CN101633947B - 一种制备葵花籽粕蛋白水解肽的新方法及用途 - Google Patents

Abstract

一种制备葵花籽粕蛋白水解肽的新方法及用途，涉及生物工程领域。按照下述步骤进行：采用碱溶酸沉法(以HCl溶液和Ca(OH)₂溶液调节pH值)制备得到葵花籽粕蛋白，将葵花籽粕蛋白以一定的浓度溶于水，再用HCl溶液和Ca(OH)₂溶液调节pH值到蛋白酶最适作用值，加入一定量蛋白酶在其最适作用条件下酶解适当时间，酶解结束后升温到90℃灭酶，再用Ca(OH)₂溶液调节pH值到中性，通过过滤、浓缩和喷雾干燥得到葵花籽粕蛋白水解肽产品。本发明采用Ca(OH)₂溶液代替常用的NaOH溶液，避免加入对高血压患者有害的Na⁺，使制备过程不需要脱盐，保留了大部分活性成分，简化了工艺、降低了成本。利用该方法制得的葵花籽粕蛋白水解肽可以用于制备抑制体内血管紧张素转换酶活性的药物或者保健食品。

Description

一种制备葵花籽粕蛋白水解肽的新方法及用途

技术领域：

本发明涉及生物工程领域，具体涉及保健食品生产和生物制药技术，特指以葵花籽粕蛋白为原料，利用酶解技术制备水解多肽的制备方法及用途。

技术背景：

葵花籽油是是继棕榈油、大豆油和菜籽油之后的第四大食用油，葵花籽粕是葵花籽制油时的副产物，其中含有29％-43％的优质蛋白质。但目前葵花籽粕一般仅用作饲料，没有对其中的蛋白质作深加工利用。

现代医学研究证明，血管紧张素转换酶(Angiotensin I-converting enzyme，ACE)在体内血压调节过程起重要作用。它使血管紧张素I转化为有升压作用的血管紧张素II并使有降压作用的舒缓激肽分解，从而使血压升高。近年来人们从食品蛋白质开发出一类血管紧张素转换酶抑制肽(ACE抑制肽)，给高血压患者服用后可以抑制体内ACE的活性，达到降血压的目的。

在制备ACE抑制肽时，由于食品蛋白质在酶解为多肽的过程中产生大量的氢离子，但是要保证酶的活性必须保持反应体系中的pH值相对稳定，因此需要不断加入盐酸溶液或氢氧化钠溶液来维持体系的pH值恒定；如果酶解是在碱性或酸性的条件进行的，在酶解结束后还需要加入大量的氢氧化钠溶液调节酶解液到中性。因此，在酶解后得到ACE抑制肽的粗提物中存在一定量的钠盐成分(主要为氯化钠，一般含10％w/w左右)。高血压与年龄、食盐的摄取、体重、遗传、性别、职业等多种因素有关。目前认为发生高血压的外在条件是高钠盐的摄取，内在因素是肾脏功能的损伤。还有研究发现对食盐的摄取是动脉血压随年龄而升高的条件。为此，一般高血压患者都需要防止钠盐的过量摄入。所以作为给高血压患者服用的ACE抑制肽，在制备过程中必须进行脱盐处理。ACE抑制肽常用的脱盐方法有活性碳吸附法、β-环糊精包埋法、大孔树脂吸附法和膜分离法等，不过处理起来都不仅很耗时，还大大增加了成本，而且活性多肽成分的损耗也很大。

国内外关于从葵花粕中制备多肽仅有白羽等在《食品与机械》杂志报道过，但该论文主要研究了酶解参数的筛选，没有对多肽制备的脱盐、干燥等重要过程进行研究，而且对水解物也没有进行功能定位。关于制备低盐多肽的报道也很少，中国发明专利“低含盐量的多肽生产方法”(申请号200610150150.6)采用三种蛋白酶顺次水解牛羊鲜骨的方法，反应起始时用氢氧化钠调节pH到碱性，过程中不加碱液，使得水解物中盐含量较低；但这种方法仍然加入了一定量的钠盐，而且由于水解过程不控制pH值可能导致酶解反应效率下降。

发明内容：

本发明的目的克服现有多肽制备技术因脱盐而造成工艺耗时长、成本高、多肽成分损耗大等不足，提供一种使用Ca(OH)₂代替NaOH碱溶酸沉法提取蛋白及在葵花籽粕蛋白酶解过程调节pH值、酶解结束中和酶解液中的酸，从而不需脱盐就得到低钠盐葵花籽粕蛋白水解肽的方法。

本发明上述目的是通过以下技术手段实现的：采用碱溶酸沉法(以HCl溶液和Ca(OH)₂溶液调节pH值)制备得到葵花籽粕蛋白，再将葵花籽粕蛋白按一定比例溶解于水，再用HCl溶液和Ca(OH)₂溶液调节pH值到蛋白酶最适作用值，加入一定量蛋白酶在其最适作用条件下酶解适当时间，酶解结束后升温到90℃灭酶，再用Ca(OH)₂溶液调节pH值到中性，通过过滤、浓缩和喷雾干燥得到粉状的葵花籽粕蛋白水解肽产品。

上述方法中所说的碱溶酸沉法制备葵花籽粕蛋白的方法为：将葵花籽粕按料液比1∶8-1∶15(w/v)加入水，升温至40-60℃，搅拌均匀，加入1mol/L的Ca(OH)₂溶液调节溶液pH保持在8.0-9.5，搅拌提取蛋白1-3h，用布袋离心机离心过滤，用1mol/L的HCl溶液调节滤液pH值到4.2，静置过夜，离心，将沉淀物喷雾干燥得到葵花籽粕蛋白。

上述方法中所说的酶解底物葵花籽粕蛋白的浓度为2％-10％(w/v)。

上述方法中所说的酶解过程调节pH值的Ca(OH)₂溶液浓度为0.5mol/L-1mol/L。

上述方法中所说的酶解用蛋白酶为胰蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶或胃蛋白酶等常见的商品蛋白酶的一种或者其中两种及两种以上蛋白酶的组合。

蛋白酶的用量以质量计为底物蛋白质量的1/60-1/20(w/w)，酶解的温度37-60℃，pH为1.8-9.0，酶解反应时间为50-180min。

上述方法中所说的酶解反应时间为50min到180min。

上述方法中所说的对酶解液的灭酶过滤、浓缩和喷雾干燥方法，是将酶解液加热到90℃保持30s灭酶，再自然冷却到室温，用布袋式离心机过滤酶解液并把滤液真空浓缩到干物质浓度为30％(w/w)，再喷雾干燥得到葵花籽粕蛋白水解肽产品。

本发明所具有的优点是：

采用Ca(OH)₂溶液代替常用的NaOH溶液用于碱溶酸沉法提取蛋白、在蛋白酶解过程中调节pH值和酶解结束中和酶解液中的酸，避免加入对高血压患者有害的Na⁺，使制备过程不需要脱盐，既保留了绝大部分活性成分，又简化了工艺、降低了成本。

附图说明

图1是本发明制备葵花籽粕蛋白水解肽的工艺流程图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步阐述，但本发明不限于下述实施例，对于本领域一般技术人员而言，在不背离本发明原理的前提下对它所做的任何显而易见的改动，都属于本发明的构思和所附权利要求的保护范围。

实施例1

将葵花籽粕按料液比1∶8(w/v)加入水，升温至60℃，搅拌均匀，加入1mol/L的Ca(OH)₂溶液调节溶液pH保持在9.5，搅拌提取蛋白3h，用布袋式离心机离心过滤，用1mol/L的HCl溶液调节滤液pH值到4.2，静置过夜，离心，将沉淀物喷雾干燥得到葵花籽粕蛋白。

将40g葵花籽蛋白加入1000mL去离子水中混合均匀，形成4％(w/v)的蛋白溶液，升温到50℃，再用1mol/L的HCl溶液和0.5mol/L的Ca(OH)₂混悬液保持pH值8.0，先加入1g胰蛋白酶酶解50min，酶解结束后升温到90℃保持30s灭酶，再用1mol/L的HCl溶液和0.5mol/L的Ca(OH)₂溶液调节pH值到7.0，冷却到室温，取样测定水解度和水解液对ACE抑制率。水解度表明蛋白质在酶的作用下水解程度，其测定采用中性甲醛滴定法(参照吴谋成编著《食品分析与感官评定》.北京：中国农业出版社，2002，pp.333.)，水解液多肽对ACE的抑制率表示其抑制ACE活性能力的大小，抑制率越高，其活性越大，一般在体内降血压的能力也就越强。对ACE抑制率具体测定方法如下：先将5μL的ACE加入10μL已经用水稀释20倍的酶解液样品在37℃下恒温5min，然后加入50μL的6.5mmol/LHip-His-Leu(用100mmol/L的硼酸盐缓冲液配制，含300mmol/L的NaCl，pH为8.3)，在37℃下恒温反应30min后加入85μL的1mol/L HCl溶液终止反应。用HPLC进行分析，记录对应组分峰面积，同时用10μL 100mmol/L、pH为8.3的硼酸盐缓冲液作空白试验。

水解肽对ACE的抑制率可用下式计算：

$R=\frac{A-B}{A}\×100\%$

式中：R——水解液多肽对ACE的抑制率；

A——空白对照组Hip的峰面积；

B——多肽组Hip的峰面积。

酶解液用布袋式离心机过滤后真空浓缩，再采用喷雾干燥得到葵花籽粕蛋白水解肽产品。

同时按照上述工艺条件进行对照的酶解反应制备葵花籽粕蛋白水解肽固体产品，仅把调节pH用的0.5mol/L的Ca(OH)₂改为1mol/L的NaOH溶液。按照上述方法取样测定酶解液的水解度和ACE抑制率。

两种方法制备葵花籽粕蛋白水解肽的结果对比如表1所示。

表1Ca(OH)₂与NaOH分别调节pH制备葵花籽粕蛋白水解肽的比较

可见，采用Ca(OH)₂调节pH值的葵花籽蛋白酶解液水解度略低，酶解液ACE抑制率明显提高。因此，采用Ca(OH)₂取代NaOH调节pH进行葵花籽蛋白葵花籽粕蛋白水解肽的制备是可行的，而且免脱盐操作可以简化工艺、节约成本。

实施例2

将葵花籽粕按料液比1∶10(w/v)加入水，升温至50℃，搅拌均匀，加入1mol/L的Ca(OH)₂溶液调节溶液pH保持在9.0，搅拌提取蛋白2h，用布袋式离心机离心过滤，用1mol/L的HCl溶液调节滤液pH值到4.2，静置过夜，离心，将沉淀物喷雾干燥得到葵花籽粕蛋白。

将100g葵花籽蛋白加入1000mL去离子水中混合均匀，形成10％(w/v)的蛋白溶液，升温到50℃，再用1mol/L的HCl溶液和1mol/L的Ca(OH)₂混悬液保持pH值8.0，加入2.5g胰蛋白酶酶解60min，再用1mol/L的HCl溶液和1mol/L Ca(OH)₂混悬液调节pH到7.0，升温到60℃加入2.5g中性蛋白酶酶解120min。酶解结束后升温到90℃保持30s灭酶，再用1mol/L的HCl溶液和1mol/L的Ca(OH)₂溶液调节pH值到7.0，冷却到室温，取样按照实施例1中的方法测定水解度和水解液对ACE抑制率。酶解液用布袋式离心机过滤后真空浓缩，再采用喷雾干燥得到葵花籽粕蛋白水解肽产品。

同时按照上述工艺条件进行对照的酶解反应制备葵花籽粕蛋白水解肽固体产品，仅把调节pH用的1mol/L的Ca(OH)₂改为2mol/L的NaOH溶液。按照上述方法取样测定酶解液的水解度和ACE抑制率。

两种方法制备葵花籽粕蛋白水解肽的结果对比如表2所示。

表2Ca(OH)₂与NaOH分别调节pH制备葵花籽粕蛋白水解肽的比较

可见，采用Ca(OH)₂调节pH值的葵花籽蛋白酶解液水解度略低，酶解液的ACE抑制率较高。所以可以采用Ca(OH)₂取代NaOH调节pH进行葵花籽粕蛋白ACE抑制肽制备，而且采用Ca(OH)₂调节pH值可以免除脱盐操作，从而简化工艺、节约成本。

实施例3

将葵花籽粕按料液比1∶12(w/v)加入水，升温至40℃，搅拌均匀，加入1mol/L的Ca(OH)₂溶液调节溶液pH保持在8.5，搅拌提取蛋白1.5h，用布袋式离心机离心过滤，用1mol/L的HCl溶液调节滤液pH值到4.2，静置过夜，离心，将沉淀物喷雾干燥得到葵花籽粕蛋白。

将20g葵花籽粕蛋白加入1000mL去离子水中混合均匀，形成2％(w/v)的蛋白溶液，升温到50℃，再用1mol/L的HCl溶液和0.5mol/L的Ca(OH)₂混悬液调节pH值9.0，加入0.34g碱性蛋白酶酶解90min。酶解结束后升温到90℃保持30s灭酶，再用1mol/L的HCl溶液和0.5mol/L的Ca(OH)₂溶液调节pH值到7.0，冷却到室温，取样按照实施例1中的方法测定水解度和水解液对ACE抑制率。酶解液用布袋式离心机过滤后真空浓缩，再采用喷雾干燥得到葵花籽粕蛋白水解肽产品。

同时按照上述工艺条件进行对照的酶解反应制备葵花籽粕蛋白水解肽固体产品，仅把调节pH用的0.5mol/L Ca(OH)₂改为1mol/L的NaOH溶液。按照上述方法取样测定酶解液的水解度和ACE抑制率。

两种方法制备葵花籽粕蛋白水解肽的结果对比如表3所示。

表3Ca(OH)₂与NaOH分别调节pH制备葵花籽粕蛋白水解肽的比较

可见，两种碱液调节pH值的葵花籽粕蛋白酶解液水解度和ACE抑制率相似，采用Ca(OH)₂取代NaOH调节pH进行葵花籽粕蛋白水解肽的制备可行，而且不用产品脱盐，可简化工艺、节约成本。

实施例4

将葵花籽粕按料液比1∶15(w/v)加入水，升温至50℃，搅拌均匀，加入1mol/L的Ca(OH)₂溶液调节溶液pH保持在8.0，搅拌提取蛋白1h，用布袋式离心机离心过滤，用1mol/L的HCl溶液调节滤液pH值到4.2，静置过夜，离心，将沉淀物喷雾干燥得到葵花籽粕蛋白。

将50g葵花籽粕蛋白加入1000mL去离子水中混合均匀，形成5％(w/v)的蛋白溶液，升温到60℃，再用1mol/L的HCl溶液和0.75mol/L的Ca(OH)₂混悬液调节并保持pH值6.0，加入1g木瓜蛋白酶酶解120min。酶解结束后升温到90℃保持30s灭酶，冷却到室温，取样按照实施例1中的方法测定水解度和水解液对ACE抑制率。酶解液用布袋式离心机过滤后真空浓缩，再采用喷雾干燥得到葵花籽粕蛋白水解肽产品。

同时按照上述工艺条件进行对照的酶解反应制备葵花籽粕蛋白水解肽固体产品，仅把调节pH用的0.75mol/L Ca(OH)₂改为1.5mol/L的NaOH溶液。按照上述方法取样测定酶解液的水解度和ACE抑制率。

两种方法制备葵花籽粕蛋白水解肽的结果对比如表4所示。

表4Ca(OH)₂与NaOH分别调节pH制备葵花籽粕蛋白水解肽的比较

可见，两种碱液调节pH值的葵花籽粕蛋白酶解液水解度和ACE抑制率相似，采用Ca(OH)₂取代NaOH调节pH进行葵花籽粕蛋白ACE抑制肽的制备不仅可行，而且因不用脱盐，可简化工艺、节约成本。

实施例5

将葵花籽粕按料液比1∶10(w/v)加入水，升温至45℃，搅拌均匀，加入1mol/L的Ca(OH)₂溶液调节溶液pH保持在9.0，搅拌提取蛋白2h，用布袋式离心机离心过滤，用1mol/L的HCl溶液调节滤液pH值到4.2，静置过夜，离心，将沉淀物喷雾干燥得到葵花籽粕蛋白。

将30g葵花籽粕蛋白加入1000mL去离子水中混合均匀，形成3％(w/v)的蛋白溶液，升温到37℃，再用1mol/L的HCl溶液和0.5mol/L的Ca(OH)₂混悬液调节并保持pH值1.8，加入1g胃蛋白酶酶解120min。酶解结束后升温到90℃保持30s灭酶，再用1mol/L的HCl溶液和0.5mol/L的Ca(OH)₂溶液调节pH值到7.0，冷却到室温，取样按照实施例1中的方法测定水解度和水解液对ACE抑制率。酶解液用布袋式离心机过滤后真空浓缩，再采用喷雾干燥得到葵花籽粕蛋白水解肽产品。

同时按照上述工艺条件进行对照的酶解反应制备葵花籽粕蛋白水解肽固体产品，仅把调节pH用的0.5mol/L Ca(OH)₂改为1mol/L的NaOH溶液。按照上述方法取样测定酶解液的水解度和ACE抑制率。

两种方法制备葵花籽粕蛋白水解肽的结果对比如表5所示。

表5Ca(OH)₂与NaOH分别调节pH制备葵花籽粕蛋白水解肽的比较

可见，两种碱液调节pH值的葵花籽粕蛋白酶解液水解度和ACE抑制率相似，采用Ca(OH)₂取代NaOH调节pH进行葵花籽粕蛋白ACE抑制肽的制备不仅可行，而且因不用脱盐，可简化工艺、节约成本。

实施例6

将葵花籽粕按料液比1∶12(w/v)加入水，升温至50℃，搅拌均匀，加入1mol/L的Ca(OH)₂溶液调节溶液pH保持在8.5，搅拌提取蛋白1.5h，用布袋式离心机离心过滤，用1mol/L的HCl溶液调节滤液pH值到4.2，静置过夜，离心，将沉淀物喷雾干燥得到葵花籽粕蛋白。

将50g葵花籽粕蛋白加入1000mL去离子水中混合均匀，形成5％(w/v)的蛋白溶液，升温到50℃，再用1mol/L的HCl溶液和0.5mol/L的Ca(OH)₂混悬液调节并保持pH值9.0，加入1g碱性蛋白酶酶解60min，再调节到pH值8.0，加入0.5g胰蛋白酶酶解60min，再用1mol/L Ca(OH)₂混悬液调节pH到7.0，升温到60℃加入0.5g中性蛋白酶酶解60min。酶解结束后升温到90℃保持30s灭酶，再用1mol/L的HCl溶液和0.5mol/L的Ca(OH)₂溶液调节pH值到7.0，冷却到室温，取样按照实施例1中的方法测定水解度和水解液对ACE抑制率。酶解液用布袋式离心机过滤后真空浓缩，再采用喷雾干燥得到葵花籽粕蛋白水解肽产品。

同时按照上述工艺条件进行对照的酶解反应制备ACE抑制肽固体产品，仅把调节pH用的0.5mol/L Ca(OH)₂改为1mol/L的NaOH溶液。按照上述方法取样测定酶解液的水解度和ACE抑制率。

两种方法制备ACE抑制肽的结果对比如表6所示。

表6Ca(OH)₂与NaOH分别调节pH制备葵花籽粕蛋白水解肽的比较

由表6可见，两种碱液调节pH值的葵花籽粕蛋白酶解液水解度相近，采用Ca(OH)₂调节的ACE抑制率略高，采用Ca(OH)₂取代NaOH调节pH进行葵花籽粕蛋白ACE抑制肽的制备不仅可行，而且由于不用脱盐，可简化工艺、节约成本。

Claims (1)

1.一种制备葵花籽粕蛋白水解肽的新方法，其特征在于按照下述步骤进行：采用碱溶酸沉法制备得到葵花籽粕蛋白，将葵花籽粕蛋白以一定的浓度溶解于水，再用HCl溶液和Ca(OH)₂溶液调节pH值到蛋白酶最适作用值，加入一定量蛋白酶在其最适作用条件下酶解适当时间，酶解结束后升温到90℃灭酶，再用Ca(OH)₂溶液调节pH值到中性，再自然冷却到室温，用布袋式离心机过滤酶解液并把滤液真空浓缩到干物质浓度以质量计为30％，再喷雾干燥得到葵花籽粕蛋白水解肽产品；其中所述碱溶酸沉法制备得到葵花籽粕蛋白步骤如下：将葵花籽粕按料液比以质量与体积比计1∶8-1∶15、加入水，升温至40-60℃，搅拌均匀，加入1mol/L的Ca(OH)₂溶液调节溶液pH保持在8.0-9.5，搅拌提取蛋白1-3h，用布袋离心机离心过滤，用1mol/L的HCl溶液调节滤液pH值到4.2，静置过夜，离心，将沉淀物喷雾干燥得到葵花籽粕蛋白；

其中酶解底物葵花籽粕蛋白的浓度为以质量与体积比计2％-10％；

其中酶解用酶为胰蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶或胃蛋白酶中的一种或者两种以上蛋白酶的组合，蛋白酶的用量以质量计为底物蛋白质量的1/60-1/20，酶解的温度37-60℃，pH为1.8-9.0，酶解反应时间为50-180min。