15所报告。

表15.化合物A主要片段的属性

代谢物分布

研究兔子和人血浆中的代谢分布。2种基质中，亲体化合物（50uM起始浓度）在最后一个时间点全部代谢。代谢物在全扫描中测得并通过MH+和MS/MS谱鉴别峰。亲体化合物显示全扫描概况中的低响应，因此初始全扫描色谱不显著。

代谢物与MH+和保留时间的概括报告于表16。兔子种中，在保留时间（r.t.）1.1、6.3和6.4分钟分别检测到MH+为557、821和360。

丰度最高的峰对应分配给单酯产物的MH+821（M2），所述产物在120分钟时1:1转变成酸性代谢物；仅出现对应二水解产物的一个小峰（MH+557,M1）。类似概况还在人血浆中观察到，其中2种主要代谢物显示与兔子概况相同的MH+和保留时间且其比例在孵育60分钟后为1:1，代谢物M3是300分钟时的主要产物。二水解代谢物（MH+557）踪迹在时间0时已存在于人血浆中，因而其不视作代谢物。因此，假设代谢物的速度测定步骤是单酯形成而所有其他降解步骤以快许多的方式出现。二酰基甘油部分在位置1或3水解的潜在选择性没有表征。

表16.兔子和人血浆中鉴定的代谢物

	M1	M2	M3
				分钟	1.1	6.3	6.4
MH+	557	821	360
				兔子	x	x	x
人		x	x

结论

研究4个物种：兔子、人、大鼠和小型猪中化合物A在血浆内的稳定性。产物由酯酶在兔子和人中高度水解且在小型猪和大鼠中程度较低。研究兔子中30分钟和120分钟以及人中60和300分钟的代谢，2个物种中亲体的剩余百分数保持大致恒定。在兔子中发现3种代谢物（M1、M2和M3）且其中2个（M2和M3）在人中发现。兔子中，主要代谢物是单酯和酸性代谢物，仅观察到二水解代谢物的踪迹。人血浆中，只有先前兔中检测到的单酯和酸性代谢物在选定时间点鉴定且酸性产物是120分钟处的主要代谢物。

总之，2个物种呈现相当的清除概况和代谢概况，仅形成2个主要代谢物，其中限速步骤是导致单酯形成的水解，所述代谢物迅速转变成酸性衍生物。

SC12在人血浆中似乎比化合物A更稳定，70%化合物在300分钟处仍存在。

实施例6：人全血试验中TLR7激动剂对浆细胞样DC、髓样DC和B细胞的效力。

目标

为了测定全血试验中2个TLR7激动剂相较咪喹莫特的效力。特定地，如果2个TLR7激动剂即化合物A和SC12在全血试验中显示激活免疫细胞效力方面的差异，则进行检测。能用以显示化合物A和SC12生物学效应差异的最优参数被认为是B细胞、髓样DC和浆细胞样DC激活测量。

方法和实验设置

从3个健康成年匿名志愿者中取约55mL体积的新鲜全血置于肝素化真空采血管中，如（J.A.Ida,Journal of Immunol Methods,310,2006,86-99）所述。供体健康，未患有已知免疫紊乱且不用药物。取血前，将化合物加入96孔圆底板的20ul10x稀释样品中。化合物在RPMI培养基中稀释，所述培养基没有血清但有抗生素。抗生素以10x浓度添加。取血后，全血样品温和混合以获得均一样品，向各孔加入180ul。

6小时和24小时孵育后，移出血浆以用于ELISA（IL-6、IL-10、IL-12p40和IFN-α）。就所有浓度在6和24小时时间点进行ELISA。用选定化合物浓度24小时孵育后，通过FACS分析细胞的激活标记。

制备下列样品：

实验设置：

1.未处理细胞

2.未处理细胞（载剂对照）

3.咪喹莫特（旧批次）

4.化合物A（旧批次）

5.SC12（旧批次）

所有化合物设置的终浓度为0-0.01-0.03-0.1-0.5-2.0-10.0微摩尔浓度。载剂对照是DMSO对照，其中使用最高浓度用于化合物。加入血液后，所有板在37°C和5% CO₂温和搅拌，直到收获。6或24小时孵育后移出样品，收集到合适管中（2ml）。

对于6小时时间点，所述板以500xg离心。上清（SN）转移至管并在10.000xg离心10分钟以去除细胞和蛋白聚集物。澄清的上清于-80°C冷冻，直至分析。

对于24小时时间点，将孔中的样品收集到管内，4°C下500xg离心10分钟以使SN澄清。将SN移入另一管并在10.000xg离心10分钟以去除聚集物等。澄清的上清于-80C冷冻，直至分析。

FACS分析

用2个化合物浓度处理24小时后，对来自3个供体的全血进行流式细胞术分析。供体1和供体2的FACS分析与供体3的分析在不同日进行。所述化合物浓度如下：

B细胞激活：2和10uM

mDC/pDC：0.1和0.5uM

FACS分析用于鉴定测试化合物能否诱导激活B细胞以及2个不同树突细胞亚组即髓样CD11c+/CD123-DC和浆细胞样CD11c-/CD123+DC。研究下列标记以鉴定所述不同亚组的活化状态：

B细胞：HLA-DR/CD20/CD40

pDC：HLA-DR/CD123+/CD11c-/CD80

HLA-DR/CD123+/CD11c-/CD86

HLA-DR/CD123+/CD11c+/CCR7

mDC：HLA-DR/CD123-/CD11c+/CD80

HLA-DR/CD123-/CD11c+/CD86

HLA-DR/CD123-/CD11c+/CCR7

根据生产商说明进行FACS染色。红血球裂解在FACS染色前进行以使自动荧光最小化。为在研究中诱导尽可能多的B细胞和DC，FACS在总共500,000个细胞上运行以用于各个染色。A P1门设置成仅包括FSC相比SSC的相关细胞（参见图12-15）。个体分析结果表示为平均荧光强度。

对于给定门设置的某些激活标记，(MFI)值代表实际细胞亚组。同种型背景值用于设置所述门，从而在阳性门上能发现最多2%的非特异性染色细胞。

数据处理：

细胞因子浓度由安迪生物的ELISA测定。结果在Graph Pad Prism中分析以绘制剂量响应曲线，并用于测定EC50值。通过使用贝迪医疗（Becton-Dickinson）FACSDiva软件和随后示于Graph Pad Prism，分析结果。

统计分析

个体EC50值之间的统计学评价用于相关细胞因子，用有不等方差的双尾T检验测定。

结果和讨论

细胞因子分泌

6和24小时后的IL-6分泌

用化合物A和SC12孵育6小时后，所有供体以剂量依赖性方式诱导IL-6分泌。咪喹莫特诱导低且不显著量的IL-6，不能像化合物A和SC12一样产生S型剂量响应曲线。就化合物A和SC12测定EC50值，如表17所见。SC12倾向于在所有3个供体中显示略强于化合物A的EC50值。然而，仅基于3个供体，这不能确认为统计上显著。

表17.用TLR7激动剂孵育全血6小时后IL-6分泌的EC50值。

用化合物A、SC12和咪喹莫特孵育24小时后，所有供体诱导IL-6分泌，但咪喹莫特仅在最高测试浓度诱导。就所有化合物测定EC50值，然而，就咪喹莫特而言此测定不精确，因为仅最高浓度显著高于可检测水平，这不能产生S型剂量响应曲线。24小时孵育后的IL-6水平仅稍高于6小时孵育后所见的IL-6水平。24小时孵育后用于IL-6分泌的所有化合物EC50值参见表18。24小时的趋势与6小时相同，即所有3个供体中SC12相较化合物A略微更强且显示更低的EC50值。就化合物A和SC12而言所有3个供体的EC50值比较用双尾T检验时显示P值为0.07，表明对2种化合物的反应没有显著差异。

表18.用TLR7激动剂孵育全血24小时后IL-6分泌的EC50值。

总之，所有3个供体中由化合物A和SC12诱导的IL6分泌水平类似且EC50值相似，但SC12显示稍微更强的趋势。此外，IL6分泌（4000-8000pg/ml）范围与Clarke等,Jour.Interferon & Cytokine Research,29,2,2009,113-126发表的结果一致。

6和24小时后的IFN-α分泌

用化合物A和SC12孵育6小时后，所有供体以剂量依赖性方式诱导IFN-α分泌，而咪喹莫特不诱导IFN-α分泌。供体1和2诱导2000pg/ml范围内的IFN-α水平，供体3仅诱导至500pg/ml范围。就化合物A和SC12测定EC50值，如表19所见。SC12再次在所有3个供体中显示EC50值略强于化合物A的趋势，然而这不显著（P=0.23）。

表19.用TLR7激动剂孵育全血6小时后IFN-α分泌的EC50值。

用化合物A、SC12和咪喹莫特孵育24小时后，所有供体诱导IFN-α分泌，但咪喹莫特再次仅在最高测试浓度诱导。就化合物A和SC12测定EC50值。由于仅在最高浓度诱导，咪喹莫特的EC50值又一次不精确。就供体1和2而言24小时孵育后的IFN-α水平低于6小时孵育后所见的IFN-α水平，表明此细胞因子可由试验中的细胞移除。24小时孵育后用于IFN-α分泌的所有化合物EC50值参见表20。24小时后所有3个供体诱导1000pg/ml范围中的IFN-α，表明供体3对化合物A和SC12的响应慢于供体1和2。SC12再次略强于化合物A，尽管不是显著差异（P=0.11）。

表20.用TLR7激动剂孵育全血24小时后IFN-α分泌的EC50值。

总之，所有3个供体中由化合物A和SC12诱导的IFN-α分泌水平类似且EC50值相似，但SC12显示稍微更强的趋势。与发表的结果相比，本研究中分泌的IFN-α范围（1000-2000pg/ml）高于发表数据（<200pg/ml），如雷西莫特所示（Clarke等,Jour.Interferon & Cytokine Research,29,2,2009,113-126）。然而，这可由雷西莫特预期效力低于化合物A和SC12来解释。第二，已知IFN-α分泌主要由pDC诱导且由于本研究中IFN-α在6小时后已分泌，表明pDC作为用化合物A和SC12处理全血细胞后观察到的初始反应之一而被激活（J.A.Ida,Journal of immunolmethods,310,2006,86-99）。

6和24小时后的IL-10分泌

用咪喹莫特、化合物A或SC12孵育6小时后，没有发现IL-10生成，表明IL-10分泌是TLR7激动剂处理全血细胞的次级效应。用化合物A、SC12或咪喹莫特孵育24小时后，所有供体诱导IL-10分泌，但咪喹莫特再次仅在最高测试浓度诱导。就所有化合物测定EC50值，然而由于仅在最高浓度诱导IL-10，此测定对于咪喹莫特又一次不精确。24小时孵育后用于IL-10分泌的所有化合物EC50值参见表21。24小时后，所有3个供体诱导2000-40000pg/ml范围内的IL-10。化合物A和SC12显示类似的诱导IL-10能力，2种化合物间没有显著差异。

表21.用TLR7激动剂孵育全血24小时后IL-10分泌的EC50值。

总之，IL-10在试验中诱导较晚，6小时后没有诱导，仅在24小时孵育后有。这表明IL-10是试验中的二级反应，且可能不是用测试化合物的TLR7连接的直接效应。这与Douagi等,Journal of Immunology,182,2009,1991-2001的研究一致，其中IL-10仅在12和20小时后于人PBMC模型中诱导，但4小时后没有。此外，Douagi等显示mDC相较pDC是IL-10的主要生产细胞。通过TLR7连接的IL-10分泌现有结果表明IL-10分泌在mDC中出现或可能巨噬细胞存在于全血试验，潜在作为二级反应，这由Boonstra等,Journal of Immunology,177,2006,7551-7558的研究支持，其显示TLR7连接后小鼠巨噬细胞和mDC生成IL-10比pDC强许多。

6和24小时后的IL-12p40分泌

用化合物A和SC12孵育6小时后，所有供体以剂量依赖性方式诱导IL-12p40分泌，而咪喹莫特不诱导IL-12p40分泌，甚至在最高浓度也不诱导。所有供体诱导8.000-12.000pg/ml范围内的IL-12p40水平。就化合物A和SC12测定EC50值，如表22所见。所述化合物看来在诱导IL-12p40方面效力相同，没有显著差异。

表22.用TLR7激动剂孵育全血6小时后IL-12p40分泌的EC50值。

用化合物A、SC12或咪喹莫特孵育24小时后，所有供体在化合物A和SC12处理后诱导IL-12p40分泌到20.000-25.000pg/ml范围内的IL-12p40水平，而咪喹莫特甚至在最高浓度也不诱导IL-12p40。就化合物A和SC12测定EC50值，如表23所见。2种化合物显示相似的EC50值，没有显著差异。

表23.用TLR7激动剂孵育全血24小时后IL-12p40分泌的EC50值。

总之，所有3个供体中由化合物A和SC12诱导的IL-12p40分泌水平类似且EC50值相似。6和24小时处理后都观察到诱导，在24小时时间点量增加。小鼠细胞中，相较巨噬细胞和pDC中的生成，IL-12p40在TLR连接后主要由mDC生成（Boonstra等,Journal of immunology,177,2006,7551-7558）。如果人细胞中发现类似的IL-12p40表达模式，表明化合物A和SC12在人mDC遵循类似的激活概况。

关于细胞因子分泌的结论

化合物A和SC12是全血细胞试验的上清中所鉴定DC分泌细胞因子的有效诱导剂，而咪喹莫特是这些细胞因子的弱诱导剂。此结果预期是根据用相同化合物的PBMC模型中的先前结果。SC12趋向于在诱导IL-6和IFN-α方面效力略高于化合物A。然而，鉴于所用的3个供体数目，这不能证明为统计上显著。

对于IL-10和IL-12p40分泌，根据本研究，化合物A和SC12效力相等。IL-10在6小时孵育后不生成，而仅在24小时孵育后产生。IL-12p40在6和24小时孵育后均被诱导。

根据涉及TLR7激活PBMC和全血试验的现有知识，已知pDC是IFN-α的主要生产细胞。IL-6由mDC和pDC生成，IL-10主要由mDC生成，IL-12p40主要由pDC生成。IL-6和IFN-α的生成模式可表明SC12在激活pDC方面略强于化合物A。用人初级细胞的试验中，刺激B细胞增殖需要存在pDC并用其TLR7配体激活，已知激活B细胞增殖和起始抗体生成需要从pDC产生IFN-α（Douagi等,Journal of immunology,182,2009,1991-2001,图2和3）。

在前面模型和测试PBMC模型内化合物A和SC12中，化合物A显示在IL-6分泌方面略强于SC12的趋势，然而，这在任一前面研究中不显著。2个模型中化合物的效力差异可由所述化合物的化学或物理性质差异来有力解释，因为潜在亲脂性差异会显示划分入各试验中细胞库的差异。全血试验包含约50%细胞体积，因为存在大量红血球和血小板。相反，PBMC模型包含低许多的细胞体积（<5%）。此方面中，全血试验中存在的大量细胞可作为高度亲脂性化合物的缓冲液。

FACS分析

B细胞分析（图12）：

B细胞上激活标记CD40的表达分析在双阳性HLA-DR（MHC II型）（P4门）和CD20细胞（B细胞标记）（P8门）上进行。图12显示用测试化合物处理24小时后3个供体的结果，包括用所示测试剂孵育24小时后双阳性HLA-DR+/CD20+B细胞上CD40表达的MFI值，所述处理是对来自3个供体（D1-D3）的全血进行。

与未处理或DMSO处理细胞相比，激活标记CD40在处理后显示所有3个供体中的表达增加，对照化合物咪喹莫特处于最高浓度（10uM）。2种测试化合物即化合物A和SC12在所有测试浓度诱导供体1和供体2的CD40表达。然而，供体3中仅2种测试化合物的最高浓度相较未处理细胞诱导CD40表达。所有3个供体中，化合物A在10uM测试时显示刺激所有3个供体中CD40表达略高于SC12的弱趋势。然而，由于供体数目少，此趋势不能确认为统计上显著。

DC分析（图13-15）：

共刺激活化标记CD80和CD86和趋化因子受体CCR7的表达模式在2种不同DC亚组上研究。用于供体1未处理细胞的DC分析的样品丢失，但作为未处理（DMSO）对照细胞的平行样品用作类似的对照细胞。

1.髓样树突细胞（mDC）：

髓样DC的分析是基于HLA-DR+/CD11c+/CD123-细胞，因此所有分析细胞包括在HLA-DR+(P3)门和CD11c+/CD123-(Q4)门中（参见图13-15中的门）。

发现咪喹莫特诱导供体1和2的弱CD80表达，这与CD80表达高的供体3相反。2种测试化合物即化合物A和SC12诱导所有3个供体中显著的CD80表达。所述3个供体的2个（D1和D3）中，最高浓度的SC12（0.5uM）显示有效刺激CD80表达，高于化合物A所见水平。供体2中，化合物A仅在最高浓度刺激略强于SC12的CD80表达。

mDC中的CD86表达分析显示未处理细胞在所有3个供体中已表达高水平CD86，这是一种普遍观察。然而，化合物A进一步刺激所有3个供体中的CD86表达。SC12诱导供体2和3中的弱CD86表达，但供体1中没有。2种测试化合物在0.1uM的最低浓度显示对诱导CD86表达最有效。这与CD80表达相反，其中0.5uM的最高测试剂量是最有效浓度。

趋化因子受体CCR7是淋巴结归巢受体，其也在mDC上研究。CCR7表达显示高于CD80和CD86的供体间变化。对于所有供体，化合物A诱导最高CCR7表达，对于供体1和3，咪喹莫特还显示高CCR7表达，这在供体2中未见。SC12对于所有供体是CCR7表达的低效力刺激剂。

2.浆细胞样树突细胞（pDC）

pDC分析是基于HLA-DR+/CD11c-/CD123+细胞，因此所有分析细胞包括于HLA-DR+(P3)门和CD11c-/CD123+(Q1)门中（图13-15）。

pDC中，化合物A和SC12显示对所有3个供体中CD80表达模式的效果相当。然而，SC12诱导所有3个供体中略高于化合物A的CD80表达，除了供体3中的较低浓度。

pDC中的CD86表达显示SC12有诱导所有3个供体中高于化合物A的CD86表达的趋势。然而，最有效浓度可变，最低剂量为0.1uM，诱导供体1和3中最高的CD86表达，而0.5uM是供体2中的最有效浓度。咪喹莫特在供体3中诱导与SC12和化合物A类似的高CD86表达。

pDC中的CCR7表达模式与mDC中所见类似。化合物A在所有3个供体中诱导大幅高于SC12的CCR7表达。图16的咪喹莫特显示用所示测试剂孵育24小时后HLA-DR+/CD11c-/CD123+pDC中的CD80、CD86和CCR7表达的MFI值，所述试验对来自3个供体（D1-D3）的全血进行。

FACS分析的结论：

B细胞研究的总体结论是最高浓度（10uM）的化合物A刺激所有3个供体中成熟标记CD40的水平略高于SC12。

对于DC激活，SC12在涉及刺激活化标记CD80方面效力比化合物A高许多，对于mDC和pDC也如此（尽管发现有一些例外）。

对于激活标记CD86，结果有些不同，因为化合物A在mDC中略强于SC12，而SC12在pDC中略强于化合物A。然而，用于CD86表达的最有效浓度在供体间不同。

趋化因子受体CCR7的表达显示化合物A在大部分供体的2种DC亚组中强于SC12。对于CD86表达，用于CCR7诱导的最有效化合物浓度在供体间不同。

在B细胞、mDC以及pDC中，咪喹莫特一般显示仅在供体3中有效，以用于表达所有研究的标记。

结果

化合物A和SC12有效诱导细胞因子IL-6,IL-10,IL-12p40和IFN-α，2种B细胞、pDC和mDC上的成熟标记表达增加。这些参数上测量的化合物A和SC12生物学效应差异不显著。然而，若使用大量供体，可能显示统计上显著效果。一些效果显示边缘显著，一些成熟标记显示由一种化合物更有效诱导的趋势。

所述趋势显示：

化合物A就下列终点显示比SC12更有效。

1.诱导mDC上的成熟标记CD86

2.诱导mDC和pDC上的迁移受体CCR7

3.诱导B细胞激活标记CD40

SC12就下列终点显示比化合物A更有效。

1.诱导mDC和pDC上的成熟标记CD80

2.诱导pDC上的迁移标记CD86

3.诱导细胞因子IL-6和IFN-α

在IL-10或IL-12p40诱导水平没有发现趋势。

基于这些结果，不能推断化合物A和SC12用新鲜人血孵育时表现显著不同。

SC12在pDC激活方面略强于化合物A，因为CD80和CD86由SC12在pDCs上更有效诱导，且pDC细胞因子IFN-α由SC12更有效诱导。另外，化合物A在B细胞激活方面稍微更有效，特别是在10uM浓度测试时观察到。

实施例7：原位大鼠膀胱中用咪喹莫特和SC12的临床前安慰剂-对照功效研究。

此研究目标是评价咪喹莫特（R-487(1)）和SC12液体制剂在F344大鼠原位膀胱癌模型中的功效。比较4组：咪喹莫特、SC12、载剂和安慰剂组。处理后，监控动物健康，从组织病理学评价大鼠-膀胱和肿瘤的反应。

动物、材料和方法

肿瘤细胞

AY-27大鼠膀胱癌细胞系从FANFT（N-[4-(5-硝基-2-呋喃)-2-噻唑基]甲酰胺）喂养的Fischer F344大鼠的原发性膀胱肿瘤中建立。细胞系由加拿大阿尔伯达省的阿尔伯塔大学十字癌症研究所友情提供。细胞培养为RPMI-1640（有谷氨酰胺的培养基（加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司（Invitrogen）））中的单层细胞，所述培养基补充有10%胎牛血清（密苏里州圣路易斯的西格玛-奥德里奇公司）、100U/mL青霉素G和100μg/mL链霉素（加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司），在潮湿95%空气/5%二氧化碳大气中。培养基一周更换2次，融合时细胞用标准胰蛋白酶化过程传代。用于实验的传代数是28和29。

动物

总共56只雌性Fischer F344大鼠购自查尔斯河公司（法国L’Arbresle Cedex）并在实验开始前至少1周适应环境。重量为170g±10g的大鼠饲养于有金片垫料（法国夫拉内的SPPS）和环境强化的单独笼（意大利米兰的Techniplast），在有12小时光暗周期和可自由获得标准饲料及水的温度控制环境中。每天，称重大鼠并监控其健康。根据操作方案运行动物程序，所述操作方案需要由实验动物饲养和使用委员会（IACUC）、动物实验委员会（荷兰拉德伯德大学内梅亨医学中心）批准并符合荷兰和欧洲法规。

样品大小计算

组大小用50%的预期治疗效果计算，α为0,05，功率为80%以及80%肿瘤发展。这产生数量为14的最小组规模。

肿瘤细胞移植

肿瘤细胞移植在第0天根据Xiao等的操作方案进行(2)。F344大鼠接受等基因肿瘤细胞，导致超过80%的膀胱肿瘤建立(3)。皮下注射恩诺沙星（德国勒沃库森的拜耳公司（Bayer））（5-10mg/kg）以在每次插管前用于抗细菌预防。在吸入麻醉下进行实验：异氟烷2-5%（诱导），然后是异氟烷2%，一氧化氮0.5升/分钟和氧气1升/分钟。大鼠膀胱用16号（1.4mm）塑料静脉套管（比利时Erembodegem-Aalst的BD生物系统公司（BD Biosystems））经尿道插管，并引流。膀胱用0.4mL 0.1M氯化氢（HCl）灌注15秒来预调理并通过加入0.4mL 0.1M氢氧化钾（KOH）持续15秒来中和。引流膀胱并用0.8mL 0.01M PBS冲洗3次。新鲜收获的AY-27细胞（传代28和29）悬于培养基。膀胱调理后不久，细胞收获后1小时内，细胞（0,5ml培养基中的1.5*106）灌注入大鼠膀胱且留置1小时。大鼠每15分钟旋转90°。1小时后，移除导管，大鼠能自发排尿。

表24.治疗组

组	膀胱灌注	N
			1	咪喹莫特0.1%	14
2	SC12 0.38%	14
			3	载剂	14
4	NaCl	14

治疗

所有大鼠在第2和第5天接受膀胱灌注。大鼠首先通过如上所述吸入药剂1小时来麻醉。然后大鼠用1.4mm套管（BD生物系统公司）经尿道插管，从膀胱引流并用pH指示条（德国达姆施塔特的默克公司（Merck））测量pH。膀胱灌注用1mL螺口注射器（Luer-Lok syringe）（BD生物系统公司）给予。组1（n=14）用0.5ml IMIQUIMOD 0.1%处理。组2用0.5ml SC12 0.38%处理。组3接受用载剂（Phosal 50）的灌注且组4接受用NaCl作为对照的灌注。测试剂溶于作为载剂的Phosal 50（类脂AG）。膀胱保持灌注1小时，大鼠每15分钟旋转90°。1小时后，移除导管。自发排尿的pH用pH指示条（默克公司）测量。

病理学评价

在第12天，用二氧化碳吸入杀死大鼠。剖检时，检查内部器官并进行胆囊切除术。膀胱称重，用4%缓冲液固定，层压并包埋于石蜡。用苏木素-伊红（H&E）染色5μm切片。由尿道病理学家评估膀胱切片，用TNM分类（国际抗癌联盟，UICC，2002）对T期评分。另外，检测每膀胱的肿瘤总数和肿瘤的侵入深度。膀胱壁和/或周边组织的炎症量评分为0（无炎症）、1（轻微）、2（中等）和3（严重炎症）。

结果

实验中，没有大鼠健康受损征兆且没有大鼠达到人道终点。预期的重量微减仅在麻醉后第1天发现，但在灌注后，所有大鼠恢复体重。偶尔报道插管日的轻微血尿。随后数天中，尿变得正常。治疗前后的尿pH没有显示差异；所有尿液的pH在6.5-7.0变化。剖检时，没有发现膀胱以外的内部器官异常。肉眼评价时，肿瘤阳性膀胱似乎具有肿瘤体但没有膀胱外生长。仅1个大鼠膀胱（组3，载剂处理）显示右尿道口附近的瘤体，向右输尿管延伸。

膀胱重量

膀胱重量与肿瘤出现相关（p<0.0001，独立样品T检验）。表格中，给出均值和范围概览。组2（SC12）和组3（载剂）间有平均膀胱重量差异（p=0.005，独立样品T检验）。其他组之间没有发现平均膀胱重量差异。

表25：每个治疗和对照组的大鼠膀胱重量。重量以克计。

组	N	平均重量	标准偏差	范围
					1	14	0.1201	0.03488	0.0814–0.1891
2	12	0.1014	0.02258	0.0780–0.1422
					3	12	0.1442	0.04163	0.0874–0.2028
4	13	0.1082	0.02311	0.0837–0.1587
					总计	51	0.1184	0.03458	0.0780–0.2028

炎症

几乎所有大鼠中出现一定程度的炎症。组之间没有观察到统计上显著差异（p=0.106，皮尔逊卡方检验）。轻微和中等程度的炎症占所有56个病例的87.5%。

肿瘤和肿瘤反应

具有肿瘤阳性膀胱的大鼠数目在咪喹莫特治疗组（组1）中为14中的9只，SC12治疗组（组2）为14中的8只，载剂对照组（组3）为14中的11只且NaCl对照组（组4）也为14中的11只。所有肿瘤显示pT2期，除了载剂组中的一个pTa肿瘤。pT2肿瘤延伸到逼尿肌中。有pTa肿瘤的大鼠中，在正常尿道上皮内层发现少部分癌细胞，没有侵入。单独组在肿瘤发展方面没有统计上显著差异。组2和组4间的肿瘤发展差异显示0.210的非显著p值（费舍尔精确检验）。对数据进行逻辑回归分析时，给予的治疗（例如咪喹莫特、SC12载剂或NaCl）未预测结果（肿瘤阳性对比肿瘤阴性）。

组	无肿瘤	pTa肿瘤	pT2肿瘤	总共
					1	5(35.7%)	9(64.3%)	14(100%)
2	6(42.9%)	1(7.1%)	7(50.0%)	14(100%)
					3	3(21.4%)	11(78.6%)	14(100%)

4

3(21.4%)

11(78.6%)

14(100%)

侵入深度

肿瘤侵入深度通过尿道病理学家对H&E染色膀胱切片的组织病理学评价来测量。发现肿瘤细胞的最深点作为侵入深度。肿瘤阳性膀胱的平均侵入深度不显示单独治疗组间的显著差异（独立样品T检验，p=0.486–0.912），或SC12-治疗（组1、2）与对照治疗（组3、4）动物间的显著差异（独立样品T检验，p=0.705）

表27：平均肿瘤侵入深度

组	平均侵入深度(mm)	标准偏差	N
				1	1.3333	0.45552	8
2	1.4250	0.70660	8
				3	1.5000	0.56921	11
4	1.3909	0.55759	11

肿瘤数目

每个膀胱的肿瘤绝对数由尿道病理学家计数。载剂对照组的肿瘤数目高于其他组。单变量分析中，载剂组（组3）的肿瘤数目与组1和4（p=0.02）以及组2（p=0.006）显著差异。

表28：每个大鼠膀胱的平均肿瘤数目

组	平均肿瘤数目	标准偏差
			1	1.71	1.773
2	1.36	2.098
			3	3.57	2.563
4	1.71	1.637

结论

咪喹莫特和SC12引起可导致抗肿瘤活性的局部免疫应答。此实验中没有发现毒性症状。尽管治疗对肿瘤率的效果在统计上不显著，咪喹莫特和SC12治疗动物中发现阳性趋势。根据这些数据，未来的实验可能增加治疗频率以改善功效。

实施例7的参考文献

(1)Hayashi T,Crain B,Corr M,Chan M,Cottam HB,Maj R等.IntravesicalToll-like receptor 7 agonist IMIQUIMOD:Optimization of its formulation in anorthotopic mouse model of bladder cancer 1（膀胱内Toll样受体7激动剂咪喹莫特：在膀胱癌1的原位小鼠模型中优化其配制）.International Journal of Urology 2010May;17(5):483-90.

(2)Xiao Z,McCallum TJ,Brown KM,Miller GG,Halls SB,Parney I等.Characterization of a novel transplantable orthotopic rat bladder transitional cell tumormodel 3（新型移植性原位大鼠膀胱移行细胞肿瘤模型3的表征）.British Journal ofCancer 1999Oct;81(4):638-46.

(3)Hendricksen K,Molkenboer-Kuenen J,Oosterwijk E,De Kaa CAHV,Witjes JA.Evaluation of an orthotopic rat bladder urothelial cell carcinoma model bycystoscopy（通过膀胱镜检查评价原位大鼠膀胱上皮细胞癌模型）.Bju International2008 Apr;101(7):889-93.

实施例8：SC12-细菌突变试验的毒性分析

检测SC12诱导鼠伤寒沙门氏菌和大肠杆菌测试株系中基因突变的能力，如通过营养缺陷型菌株回复成原养型来测量。使用5个测试株系TA1535、TA1537、TA98、TA100和WP2 uvrA。有和没有代谢激活时进行实验，用苯巴比妥和β-萘黄酮预处理大鼠的肝S9部分。SC12用作二甲亚砜（DMSO）中溶液。SC12以最大浓度5000微克/板和4个隔开约半对数间隔的较低浓度：1580、500、158和50.0微克/板在毒性试验中测定。在2个最高浓度的孵育阶段结束时观察到SC12沉淀。有或没有S9代谢时用任何测试株系以任何剂量水平都没有观察到毒性。

使用平板混合方法，SC12以最高剂量水平5000微克/板和4个由2倍稀释隔开的较低剂量水平：2500、1250、625和313微克/板测定。有或没有S9代谢时用任何测试株系以任何剂量水平都没有观察到毒性。在2个最高浓度的孵育阶段结束时观察到SC12沉淀。

由于在任何测试浓度都没有观察到回复突变数量增加，纳入预孵育步骤以用于主要试验II的所有治疗。SC12在主要试验I所用同一剂量范围内测定。有或没有S9代谢时用任何测试株系以任何剂量水平都没有观察到毒性。

在4个最高浓度孵育阶段结束时观察到SC12的剂量相关沉淀，其不干扰评分。

有或没有S9代谢时用任何测试株系以任何剂量水平，SC12不诱导平板混合或预孵育试验中回复突变菌落数增加2倍。

结论是有或没有S9代谢时，SC12在报道的实验条件下不诱导鼠伤寒沙门氏菌或大肠杆菌中的回复突变。

实施例9：大鼠中SC12毒性分析-单剂量静脉内研究

SC12的急性毒性在单次静脉内给予SD大鼠后研究，然后是14天的观察期。随后对1只雄性和1只雌性大鼠76、100、85和90mg/kg剂量组完成初期阶段，观察7天。类似构成的另一组接受单独载剂并用作对照。76mg/kg时不发生死亡。临床征兆限于在给药日观察到的立毛和活性下降。

第二组以100mg/kg给药。动物在给药时抽搐后死亡。

然后，第三组以85mg/kg给药。在给药日观察到立毛。最后，第四组以90mg/kg给药。没有发生死亡。在研究第2天-第4天观察到立毛。没有发生死亡且在用单独载剂处理的雄性和雌性动物中没有注意到临床征兆。

在主要阶段，5只雄性和5只雌性动物以90mg/kg给药并观察14天。类似构成的第二组接受单独载剂且用作对照。90mg/kg处理的3只雄性动物在给药后立即死亡，而2只雌性动物在给药后2小时死亡。另外，发现90mg/kg给药的1只雄性和1只雌性动物在研究第2天死亡。抽搐、共济失调、活动减少和弓背姿态是动物死亡前观察到的主要征兆。在给药日的存活动物中注意到共济失调、立毛、活动减少、弓背姿态和半闭眼。观察到立毛，直至研究第3天。类似构成的第二组以80mg/kg给药。在观察期没有记录下发生死亡和临床征兆。在接受单独载剂的动物中没有观察到死亡发生和临床征兆。

90mg/kg处理的存活动物和80mg/kg给药的动物在研究第2天显示轻微到中等体重减轻。第15天发生的恢复和体重变化在此物种和研究结束时动物年龄的预期范围内。接受单独载剂的动物在研究中没有观察到相关体重变化。在观察期结束时用二氧化碳麻醉杀死存活动物。包括早期死亡动物在内的所有动物接受剖检。对90mg/kg（包括早期死亡动物）、80mg/kg处理的所有动物和对照动物进行剖检时没有观察到异常。这些结果表明测试项目SC12在静脉内给予90mg/kg单剂量后诱导大鼠死亡或显著毒性症状，80mg/kg时没有观察到死亡和毒性症状。因此，此研究中的最大耐受剂量认为是80mg/kg。

实施例10：结合试验

咪喹莫特和SC12在酶和放射结合试验中分析，分别如图17和18所示。SC12和咪喹莫特在放射性配体结合试验的73个主要分子靶标中评价，用不同人重组受体类型和亚型或啮齿动物组织匀浆的膜部分。SC12以30μM的固定浓度测试。

显示咪喹莫特结合与疼痛相关综合征关联的受体（如腺苷和钠通道），其是艾特乐（咪喹莫特）治疗后患者中最常见的不良事件。SC12不结合此类受体。

实施例11：研究SC12在小鼠中的静脉内药物动力学。

在禁食雄性CD-1小鼠中测试SC12的药物动力学。

材料和方法

以5ml中的1mg/kg剂量给予尾静脉静脉推注。化合物重量为2.08/10.04ml。研究24只小鼠。通过麻醉放血在5、15、30、60、240和480分钟以及24小时取样。SC12在3% DMSO,20%β-环糊精的水制剂中以5ml/kg剂量体积给予。实验结束时用乙醚杀死动物。

样品制备：Sirocco滤板中，将100微升血浆加入掺有5微升IS（IV29810微克/ml）和10微升5% H₃PO₄的300微升ACN/MeOH。板在80rpm振荡10分钟并真空过滤5分钟。

分析方法：LC/MS/MS：Premiere XE,洗脱剂:水(A)MeOH(B)加0.1% HCOOH梯度。15%B-100%B从0.1到0.5，然后多至1.5分钟的等度100%B，流动0.8毫升/分钟;柱Acquity UPLC BEH C18 1.7 microm 2.1x50mm,注射体积5微升，T柱中50°C。ESI正,MRM,萃取锥孔电压5V;毛细管电压3.5kV;源温度115°C;脱溶剂气温度450°C.SC12:MH+921.5>385.05/439.29CV35 CE33 LLOQ:5ng/ml。

数据分析：非隔室分析WinNonlin 5.1；线性梯形，均匀重量。

结果

治疗中没有注意到不良行为影响。

SC12显示有短MRT的541ng/ml血浆中的Cmax，其由高清除所反映（表29）。在第一时间点（5分钟）观察到一些动物间变异，这可能是由于第一部分衰退中的极迅速清除，而第二部分曲线中，血浆浓度缓慢下降，2小时后位于LLOQ（最低定量极限）下方。

原始数据和非隔室分析输出报告于表30。

表29：药物动力学参数

表30：原始数据和非隔室分析输出

实施例12：体外抑制人CYP450

SC12与细胞色素P450酶的相互作用使用荧光高通量P450试验（Gentest）测试；对同工酶（CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2C8、CYP2B6、CYP2D6、CYP2E1、CYP3A4和CYP3A5）计算所述化合物的IC50。

材料和方法

用特异性底物在特定试验中检测P450同种型的抑制，所述底物在CYP代谢后产生荧光。溶于ACN（乙腈）（CYP2E1、CYP2C8、CYP2B6、CYP3A5）或DMSO（所有剩余同种型）的化合物一式两份（n=2）以浓度-反应曲线（8个浓度）在96孔板中测试，所述板含有孵育/NADPH再生缓冲液。添加特异性同工酶和底物并在37°C孵育。反应根据试验在不同时间终止，板在合适发射/激发波长于Fluoroskan Ascent上读数。就各同工酶的已知抑制剂一式两份运行的浓度-反应曲线在各试验中作为阳性对照测试。

数据分析

对于各化合物和标准，IC50（50%抑制时的浓度）用Grafit v.5.0.1测定。

结果

结果示于表31（化合物）和表32（标准）。

SC12显示对CYP2E1、CYP3A5和CYP3A4同种型的中等抑制以及对CYP2C9的弱抑制，而其未表现出抑制同种型活性。由于SC12显示低溶解度，特别是在ACN中，结果可能被低估。所有进行实验中的标准参考抑制剂显示预期效力。

表31：P450结果

缩写：

BFC：7-苄氧基-4-(三氟甲基)-香豆素

CEC：3-氰基-7-乙氧基香豆素

AMMC：3-[2(N,N-乙基-N-甲基氨基)乙基]-7-甲氧基-4-甲基香豆素

DBF：二苄基荧光素

DMSO：二甲亚砜

EFC：7-乙氧基-4-三氟甲基香豆素

MFC：7-甲氧基-4-三氟甲基香豆素

表32：标准抑制剂的P450结果

同种型	标准抑制剂	实验数据
					IC50(μM)
CYP1A2	呋拉茶碱	1.9±0.1
			CYP2C9	磺胺苯吡唑	0.27±0.01
CYP2C19	反苯环丙胺	5.0±0.2
			CYP2D6	奎尼丁	0.009±0.001
CYP3A4	酮康唑	0.012±0.001
			CYP3A5	酮康唑	0.12±0.10
CYP2E1	DDTC	0.85±0.01
			CYP2C8	槲皮素	3.5±0.4
CYP2B6	反苯环丙胺	6.9±1.2

实施例13研究化合物A在哺乳动物血浆中的代谢稳定性和分布，以及比较人血浆中化合物A与SC12稳定性

测试大鼠、兔子、小型猪和人血浆中多至5小时的化合物A稳定性，评价兔子和人血浆中的代谢分布。化合物A在兔子和人中由酯酶/酰胺酶高度代谢，在小型猪和大鼠种中程度较低。研究大鼠中30和120分钟以及人中60和300分钟的代谢，即以2个物种中大致相同的亲体剩余百分数运行。在兔子中发现3种代谢物且其中2种在人中发现。

兔子中，主要代谢物是单酯（失去一个油酸,M2）和酸性代谢物（酰胺水解,M3），而仅观察到二水解代谢物（失去两个油酸,M1）的踪迹。人血浆中，只有先前兔中检测到的前两种主要代谢物在选定时间点鉴定且酸性产物（M3）是120分钟处的主要代谢物。

总之，人和兔子种中发现相当的清除概况和代谢概况，仅形成2个主要代谢物，其中限速步骤是导致单酯形成（M2）的水解，所述代谢物迅速转变成酸性衍生物（M3）。

用第二批化合物A相较SC12在人血浆中进行的第二实验表明SC12比化合物A稍微更稳定，因为其不代谢多至120分钟，超过70%化合物在300分钟时仍存在（300分钟时不改变的化合物A：55%）。

实施例14：SC12对皮肤癌细胞系的直接促凋亡作用：与咪喹莫特比较

除了其免疫调节作用，据报道咪喹莫特直接诱导肿瘤细胞凋亡，这在不同来源肿瘤中体内确认。咪喹莫特的促凋亡活性可引起咪喹莫特的体内抗肿瘤作用，因为所需浓度仍比艾特乐5%乳膏中的浓度低约3个对数。

实验方法和结果

细胞系：

皮肤鳞状细胞癌（SCC）细胞系（人）SCL-I、SCL-II、SCC-12、SCC-13就其生长性能和对死亡配体（CD95L、TRAIL、TNF-α）以及其他处理的凋亡敏感性进行良好鉴定。SCC细胞在标准条件（10% FBS）下生长。

测定SC12对SCC细胞的直接促凋亡和细胞毒性效果：

通过实时细胞分析研究对总细胞数目作用的时间和剂量依赖性，所述分析基于连续监控微量滴定板孔（E板，罗氏公司）中的电导，其对应于细胞数目。使用不同浓度的SC12以及咪喹莫特（Imq）治疗4个细胞系且细胞数目与未处理对照细胞作比较（2个独立实验用于各细胞系，三重值，不同浓度）。对于这些试验，应采用4个细胞系以获得对SCC细胞效果的代表性概览。因此，细胞用不同浓度的SC12或咪喹莫特处理；生长和凋亡效果通过显微镜监控至少7天。

图17显示用SC12和咪喹莫特的细胞数目减少。连续监控微量滴定孔（E板，罗氏公司）中皮肤SCC细胞系的电导，其对应于细胞数目。TMX指示图表中的SC12。图18提供的图显示SC12和咪喹莫特诱导的类似形态变化。第3天时，可在SC12或咪喹莫特处理的SCC细胞中观察到细胞脱落、形态变化和增殖抑制。处理时间为3天，浓度：120μM。

实施例15：化合物A和SC12作为佐剂

用添加化合物A和SC12佐剂的蛋白抗原进行初步免疫研究。用大肠杆菌（E.coli）中表达的2种重组蛋白进行免疫实验。一种抗原获自疟疾寄生虫镰状疟原虫（Plasmodium falciparum）且另一种来自引起皮肤溃疡病布路里溃疡的溃疡分枝杆菌（Mycobacterium ulcerans）。

5只小鼠的组以3周间隔接受3次皮下免疫，用混合有10nMol化合物A或SC12的20微克靶标抗原。

第三次免疫后，所有20只免疫接种小鼠发展出针对各靶标抗原的IgG反应。化合物A和SC12的性能相当。没有观察到局部副作用，如肿胀或溃疡。有批准用于小鼠的商业佐剂的平行免疫产生较高抗体效价；但此处观察到局部反应。

图19显示针对溃疡分枝杆菌抗原的IgG效价的发展（左：化合物A，右：SC12）。

实施例16：研究膀胱内慢性治疗后小鼠血清中的咪喹莫特和SC12接触

材料和方法

雌性6-8周龄C57BL/6小鼠用咪喹莫特（0.1w/v%，共208nmol）或SC12（0.38w/v%，共206.5nmol）膀胱内治疗。在以下时间点取血清样品：第0天,2小时，第1天,24小时和第6天,2小时。

样品制备

咪喹莫特：Sirocco滤板（沃特世）中，50微升小鼠血清与195微升乙腈/甲醇1:1，掺有5微升IS（咪喹莫特-D9100微克/毫升）。所述板振荡10分钟并真空过滤（5-10mm Hg）。

SC12：Sirocco滤板（沃特世）中，70微升小鼠血清加入210微升乙腈/甲醇1:1，掺有5微升IS（咪喹莫特-D9 100ng/ml）。所述板振荡10分钟并真空过滤（5-10mm Hg）。样品蒸发并重悬于70微升乙腈/甲醇1:1。

分析方法

咪喹莫特：LC/MS/MS：Premiere XE,洗脱剂:(ACN/H2O 95/5(A)+0.1%HCOOH,5/95(B))从98%A以0.60毫升/分钟流动0-0.20分钟，用0.6分钟梯度到100%B，然后停留于100%直到1.1分钟，用0.4分钟恢复。

柱：Acquity BEH C1850x2.1mm 1.7微米；注射体积5微升，柱温50°C。

SC 12：LC/MS/MS:Premiere XE,洗脱剂:(MeOH/H2O 95/5(A)+0.1% HCOOH,5/95(B))从85%A以0.80毫升/分钟流动0-0.10分钟，用0.4分钟梯度到100%B，然后停留于100%直到1.5分钟，用0.7分钟恢复。

柱：Acquity BEH C850x2.1mm 1.7微米，注射体积10微升，柱温50°C。

SC12 Q1/Q3 921.5/385.05;CV35,CE33

921.5/439.29;CV35,CE33

咪喹莫特Q1/Q3 241.1/113.98;CV30,CE45

241.1/140.9;CV30,CE40

IS:咪喹莫特-D9 Q1/Q3 250.1/113.98;CV30,CE45

ESI正,MRM,萃取锥孔电压5V;毛细管电压3.5kV;源温度140°C;脱溶剂气温度450°C 3.5kV;

LLOQ:0.5ng/ml SC12和2.5ng/ml用于咪喹莫特

结果

本研究目的是评价膀胱内慢性给予咪喹莫特和SC12后的血清暴露。SC12和咪喹莫特的血清水平分别报告于表33和表34。就2种化合物都观察到低浓度，特别是SC12，即使就SC12获得的LLOQ比就咪喹莫特获得的LLOQ低5倍（0.5相比2.5ng/ml），其中仍有大部分样品低于LLOQ。咪喹莫特在给予后多至2小时存在于血清中，但没有累积，导致24小时时低于LLOQ以及治疗6天后的值与第1天相当。

表33：血清中的SC12水平

结果表示为均值±S.D.，n=2

表34：血清中的咪喹莫特水平

结果表示为均值±S.D.,n=2

缩写列表

乙腈 ACN

碰撞能量 CE

锥孔电压 CV

二甲亚砜 DMSO

电喷雾电离 ESI

内标 IS

液相色谱/质谱 LC-MS/MS

定量下限 LLOQ

甲醇 MeOH

多反应监控 MRM

超高效液相色谱 UPLC

实施例17：RAW.264细胞的胞内摄入

细胞试验中，SC12迅速达到高胞内浓度。5x10⁶RAW.264细胞在10cm组织培养皿中过夜贴壁生长。所述培养基用含10μM化合物A和SC12的10ml新培养基更换。细胞孵育1、6和18小时。上清（2ml）和细胞（团）通过胰蛋白酶化收集并20°C冷冻以用于后续LC-MS分析。表35显示此分析结果。

表35胞内摄入试验的结果

本文参考的各专利、专利申请、发表物和文献通过引用全文纳入本文。引用上述专利、专利申请、发表物和文献不承认任何上述内容是相关现有技术，也不作为承认这些发表物或文献的内容或日期。

可对上述内容进行修改而不偏离所述技术基本方面。尽管所述技术已参考一个或多个特定实施方式来详细描述，本领域普通技术人员应认识到可对本申请特定公开的实施方式作出改变，这些修改和改良在所述技术范围和精神内。

本文适当说明性描述的技术可在没有本文特定公开的任何元件情况下实施。因此，例如，在本文各情况中，术语“包括”、“基本由…组成”和“由…组成”中的任何一种可由另2个术语中任一种取代。所用术语和表达用于描述而不是限制，使用所述术语和表达不排除所显示和描述特征或其部分的任何等价物，在要求权利的技术范围内可能有多种修改。术语“一个”或“一种”可指一个或多个其修饰的元件（例如，“一个试剂”可表示一种或多种试剂），除非上下文明确描述任一种元件或一种以上元件。本文所用的术语“约”指基本参数10%以内的值（即加或减10%），在一串值开始处使用术语“约”修饰各个值（即，“约1、2和3”指约1、约2和约3）。例如，重量“约100克”可包括90克-110克的重量。此外，本文描述值列表时（例如约50%,60%,70%,80%,85%或86%），所述列表包括所有中间值和其分数值（例如54%,85.4%）。因此，应理解尽管本技术通过各实施方式和可选特征来特定公开，本文所公开概念的修改和变化可由本领域技术人员采用，所述修改和变化认为在本技术范围内。

所述技术的某些实施方式列于所附权利要求中。

Claims

1.一种组合物，所述组合物包含具有式A或式B所示结构的化合物：

或其药学上可接受盐、互变异构体或水合物，其中：

X¹是-O-、-S-、或–NRa-；

R^a是氢、C1-C10烷基、或取代的C1-C10烷基，或Ra和R1可与氮原子一起形成杂环或取代的杂环，其中烷基或杂环基团上的取代基是羟基、C1-C10烷基、羟基C1-C10烯基、C1-C6烷氧基、C3-C6环烷基、C1-C6烷氧基C1-C6亚烷基、氨基、氰基、卤素或芳基；

X²是键或连接基团；n是0、1、2、3或4；和

X³是键或–PO₄-；

各R^d和R^e独立地是线性及饱和C6-C30烷基。

2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述R^d和R^e独立地是线性及饱和C6-C30烷基。

3.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述R^d和R^e独立地是线性和饱和C8-C18烷基。

4.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述R^d和R^e独立地是线性和饱和C8、C12或C18烷基。

5.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述R^d和R^e相同。

6.如权利要求1-5中任一项所述的组合物，其特征在于，所述–X²-X³-R³一起形成式C所示结构：

7.如权利要求1-5中任一项所述的组合物，其特征在于，所述–X²-X³-R³一起形成式D所示结构：

8.如权利要求1-7中任一项所述的组合物，其特征在于，所述X¹是O。

9.如权利要求1-8中任一项所述的组合物，其特征在于，所述R¹是取代有C1-6烷氧基的C1-C10烷基。

10.如权利要求1-9中任一项所述的组合物，其特征在于，所述n是0且X²是–C(O)NH-(CH₂)₂-。

11.如权利要求1-10中任一项所述的组合物，其特征在于，所述R³是取代有–OC(O)-R^d和–OC(O)-R^e的C3烷基。

12.如权利要求11所述的组合物，其特征在于，所述R³C3烷基在C3烷基的位置3处取代有–OC(O)-R^d且位置2处取代有–OC(O)-R^e。

13.如权利要求1-12中任一项所述的组合物，其特征在于，所述R^d和R^e是饱和及线性C12烷基。

14.如权利要求1-4和6-13中任一项所述的组合物，其特征在于，所述X¹是O，R¹是–(CH₂)₂-OCH₃，n是0，X²是–C(O)NH-(CH₂)₂-，X³是磷酸盐，R³是取代有–OC(O)-R^d和–OC(O)-R^e的C3烷基，且R^d和R^e是线性及饱和C12烷基。

15.如权利要求1-14中任一项所述的组合物，其特征在于，所述R^d和R^e不由环氧基部分取代。

16.如权利要求1-15中任一项所述的组合物，其特征在于，所述R^d和R^e不由羟基部分取代。

17.如权利要求1-16中任一项所述的组合物，其特征在于，所述R^d和R^e不由环氧基部分或羟基部分取代。

18.如权利要求1-17中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物包括脂质体。

19.如权利要求1-17中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物包括抗原。

20.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述化合物是SC12。

21.一种免疫刺激组合物，所述组合物包含如权利要求1-19中任一项所述具有式A或式B所示结构的化合物。

22.如权利要求21所述的组合物，其特征在于，所述化合物用作佐剂。

23.如权利要求21或22所述的组合物，其特征在于，所述组合物包括抗原。

24.如权利要求21-23中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物包括疫苗。

25.一种治疗对象病症的方法，所述方法包括以治疗病症的有效量将权利要求1-24中任一项所述组合物给予需要的对象。

26.一种治疗对象病症的方法，所述方法包括以治疗病症的有效量将权利要求21或24所述组合物给予需要的对象。

27.如权利要求25或26所述的方法，其特征在于，所述对象是哺乳动物。

28.如权利要求25-27中任一项所述的方法，其特征在于，所述对象是人。

29.如权利要求25-28中任一项所述的方法，其特征在于，所述病症是癌症。

30.如权利要求25-29中任一项所述的方法，其特征在于，所述病症是膀胱癌病症。

31.如权利要求30所述的方法，其特征在于，所述组合物通过膀胱内灌注来给予。

32.如权利要求30所述的方法，其特征在于，所述组合物通过局部递送膀胱来给予。

33.如权利要求25-28中任一项所述的方法，其特征在于，所述病症是微生物感染。

34.如权利要求25-29中任一项所述的方法，其特征在于，所述病症是皮肤癌前病症或癌病症。

35.一种诱导对象免疫应答的方法，所述方法包括将权利要求1-24中任一项所述的组合物给予对象。

35.如权利要求35所述的方法，其特征在于，所述免疫应答是抗体反应。

36.如权利要求36所述的方法，其特征在于，所述抗体反应是IgG1或IgG2a抗体反应。

37.如权利要求25-36中任一项所述的方法，其特征在于，所述抗原是微生物抗原。