CN103214595A - 硫酸软骨素钠的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了硫酸软骨素钠的制备方法。本发明所提供的硫酸软骨素钠的制备方法,包括以下步骤:(1)酶解;(2)树脂吸附;(3)洗脱;(4)脱色;(5)超滤;(6)沉淀;(7)脱水干燥。采用本发明的制备方法制备得到的硫酸软骨素钠,产品干物质收率提高了2%,硫酸软骨素钠含量提高了10%,从而提升了产品附加值,降低了生产成本,提高了经济效益。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,具体涉及硫酸软骨素钠的制备方法。
背景技术
硫酸软骨素钠是从动物的喉骨、鼻中骨、气管等软骨组织提取制得的硫酸化链状粘多糖钠盐。硫酸软骨素钠主要由N-乙酰半乳糖胺(2-乙酰胺-2脱氧-β-D-吡喃半乳糖)和D-葡萄糖醛酸的共聚物的硫酸酯钠盐,共聚物内己糖通过β-1,3及β-1,4糖苷键交替连接。
目前硫酸软骨素钠采用的是碱盐消化沉淀法,即软骨经碱化后,酶解、过滤后用酒精直接沉淀,按此方法生产硫酸软骨素钠含量低,重金属、含氮量、炽灼残渣超标,达不到《中国药典》2010年版标准及出口标准。
发明内容
为解决现有技术中硫酸软骨素钠含量低,重金属、含氮量、炽灼残渣超标的技术难题;从而达到《中国药典》2010年版标准及(USP)美国药典、(EP)欧州药典出口标准,本发明提供了一种硫酸软骨素钠的制备方法。
本发明所提供的硫酸软骨素钠的制备方法,包括以下步骤:
(1)酶解:向软骨原料中加入软骨重量1%~3.5%的食盐,用稀碱溶液调节pH值至8~11,加入软骨重量0.2~0.4%的碱性蛋白酶酶解1~3小时,再用盐酸调节pH值至7~8,升温至42~50℃,再加入软骨重0.4~0.6%的胰酶酶解2~5小时;酶解结束后用盐酸调节pH值至6~6.5,升温至80℃,静置冷却至50℃左右,过滤,得到滤液;
(2)树脂吸附:向所述步骤(1)得到的滤液中加入强碱性阴离子交换树脂,在搅拌状态下吸附1~5小时,后用纯化水漂洗树脂,得到漂洗后的吸附树脂;
(3)洗脱:将所述步骤(2)得到的漂洗后的吸附树脂用盐水进行洗脱,收集洗脱液;
(4)脱色:将所述步骤(3)得到的洗脱液用氢氧化钠调节pH值至8~10,升温至37~40℃,加双氧水静置氧化脱色,得到脱色后的溶液;
(5)超滤:将所述步骤(4)得到的脱色后的溶液进行超滤,得到超滤液;
(6)沉淀:将所述步骤(5)得到的超滤液用盐酸调节pH值至5.8~6.0,用质量百分比浓度为70%~75%的酒精沉淀3~6小时,得到硫酸软骨素钠沉淀;
(7)脱水干燥:将所述步骤(6)得到的硫酸软骨素钠沉淀用酒精脱水后离心,干燥,即得到硫酸软骨素钠。
在所述步骤(1)之前还包括将所述软骨原料进行预处理的步骤;所述预处理的方法为将所述软骨原料加水浸泡,升温至80℃,搅拌清洗直至将原料洗净。
所述步骤(1)中所述酶解温度为30~40℃,所述盐酸浓度为盐酸与水体积比是1:1。
所述步骤(2)中所述强碱性阴离子交换树脂的加入量为软骨原料质量的80%。
所述步骤(3)中所述盐水的质量百分比浓度为10%-15%;所述洗脱为两次洗脱,第一次洗脱中所述盐水与所述吸附树脂的质量比为1.5:1,洗脱时间为2-3小时;第二次洗脱中所述盐水与所述吸附树脂的质量比为1:1,洗脱时间为1-2小时。
所述步骤(4)中所述双氧水为所述洗脱液重量的0.2%-0.8%,所述脱色的时间为2小时。
所述步骤(7)中所述用酒精脱水之前还包括将所述硫酸软骨素钠沉淀用质量百分比浓度为80~85%的酒精浸泡的步骤。
所述步骤(7)中所述用干燥是采用真空干燥,温度50~70℃,压力550~750mm汞柱,干燥8~10小时。
采用本发明的制备方法制备得到的硫酸软骨素钠,产品干物质收率提高了2%,硫酸软骨素钠含量提高了10%,从而提升了产品附加值,降低了生产成本,提高了经济效益。
附图说明
图1为硫酸软骨素钠的制备工艺流程图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细描述。
实施例1、制备硫酸软骨素钠
一、按照以下步骤制备硫酸软骨素钠:
(1)原料预处理:将猪、牛喉骨、鼻中骨、气管等软骨组织投入洗料罐子中,加水浸泡,至全部淹没,升温至80℃左右,反复搅拌清洗,去掉肉渣、浮油、杂质,直至原料洗净。
将洗净的原料投入到消化罐中,加入纯化水至软骨完全淹没后加热煮料,待煮沸后,应关小蒸汽,微开焖油2小时。待原料煮好后,打尽浮油。
(2)酶解:将煮好的原料降温至30℃,加入软骨重量1%的食盐,用稀碱溶液(40%的NaOH水溶液:100毫升水加40克氢氧化钠)调节pH值至8,加入软骨重量0.3%的碱性蛋白酶(购自石家庄兴达酶制剂有限公司)酶解1小时,再用1:1盐酸(盐酸与水体积比)调节pH值至7,升温至42℃,再加入软骨重0.4%的胰酶(重庆奥力生物制药有限公司生产)酶解2小时。酶解结束后用盐酸调节pH值至6,升温至80℃,静置冷却至50℃左右,用V型槽硅藻土作助滤剂过滤,得滤液。
(3)树脂吸附:将上述酶解后的滤液抽入已清洗干净的树脂罐中,加入纯化水调比重至1.03,温度控制在30℃,按软骨重量50%添加SPNⅣ大孔强碱性阴离子交换树脂,在搅拌状态下吸附1小时。再将第一次吸附后的料液抽入另一树脂罐中,用纯化水调比重至1.01,加入软骨重30%的树脂进行第二次吸附,时间为2小时。完成后,应放掉料液,合并两次树脂,用纯化水漂洗树脂两次,得到漂洗后的吸附树脂。
(4)洗脱:将漂洗后的吸附树脂再用浓度为10%的盐水按树脂重量1.5倍量进行第一次洗脱,时间为2小时,收集洗脱液。第一次洗脱放掉盐水后,再用10%的盐水按树脂重量等量进行第二次洗脱,时间为1小时。收集洗脱液,合并两次洗脱液。
洗脱后的树脂用纯化水动态漂洗3次,再用纯化水浸泡备用。
(5)脱色:将洗脱液泵入脱色罐中,用氢氧化钠调节pH值至8,升温至37℃,加双氧水0.2%,静置氧化脱色2小时左右,得到脱色后的溶液。
(6)超滤:将上述脱色后的溶液超滤,超滤膜孔径为10000道尔顿,得到超滤液。
(7)沉淀:将超滤液用盐酸调节pH值至5.8,加纯酒精沉淀至浓度为70%左右,沉淀时间为3小时,得到硫酸软骨素钠沉淀。
(8)脱水干燥:将硫酸软骨素钠沉淀用80%的酒精(质量百分比浓度)浸泡2次,每次2小时以上洗盐,再用95%的酒精(质量百分比浓度)脱水2次,再离心。将离心后的硫酸软骨素钠置于双锥回转真空干燥机中干燥10小时,真空泵压力为550~750mm汞柱,温度为50℃。
(9)粉碎过筛:将干燥完毕的硫酸软骨素钠粉碎,过80目筛,即得硫酸软骨素钠原粉。
(10)包装:将硫酸软骨素钠原粉即时包装,密封,遮光,于干燥处保存。
二、测定制备的硫酸软骨素钠的质量指标
1、各指标的测定方法:
(1)收率:收到的干物质与投料量之百分比,即收率=(硫酸软骨素钠粉重量/原料重量)×100%。
(2)比旋度:取本品,精密称定,用水溶解并定量稀释制成每1ml中约含40mg的溶液。依法测定(《中国药典》2010年版二部附录ⅥE),比旋度应-25°至-32°。
(3)含氮量:取本品,照氮测定法(《中国药典》2010年版二部附录ⅦD第二法)测定,按干燥品计算,含氮量应为2.5%~3.5%。
(4)酸度:取本品0.5g,用水10ml溶解后,依法测定(《中国药典》2010年版二部附录ⅥH),pH值应为6.0~7.0。
(5)氯化物:取本品0.01g,依法检查(《中国药典》2010年版二部附录ⅧA),与标准氯化钠溶液5ml制成的对照液比较,不得更浓(0.5%)。
(6)硫酸盐:取本品0.1g,依法检查(《中国药典》2010年版二部附录ⅧB),与标准硫酸钾溶液2.4ml制成的对照液比较,不得更浓(0.24%)。
(7)干燥失重:取本品,在105℃干燥4小时,减失重量不得过10.0%(《中国药典》2010年版二部附录ⅧL)。
(8)炽灼残渣:取本品1.0g,依法检查(《中国药典》2010年版二部附录ⅧN),按干燥品计算,遗留残渣应为20.0%~30.0%。
(9)重金属:取炽灼残渣项下遗留的残渣,依法检查(《中国药典》2010年版二部附录ⅧH第二法),含重金属不得过百万分之二十。
(10)硫酸软骨素钠含量:取本品0.1g,精密称定,置10ml的量瓶中,加水溶解并稀释至刻度,摇匀,0.45μm的滤膜滤过,精密量取100μl,置具塞试管中,加三羟甲基氨基甲烷缓冲液(取三羟甲基氨基甲烷6.06g与三水乙酸钠8.17g,加水900ml溶解,用稀盐酸调节pH值至8.0,用水稀释至1000ml)800μl,充分混匀,再加入硫酸软骨素钠ABC酶液(取硫酸软骨素钠ABC酶适量,按标示单位用上述缓冲液稀释成每100μl含0.1单位的溶液)100μl,摇匀,置于37℃水浴中反应1小时,取出,在100℃加热5分钟,用冷水冷却。以每分钟10000转离心20分钟,取上清液,0.45μm的滤膜滤过,作为供试品溶液。精密量取20μl注入液相色谱仪,记录色谱图。另取硫酸软骨素钠对照品适量,精密称定,同法测定,按外标法以硫酸软骨素A、硫酸软骨素B和硫酸软骨素C的峰面积之和计算,即得。
2、测定结果:
收率为10.2%。
质量指标:
①比旋度:-27.5°
②含氮量:2.8%
③酸度:6.6
④氯化物:<0.5%
⑤硫酸盐:<0.24%
⑥干燥失重:8.3%
⑦炽灼残渣:23.8%
⑧重金属:<20ppm
⑨硫酸软骨素钠含量:94.6%
实施例2、制备硫酸软骨素钠
一、按照以下步骤制备硫酸软骨素钠:
(1)原料预处理:将猪、牛喉骨、鼻中骨、气管等软骨组织投入洗料罐子中,加水浸泡,至全部淹没,升温至80℃左右,反复搅拌清洗,去掉肉渣、浮油、杂质,直至原料洗净。
将洗净的原料投入到消化罐中,加入纯化水至软骨完全淹没后加热煮料,待煮沸后,应关小蒸汽,微开焖油3小时。待原料煮好后,打尽浮油。
(2)酶解:将煮好的原料降温至40℃,加入软骨重量3.5%的食盐,用稀碱溶液(40%的NaOH水溶液:100毫升水加40克氢氧化钠)调节pH值至11,加入软骨重量0.4%的碱性蛋白酶(购自石家庄兴达酶制剂有限公司)酶解3小时,再用1:1盐酸(盐酸与水体积比)调节pH值至8,升温至50℃,再加入软骨重0.6%的胰酶(重庆奥力生物制药有限公司生产)酶解5小时。酶解结束后用盐酸调节pH值至6.5,升温至80℃,静置冷却至50℃左右,用V型槽硅藻土作助滤剂过滤,得滤液。
(3)树脂吸附:将上述酶解后的滤液抽入已清洗干净的树脂罐中,加入纯化水调比重至1.03,温度控制在40℃,按软骨重量40%添加SPNⅣ大孔强碱性阴离子交换树脂,在搅拌状态下吸附2小时。再将第一次吸附后的料液抽入另一树脂罐中,用纯化水调比重至1.01,加入软骨重量40%的树脂进行第二次吸附,时间为3小时。完成后,应放掉料液,合并两次树脂,用纯化水漂洗树脂两次,得到漂洗后的吸附树脂。
(4)洗脱:将漂洗后的吸附树脂再用浓度为15%的盐水按树脂重量1.5倍量进行第一次洗脱,时间为3小时,收集洗脱液。第一次洗脱放掉盐水后,再用15%的盐水按树脂重量等量进行第二次洗脱,时间为2小时。收集洗脱液,合并两次洗脱液。
洗脱后的树脂用纯化水动态漂洗3次,再用纯化水浸泡备用。
(5)脱色:将洗脱液泵入脱色罐中,用氢氧化钠调节pH值至10,升温至40℃,加双氧水0.8%,静置氧化脱色2小时左右,得到脱色后的溶液。
(6)超滤:将上述脱色后的溶液超滤,超滤膜孔径为10000道尔顿,得到超滤液。
(7)沉淀:将超滤液用盐酸调节pH值至6.0,加纯酒精沉淀至浓度为70%左右,沉淀时间为6小时,得到硫酸软骨素钠沉淀。
(8)脱水干燥:将硫酸软骨素钠沉淀用85%的酒精(质量百分比浓度)浸泡3次,每次2小时以上洗盐,再用95%的酒精(质量百分比浓度)脱水2次,再离心。将离心后的硫酸软骨素钠置于双锥回转真空干燥机中干燥8小时,真空泵压力为550~750mm汞柱,温度为70℃。
(9)粉碎过筛:将干燥完毕的硫酸软骨素钠粉碎,过80目筛,即得硫酸软骨素钠原粉。
(10)包装:将硫酸软骨素钠原粉即时包装,密封,遮光,于干燥处保存。
二、测定制备的硫酸软骨素钠的质量指标
1、各指标的测定方法:
测定指标分别为:(1)收率、(2)比旋度、(3)含氮量、(4)酸度、(5)氯化物、(6)硫酸盐、(7)干燥失重、(8)炽灼残渣、(9)重金属、(10)硫酸软骨素钠含量。
各指标的测定方法与实施例1中相同。
2、测定结果:
收率为9.8%
质量指标:
①比旋度:-27.1°
②含氮量:2.9%
③酸度:6.5
④氯化物:<0.5%
⑤硫酸盐:<0.24%
⑥干燥失重:8.2%
⑦炽灼残渣:25.3%
⑧重金属:<20ppm
⑨硫酸软骨素钠含量:95.2%。
实施例3、制备硫酸软骨素钠
一、按照以下步骤制备硫酸软骨素钠:
(1)原料预处理:将猪、牛喉骨、鼻中骨、气管等软骨组织投入洗料罐子中,加水浸泡,至全部淹没,升温至80℃左右,反复搅拌清洗,去掉肉渣、浮油、杂质,直至原料洗净。
将洗净的原料投入到消化罐中,加入纯化水至软骨完全淹没后加热煮料,待煮沸后,应关小蒸汽,微开焖油2.5小时。待原料煮好后,打尽浮油。
(2)酶解:将煮好的原料降温至35℃,加入软骨重量2%的食盐,用稀碱溶液(40%的NaOH水溶液:100毫升水加40克氢氧化钠)调节pH值至10,加入软骨重量0.2%的碱性蛋白酶(购自石家庄兴达酶制剂有限公司)酶解2小时,再用1:1盐酸(盐酸与水体积比)调节pH值至7,升温至45℃,再加入软骨重0.5%的胰酶(重庆奥力生物制药有限公司生产)酶解3小时。酶解结束后用盐酸调节pH值至6.3,升温至80℃,静置冷却至50℃左右,用V型槽硅藻土作助滤剂过滤,得滤液。
(3)树脂吸附:将上述酶解后的滤液抽入已清洗干净的树脂罐中,加入纯化水调比重至1.03,温度控制在35℃,按软骨重量45%添加SPNⅣ大孔强碱性阴离子交换树脂,在搅拌状态下吸附2小时。再将第一次吸附后的料液抽入另一树脂罐中,用纯化水调比重至1.01,加入软骨重量35%的树脂,进行第二次吸附,时间为2小时。完成后,应放掉料液,合并两次树脂,用纯化水漂洗树脂两次,得到漂洗后的吸附树脂。
(4)洗脱:将漂洗后的吸附树脂再用浓度为12%的盐水按树脂重量1.5倍量进行第一次洗脱,时间为2小时,收集洗脱液。第一次洗脱放掉盐水后,再用10%~15%的盐水按树脂重量等量进行第二次洗脱,时间为1.5小时。收集洗脱液,合并两次洗脱液。
洗脱后的树脂用纯化水动态漂洗3次,再用纯化水浸泡备用。
(5)脱色:将洗脱液泵入脱色罐中,用氢氧化钠调节pH值至9,升温至38℃,加双氧水0.5%,静置氧化脱色2小时左右,得到脱色后的溶液。
(6)超滤:将上述脱色后的溶液超滤,超滤膜孔径为10000道尔顿,得到超滤液。
(7)沉淀:将超滤液用盐酸调节pH值至5.9,加纯酒精沉淀至浓度为70%左右,沉淀时间为5小时,得到硫酸软骨素钠沉淀。
(8)脱水干燥:将硫酸软骨素钠沉淀用83%的酒精(质量百分比浓度)浸泡2次,每次2小时以上洗盐,再用95%的酒精(质量百分比浓度)脱水2次,再离心。将离心后的硫酸软骨素钠置于双锥回转真空干燥机中干燥9小时,真空泵压力为550~750mm汞柱,温度为60℃。
(9)粉碎过筛:将干燥完毕的硫酸软骨素钠粉碎,过80目筛,即得硫酸软骨素钠原粉。
(10)包装:将硫酸软骨素钠原粉即时包装,密封,遮光,于干燥处保存。
二、测定制备的硫酸软骨素钠的质量指标
1、各指标的测定方法:
测定指标分别为:(1)收率、(2)比旋度、(3)含氮量、(4)酸度、(5)氯化物、(6)硫酸盐、(7)干燥失重、(8)炽灼残渣、(9)重金属、(10)硫酸软骨素钠含量。
各指标的测定方法与实施例1中相同。
2、测定结果:
收率为10.4%
质量指标:
①比旋度:-27.8°~-32°
②含氮量:3.0%
③酸度:6.4
④氯化物:<0.5%
⑤硫酸盐:<0.24%
⑥干燥失重:8.0%
⑦炽灼残渣:26.2%
⑧重金属:<20ppm
⑨硫酸软骨素钠含量:94.5%。
Claims (8)
1.硫酸软骨素钠的制备方法,包括以下步骤:
(1)酶解:向软骨原料中加入软骨重量1%~3.5%的食盐,用稀碱溶液调节pH值至8~11,加入软骨重量0.2~0.4%的碱性蛋白酶酶解1~3小时,再用盐酸调节pH值至7~8,升温至42~50℃,再加入软骨重0.4~0.6%的胰酶酶解2~5小时;酶解结束后用盐酸调节pH值至6~6.5,升温至80℃,静置冷却至50℃左右,过滤,得到滤液;
(2)树脂吸附:向所述步骤(1)得到的滤液中加入强碱性阴离子交换树脂,在搅拌状态下吸附,后用纯化水漂洗树脂,得到漂洗后的吸附树脂;
(3)洗脱:将所述步骤(2)得到的漂洗后的吸附树脂用盐水进行洗脱,收集洗脱液;
(4)脱色:将所述步骤(3)得到的洗脱液用氢氧化钠调节pH值至8~10,升温至37~40℃,加双氧水静置氧化脱色,得到脱色后的溶液;
(5)超滤:将所述步骤(4)得到的脱色后的溶液进行超滤,得到超滤液;
(6)沉淀:将所述步骤(5)得到的超滤液用盐酸调节pH值至5.8~6.0,用质量百分比浓度为70%~75%的酒精沉淀3~6小时,得到硫酸软骨素钠沉淀;
(7)脱水干燥:将所述步骤(6)得到的硫酸软骨素钠沉淀用酒精脱水后离心,干燥,即得到硫酸软骨素钠。
2.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于:在所述步骤(1)之前还包括将所述软骨原料进行预处理的步骤;所述预处理的方法为将所述软骨原料加水浸泡,升温至80℃,搅拌清洗直至将原料洗净。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法,其特征在于:所述步骤(1)中所述酶解温度为30~40℃,所述盐酸浓度为盐酸与水体积比是1:1。
4.根据权利要求3所述的制备方法,其特征在于:所述步骤(2)中所述强碱性阴离子交换树脂的加入量为软骨原料质量的40%-50%,吸附2~5小时。
5.根据权利要求4所述的制备方法,其特征在于:所述步骤(3)中所述盐水的质量百分比浓度为10%-15%;所述洗脱为两次洗脱,第一次洗脱中所述盐水与所述吸附树脂的质量比为1.5:1,洗脱时间为2-3小时;第二次洗脱中所述盐水与所述吸附树脂的质量比为1:1,洗脱时间为1-2小时。
6.根据权利要求5所述的制备方法,其特征在于:所述步骤(4)中所述双氧水为所述洗脱液重量的0.2%-0.8%,所述脱色的时间为2小时。
7.根据权利要求6所述的制备方法,其特征在于:所述步骤(7)中所述用酒精脱水之前还包括将所述硫酸软骨素钠沉淀用质量百分比浓度为80~85%的酒精浸泡的步骤。
8.根据权利要求7所述的制备方法,其特征在于:所述步骤(7)中所述干燥是采用真空干燥,温度50~70℃,压力550~750mm汞柱,干燥8~10小时。
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