CN103202837A

CN103202837A - 青蒿素衍生物及其药用盐用于治疗制备白血病的药物

Info

Publication number: CN103202837A
Application number: CN2012100123869A
Authority: CN
Inventors: 糜坚青; 李英; 聂瑞敏; 张瑜; 王瑾; 蔡循; 王振义
Original assignee: Shanghai Institute of Materia Medica of CAS; Ruinjin Hospital Affiliated to Shanghai Jiaotong University School of Medicine Co Ltd
Current assignee: Shanghai Institute of Materia Medica of CAS; Ruinjin Hospital Affiliated to Shanghai Jiaotong University School of Medicine Co Ltd
Priority date: 2012-01-16
Filing date: 2012-01-16
Publication date: 2013-07-17
Anticipated expiration: 2032-01-16
Also published as: CN103202837B

Abstract

本发明公开了一种青蒿素衍生物及其药用盐的应用。该青蒿素衍生物二蒿乙醚基胺及其药用盐能够抑制白血病细胞的增殖，诱导肿瘤细胞凋亡。本发明的青蒿素衍生物二蒿乙醚基胺及其药用盐能用于制备治疗白血病的药物，特别是用于制备治疗急性白血病的药物，更特别是用于制备治疗急性髓细胞性白血病的药物，尤其特别是用于制备治疗急性髓细胞性白血病M3亚型的药物。

Description

青蒿素衍生物及其药用盐用于治疗制备白血病的药物

技术领域

本发明属于医学领域，具体地说，涉及一种青蒿素衍生物及其药用盐的应用。

背景技术

白血病是血液系统的恶性肿瘤，是一类造血干细胞的恶性克隆性疾病，严重危害人类健康。其中，急性白血病是一类急速发展的疾病，其导致骨髓和血液中未成熟的血细胞大量积累，包括急性髓细胞性白血病(AML)和急性淋巴细胞性白血病(ALL)。其中，急性髓细胞性白血病又称为急性非淋巴细胞白血病(ANLL)，可分为M0、M1、M2、M3、M4、M5、M6和M7八种亚型，急性淋巴细胞白血病可分为L1、L2和L3三种亚型。

急性髓细胞性白血病(acute myelocytic leukemia，AML)或急性非淋巴细胞白血病(ANLL)包括所有非淋巴细胞来源的急性白血病。它是多能干细胞或已轻度分化的前体细胞核型发生突变所形成的一类疾病，是造血系统的克隆性恶性疾病。急性髓细胞性白血病八种亚型的诊断标准如下：(1)M0(急性髓细胞白血病微小分化型)：原始细胞在光镜下类似L2型细胞，核仁明显，胞浆透明，嗜碱性，无嗜天青颗粒及Auer小体。髓过氧化物酶(MPO)及苏丹黑B阳性＜3％。在电镜下，MPO为(+)，CD33或CD13等髓系标志可呈(+)。通常淋巴系抗原为(-)，但有时CD7+、TdT+；(2)M1(急性粒细胞白血病未分化型)：未分化原粒细胞(I型+II型)占骨髓非红系细胞的90％以上，至少3％细胞为过氧化物酶染色(+)；(3)M2(急性粒细胞白血病部分分化型)：原粒细胞(I型+II型)占骨髓非红系细胞的30％～89％，单核细胞＜20％，其他粒细胞＞10％；(4)M3(急性早幼粒细胞白血病)：骨髓中以多颗粒的早幼粒细胞为主，此类细胞在非红系细胞中≥30％。可检测到染色体t(15；17)易位和PML/RARα融合基因；(5)M4(急性粒-单核细胞白血病)：骨髓中原始细胞占非红系细胞的30％以上，各阶段粒细胞占30％～＜80％，各阶段单核细胞＞20％，CD14阳性；(6)M5(急性单核细胞白血病)：骨髓非红系细胞中原单核、幼单核≥30％，CD14阳性；(7)M6(急性红白血病)：骨髓中幼红细胞≥50％，非红系细胞中原始细胞(I型+II型)≥30％；(8)M7(急性巨核细胞白血病)：骨髓中原始巨核细胞≥30％，CD41、CD61和CD42阳性。

目前治疗白血病标准方法包括常规化疗、骨髓移植和放射治疗。但是，大多数病人的预后依旧很差。治疗后的严重副反应(如感染，出血，移植后的排斥反应等)或疾病的复发严重地影响了患者的生存率。因此寻找新型的高效的抗肿瘤药物以提高患者的完全缓解率和生存期，显得尤为重要。并且，由于白血病亚型不同，诊断标准也有不同，治疗方案及预后亦不尽相同。因此应根据白血病细胞的形态学、免疫学和细胞遗传学特点进一步作出分型诊断和亚型诊断。

发明内容

本发明的目的在于提供一种青蒿素衍生物二蒿乙醚基胺及其药用盐的应用，为白血病患者提供一种新型的治疗药物。

本发明的青蒿素衍生物为二蒿乙醚基胺，具有如下结构：

经发明人广泛而深入的研究，发现水溶性的青蒿素衍生物二蒿乙醚基胺马来酸盐(标记为SM1044)能够抑制白血病细胞增殖，诱导细胞凋亡。表明本发明的青蒿素衍生物二蒿乙醚基胺及其药用盐能用于制备治疗白血病的药物，特别是用于制备治疗急性白血病的药物，更特别是用于制备治疗急性髓细胞性白血病的药物，尤其特别是用于制备治疗急性髓细胞性白血病M3亚型的药物。

附图说明

图1为急性髓细胞性白血病维甲酸抗性M3细胞株NB4-R1细胞经SM1044处理后的生长抑制曲线图。

图2为流式细胞仪检测NB4-R1细胞经SM1044处理后的凋亡率曲线图。

图3为流式细胞仪检测NB4-R1细胞经SM1044处理后的线粒体跨膜电位结果图。

图4为western blot检测NB4-R1细胞经SM1044处理后的凋亡相关蛋白结果图。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。

以下实施例中使用的NB4-R1细胞为急性髓细胞性白血病维甲酸抗性M3细胞株，来源于上海血液研究所。

实施例1青蒿素衍生物二蒿乙醚基胺马来酸盐的制备

本实施例从已知化合物羟基蒿乙醚(参考文献：李英等，药学学报，1981，16：429-439)出发，先制成它的对甲苯磺酸酯，然后在溶剂二甲基甲酰胺中与氨水反应即得到二蒿乙醚基胺，反应路线为：

随后将制得的二蒿乙醚基胺再制成马来酸盐。

具体操作如下：

将羟基蒿乙醚的对甲苯磺酸酯(1.54g)溶于二甲基甲酰胺(10mL)中，再加氨水(0.5mL)搅拌加热至40～50℃，反应20h左右。TLC检测原料点基本消失后，将反应液倒入冰水，用乙酸乙酯反复提取，合并有机相，再用饱和盐水洗涤，无水硫酸钠干燥。减压蒸去溶剂，残余物通过柱层析(硅胶，洗脱剂为乙酸乙酯/石油醚/三乙胺的混合溶剂，梯度洗脱的浓度为1/19/1→1/10/1，v/v/v)。得到浅黄色油状产物0.4g，收率40％。油状产物用少许乙酸乙酯溶解后，慢慢滴入马来酸/乙酸乙酯溶液至弱酸性，即有固体析出，将此马来酸盐过滤，乙醇/石油醚重结晶，得白色晶体。熔点：140～142℃。¹HNMR(游离碱，300MHz，CDCl₃)δ：5.40(s，2H)，4.82(d，J＝3.3Hz，2H)，3.97(m，2H)，3.56(m，2H)，2.84(m，4H)，1.43(s，6H)，0.95(d，J＝6.0Hz，6H)，0.90(d，J＝7.2Hz，6H)。质谱分析(游离碱C₃₄H₅₅NO₁₀)：m/z 638(M+1)⁺。元素分析(马来酸盐，C₃₈H₅₉NO₁₄)：计算值为C60.53、H 7.89、N 1.86；实测值为C 60.72、H 8.00、N 1.73。

以上分析数据确证二蒿乙醚基胺马来酸盐(SM 1044)的结构如下：

实施例2SM1044对白血病细胞的抑制试验

首先将SM1044溶解于三蒸水中，浓度为1mg/ml，然后选取典型的急性髓细胞性白血病M3维甲酸抗性细胞株NB4-R1细胞进行实验。我们将5×10⁴个细胞悬于200μl培养基中，接种于96孔板。分别设置空白组、不加药的对照组、不同浓度(0.0025μM、0.005μM、0.01μM、0.04μM、0.4μM、0.8μM、1.6μM SM1044)加药组，每种浓度设置3个平行孔。分别培养24h、48h和72h后加入MTT(5mg/ml)继续培养4h。离心，吸掉180μl上清，每孔加入180μl DMSO，置于摇床振荡15min。酶标仪检测570nm吸光值(A)，计算半数抑制浓度IC₅₀。结果如图1所示，NB4-R1细胞对SM1044敏感，48h时，IC₅₀为0.021μM，表明SM1044能抑制白血病细胞的增殖。

实施例3SM1044诱导NB4-R1细胞凋亡试验

将5×10⁵个NB4-R1细胞悬于1ml培养基，接种于24孔板。分别设置对照组(0μM)、不同浓度(0.1μM，0.5μM，1μM SM1044)加药组，分别培养24h和48h，收集待检测细胞，预冷的磷酸盐缓冲液(PBS)洗2遍后用200μl结合缓冲液(binding buffer)重悬，加入5μl Annexin V-FITC和5μl碘化丙啶(PI)，轻轻混匀，于室温避光孵育15min，1h内流式细胞仪检测，结果如图2所示，SM1044浓度为0.1μM～1μM，作用于NB4-R1细胞24～48小时内能诱导细胞凋亡。表明SM1044可诱导NB4-R1细胞凋亡，凋亡细胞比例随药物浓度的增大和处理时间的延长而升高。

实施例4SM1044诱导NB4-R1细胞线粒体跨膜电位丢失试验

将1×10⁶个NB4-R1细胞悬于2ml培养基，接种于6孔板。分别设置对照组(0μM)、不同浓度(0.1μM，0.5μM，1μM SM1044)加药组，培养分别24h和48h后，加入20nM DiOC₆(3)于37℃避光孵育15min，PBS洗细胞2次，再用100μl PBS重悬细胞，流式细胞仪检测。DiOC₆(3)阴性的细胞为线粒体跨膜电位丢失的细胞。图3显示SM1044使NB4-R1细胞的线粒体跨膜电位丢失，同时电位丢失有时间和浓度的依赖性。细胞凋亡包括内在途经和外在途径，其中线粒体跨膜电位的丢失是细胞凋亡内在途经的重要表现，结果表明SM1044可通过内在途径诱导NB4-R1细胞的凋亡。

实施例4SM1044诱导NB4-R1细胞凋亡相关蛋白形成试验

将NB4-R1细胞以5×10⁵个/ml浓度接种于6孔板。分别设置对照组(0μM)、不同浓度(0.1μM，0.5μM，1μM SM1044)加药组，培养24h后抽取细胞总蛋白，通过western blot的方法，用抗凋亡相关蛋白(caspase-3，caspase-8，caspase-9)的抗体检测凋亡相关蛋白量的变化。Caspase家族在介导细胞凋亡的过程中起着非常重要的作用。而细胞凋亡的途径主要有两条：一条是通过胞外信号激活细胞内的凋亡酶caspase-8等；另一条是通过线粒体释放凋亡酶激活因子激活caspase-9等。这些活化的caspase进而激活凋亡执行蛋白caspase-3引起细胞凋亡。如图4所示，经SM1044处理后，凋亡相关蛋白活化的caspase-8和caspase-9量增加，表明SM1044可通过内在和外在两种途径诱导NB4-R1细胞凋亡。

青蒿素(artemisinin)是从植物黄花蒿中提取出的具有过氧基团的倍半萜内酯，青蒿琥酯(artesunate)、蒿甲醚(artemether)和二氢青蒿素(dihydroartemisinin)等均为青蒿素的衍生物。目前上述青蒿素类药物已成为在世界范围内治疗疟疾的第一线药物。虽然近20年来，国内外学者开展了青蒿素类化合物的抗肿瘤作用的研究，证明青蒿素类化合物体外抗瘤谱广，但是具体在体内实施中往往疗效不佳，而最终没能进一步深入研究。我们试图在原有的基础上研究一种新型的青蒿素衍生物，以期提高抗肿瘤作用的效果。本实验采用新型的水溶性青蒿素衍生物二蒿乙醚基胺马来酸盐，对抑制白血病细胞增殖等试验进行考察，表明SM1044能抑制白血病细胞增殖，诱导细胞凋亡，并具有时间和剂量的依赖性。SM1044能够用于制备治疗白血病的药物，特别是用于治疗急性白血病的药物，更特别是用于制备治疗急性髓细胞性白血病的药物，尤其特别是用于制备治疗急性髓细胞性白血病M3亚型的药物。

应当理解，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，如采用二蒿乙醚基胺的其它水溶性盐，也能达到本发明的技术效果。本发明的青蒿素衍生物二蒿乙醚基胺对白血病的诱导凋亡能力较强，可在短时间、小剂量内抑制肿瘤细胞，且毒副作用较小，对白血病的临床治疗有重要意义。

Claims

1.一种青蒿素衍生物及其药用盐的应用，其特征在于，用于制备治疗白血病的药物，其中，所述青蒿素衍生物为二蒿乙醚基胺，结构为：

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述白血病为急性白血病。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述急性白血病为AML型急性髓细胞性白血病。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述AML型急性髓细胞性白血病为M3亚型。