CN103167871B - 包含乳香的酸性提取物的组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及包括乳香的分离的酸性级分的组合物和制剂，和其用于治疗神经功能缺损以及伤口和组织修复的应用。

Description

包含乳香的酸性提取物的组合物

发明领域

本发明涉及来自乳香的分离的酸性级分的组合物，及其应用。

发明背景

对来自植物和植物产物、用于多种治疗应用的新型药物实体的追寻源于古代并持续至今。一种这样的来源是乳香（mastic），也被称为乳香（gum mastic）或乳香（masticgum），其是作为漆树科（Anacardiaceae）的成员乳香黄连木（Pistacia lentiscus L.）的渗出物获得的树脂。乳香在古地中海世界用于胃肠功能疾患，比如胃痛、消化不良和消化性溃疡。已公开向患有十二指肠溃疡的人类患者和患有诱发性胃溃疡和十二指肠溃疡的实验大鼠口服施用乳香具有治疗作用（Al-Habbal等人(1984)Clin Exp Pharmacop Physio11(5):541-4；Said等人(1986)J Ethnopharmacol15(3):271-8）。虽然已公开乳香对引起消化性溃疡病的病原体幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）具有体外杀菌作用（Marone等（2001）JChemother13:611-614），但其他报道公开了在将乳香施用于幽门螺杆菌阳性的人类患者（Bebb等（2003）J Antimicrob Chemother52:522-23）或施用于实验感染的小鼠（Loughlin等（2003）J Antimicrob Chemother51:367-371）时未发挥抗细菌活性。

希腊专利第GR1,003,541号公开了提取自乳香黄连木Chia品种（Pistacialentiscus var Chia）的叶、枝和果实的希俄斯乳香油的抗微生物和抗真菌作用。

希腊专利第GR1,003,868号公开了来自乳香黄连木Chia品种的产物作为抗氧化剂、作为伤口（wound）愈合诱导剂和作为细胞生长抑制剂的应用。

美国专利申请公布第2005/0238740涉及乳香和其组分用于控制微生物感染的应用。

Paraschos等人（2007），由上述专利申请的发明人中的一些所著，公开了不含聚合物的总乳香提取物（TMEWP）的制备，其通过对粗乳香进行极性溶剂萃取并从其中去除不溶性的聚合物聚-β-月桂烯以及从TMEWP中分离酸性级分和中性级分而制备（Paraschos等（2007）Antimicrob Agents Chemother51(2):551-559）。根据该公开，向幽门螺杆菌感染的小鼠施用TMEWP3个月时间导致细菌定殖的30倍减少，很大程度上归因于从酸性级分纯化的特定化合物。作者指出，由于推测在先前研究中所用的粗乳香制品中高百分比的聚-β-月桂烯阻碍在口服施用过程中潜在的体内活性，因此制备了TMEWP。作者还公开了去除聚-β-月桂烯可产生具有抗幽门螺杆菌活性的增强的治疗部分。

EP专利申请第1520585号涉及利用来自某些黄连木属物种的天然植物产物或精油或组分的癌症治疗。

国际专利申请公布第WO2005/112967号涉及希俄斯乳香的抗癌活性。

Van der Berg等人（1998）公开了利用萃取和尺寸排阻色谱对乳香的聚合物级分的分离和纯化（Van der Berg等人(1998)Tetrahedron Lett3:2645-2648）。

Barra等人(2007)公开了对来自乳香黄连木的精油的萃取和气相色谱分析（Barra等人(2007)J Agric Food Chem55(17):7093-7098）。根据该公开内容，鉴定了总45个化合物，包括作为主要化合物之一的β-月桂烯。

本发明的发明人中的某些的国际专利申请公布第WO2010/100650号涉及乳香级分的治疗应用。

本发明的发明人中的某些的国际专利申请公布第WO2010/100651号涉及聚月桂烯的组合物。

国际专利申请公布第WO2005/094837号涉及乳香二烯酸作为DNA聚合酶-β的抑制剂、用于治疗癌症、肿瘤和神经变性疾病的应用。

Marner等人(1991)公开了来自乳香黄连木（P.lentiscus）的乳香的多种类三萜（triterpenoid）的鉴定（Marner等人(1991)Phytochemistry,30,3709-3712）。

Giner-Larza等人(2002)公开了来自黑黄连木（pistacia terebinthus）树瘤的抗炎三萜（triterpene）（Planta Med(2002),68,311-315）。

然而，对于用来治疗多种病症的安全、通用和有效的剂仍存在未满足的需求，所述多种病症比如与神经功能缺损相关的那些病症和相关的神经变性病症，包括，例如，阿尔茨海默病、中风和类似病症，以及其他病症诸如组织再生、伤口和组织修复。

发明概述

本发明提供了包括乳香的分离的酸性级分的药物组合物，其包含在极性和非极性有机溶剂中均可溶的酸性化合物。本发明的级分表现出可被开发用于多种治疗应用的多种有益的生物活性。更具体地，现在公开了乳香的分离的酸性级分具有活性且可用于治疗神经功能缺损和相关的神经变性病症（例如，通过对神经变性病症进行逆转）、中风、组织再生、伤口和组织修复，和类似的病症。

根据一些实施方案，本发明还提供了包括来自乳香的分离的酸性级分的分离的化合物的组合物，所述分离的化合物具有治疗活性。在一些实施方案中，组合物可包括多种分离的化合物，所述分离的化合物选自在根据本发明的乳香的酸性级分中发现的单独的酸性化合物。根据一些实施方案，组合物包括选自乳香二烯酸（masticadienoic acid）、异乳香二烯酸（isomasticadienoic acid）、乳香二烯醇酸（masticadienolic acid）、异乳香二烯醇酸（isomasticadienolic acid）、3-O-乙酰基乳香二烯醇酸（3-O-acetylmasticadienolic acid）、3-O-乙酰基表乳香二烯醇酸（3-O-acetyl epimasticadienolicacid）、3-O-乙酰基异乳香二烯醇酸（3-O-acetyl isomasticadienolic acid）、3-O-乙酰基表-异乳香二烯醇酸（3-O-acetyl epi-isomasticadienolic acid）、齐墩果酮酸（oleanonic acid）、模绕酮酸（moronic acid）和3-氧代-羽扇-20(29)-烯-28-酸（3-oxo-lup-20(29)-en-28-oic acid）的至少3种分离的化合物。在一些示例性的实施方案中，组合物包括至少乳香二烯酸、异乳香二烯酸和齐墩果酮酸。这样的组合物意外地表现出协同效应，从而在神经功能缺损和神经变性疾患/病症的治疗中，与仅单独的化合物比较，化合物的组合表现出显著增高的疗效。

根据本发明的实施方案的乳香酸性级分可与现有技术中所公开的乳香级分区别，因为其制备包括使用极性溶剂和非极性溶剂，而现有技术仅教导使用极性溶剂。通过仅使用极性溶剂制备的酸性级分包含不溶于非极性溶剂诸如己烷的化合物，而这些化合物在本发明的酸性级分中是不存在的。因此，本发明的级分包括与现有技术中所公开的不同的化合物的组合。并且，本发明的发明人已发现，本发明的酸性级分意外地具有现有技术未提到的一系列非常意外的治疗活性。

本发明的教导由以下来示例：通过三步提取程序制备乳香提取物，从而获得在极性溶剂和非极性溶剂中均可溶的酸性级分，且其中去除了在极性溶剂中可溶但在非极性溶剂中保持不可溶的来自乳香的物质。在另外的实施方案中，分离的酸性级分的主要化合物已被分离和鉴定。这些化合物中的一些的多种组合在多种神经功能缺损（比如，例如，中风）的治疗中和在相关神经变性疾患诸如阿尔茨海默病的治疗中表现出意外的协同效应。

不希望被任何特定的理论或作用机制所束缚地，本文所公开的乳香的分离的酸性级分的活性使本发明对于与受损的神经元病症相关的多种疾病或病症是有用的，比如，例如，受与突触形成不足相关联的病理影响的脑和神经组织中神经元间连接点的再形成和克服有缺陷的神经元间通讯。该病理是许多神经系统病状的基础，包括例如阿尔茨海默病。显示乳香的分离的酸性级分的活性可用于中风的治疗。本发明还可用于促进伤口愈合和大量细胞和组织的复壮。本发明还可用于延长动物的寿命。

还需理解的是，本文所公开的级分和组合物的生物活性受存在于在不应用本文所公开的前两个提取步骤的情况下制备的酸性级分中的某些化合物的存在所抑制。

根据一些实施方案，本发明提供了包括有效量的乳香的分离的酸性级分，和药学上可接受的载体的组合物；其中所述级分的特征在于其在至少一种极性有机溶剂中是可溶的且在至少一种非极性有机溶剂中是可溶的，且其中所述级分基本上不含在所述极性有机溶剂中可溶但在所述非极性有机溶剂中不可溶的化合物。

在一些实施方案中，组合物由包括以下步骤的方法所获得：

(a)用极性有机溶剂处理乳香；

(b)分离在所述极性有机溶剂中可溶的级分；

(c)任选地去除所述极性有机溶剂；

(d)用非极性有机溶剂处理步骤(b)或(c)中获得的可溶级分，

(e)分离在所述非极性有机溶剂中可溶的级分；

(f)任选地去除所述非极性有机溶剂；

(g)将步骤(f)中获得的级分溶解于有机溶剂中；

(h)用碱性溶液处理步骤(g)中获得的溶液从而获得碱性级分；和

(i)用酸溶液使步骤(h)中获得的所述碱性级分酸化；

在一些实施方案中，步骤(d)至(f)可位于步骤(a)至(c)之前。

在一些实施方案中，步骤(h)中用碱性溶液进行的处理（碱化）包括用一种或多种适宜的碱性水溶液萃取步骤(g)中获得的溶液；或将步骤(g)中获得的溶液与碱性离子交换树脂接触。

在一些实施方案中，步骤(h)包括将步骤(g)中获得的溶液与碱性离子交换树脂接触，且之后通过过滤去除碱性离子交换树脂。在这些实施方案中，步骤(i)包括用酸性溶液处理碱性离子交换树脂。

在一些实施方案中，该方法还包括以下步骤：

(j)用有机溶剂萃取步骤(i)中获得的酸化的级分；

k)任选地，用干燥剂与步骤(j)中获得的有机级分接触从而去除剩余的水；

(l)从步骤(i)、(j)或(k)中的任一步骤中获得的级分中去除有机溶剂和/或多余的酸；和

(m)将步骤(l)中获得的分离的级分溶于载体中。

在一些实施方案中，在步骤(d)至(f)之前进行步骤(a)至(c)；或在步骤(a)至(c)之前进行步骤(d)至(f)。在一些实施方案中，(a)至(c)和/或步骤(d)至(f)重复多个循环。

在一些实施方案中，步骤(c)、(f)和(l)包括通过选自由旋转蒸发、施加高真空和其组合组成的组的手段去除溶剂。

在一些实施方案中，步骤(h)包括用碱性水溶液萃取步骤(g)中获得的溶液，并收集从而获得的有机级分。在一些实施方案中，该方法还包括合并从步骤(h)获得的有机级分与步骤(i)、(j)或(k)的任一步骤中获得的级分。

在一些实施方案中，将步骤(h)中获得的有机级分与以从步骤(h)中获得的有机级分的从约0.1%至约50%的范围的量的在步骤(i)、(j)或(k)的任一步骤中获得的级分合并。在一些实施方案中，该量在从0.5至50%的范围中；或2至25%的范围中；或0.1至10%的范围中。

适用于本发明的极性有机溶剂可选自醇、醚、酯、酰胺、醛、酮、腈、和其组合。

适宜的极性有机溶剂的具体的实例包括甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、1-丁醇、2-丁醇、仲-丁醇、叔-丁醇、1-戊醇、2-戊醇、3-戊醇、新戊醇、3-甲基-1-丁醇、2-甲基-1-丁醇、3-甲基-2-丁醇、2-甲基-2-丁醇、乙二醇、乙二醇单甲醚、乙醚、甲基乙醚、乙基丙醚、甲基丙醚、1,2-二甲氧基乙烷、四氢呋喃、二氢呋喃、呋喃、吡喃、二氢吡喃、四氢吡喃、乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙醛、甲酸甲酯、甲酸乙酯、丙酸乙酯、丙酸甲酯、二氯甲烷、三氯甲烷、二甲基甲酰胺、乙酰胺、二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮、丙酮、乙基甲基甲酮、二乙基甲酮、乙腈、丙腈、和其组合。

在一些实施方案中，极性有机溶剂选自甲醇和乙醇、或其组合。

在一些实施方案中，极性溶剂是乙醇。

适用于本发明的非极性有机溶剂可选自无环的或环状的、饱和的或不饱和的脂族烃和芳族烃、和其组合，其中每一个任选地由一个或多个卤素取代。在一些实施方案中，非极性有机溶剂选自C5-C10烷烃，C5-C10环烷烃，C6-C14芳族烃和C7-C14全氟烷烃、和其组合。

在一些实施方案中，非极性有机溶剂选自戊烷、己烷、庚烷、辛烷、壬烷、癸烷、环戊烷、环己烷、环庚烷、苯、甲苯、二甲苯和其异构体和混合物。

在一些实施方案中，C5-C10烷烃选自由戊烷、己烷、庚烷、辛烷、壬烷、癸烷、环己烷，和其异构体和混合物组成的组。

在一些实施方案中，非极性有机溶剂是己烷。

在一些实施方案中，步骤(g)和步骤(j)中的有机溶剂独立地选自由二烷基醚（dialkyl ether）、烷基芳基醚、二芳基醚、酯、酮、卤化烃、C5-C14芳族烃、C5-C14全氟烷烃组成的组。

在一些实施方案中，步骤(g)和步骤(j)中适宜的有机溶剂是相同的或不同的。

在一些实施方案中，有机溶剂包括二烷基醚。

在一些实施方案中，有机溶剂是乙醚。

在一些实施方案中，极性有机溶剂包括乙醇，非极性有机溶剂包括己烷且有机溶剂包括乙醚。

在一些实施方案中，步骤(h)包括用碱性水溶液进行碱化。在一些实施方案中，碱性水溶液通过将无机碱溶于水中而制备。

在一些实施方案中，无机碱选自由碳酸钠、氢氧化钠、碳酸钾、氢氧化钾、氢氧化铵、碳酸氢钠、磷酸钠、氢氧化锂、碳酸锂和磷酸钾组成的组。

在一些实施方案中，无机碱是碳酸钠。在一些实施方案中，水中的碳酸钠的浓度在2至20%w/w的范围。在一些实施方案中，碳酸钠的浓度在3至15%w/w的范围。在一些实施方案中，碳酸钠的浓度为约5%w/w。

在一些实施方案中，无机碱是氢氧化钠。

在一些实施方案中，碱性水溶液通过将水溶性的有机碱溶于水中而制备。

在一些实施方案中，第一无机碱为约5%w/w碳酸钠水溶液，然后为约4%w/w氢氧化钠水溶液。

在一些实施方案中，步骤(h)中的碱化包括将步骤(g)中获得的溶液与碱性离子交换树脂接触。在一些实施方案中，碱性离子交换树脂包括苯乙烯二乙烯苯、聚丙烯共聚物或酚醛共聚物（formophenolic copolymer）。

在一些实施方案中，使溶液碱化至高于约7的pH。

在一些实施方案中，使溶液碱化至8-10的pH范围。

在一些实施方案中，使溶液碱化10-13的pH范围。

在一些实施方案中，使溶液碱化至>13的pH。

在一些实施方案中，步骤(i)中的酸性溶液包括酸性水溶液或酸性非水溶液。

在一些实施方案中，步骤(i)中的酸性水溶液通过将无机酸溶于水中而制备或通过稀释浓缩的矿物酸溶液而制备。

在一些实施方案中，酸性水溶液是盐酸或磷酸的溶液。

在一些实施方案中，酸性水溶液是盐酸的溶液。

在一些实施方案中，步骤(i)中的酸性水溶液通过将有机酸溶于水中或通过稀释浓缩的矿物酸溶液来制备。

在一些实施方案中，进行酸化至低于约7的pH。在一些实施方案中，进行酸化至低于约6的pH。在一些实施方案中，进行酸化至低于约5的pH。在一些实施方案中，进行酸化至低于约4的pH。在一些实施方案中，进行酸化至低于约3的pH。

在一些实施方案中，进行酸化至范围在1-3的pH。

在一些实施方案中，步骤(i)中的酸性非水溶液通过将有机酸溶于选自醇、酯、醚、酰胺或其混合物的非水有机溶剂而制备。在一些实施方案中，非水溶剂是甲醇或乙醇或其混合物。

在一些实施方案中，有机酸选自由甲酸、乙酸、丙酸、柠檬酸、酒石酸、甲磺酸和对甲苯磺酸组成的组。

在一些实施方案中，步骤(k)中所用的干燥剂选自由硫酸钠、硫酸镁、硫酸钙、氯化钙、氯化镁、硫酸钾组成的组。

在一些实施方案中，组合物基本上不含在所述极性有机溶剂中可溶和在所述非极性有机溶剂中不可溶的萜烯化合物。

在一些实施方案中，组合物包括基于组合物的总重量从约0.01至约25%（w/w）的乳香的分离的酸性级分。在一些实施方案中，组合物包括基于组合物的总重量从约0.01至约12%（w/w）的乳香的分离的酸性级分。

在一些实施方案中，分离的酸性级分包括以下中的至少一种：乳香二烯醇酸；异乳香二烯酸；异乳香二烯醇酸；3-O-乙酰基乳香二烯醇酸；3-O-乙酰基表乳香二烯醇酸；3-O-乙酰基异乳香二烯醇酸；3-O-乙酰基表-异乳香二烯醇酸；齐墩果酮酸；模绕酮酸；和3-氧代-羽扇-20(29)-烯-28-酸。每种可能性是本发明的独立的实施方案。

在一些实施方案中，分离的酸性级分还包括以下中的至少一种：齐墩果醇酸（oleanolic acid）；乌宋酸（ursonic acid）；和熊果酸（ursolic acid）。每种可能性是本发明的独立的实施方案。

在一些实施方案中，分离的酸性级分基本上不含乳香二烯酸。

在一些实施方案中，分离的酸性级分可以基本上不含精油。

在一些实施方案中，分离的酸性级分包括至少一种萜酸（terpenoic acid）。

在一些实施方案中，分离的酸性级分包括至少一种三萜酸（triterpenoic acid）。

在一些实施方案中，至少一种萜酸包括至少一种三萜酸。在一些实施方案中，至少一种三萜酸选自由以下组成的组：乳香二烯醇酸；异乳香二烯酸；异乳香二烯醇酸；3-O-乙酰基乳香二烯醇酸；3-O-乙酰基表乳香二烯醇酸；3-O-乙酰基异乳香二烯醇酸；3-O-乙酰基表-异乳香二烯醇酸；齐墩果酮酸；模绕酮酸；3-氧代-羽扇-20(29)-烯-28-酸、和其组合。每种可能性是本发明的独立的实施方案。

在一些实施方案中，至少一种萜酸是单体形式。在一些实施方案中，至少一种萜酸是寡聚形式。在一些实施方案中，寡聚形式选自由二聚体、三聚体、和其组合组成的组。每种可能性是本发明的独立的实施方案。

在一些实施方案中，寡聚形式是二聚体。

在一些实施方案中，寡聚形式是三聚体。

在一些实施方案中，至少一种三萜酸是单体形式。在一些实施方案中，至少一种三萜酸是寡聚形式。在一些实施方案中，寡聚形式选自由二聚体、三聚体、和其组合组成的组。每种可能性是本发明的独立的实施方案。

在一些实施方案中，寡聚形式是二聚体。

在一些实施方案中，寡聚形式是三聚体。

在一些实施方案中，分离的酸性级分包括单体三萜酸和二聚三萜酸的组合。在一些实施方案中，分离的酸性级分包括单体三萜酸、二聚三萜酸和三聚三萜酸的组合。

在一些实施方案中，组合物包括以下中的至少一种：乳香二烯醇酸；异乳香二烯酸；异乳香二烯醇酸；3-O-乙酰基乳香二烯醇酸；3-O-乙酰基表乳香二烯醇酸；3-O-乙酰基异乳香二烯醇酸；3-O-乙酰基表-异乳香二烯醇酸；齐墩果酮酸；模绕酮酸；和3-氧代-羽扇-20(29)-烯-28-酸。每种可能性代表本发明的独立的实施方案。

在一些实施方案中，组合物还包括以下中的至少一种：齐墩果醇酸；乌宋酸；和熊果酸。每种可能性代表本发明的独立的实施方案。

在一些实施方案中，组合物包括至少一种萜酸。萜酸的实施方案如上所述。

在一些实施方案中，组合物包括至少一种三萜酸。三萜酸的实施方案如上所述。

在一些实施方案中，组合物基本上不含乳香二烯酸。

在一些实施方案中，乳香来自分类为漆树科的植物。适宜的植物包括分类为选自由以下组成的组的属的那些：黄连木属（Pistacia）、松属（Pinus）、云杉属（Picea）、刺柏属（Juniperus）、Alsies、落叶松属（Larix）、金鱼草属（Antirrhinum）、乳香属（Boswellia）、柑橘属（Citrus）和三七草属（Gynura）。

在一些实施方案中，适宜的植物选自黄连木属。

在一些实施方案中，黄连木属的物种选自由以下组成的组：乳香黄连木（P.lentiscus）、大西洋黄连木（P.atlantica）、P.palestina、P.saportae、黑黄连木（P.terebinthus）、阿月浑子（P.vera）和全缘叶黄连木（P.integerrima）。

在一些实施方案中，黄连木属的物种是乳香黄连木。

在一些实施方案中，分离的酸性级分来自选自由树脂、叶、枝、根、花、种子、芽、树皮、果实和根组成的组的植物物质。

在一些实施方案中，乳香的分离的酸性级分通过包括以下步骤的方法来获得：

(a)用极性有机溶剂处理乳香；

(b)分离在所述极性有机溶剂中可溶的级分；

(c)任选地去除所述极性有机溶剂；

(d)用非极性有机溶剂处理步骤(b)或(c)中获得的可溶的级分，

(e)分离在所述非极性有机溶剂中可溶的级分；

(f)任选地去除所述非极性有机溶剂；

(g)将在步骤(f)中获得的级分溶于有机溶剂中；

(h)用碱性溶液处理步骤(g)中获得的溶液以获得碱性级分；

(i)用酸溶液使步骤(i)中获得的碱性级分酸化；

(j)用有机溶剂萃取步骤(i)中获得的酸化的级分；

(k)任选地将步骤(k)中获得的有机级分与干燥剂接触以去除剩余的水；

(l)从步骤(i)、(j)或(k)中的任一步骤中获得的级分中去除有机溶剂和/或多余的酸；和

(m)将步骤(l)中获得的分离的级分溶于载体中。

在另外的实施方案中，本发明提供了包括至少一种三萜酸；和药学上可接受的载体的药物组合物。在一些实施方案中，至少一种三萜酸选自由以下组成的组：乳香二烯醇酸；异乳香二烯酸；异乳香二烯醇酸；3-O-乙酰基乳香二烯醇酸；3-O-乙酰基表乳香二烯醇酸；3-O-乙酰基异乳香二烯醇酸；3-O-乙酰基表-异乳香二烯醇酸；乳香二烯酸；齐墩果酮酸；模绕酮酸；3-氧代-羽扇-20(29)-烯-28-酸、和其组合。每种可能性是本发明的独立的实施方案。

根据一些实施方案，本发明提供了基本上由作为药物活性成分的异乳香二烯酸和乳香二烯酸；和药学上可接受的载体组成的药物组合物。关于组合物治疗神经功能缺损（并进而治疗神经变性疾患/病症）的效力，当与单独的化合物的效力相比较时，两种化合物的组合存在导致了增强/协同效应。

异乳香二烯酸和乳香二烯酸中的任一种可分离自诸如乳香的天然来源，或可以是化学合成的产物。

在一些实施方案中，异乳香二烯酸和乳香二烯酸之间的比率为约1:1w/w。

根据一些实施方案，本发明提供了基本上由作为仅有的药物活性成分的齐墩果酮酸、异乳香二烯酸和乳香二烯酸；和药学上可接受的载体组成的药物组合物。关于组合物治疗神经功能缺损和治疗神经变性疾患的效力，当与单独的化合物的效力或该三种化合物中的仅两种的混合物的效力相比较时，全部三种化合物的组合存在导致了显著的协同效应。

齐墩果酮酸、异乳香二烯酸和乳香二烯酸中的任一种可分离自天然来源，诸如乳香，或可以是化学合成的产物。

在一些实施方案中，异乳香二烯酸和乳香二烯酸和齐墩果酮酸之间的比率为约1:1:1w/w/w。

在一些实施方案中，至少一种三萜酸是单体。在一些实施方案中，组合物包括齐墩果酮酸和模绕酮酸的单体。在一些实施方案中，齐墩果酮酸和模绕酮酸的单体是化学合成反应的产物。

在一些实施方案中，至少一种三萜酸包括寡聚形式。在一些实施方案中，寡聚形式选自由二聚体、三聚体、和其组合组成的组。每种可能性是本发明的独立的实施方案。在一些实施方案中，寡聚形式是二聚体。

在一些实施方案中，至少一种三萜酸是化学合成的产物。

在一些实施方案中，包括寡聚形式的至少一种三萜酸是化学合成的产物。在一些实施方案中，至少一种三萜酸是二聚形式且是化学合成的产物。

在一些实施方案中，至少一种三萜酸来自天然来源，尤其是植物来源。

在一些实施方案中，组合物包括不同的三萜酸的组合，其中至少一种三萜酸是化学合成的产物且至少一种另外的三萜酸来自植物来源。

天然来源包括分类为漆树科的植物。适宜的植物包括分类为选自由以下组成的组的属的那些：黄连木属、松属、云杉属、刺柏属、Alsies、落叶松属、金鱼草属、乳香属、柑橘属和三七草属。

在一些实施方案中，适宜的植物选自黄连木属。

在一些实施方案中，黄连木属的物种选自由乳香黄连木、大西洋黄连木、P.palestina、P.saportae、黑黄连木、阿月浑子和全缘叶黄连木组成的组。

在一些实施方案中，黄连木属的物种是乳香黄连木。

在一些实施方案中，天然来源是选自由以下组成的组的植物物质：树脂、叶、枝、根、花、种子、芽、树皮、果实和根。

在一些实施方案中，天然来源是分类为选自由罗勒属（Ocimum）、月桂属（Laurus）和薰衣草属（Lavendula）组成的组的属的植物。

在一些实施方案中，药学上可接受的载体包括疏水载体。在一些实施方案中，疏水载体包括至少一种油。在一些实施方案中，油选自由矿物油、植物油和其组合组成的组。在一些实施方案中，植物油选自由棉籽油、橄榄油、杏仁油、油菜籽油（canola oil）、椰子油、玉米油、葡萄籽油、花生油、藏红花油（saffron oil）、芝麻油、大豆油、和其组合组成的组。在一些实施方案中，矿物油是轻质矿物油。在一些实施方案中，疏水载体包括至少一种蜡。在一些实施方案中，疏水载体包括至少一种油和至少一种蜡的组合。

在不同的实施方案中，根据本发明的组合物为适宜于通过选自由胃肠外、透皮、口服和局部（topical）组成的组的途径施用的形式。

在不同的实施方案中，根据本发明的组合物为适宜于局部施用的形式。

在不同的实施方案中，根据本发明的组合物为适宜于口服施用的形式。

在不同的实施方案中，根据本发明的组合物为适宜于胃肠外施用的形式。

在一些实施方案中，组合物为适宜于通过注射施用的形式。在不同的实施方案中，组合物是用于通过选自由以下组成的组的途径施用的胃肠外制剂：皮下的、静脉内的、肌内的、皮内的、腹膜内的、动脉内的、大脑内的、脑室内的、骨内的和鞘内的。

在一些实施方案中，组合物是用于通过皮下途径施用的胃肠外制剂。

在不同的实施方案中，组合物被配制为用于通过选自由以下组成的组的途径施用：表皮的、阴道的、直肠的、吸入的、鼻内的、眼睛的、耳的和口腔的。

在一些实施方案中，组合物为适宜于化妆施用或皮肤病学施用的形式。

在一些实施方案中，药物组合物为选自由胶囊、片剂、脂质体、栓剂、悬浮剂、软膏、乳霜、洗剂（lotion）、溶液、乳液、薄膜、粘固剂（cement）、粉末、胶、气溶胶和喷雾剂组成的组的形式。在一些实施方案中，胶囊选自由硬明胶胶囊和软明胶胶囊组成的组。在一些实施方案中，乳液是纳米乳液或微乳液。

在一些实施方案中，制剂包括以下中的至少一种：包合复合物、纳米乳液、微乳液、粉末、脂筏、脂质微粒、树状聚物（dendrimer）和脂质体。在一些实施方案中，包合复合物包括至少一种环糊精。在一些实施方案中，至少一种环糊精包括羟丙基-β-环糊精。在一些实施方案中，纳米乳液包括具有小于800nm的平均粒径的液滴。在一些实施方案中，液滴具有小于500nm的平均粒径。在一些实施方案中，液滴具有小于200nm的平均粒径。在一些实施方案中，粉末是喷雾干燥的粉末。在一些实施方案中，脂质体包括多层囊泡。在一些实施方案中，微乳液包括非离子型表面活性剂。在一些实施方案中，非离子型表面活性剂选自由以下组成的组：聚氧乙烯蓖麻油、聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯（聚山梨醇酯）、泊洛沙姆、维生素E衍生物、聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯硬脂酸酯或饱和的多糖酵解的甘油酯、或其组合。

在一些实施方案中，组合物以涂层（coating）的形式被置于制品上。在一些实施方案中，制品包括容器，其中所述组合物被置于容器中。在一些实施方案中，制品选自由以下组成的组：织物制品、尿布、伤口敷料、医疗装置、针或多个针、显微针或多个显微针、注射装置和喷雾分配器。在一些实施方案中，制品包括多个显微针。在一些实施方案中，医疗装置选自由以下组成的组：假体、人工器官或其组件、阀门、导管、试管、支架、人工膜、起搏器、传感器、内窥镜、显像装置、泵、金属丝（wire）和植入物。在一些实施方案中，植入物选自由以下组成的组：心脏植入物、耳蜗植入物、角膜植入物、颅骨植入物、牙科植入物、颌面植入物、器官植入物、整形外科植入物、血管植入物、关节内植入物和乳房植入物（breastimplant）。

在一些实施方案中，组合物适宜于通过选自由电穿孔、声裂法、射频、加压喷雾和其组合组成的组的方式的施用。

在一些实施方案中，组合物用于治疗神经功能缺损。在一些实施方案中，神经功能缺损包括选自由认知功能、感觉功能、运动功能和其组合组成的组的功能的降低。在一些实施方案中，神经功能缺损与病症或疾病相关联。在一些实施方案中，所述病症或疾病选自由以下组成的组：阿尔茨海默病、肌萎缩侧索硬化症（ALS）、多发性硬化症、帕金森氏病、血管性痴呆和老年性痴呆。在一些实施方案中，病症是创伤（trauma）或中风。

在一些实施方案中，病症或疾病是精神病疾患，比如精神分裂症、双相性精神障碍或抑郁。

在一些实施方案中，病症或疾病选自肥胖症、厌食症、恶病质、感染和免疫疾患。

在一些实施方案中，神经功能缺损由于与药物接触而导致，比如麻醉剂。

在一些实施方案中，病症或疾病选自由以下组成的组：血管性痴呆、老年性痴呆、阿尔茨海默病、肌萎缩侧索硬化症（ALS）、多发性硬化症、帕金森氏病和中风。

在一些实施方案中，病症是中风。

在一些实施方案中，病症是创伤。

在一些实施方案中，病症或疾病选自由血管性痴呆、老年性痴呆、阿尔茨海默病、肌萎缩侧索硬化症（ALS）和多发性硬化症组成的组。

在一些实施方案中，病症或疾病选自由血管性痴呆、老年性痴呆、阿尔茨海默病和肌萎缩侧索硬化症（ALS）组成的组。

在一些实施方案中，病症或疾病选自由血管性痴呆、老年性痴呆和阿尔茨海默病组成的组。

在一些实施方案中，疾病是阿尔茨海默病。

在一些实施方案中，疾病是肌萎缩侧索硬化症（ALS）。

在一些实施方案中，组合物是用于治疗皮肤伤口的，包括例如，下肢静脉性溃疡、压迫性溃疡、糖尿病足溃疡、烧伤、截肢伤口、褥疮溃疡（褥疮）、分层皮肤供体移植物（split-skin donor graft）、皮肤移植的供区、医疗装置植入位点、咬伤、冻伤、刺伤、弹片伤、皮肤磨削术（dermabrasion）、挫伤、感染、伤口和外科伤口。

在一些实施方案中，组合物用于诱导或促进组织修复。如本文所用的，组织修复包含诱导和促进组织再生，包括神经组织。

在一些实施方案中，组合物用于诱导或促进损伤或伤害后的组织修复。在一些实施方案中，损伤或伤害选自由以下组成的组：心肌梗塞、肺栓塞、脑梗塞、外周动脉闭塞性疾病、疝、脾梗塞、静脉溃疡、轴索显微外科术（axotomy）、视网膜剥离、感染和手术操作。

在一些实施方案中，组合物用于在动物中诱导或促进寿命延长。在一些实施方案中，动物选自由人类、非人类哺乳动物、鸟类和鱼组成的组。

本发明的其他目的、特征和优点将从以下的描述和图中变得清楚。

附图简述

图1显示根据本发明的分离的酸性级分的反相HPLC色谱图。利用UV-VIS检测器获得在波长205nm处检测的色谱图。

图2A显示根据本发明的分离的酸性级分的LC-MS色谱图，指示三萜酸二聚体的混合物。

图2B显示图2A的色谱图的主峰的质谱。

图2C显示放大的如图2A中所示的保留时间6.09分钟处的峰的质谱。

图2D显示放大的如图2A中所示的保留时间6.17分钟处的峰的质谱。

图3A显示乳香的分离的酸性级分的TOF质谱，指示单体三萜酸和二聚三萜酸的混合物。

图3B是图3A的峰的列表。

图4显示根据实施例1所制备的分离的酸性级分的制备型色谱图。峰编号与图1的分析型色谱图的峰编号一致。

图5A显示模绕酮酸的¹H-NMR谱，所述模绕酮酸通过制备型HPLC从根据实施例1制备的酸性级分分离。

图5B显示模绕酮酸的¹³C-NMR谱，所述模绕酮酸通过制备型HPLC从根据实施例1制备的酸性级分分离。

图6A显示齐墩果酮酸的¹H-NMR谱，所述齐墩果酮酸通过制备型HPLC从根据实施例1制备的酸性级分分离。

图6B显示齐墩果酮酸的¹³C-NMR谱，所述齐墩果酮酸通过制备型HPLC从根据实施例1制备的酸性级分分离。

图7A显示乳香二烯酸的¹H-NMR谱，所述乳香二烯酸通过制备型HPLC从根据实施例1制备的酸性级分分离。

图7B显示乳香二烯酸的¹³C-NMR谱，所述乳香二烯酸通过制备型HPLC从根据实施例1制备的酸性级分分离。

图8A显示异乳香二烯酸的¹H-NMR谱，所述异乳香二烯酸通过制备型HPLC从根据实施例1制备的酸性级分分离。

图8B显示异乳香二烯酸的¹³C-NMR谱，所述异乳香二烯酸通过制备型HPLC从根据实施例1制备的酸性级分分离。

图9A显示3-(O-乙酰基)-乳香二烯醇酸的¹H-NMR谱，所述3-(O-乙酰基)-乳香二烯醇酸通过制备型HPLC从根据实施例1制备的酸性级分分离。

图9B显示3-(O-乙酰基)-乳香二烯醇酸的¹³C-NMR谱，所述3-(O-乙酰基)-乳香二烯醇酸通过制备型HPLC从根据实施例1制备的酸性级分分离。

图10A显示3-(O-乙酰基)-异乳香二烯醇酸的¹H-NMR谱，所述3-(O-乙酰基)-异乳香二烯醇酸通过制备型HPLC从根据实施例1制备的酸性级分分离。

图10B显示3-(O-乙酰基)-异乳香二烯醇酸的¹³C-NMR谱，所述3-(O-乙酰基)-异乳香二烯醇酸通过制备型HPLC从根据实施例1制备的酸性级分分离。

图11A显示根据WO2003/097212的教导制备的酸性级分对ARPE-19细胞的作用。

图11B显示根据本发明的实施例2制备的酸性级分对ARPE-19细胞的作用。

图11C显示棉籽油运载体（vehicle）对ARPE-19细胞的作用。

图12A显示从根据WO2003/097212的教导制备的酸性级分分离的己烷不可溶级分对ARPE-19细胞的作用。

图12B显示根据本发明的实施例1制备的分离的酸性级分的1%（w/w）乙醇溶液对ARPE-19细胞的作用。

图12C显示乙醇运载体对ARPE-19细胞的作用。

图13A-C显示用RPh-Ac处理的细胞（上图）或未处理的细胞（运载体，下图）并用针对以下的抗体（Ab.）进行染色的照片：突触素（图13A）；磷酸化的Akt（pAk^Ser473）（图13B）；磷酸化的GSK3-β^Ser9（图13C）。

图14A显示的图描绘对于本发明的不同的组合物，大鼠MCAO模型关于从对侧爪清除胶带的时间的结果。

图14B显示描绘以下组合物对从对侧爪清除胶带的基线改变倍数的图：异乳香二烯酸（IMDA）、或异乳香二烯酸和乳香二烯酸的组合（IMDA+MDA）；或齐墩果酮酸、异乳香二烯酸和乳香二烯酸的组合（OA+MDA+IMDA）。

图15显示大鼠的照片，表明棉籽油运载体（左图）、RPh-Ac（中图）和OA+MDA+IMDA的组合（右图）对来自实施例5的MCAo模型的大鼠中的外科伤口的愈合的作用。

发明详述

本发明的发明人已惊人地发现，乳香的分离的酸性级分在改善或逆转神经功能缺损、中风康复、皮肤伤口的愈合、促进组织修复和促进动物寿命延长当中表现了高度活性。

本文首次公开了，由于其刺激和诱导细胞再生的多种活性，如本文所描述的乳香的分离的酸性级分以及从中分离的化合物的组合，可用作用于大量治疗适应症的药物组合物中的活性成分。

有利地，本发明的组合物可用于治疗神经功能缺损和皮肤病症的方法中。在与人类和非人类受治疗者的细胞接触后，组合物在包括皮肤、内皮、粘膜、骨、腱和软骨的一系列广泛的组织、细胞区室（cell compartment）和细胞谱系中诱导细胞分化。此外，可开发药物组合物的细胞分化活性以用于促进医疗装置、植入物和器官移植物的体内并入。并且，药物组合物可用于在动物中促进寿命延长。

定义

如本文所用的，术语“乳香（mastic）”、“乳香树脂（mastic resin）”、“乳香（gummastic）”和“乳香（mastic gum）”互换地使用，指作为来自分类为漆树科的任何树的渗出物获得的树脂（也称作油树脂）。黄连木属的树，最著名的是乳香黄连木，且尤其是栽培品种乳香黄连木Chia品种（P.lentiscus L.cv.Chia）（在希腊的Chios岛上栽培）以其乳香高产量而闻名。其他品种包括P.lentiscus L.var.emarginata Engl.和P.lentiscusL.var.latifolia Coss。更多黄连木属物种包括：例如，大西洋黄连木、P.palestina、P.saportae、黑黄连木、阿月浑子和全缘叶黄连木。

如本文所用的，术语“乳香的分离的酸性级分”指在利用至少一种极性和至少一种非极性有机溶剂萃取乳香之后，通过对从而获得物质的溶液进行酸碱萃取和分离所得的酸性级分而获得的级分。本发明的分离的酸性级分在极性有机溶剂和非极性有机溶剂中均是可溶的。

如本文所用的，术语“多个”指多于一个，优选地多于两个。如本文所用的术语“协同的”意为多于加和的。

如本文所用的，术语“酸碱萃取”指其中用一种或多种碱性水溶液处理/萃取含有机酸性组分和有机非酸性组分的有机溶剂溶液的方案。其结果是，有机酸性组分被去质子化并从而转化为其对应的离子盐形式，并且从而将溶于所述碱性水溶液中。非酸性有机组分将留在原始的有机溶液中。随后，对含酸性组分的盐形式的碱性水溶液进行酸化，导致了有机酸性组分的质子化酸性形式的再形成。根据酸性化合物的性质，可用多种方式将这些质子化酸形式（酸性级分）从酸化的水溶液中移去。用于将酸性级分从酸化的溶液中移去的一个选择是通过萃取到适宜的有机溶剂中。实施例1是如上所述的酸碱萃取的非限制性例子。

根据酸性化合物在酸化的水溶液中的溶解度，酸性级分可经由酸化的水溶液的过滤来分离。

代替将碱性水溶液用于酸碱萃取，还可使用离子交换树脂的碱性形式。在这些情况下，酸性有机组分（酸性级分）以其去质子化的阴离子形式被树脂所捕捉。随后从初始溶液中移出树脂，留下非酸性的组分。随后通过用适宜的酸性溶液处理树脂将酸性组分（酸性级分）从树脂中释放。

离子交换树脂用于酸碱萃取的应用尤其适宜于规模扩大的工艺，且可用于（半）连续萃取工艺的开发。

以上的酸碱萃取和其他变化形式的例子可见于许多教科书和其他出版物中，并认为是本领域技术人员所公知的。有用的教科书的例子为“Vogel’s Textbook of PracticalOrganic Chemistry”，第5版，1989，（第162-163页）。

如本文所用的，术语“纯度”指制备物中特定的化学化合物的含量，表示为特定的化学化合物相对于制备物中的其他化学化合物的基于重量/重量的百分比。

如本文所用的，“萜化合物（terpene compound）”指含异戊二烯的烃，其具有头接尾方向的异戊二烯单元（CH₂=C(CH₃)-CH=CH₂）。萜烃通常具有分子式(C₅H₈)_n，且包括半萜(C5)、单萜(C10)、倍半萜(C15)、二萜(C20)、三萜(C30)和四萜(C40)，其分别具有1、2、3、4、6和8个异戊二烯单元。萜可被进一步分类为无环的或环状的。

如本文所用的，“类萜（terpenoid）”和“类萜化合物（terpenoid compound）”互换地指萜相关的化合物，其除异戊二烯单元之外含有氧原子，且因此包括醇、醛和酮。类萜根据碳原子的数目以相似于萜的方式细分，且因此包括类半萜（hemiterpenoid）(C5)、类单萜（monoterpenoid）(C10)、类倍半萜（sesquiterpenoid）(C15)、类二萜（diterpenoid）(C20)、类三萜（triterpenoid）(C30)和类四萜（tetraterpenoid）(C40)，其分别具有1、2、3、4、6和8个异戊二烯单元。类萜的骨架可通过片段的缺失或移动而与异戊二烯单元的严格相加性不同，所述片段通常是甲基。类单萜的例子包括樟脑、丁香酚和冰片。类二萜的例子包括植醇和紫杉酚。类三萜的例子包括角鲨烯和羊毛甾醇。

如本文所用的，“萜酸”指含至少一个羧酸基团的类萜化合物。萜酸可另外地含有一个或多个其他的含氧官能团，包括羟基、酮基、醛基、醚基（环状的和非环状的）和酯基（环状的和非环状的）。

如本文所用的，“三萜酸”指含有至少一个羧酸基团的类三萜化合物。三萜酸可另外地含有一个或多个其他含氧官能团，包括羟基、酮基、醛基、醚基（环状的和非环状的）和酯基（环状的和非环状的）。

如本文所用的，“萜酸的寡聚形式”指寡聚萜酸，其中单体单元为相同的萜酸或不同的萜酸，且以任何可能的排列连接，且通过任何可能的键或官能团彼此连接，比如C-C键、酯基或醚基。

如本文所用的，“三萜酸的寡聚形式”指寡聚三萜酸，其中单体单元为相同的三萜酸或不同的三萜酸，且以任何可能的排列连接，且通过任何可能的键或官能团彼此连接，比如C-C键、酯基或醚基。

如本文所用的，术语“乳香二烯酸（masticadienoic acid）”、“乳香二烯酮酸（masticadienonic acid）”、“乳香二烯酸（masticadienoic）”和“乳香二烯酮酸（masticadienonic acid）”可互换地使用。

如本文所用的，术语“异乳香二烯酸（isomasticadienoic acid）”、“异乳香二烯酮酸（isomasticadienonic acid）”、“异乳香二烯酸（isomasticadienoic）”和“异乳香二烯酮酸（isomasticadienonic）”可互换地使用。

如本文所用的，“基本上不含”意为根据本发明的制备物或药物组合物一般含有低于约5%的指定物质。例如，低于约3%、低于1%、低于0.5%、低于0.1%。

如本文所用的，“治疗有效量”指显著诱导、促进或导致期望的治疗效果的药物成分的量。

如本文所用的，“药学上可接受的载体”指用于增强与其一同配制的药物成分的递送性能和/或药代动力学性能的稀释剂或运载体，但其自身无治疗效果，也不会在受治疗者中诱导或导致任何不想要的或不适当的效果或不良反应。

如本文所用的，“药学上可接受的疏水载体”指在其中溶解或悬浮乳香级分的疏水的非极性稀释剂或运载体。

如本文所用的，“细胞分化”指其中较不特化的细胞变为较特化的细胞的过程。细胞分化可基于多种细胞特性中的任一种的改变而建立，所述特性包括但不限于大小、形状、细胞器外观、膜电位、代谢活性和信号响应性。可对细胞类型给出具体“级”以描述分化程度。

如本文所用的，“神经功能缺损”指感觉、认知或运动功能中的至少一种与功能或活性的先前的水平相比较和/或与根据公认标准匹配的非受损的个体相比较下降或减少。

如本文所用的关于本文所指定的数值的术语“约”应被理解为如所指定的值+/-10%。

三萜酸和包括萜酸的分离的酸性级分

在一些实施方案中，本发明提供了包括萜酸的特定的组合的组合物，比如见于乳香的分离的酸性级分中的萜酸的特定的组合的组合物。在一些实施方案中，本发明提供了由特定的三萜酸化合物组成的组合物，这些组合物显示在神经系统疾患的治疗中与相同的单独的三萜酸化合物相比较具有意外的协同作用。三萜酸化合物可来自植物来源，尤其是乳香，或可以是化学合成反应的产物。在某些情况下，组合物可对应于化合物的组合，其中某些是化学合成的且某些来源于植物来源。

可用于获得本发明的组合物的植物物种包括但不限于，黄连木属、松属、云杉属、刺柏属、Alsies、落叶松属、罗勒属、月桂属和薰衣草属的那些。

有用的黄连木属的物种包括但不限于，乳香黄连木、大西洋黄连木、P.palestina、P.saportae、黑黄连木、阿月浑子和全缘叶黄连木。

乳香的商业上的制备物是可获得的，例如，从Chios Gum Mastic GrowersAssociation或G.Baldwin&Co.,U.K获得。

用于确定所获得的乳香的分离的酸性级分的精确化学组成的分析方法包括核磁共振（例如¹HNMR和¹³CNMR）、粘度测定法、多种质谱测定方法（例如MALDI-TOF）、HPLC、组合方法诸如液相色谱-质谱测定法（LC-MS）、UV-VIS光谱测定法、IR和FT-IR光谱测定法和本领域中已知的其他方法。

用于获得乳香的分离的酸性级分的方法可如以下所描述。通过概述的方式，将收集的植物物质，例如乳香与适宜的溶剂在适宜的器皿中混合，所述溶剂通常是极性溶剂。适宜的极性溶剂包括例如，醇、醚、酯、酰胺、醛、酮、腈、和其组合。

极性有机溶剂的具体的例子是甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、1-丁醇、2-丁醇、仲-丁醇、叔-丁醇、1-戊醇、2-戊醇、3-戊醇、新戊醇、3-甲基-1-丁醇、2-甲基-1-丁醇、3-甲基-2-丁醇、2-甲基-2-丁醇、乙二醇、乙二醇单甲醚、乙醚、甲基乙醚、乙基丙醚、甲基丙醚、1,2-二甲氧基乙烷、四氢呋喃、二氢呋喃、呋喃、吡喃、二氢吡喃、四氢吡喃、乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙醛、甲酸甲酯、甲酸乙酯、丙酸乙酯、丙酸甲酯、二氯甲烷、三氯甲烷、二甲基甲酰胺、乙酰胺、二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮、丙酮、乙基甲基甲酮、二乙基甲酮、乙腈、丙腈、和其组合。

优选地混合乳香和溶剂而使溶剂大量过量，例如10:1或20:1。在范围从几分钟到几小时的时间段中可周期性地或持续地搅拌混合物。可不做任何处理而倾去溶剂，或可选地使混合物首先经历低速离心，如本领域所知，例如以100至2000rpm离心。从提取物中回收不可溶的物质并将新鲜的溶剂等份添加到不可溶的物质中，从而重复提取和溶解过程若干循环，以获得尽可能多的极性溶剂可溶的化合物。在最终的溶解步骤之后，合并含有极性溶剂可溶物质的提取物并蒸发极性溶剂（例如通过利用如本领域中已知的旋转蒸发），从而产生极性溶剂可溶的物质，可将其称作粗产物，或“第一步”提取物。

将第一步提取物物质与非极性有机溶剂混合，并通过振荡1至2小时的时间段来萃取。适宜的非极性溶剂包括无环的或环状的、饱和的或不饱和的脂族烃和芳族烃，例如，C5-C10烷烃、C5-C10环烷烃、C6-C14芳族烃、和其组合。前述中的每一种可任选地被一个或多个卤素所取代，例如，C7-C14全氟烷烃。非极性有机溶剂的具体的例子是戊烷、己烷、庚烷、辛烷、壬烷、癸烷、环戊烷、环己烷、环庚烷、苯、甲苯、二甲苯和其异构体和混合物。将在非极性溶剂存在下保持不可溶的或沉淀的物质去除并弃去。然后通过蒸发非极性溶剂（例如通过旋转蒸发）获得非极性溶剂可溶级分。该级分可称为纯化的或“二步骤”提取物，对应于乳香的分离的级分，其特征为在极性溶剂和非极性溶剂中均可溶的事实，同时在极性溶剂中可溶但在非极性溶剂中不可溶的物质已被去除。

随后将第二步提取物质溶于有机溶剂中并用碱性水溶液重复（例如，四次）萃取该溶液。可进行用不同的碱性水溶液的第二萃取。用稀酸水溶液对从而获得的碱性级分酸化至酸性pH。用有机溶剂萃取酸化的水溶液若干次。将从而获得的合并的有机溶剂萃取物（也称作“三步骤提取物”）用干燥剂处理。然后通过蒸发有机溶剂（例如通过旋转蒸发）获得该乳香的分离的酸性级分。该级分被称作乳香的分离的酸性级分。如本领域中已知的，在其他步骤之间可进行干燥和/或溶剂去除的另外的中间步骤。可选地，第二步提取物质可与碱性离子交换树脂例如A26混合。用非水的酸性溶液处理分离的离子交换树脂以将酸性级分从树脂释放。然后通过蒸发该非水溶剂和任何多余的酸获得分离的酸性级分。

区分本发明的乳香的分离的酸性级分和现有技术提取物的特征是：在方案的前两步中已去除了某些酸性化合物，否则其将留在最终酸性级分中。根据本发明的教导，在分离工序的前两步过程中去除的酸性化合物对本文所公开的分离的酸性级分的有利的生物活性具有有害作用。

还可将三步提取物进一步干燥，例如通过高真空处理（例如<0.01毫巴持续长达数天）以去除残余溶剂和其他挥发性物质，称重并与非极性有机溶剂或其他载体混合以使其溶解。

在一些实施方案中，本发明的分离的级分可通过包括以下步骤的方法来获得：

(a)用极性有机溶剂处理乳香；

(b)分离在所述极性有机溶剂中可溶的级分；

(c)任选地去除所述极性有机溶剂；

(d)用非极性有机溶剂处理步骤(b)或(c)中获得的可溶级分，

(e)分离在所述非极性有机溶剂中可溶的级分；

(f)任选地去除所述非极性有机溶剂；

(g)将步骤(f)中获得的级分溶解于有机溶剂中；

(h)用碱性溶液处理步骤(g)中获得的溶液以获得碱性级分；和

(i)用酸溶液酸化步骤(h)中获得的碱性级分。

在一些实施方案中，步骤(h)中用碱性溶液进行的处理（碱化）包括用一种或多种适宜的碱性水溶液萃取步骤(g)中获得的溶液；或将步骤(g)中获得的溶液与碱性离子交换树脂接触，可随后用酸性溶液处理树脂以释放所捕捉的酸性级分。然后通过利用例如施加真空去除任何挥发物而获得分离的酸性级分。

在一些实施方案中，步骤(h)包括将步骤(g)中获得的溶液与碱性离子交换树脂接触，并此后通过过滤除去碱性离子交换树脂。随后可用酸性溶液处理碱性离子交换树脂以释放所捕捉的酸性级分。然后通过利用例如施加真空去除任何挥发物而获得分离的酸性级分。

在一些实施方案中，该方法还包括以下的步骤：

(j)用有机溶剂萃取步骤(i)中获得的酸化的级分；

k)任选地用干燥剂与步骤(j)中获得的有机级分接触以去除剩余的水；

(l)从步骤(i)、(j)或(k)中的任一步骤中获得的级分中去除有机溶剂和/或多余的酸；和

(m)将步骤(l)中获得的分离的级分溶于载体中。

该方法还可包括在步骤(c)、(f)或(l)中的任何步骤之后去除溶剂。溶剂去除可通过本领域中已知的任何方式来进行，例如旋转蒸发、施加高真空和其组合。在一些实施方案中，步骤(a)至(c)在步骤(d)至(f)之前进行或反之。在一些实施方案中，极性有机溶剂包括乙醇，非极性有机溶剂包括己烷，且用于酸碱萃取的有机溶剂包括乙醚。如本领域技术人员所易于理解地，步骤(a)至(c)和步骤(d)至(f)可各自独立地进行多个循环以优化提取过程和产物的纯度。

在一些实施方案中，步骤(h)包括用碱性水溶液萃取步骤(g)中获得的溶液，并收集从中获得的有机级分。在一些实施方案中，该方法还可包括将从步骤(h)中获得的有机级分与在步骤(i)、(j)或(k)的任一步骤中获得的级分合并。

在一些实施方案中，将步骤(h)中获得的有机级分与以从步骤(h)中获得的有机级分的0.1至50%的范围中的量的步骤(i)、(j)或(k)中的任一步骤中获得的级分合并。在一些实施方案中，该量在从约0.5-50%；或2至25%；或0.1至10%的范围中。

分离的酸性级分可包括至少一种萜酸，比如多种三萜酸组合的组合。三萜酸包括，例如，乳香二烯醇酸；异乳香二烯酸；异乳香二烯醇酸；3-O-乙酰基乳香二烯醇酸；3-O-乙酰基表-乳香二烯醇酸；3-O-乙酰基异乳香二烯醇酸；3-O-乙酰基表-异乳香二烯醇酸；齐墩果酮酸；齐墩果醇酸；乌宋酸；熊果酸；模绕酮酸；和3-氧代-羽扇-20(29)-烯-28-酸。

在一些实施方案中，分离的酸性级分可包括至少两种萜酸化合物，选自，例如，乳香二烯醇酸；异乳香二烯酸；异乳香二烯醇酸；3-O-乙酰基乳香二烯醇酸；3-O-乙酰基表乳香二烯醇酸；3-O-乙酰基异乳香二烯醇酸；3-O-乙酰基表-异乳香二烯醇酸；齐墩果酮酸；齐墩果醇酸；乌宋酸；熊果酸；模绕酮酸；和3-氧代-羽扇-20(29)-烯-28-酸。

在一些实施方案中，分离的酸性级分可包括至少三种萜酸化合物，选自，乳香二烯醇酸；异乳香二烯酸；异乳香二烯醇酸；3-O-乙酰基乳香二烯醇酸；3-O-乙酰基表乳香二烯醇酸；3-O-乙酰基异乳香二烯醇酸；3-O-乙酰基表-异乳香二烯醇酸；齐墩果酮酸；齐墩果醇酸；乌宋酸；熊果酸；模绕酮酸；和3-氧代-羽扇-20(29)-烯-28-酸。

在一些实施方案中，分离的酸性级分可包括至少两种萜酸化合物，选自，乳香二烯醇酸，异乳香二烯酸和齐墩果酮酸。

在一些实施方案中，分离的酸性级分可基本上不含特定的三萜酸，诸如，例如，乳香二烯酸，或模绕酮酸。每种可能性是独立的实施方案。

在一些实施方案中，分离的酸性级分可基本上不含精油。

并且，分离的酸性级分中的萜酸和或三萜酸可以是单体形式、或寡聚形式，比如二聚体、三聚体、或其组合。

药物组合物

用于本发明的组合物包括治疗有效量的本文描述的乳香的分离的酸性级分，和药学上可接受的疏水载体。

本发明还提供了包括至少一种三萜酸；和药学上可接受的载体的组合物。如前所述，三萜酸可分离自植物产物，比如乳香，或其可以是化学合成的产物。并且，组合物可包括三萜酸的组合，其中的一些是化学合成的，且其中的一些分离自一种或多种植物产物。在某些实施方案中，组合物可由作为药物活性成分的至少两种三萜酸化合物和药学上可接受的载体组成。此外，组合物可包括三萜酸的二聚形式、三聚形式和更高的寡聚形式；寡聚体可从相同的和不同的单体三萜酸形成。在一些实施方案中，组合物可由作为药物活性成分的至少三种三萜酸化合物和药学上可接受的载体组成。

为制备用于治疗应用的组合物，可使用适宜的载体，比如疏水载体，包括药学上可接受的油，任选地与蜡组合，如本文所描述。

疏水载体包括至少一种油，比如例如，矿物油、植物油、或其组合。

术语“矿物油”指从石油的蒸馏中获得的澄清无色几乎无臭和无味的液体。其还可称为白油、白矿物油、液体凡士林（liquid petrolatum）、液体石蜡或白石蜡油。根据本发明的一些实施方案，矿物油是轻质矿物油，其为可作为NF（National Formulary，国家处方集）级产品或作为USP（US Pharmacopoeia，美国药典）级产品从商业上可获得的产品。对于本发明中的应用，矿物油优选地无芳香剂或不饱和的化合物。

适宜的植物油包括，但不限于，棉籽油、橄榄油、杏仁油、油菜籽油、椰子油、玉米油、葡萄籽油、花生油、藏红花油、芝麻油、大豆油、或其组合。在一些实施方案中，矿物油是轻质矿物油。

药学上可接受的载体可可选地或另外地包括油替代物。油替代物包括具有至少10个碳的烷烃（例如，异十六烷），苯甲酸酯、脂族酯、无致粉刺性酯（noncomodogenic ester）、挥发性硅酮化合物（例如，环甲硅油），和挥发性硅酮替代物。苯甲酸酯的例子包括C₁₂C₁₅烷基苯甲酸酯、异硬脂酰苯甲酸酯、2-乙基己基苯甲酸酯、二丙二醇苯甲酸酯、辛基十二烷基苯甲酸酯、硬脂酰苯甲酸酯和山嵛醇苯甲酸酯。脂族酯的例子包括C₁₂C₁₅烷基辛酸酯和马来酸二辛酯。无致粉刺性酯的例子包括异壬酸异壬酯、异壬酸异癸酯、二异硬脂酰二聚二亚油酸酯、花生醇丙酸酯和异十三烷基异壬酸酯。挥发性硅酮替代物的例子包括癸酸异己酯、异壬酸辛酯、辛酸异壬酯和二乙二醇二辛酸酯。

环甲硅油是蒸发的硅酮，其可被含于载体中以协助生成适应于从喷雾分配器中喷出的组合物。并且，由于其蒸发性质，环甲硅油可协助将制剂保留和固定在其所喷雾的表面，例如伤口位置。

疏水载体还可包括至少一种蜡。蜡包括例如，蜂蜡；植物蜡，甘蔗蜡、矿物蜡和合成的蜡。植物蜡包括例如，巴西棕榈蜡，小烛树蜡，小冠椰子蜡和荷荷巴蜡。矿物蜡包括，例如，石蜡、褐煤蜡、微晶蜡和地蜡。合成的蜡包括例如，聚乙烯蜡。

药物组合物可以多种形式中的任一种来配制，诸如例如，胶囊（包括软胶囊）、片剂、凝胶、脂质体、栓剂、悬浮剂、软膏、溶液、乳液或微乳液、薄膜、粘固剂、粉末、胶、气溶胶、喷雾剂和凝胶。

为制备药物组合物，可适宜地将乳香的分离的酸性级分配制为包合复合物、纳米乳液、微乳液、粉末和脂质体。在一些实施方案中，包合复合物包括至少一种环糊精。在一些实施方案中，环糊精包括羟丙基-β-环糊精。在一些实施方案中，纳米乳液包括具有小于800nm的平均粒径的液滴。在一些实施方案中，液滴具有小于500nm的平均粒径。在一些实施方案中，液滴具有小于200nm的平均粒径。在一些实施方案中，粉末是喷雾干燥的粉末。在一些实施方案中，脂质体包括多层囊泡。在一些实施方案中，微乳液包括非离子表面活性剂。非离子表面活性剂包括，但不限于，聚氧乙烯蓖麻油、聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯（聚山梨醇酯）、泊洛沙姆、维生素E衍生物、聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯硬脂酸酯、饱和的多糖酵解的甘油酯、或其组合。

本文在实施例7-11中公开了乳香的分离的酸性级分的不同的制剂和其制备。本发明的药物组合物可通过实现其预期目的的任何方式来施用。例如，施用可通过，例如，口服施用途径、胃肠外施用途径、局部施用途径、透皮施用途径比如例如皮下施用途径、静脉内施用途径、肌内施用途径、皮内施用途径、腹膜内施用途径、动脉内施用途径、子宫内施用途径、尿道内施用途径、心脏内施用途径、大脑内施用途径、脑室内施用途径、肾内施用途径、肝内施用途径、腱内施用途径、骨内施用途径、鞘内施用途径、皮肤施用途径、阴道施用途径、直肠施用途径、吸入施用途径、鼻内施用途径、眼施用途径、耳施用途径和口腔施用途径。

施用可另外包括诸如电穿孔或声裂法的技术或方法以协助其递送，例如，透皮递送。可使用的其他技术包括例如，射频或加压喷雾应用。

施用的剂量将取决于受治疗者的年龄、健康和体重、并行治疗的应用（若有的话）、治疗的频率和期望的效果的性质。任何单位剂型中本发明的乳香的分离的酸性级分的量包括治疗有效量，其可根据接受者受治疗者、施用途径和频率而不同。

通常，药物组合物中存在的乳香的分离的酸性级分的量基于组合物的总重量可适宜地在重量/重量基础上从约0.01%至约50%的范围中，比如，0.01%至约25%，比如0.01%至约12%的范围中。对于局部应用，组合物中乳香的分离的酸性级分的百分比可在从约0.05%至约2.5%的范围中。对于通过注射施用，组合物中的乳香的分离的酸性级分可适宜地在从约0.1%至约7%的范围中。对于口服施用，组合物中的乳香的分离的酸性级分的百分比可在从约0.005%至约7%的范围中。

在示例性的实施方案中，乳香二烯酸和异乳香二烯酸在由作为活性成分的该两种化合物组成的组合物中的量可为每种化合物在约0.05%至约20%的范围中。对于通过注射施用，每种化合物的量可在从约0.1%至约10%的范围中。对于局部施用，每种化合物的量可在从约0.5%至约12%的范围中。对于口服施用，每种化合物的量可在从约0.5%至约15%的范围中。

在示例性的实施方案中，齐墩果酮酸、乳香二烯酸和异乳香二烯酸在由作为活性成分的该三种化合物组成的组合物中的量可为每种化合物在约0.05%至约15%的范围中。对于通过注射施用，每种化合物的量可在从约0.1%至约10%的范围中。对于局部施用，每种化合物的量可在从约0.5%至约12%的范围中。对于口服施用，每种化合物的量可在从约0.5%至约15%的范围中。

本发明的药物组合物可以本领域技术人员已知的方式来制造，例如，通过常规的混合、粒化、制造糖衣药丸、软胶封装、溶解、萃取或冻干方案。用于口服施用的药物组合物可通过将活性化合物与固体和半固体赋形剂和适宜的防腐剂、和/或抗氧化剂混合来获得。任选地，可磨碎和处理所得的混合物。若必要，在添加适宜的辅助剂后，所得的颗粒混合物可用于获得片剂、软胶、胶囊或糖衣药丸核心。

适宜的赋形剂具体为填充剂，诸如糖类，例如，乳糖或蔗糖，甘露醇或山梨醇；纤维素制备物和/或磷酸钙，例如，磷酸三钙或磷酸氢钙；和粘合剂，例如淀粉糊，其利用例如，玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、马铃薯淀粉，明胶，黄蓍胶，甲基纤维素，羟丙基甲基纤维素，羧甲基纤维素钠，和/或聚乙烯吡咯烷酮。若需要，可添加崩解剂，如上述淀粉以及羧甲基淀粉、交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或海藻酸或其盐，比如海藻酸钠。辅助剂为流动调节剂和润滑剂，例如，二氧化硅、滑石、硬脂酸或其盐，比如硬脂酸钠或硬脂酸钙，和/或聚乙二醇。糖衣药丸核心设有适宜的包衣，若需要，该包衣对胃液具有耐受性。为此目的，可使用浓缩的糖溶液，其可任选地包含阿拉伯胶、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇和/或二氧化钛、漆溶液和适宜的有机溶剂或溶剂混合物。为生成对胃液具有耐受性的包衣，使用适宜的纤维素制备物比如醋酸纤维素邻苯二甲酸酯或羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯的溶液。可向片剂或糖衣药丸包衣添加染料或颜料，例如以用于识别或便于表征活性化合物剂量的组合。

用于口服施用的其他药物组合物包括由明胶制成的压接胶囊（push-fitcapsules）和由明胶和增塑剂诸如甘油或山梨醇制成的密封软胶囊。压接胶囊可包含颗粒形式的活性化合物，该活性化合物可与如下混合：填充剂，诸如乳糖；粘合剂，诸如淀粉；和/或润滑剂，诸如滑石或硬脂酸镁；以及任选地，稳定剂。在软胶囊中，活性化合物优选地溶于或悬浮于适宜的液体中，诸如脂肪油或液体石蜡。此外，可添加稳定剂。

用于口服施用的其他药物组合物包括薄膜，该薄膜被设计为粘附于口腔粘膜，如例如以下中所公开的：美国专利第4,713,243号；第5,948,430号；第6,177,096号；第6,284,264号；第6,592,887号和第6,709,671号。

栓剂形式的药物组合物由活性化合物与栓剂基料的组合组成。适宜的栓剂基料包括例如，天然或合成的甘油三酯、聚乙二醇或石蜡烃。

用于胃肠外施用的制剂视情况包括活性化合物的悬浮液和微粒分散体。在一些实施方案中，可施用油性注射悬浮液。适宜的亲脂性溶剂或载体包括脂肪油，例如，芝麻油或合成的脂肪酸酯，例如，油酸乙酯、甘油三酯、聚乙二醇-400、克列莫佛或环糊精。注射悬浮液可包含使悬浮液粘度增大的物质，包括，例如，羧甲基纤维素钠、山梨醇和/或葡聚糖。任选地，悬浮液还可包含稳定剂。

还可利用包含活性成分的脂质体制备药物组合物。如本领域中已知的，脂质体一般来自磷脂或其他脂类物质。脂质体由分散在水介质中的单层或多层水合液态晶体形成。任何能形成脂质体的无毒的、生理上可接受的和可代谢的脂质均可使用。一般，优选的脂质为磷脂和磷脂酰胆碱（卵磷脂），天然的和合成的均可。形成脂质体的方法是本领域中已知的，如以下中所公开的，例如，Prescott,编,Methods in Cell Biology,XIV卷,AcademicPress,New York,N.Y.(1976)和美国专利第7,048,943号。

用于局部施用的制剂包括软膏。适宜的载体包括植物油或矿物油、白凡士林、支链脂肪或油、动物脂肪和蜡。优选的载体是活性成分可溶于其中的载体。还可包含稳定剂、湿润剂和抗氧化剂以及，若需要的话，包含赋予颜色或香味的剂。通过如下可制成软膏：例如，将含活性成分的植物油诸如杏仁油的溶液与温软的石蜡混合，并使混合物冷却。

药物组合物可包括水包油乳液或微乳液，以有助于其用于口服施用、胃肠外施用或局部施用的制剂。这样的乳液/微乳液一般包含脂质、表面活性剂、任选地湿润剂以及水。适宜的脂质包括通常已知可用于生成水包油乳液/微乳液的脂质，例如脂肪酸甘油酯。适当的表面活性剂包括通常已知可用于生成水包油乳液/微乳液的表面活性剂，其中脂质被用作乳液中的油成分。非离子型表面活性剂可以是优选的，比如例如，乙氧基化蓖麻油、磷脂和环氧乙烷与环氧丙烷的嵌段共聚物。适宜的湿润剂（若使用），包括例如丙二醇或聚乙二醇。

药物组合物可被配制成凝胶的形式，比如由凝胶形成聚合物诸如卡拉胶、黄原胶、梧桐胶、阿拉伯胶、刺槐豆胶、瓜尔豆胶形成的水凝胶。水凝胶可与含活性成分的水包油乳液混合。

药物组合物可被配制为粘固剂的形式，诸如矫形手术中所用的含聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）或磷酸钙的那些粘固剂。

药物组合物可被配制为粉末形式，尤其是诸如利用射频用于经皮应用的粉末，如例如美国专利第6,074,688号和第6,319,541号和WO2006/003659中所描述的。

药物组合物可以胶的形式来配制，比如用于伤口闭合应用的包括氰基丙烯酸辛酯的那些胶。

治疗应用

本发明提供了在需要治疗的受治疗者中治疗神经功能缺损、治疗皮肤和头皮疾患、诱导组织修复和伤口的治疗应用和方法。该方法包括向受治疗者施用治疗有效量的包括如本文所描述的乳香的分离的酸性级分的组合物。在一些实施方案中，该方法包括向受治疗者施用治疗有效量的包括选自以下的至少两种三萜酸的组合的组合物：乳香二烯醇酸；异乳香二烯酸；异乳香二烯醇酸；3-O-乙酰基乳香二烯醇酸；3-O-乙酰基表乳香二烯醇酸；3-O-乙酰基异乳香二烯醇酸；3-O-乙酰基表-异乳香二烯醇酸；和齐墩果酮酸。在另外的实施方案中，该方法包括向受治疗者施用治疗有效量的包括选自乳香二烯醇酸；异乳香二烯酸和齐墩果酮酸的至少两种三萜酸的组合的组合物。

在一些实施方案中，该方法包括向受治疗者施用治疗有效量的包括由乳香二烯酸和异乳香二烯酸组成的三萜酸的组合物。在另外的示例性的实施方案中，该方法包括向受治疗者施用治疗有效量的包括由齐墩果酮酸、乳香二烯酸和异乳香二烯酸组成的三萜酸的组合物。

施用组合物的步骤可包括任何可接受的途径，包括，口服施用途径、局部施用途径、胃肠外施用途径和透皮施用途径，比如，例如，胃肠外施用包括静脉内施用途径、肌内施用途径、皮下施用途径、皮内施用途径、腹膜内施用途径、动脉内施用途径、子宫内施用途径、尿道内施用途径、心脏内施用途径、大脑内施用途径、脑室内施用途径、肾内施用途径、肝内施用途径、腱内施用途径、骨内施用途径、鞘内施用途径、皮肤施用途径、阴道施用途径、直肠施用途径、吸入施用途径、鼻内施用途径、眼施用途径、耳施用途径和口腔施用途径。

在一些实施方案中，施用的步骤包括将特定类型、特定谱系或处于分化的特定阶段的细胞与组合物接触。细胞可以是多种细胞类型的任一种，包括，尤其是，神经细胞、神经元细胞、内皮细胞、上皮细胞和所述谱系的干细胞。并且，细胞可以是任何谱系的，例如，外胚层谱系、中胚层谱系、内胚层谱系和所述谱系的干细胞。在不同的实施方案中，在体内、离体（ex vivo）或体外进行接触细胞的步骤。在一些实施方案中，待接触的细胞是干细胞且细胞的接触在体内、离体和体外进行。在一些实施方案中，在体内接触干细胞。在一些实施方案中，离体接触干细胞。在一些实施方案中，在体外接触干细胞。

本文所公开的用于治疗神经功能缺损的方法对于罹患神经变性病症和疾病的受治疗者是尤其有利的，所述神经变性病症和疾病包括，尤其是，创伤、中风、血管性痴呆、老年性痴呆、阿尔茨海默病、肌萎缩侧索硬化症（ALS）、多发性硬化症（MS）和帕金森氏病。

在另外的情况下，该方法可应用于患有由于感染（例如，病毒、细菌、真菌、寄生虫）导致的神经功能缺损的受治疗者。

在一些实施方案中，该方法可应用于患有由于免疫性疾患导致的神经功能缺损的受治疗者。

在一些实施方案中，神经功能缺损由于暴露于药物诸如麻醉剂而导致。

在一些实施方案中，神经功能缺损还可与选自由精神分裂症、双相性精神障碍、抑郁、肥胖症、厌食症和恶病质组成的组的病症相关。

在一些实施方案中，皮肤和头皮疾患包括皮肤、头皮和毛发附属物，包括，例如，指甲和毛囊，的所有疾患。可受益于本发明的具体的病症包括脱发、湿疹、牛皮癣、脂溢性角化病、皮脂溢和皮肤伤口。皮肤伤口包括下肢静脉性溃疡、压迫性溃疡、糖尿病足溃疡、烧伤、截肢伤口、褥疮溃疡（褥疮）、分层皮肤供体移植物、皮肤移植的供区、医疗装置植入位点、咬伤、冻伤、刺伤、弹片伤、皮肤磨削术、挫伤、感染伤口和外科伤口。伤口可以是感染的结果；暴露于电离辐射的结果；暴露于激光的结果，或与化学剂接触的结果。

在一些实施方案中，本发明对于治疗慢性非愈合伤口可以是有效且经济的。如本领域普通技术人员所已知的，具体的治疗在促进伤口愈合中的效力可通过多种标准来评估，包括通过伤口的长度、宽度和深度随时间测量的闭合的速率、上皮形成速率、肉芽组织的形成和组织伸展强度。

在一些实施方案中，本发明对于在人类、非人类哺乳动物、鸟类和鱼中诱导和促进寿命延长可以是尤其有效的。

在一些实施方案中，本文所公开的用于诱导或促进组织再生的方法对于患有组织损伤的受治疗者是尤其有利的，所述组织损伤例如可与损害或伤害相关或是损害或伤害的结果。用于诱导或促进组织再生的方法可用于患有选自由以下组成的组的损害或伤害的受治疗者：心肌梗塞、肺栓塞、脑梗塞、外周动脉闭塞性疾病、疝、脾梗塞、静脉曲张性溃疡、轴索显微外科术、视网膜剥离、伤口（例如，烧伤、咬伤、冻伤、刺伤、弹片伤、挫伤、感染伤口或外科伤口）、感染和手术操作。在一些实施方案中，本发明对于伤口的无疤痕修复术是有效的。

在一些实施方案中，该方法可在在受治疗者中植入医疗装置之前或之后进行。医疗装置包括，但不限于，假体、人造器官或其组件、阀门、导管、试管、支架、人工膜、起搏器、传感器、内窥镜、显像装置、泵、金属丝和植入物。植入物包括，但不限于心脏植入物、耳蜗植入物、角膜植入物、颅骨植入物、牙齿植入物、颌面植入物、器官植入物、整形外科植入物、血管植入物、关节内植入物和乳房植入物。

在一些实施方案中，医疗装置是器官植入物，其在某些情况下可包括受治疗者的自体细胞。

在一些实施方案中，接触的步骤包括选自由电穿孔、声裂法、射频、加压喷雾和其组合组成的组的方式。

在一些实施方案中，接触的步骤包括在间质液和组合物之间建立接触。这对于为间质液所包围的伤口是尤其有利的。间质液和组合物之间的接触可通过用针、显微针、或包括多个针或显微针的器械刺和/或挑真皮来实现。这样的针或显微针优选地是非中空的，且可以多个的方式在诸如梳子或刷样设备上成型。

本发明的方法适宜于在人类、非人哺乳动物、鱼和鸟类中应用。

制品

本发明的方法可包括并入了含本文所描述的乳香的分离的酸性级分的组合物的制品的应用。

药物组合物可以是制品上的涂层的形式，或可被包含在与该制品构成一体的容器中。药物组合物有利地作为装置上的涂层存在，该装置被嵌入机体并为了在其中整合，例如植入物。因此药物组合物可由于乳香的分离的酸性级分在诱导细胞分化方面的活性而促进组织在植入物上闭合。

药物组合物可有利地被并入到用于伤口愈合或组织修复的制品上或制品中，例如，敷料或绷带。因此药物组合物可由于乳香的分离的酸性级分在诱导细胞分化方面的活性促进伤口愈合。

在其他情况下，药物组合物可被并入递送装置，比如针、注射装置或喷雾分配器，组合物从所述装置被递送到需要治疗的机体部位，例如伤口部位。

制品包括但不限于织物制品、尿布、伤口敷料、医疗装置、针、显微针、注射装置和喷雾分配器。在一些实施方案中，制品包括多个显微针。医疗装置和植入物如上文所述。

给出以下实施例以更充分地说明本发明的某些实施方案。但其无论如何都不应被解释为限制本发明的宽泛范围。本领域技术人员可容易地对本文所公开的原理作出多种改变和修正，而不脱离本发明的范围。

实施例

实施例1.乳香的分离的酸性级分的制备

将乳香树脂（10g）与无水乙醇（200ml）混合，并允许混合物放置过夜。在150rpm下振荡混合物约15分钟，使任何较大的不可溶的颗粒沉降20分钟，并将乙醇转移至新烧瓶。用一份新鲜的无水乙醇部分（150ml）在200rpm下振荡残余物10分钟。将该乙醇级分与第一级分混合。用另一份150ml的无水乙醇部分重复该过程，将该级分与前两个乙醇级分混合。随后，利用旋转蒸发器（水浴温度30℃）在真空中去除乙醇。向残余物添加己烷（300ml），并在150rpm下振荡混合物两小时。在封闭的烧瓶中放置过夜以完成可溶的物质的完全溶解和任何不可溶物质的沉淀，然后将澄清的己烷溶液转移至干净的、预称重的烧瓶中，并利用旋转蒸发器去除己烷，得到约6克萃取的物质。随后将所获得的萃取的物质溶于乙醚（300ML）中并用5%碳酸钠水溶液（4×100ML）萃取，然后利用0.1N氢氧化钠水溶液（3×100ML）萃取。通过缓慢添加10%的盐酸水溶液将该两种碱性水性萃取物分别酸化至pH1-2，且随后用新鲜的乙醚（3×100ML）萃取。合并由此获得的醚级分并在无水硫酸钠中干燥。在过滤掉硫酸钠之后，利用旋转蒸发器去除乙醚。得到白色固体的约3克乳香的分离的酸性级分。

为进行比较，将己烷添加到根据WO2003/092712或Parachos等人,(2007),Antimacrobial Agents and Chemotherapy,51(2),551的教导所制备的酸性级分，显示大量的该酸性级分在己烷中是不可溶的。当在如实施例4中所描述的体外测定中试验作为1%乙醇溶液的该己烷-不可溶物质时（据发现其在棉籽油中基本上不可溶），发现其可对细胞导致严重的胁迫。无水乙醇（plane ethanol）用作阴性对照且以所用的体积对细胞不导致任何胁迫或害处。此外，根据本发明制备的酸性级分的1%乙醇溶液诱导细胞有效分化成神经元细胞。该结果清楚地表明，本发明的酸性级分不含存在于现有技术所公开的酸性级分中的有害物质。

实施例2.乳香的分离的酸性级分（RPh-Ac）在USP/NF级棉籽油中的5%（w/w）组合物 的制备

向1克的来自实施例1的获得的分离的酸性级分中添加19克棉籽油（USP/NF）并以150rpm摇动混合物直至获得澄清和均一的组合物（约2小时）。

实施例3.乳香的分离的酸性级分的分离和化学表征

根据实施例1萃取来自乳香黄连木的乳香以获得级分，通过反相HPLC（图1）对其进行分析以鉴定主要成分。在与分析型标准相比较的基础上，HPLC分析与分离的级分中的模绕酮酸和齐墩果酮酸的分离的级分的存在一致。

分离的酸性级分的反相HPLC方法所用的条件为：流速：1ml/分钟；检测UV波长220nm；样品浓度1mg/ml；注入体积20μl；用20%的乙腈水溶液回洗针头和泵；ELSD-氮流速1ml/分钟；蒸发温度-80℃；雾化温度60℃；0.8%乙酸-ACN梯度。

酸性物质和制剂样品的梯度比显示于表1中：

表1

时间	A-0.8%乙酸	B-ACN
			0	20	80
5	20	80
			25	7.7	92.3

45	8	92
			48	0	100
55	0	100
			57	20	80
67	20	80

分离的酸性级分的质谱数据（图2A-D和图3A）显示的峰表明了单体三萜酸诸如模绕酮酸、齐墩果酮酸和其他三萜酸的存在（455Da处的MH⁺；477Da处的M⁺+Na）。还存在于质谱数据中的是对应于二聚三萜酸的峰（910Da处的MH⁺；932Da处的M⁺+Na），以及指示三萜酸的三聚形式的峰（1364Da处的MH⁺；1387处的M⁺+Na）。

为分离和确定分离的酸性级分的进一步的主要成分的结构，进行了制备型HPLC方法。利用该方法，通过制备型HPLC随后分离了分离的酸性级分的6种主要成分。

在30x250mm制备型柱（ACE-121-2530）上进行制备型HPLC方法。利用5ML环注射分离的级分的样品（每次运行约75mg）。

方法详细信息：

检测波长：205nm；流速：15ml/分钟

洗脱剂：

1.0.8%乙酸:乙腈:THF=25:72:3

2.0.8%乙酸:乙腈:THF=15:82:3

3.0.8%乙酸:乙腈:THF=10:87:3

4.0.8%乙酸:乙腈:THF=5:92:3

进程：在调节柱之前，在至少40分钟的时间内需用乙腈HPLC级进行洗涤。总运行时间为约155分钟。

调节：运行洗脱剂1持续30分钟。

加载：注射在MeOH中的75mg样品的5ML溶液

洗脱：

洗脱剂1：0-10分钟

洗脱剂2：直至达到峰2的洗脱

洗脱剂3：直到峰4洗脱后10分钟

洗脱剂4：直到峰6洗脱后10分钟

制备型HPLC方法的色谱图显示于图4中。

分离和通过¹H-NMR和¹³C-NMR表征了对应于图4中6个所示的峰的化合物。

在与文献数据的NMR谱比较后，峰1和峰2确实显示分别为模绕酮酸和齐墩果酮酸。该两种酸的¹H-NMR和¹³C-NMR谱分别显示于图5A-B中（峰1，模绕酮酸）和6A-B（峰2，齐墩果酮酸）。通过与商业样品相比较也对模绕酮酸进行了阳性的鉴定。进一步比较齐墩果酮酸，发现其与根据文献方法（Helv.Chim.Acta卷83,第1766页(2000)）对齐墩果醇酸进行氧化而制备的样品相同。

峰3-6显示分别为乳香二烯酸（峰3）、异乳香二烯酸（峰4）、3-O乙酰基-乳香二烯醇酸（峰5）和3-O-乙酰基-异乳香二烯醇酸（峰6）。这些的¹H-NMR和¹³C-NMR谱分别显示于图7A-B、图8A-B、图9A-B和图10A-B中。（参考-Parachos等人,(2007),Antimacrobial Agents andChemotherapy,51(2),551和其中的参考文献）。

实施例4.RPh-Ac在视网膜色素上皮（RPE）细胞中的生物学研究

目的为评估RPh-Ac对人源的多种细胞系的作用的研究使用了ARPE-19细胞，其为非恶性的人类视网膜色素上皮细胞系。

视网膜色素上皮（RPE）是神经元来源的单层的六边形色素上皮细胞，其形成眼睛视网膜的最外细胞层，并附着于下方的脉络膜。RPE功能包括对下方的神经-视网膜的光感受器的支持、给养和保护。

ARPE-19细胞参与光感受器细胞的外节的吞噬作用，参与维生素A循环，其中其使全反式视黄醇异构化为11-顺式视黄醛，还参与向光感受器提供D-葡萄糖、氨基酸和抗坏血酸。

虽然在体内RPE是着色的，ARPE-19细胞不会形成黑色素且不会着色。在培养中细胞呈纺锤状和作为多角形细胞生长。

方法

将ARPE-19细胞（获自美国典型培养物保藏中心（ATCC））以浓度为2-5x10³细胞每孔（1-2.5x10⁴细胞/mL）铺板到平底96孔组织培养微量培养板（Costar）中的由补充10%胎牛血清、200mM谷氨酰胺、100单位/mL青霉素和100g/mL链霉素的DMEM:Ham F-12，1:1组成的生长培养基中。在用RPh-Ac处理之前，使细胞附着在平板表面过夜。

RPh-Ac大体上如实施例2中所描述的制备，以提供由棉籽油组成的载体中的2.5%的溶液。将制备物以0.5μl、1μl、1.5μl、2μl的体积添加到孔中。被导入到200μl的总样品培养基体积的这些体积分别对应的最终RPh-Ac浓度为0.0125%、0.025%、0.0375%和0.05%。油载体作为运载体对照，并以相同的体积应用于对照培养。

将培养物在37℃，5%CO₂孵箱中孵育48小时。去除培养基，用磷酸缓冲盐溶液（PBS）洗涤培养物两次，用无水甲醇固定10分钟，并用试剂（Boehringer Mannheim）染色，其以与Giemsa相似的方式染色细胞，且可用于定量细胞存活率测定（Keisari,Y.Acolorimetric microtiter assay for the quantitation of cytokine activity onadherent cells in tissue culture.J.Immunol.Methods146,155-161,1992）。

为确定对用RPh-Ac处理细胞的响应的标志物蛋白突触素、磷酸化的Akt（pAk^Ser473）和磷酸化的GSK3-β^Ser9的表达，将细胞以5·10⁴细胞/孔铺板于浸入到24孔微量培养板中的无菌玻璃盖玻片上的由补充有10%胎牛血清和青霉素（100单位/ml）、链霉素（100μg/ml）和谷氨酰胺（2mM）的Dulbecco最低限度必需培养基和Ham F12培养基的1:1混合物组成的培养基中。

允许细胞粘附过夜以覆盖盖玻片，将含2.5%RPh-Ac的棉籽油以20μl/ml培养基的体积添加到培养物中并在37℃，5%CO₂中孵育48小时。将油载体用作运载体对照并以相同体积施加于对照培养物。

然后用PBS洗细胞两次并用4%多聚甲醛固定。为确定突触素、pAkt^Ser473和磷酸化-GSK3-β^Ser9在细胞中的蛋白表达，用抗人类突触素、pAkt^Ser473和磷酸化-GSK3-β^Ser9的小鼠/兔单克隆抗体（Ab.）对玻璃盖玻片染色，然后用第二FITC标记的抗小鼠/兔IgG染色。用DAPI复染细胞核。然后在荧光显微镜中评价试验制备物和对照制备物。结果呈现在图13A-C中，如下所述。

结果

意外地发现，用RPh-Ac处理ARPE-19RPE细胞诱导显著的形态改变，该形态改变是神经分化的明显特征。该形态改变在单独用油载体处理的对照培养物中并未发生，并且在用RPh-Ac处理的试验培养物中观察到相似的结果，而与油用作活性化合物的载体无关。形态改变还与细胞增殖的停止相关，进一步支持了RPh-Ac诱导神经分化的结论。

对照油处理的培养物表现出APRE-19RPE细胞的典型的纺锤形状和多角形生长图案特征（图11A）。在培养中孵育48小时后，用RPh-Ac（0.01%；0.2mg/ml）处理的细胞形状改变，并形成稠密的、致密染色的非常长的单个突出，表明为神经元细胞轴突。48小时孵育后，用RPh-Ac（0.025%；0.25mg/ml）处理的细胞显示出大量较细的长突出，表明为树突；并且在用RPh-Ac孵育48小时后，该细长突出与邻近细胞中的相似的突出形成连接点，构建了连接的细胞之间的网络，可能能够在相互之间交流信息（图11B）。相似的网络通常存在于中枢神经系统中的神经元之间并能够使信息得以传播和处理。

对照细胞在48小时孵育期间增殖（图11C），而RPh-Ac处理的细胞快速地停止增殖并且细胞保持较稀的密度，进一步支持了细胞分化的观点。

诱导细胞分化的能力的评分系统

在以上结果的基础上，建立了评分系统以评估级分诱导细胞培养物的分化的能力，细胞以2x10³每孔铺板。等级和其相关描述列于表2中。

表2

利用以下处理进行了相同的测定：

-棉籽油运载体（阴性对照）（结果显示于图11C）

-根据WO2003/097212的酸性级分和从根据WO2003/097212的教导的酸性级分分离的己烷不可溶物质，以1%含于乙醇中（结果显示于图12A）

-RPh-Ac，以1%含于乙醇中（结果显示于图12B中）

-乙醇运载体（阴性对照）（结果显示于图12C中）。

根据以上评分表格的评估图11和图12中观察到的响应于不同的处理的分化的结果示于以下的表3和表4中。

表3

*以这些量，细胞达到了完全分化并随后在48小时孵育结束之前自然死亡。

**细胞受到明显胁迫且最多仅显示了分化的迹象。

表4

*以这些量，细胞达到了完全分化并随后在48小时孵育结束之前自然死亡。

**细胞受到明显胁迫且最多仅显示了分化的迹象。

然后用PBS洗细胞两次并用4%多聚甲醛固定。为确定突触素、pAkt^Ser473和磷酸化-GSK3-β^Ser9在细胞中的蛋白表达，用抗人类突触素、pAkt^Ser473和磷酸化-GSK3-β^Ser9的小鼠/兔单克隆抗体对玻璃盖玻片染色，然后用第二FITC标记的抗小鼠/兔IgG染色。用DAPI复染细胞核。然后在荧光显微镜中评价试验制备物和对照制备物。结果呈现在图13A-C中，如下所述。

结果显示于图13A中，表明与其中突触素完全不表达的对照细胞（下图）相比较，在用组合物RPh-Ac处理的细胞中，高水平的突触素簇在细胞突（cellular process）中是明显的（上图）。突触素是脑中丰富的突触囊泡，且调节神经元中的活性依赖的突触形成。突触素已被广泛用于鉴定分化的神经元细胞中的突触形成。

GSK-3的活性受丝氨酸磷酸化的负调控。GSK-3β的失活是磷脂酰基-肌醇3-激酶/Akt存活途径的主要调控靶标，并发挥一些其神经保护作用。已提出GSK-3失活作为促进神经元存活功能的机制，包括调控轴突形成和调节谷氨酸能神经传递。GSK-3β抑制还参与形成中的神经元中的轴突形态和突触蛋白簇集。GSK-3-介导的底物磷酸化和信号传递途径的失调参与多种疾病的病理生理状况，包括阿尔茨海默病、2型糖尿病和癌症、精神分裂症和情感障碍。

图13B中显示的结果表明与运载体处理的细胞（下图）相比较，用组合物RPh-Ac处理的细胞表现出高水平的pAkt^Ser473（上图）。图13C中显示的结果表明与运载体处理的细胞（下图）相比较，用组合物RPh-Ac处理的细胞表现出高水平的pGSK-β^Ser9以及其定位的改变。这些结果表明组合物RPh-Ac通过经由Akt的活化（Ser473的磷酸化）对其Ser9的磷酸化使GSK3β失活。

实施例5.分离的酸性级分的特定的类三萜化合物的组合在大鼠MCAO模型中的协 同效应

中风是严重的长期失能（disability）的主要原因，且在美国是第三位死亡原因。缺血性中风占全部中风的88%以上，使其成为脑血管损害的最常见类型。脑中的缺血状况引起神经元死亡，导致永久性的感觉运动和认知缺陷。大脑中动脉栓塞（Middle CerebralArtery occlusion，MCAO）模型是用于大鼠中的中风的可信模型并模拟人类病症。MCA的栓塞由于神经元丢失导致感觉运动皮质的损害。该损害的水平可通过对梗塞面积的组织学评估和多种行为试验来评估。中风诱发后的行为改良和低梗塞体积表明了较好的病理状态并很可能是神经保护或神经发生的结果。因此，MCAO模型可用作可信赖的试验系统以评价药物作为诸如例如中风和神经变性疾病/病症的受损的神经系统病症的治疗剂的效力。

为进行本文所描述的实验，利用氯胺酮/甲苯噻嗪溶液麻醉动物。然后将动物的颈部剃毛并在颈部皮肤中作出正中切口，钝性切开下面的组织。通过钝性切开暴露右颈总动脉（CCA）和其与颈外动脉（ECA）和颈内动脉（ICA）的连接点。通过在其周围安置3-0丝缝线材料暂时封闭CCA。用相同类型的缝线材料永久性地封闭ECA。也在ICA中用3-0丝缝线材料进行暂时的第三闭合。

在ECA中切割小洞并将尼龙线插入到ICA中，同时避免进入翼腭动脉。将线插入21-25mm直至感到轻微阻力。然后用3-0丝缝线结缚牢该线。

手术后，将大鼠放回其笼中并呆在加热灯下直至其醒来。

在缺血手术过程中监测和记录两个参数：动物体中心温度和血糖水平（BGL）。

在整个手术时间中利用与测量单元（Cole Parmer model8402-00）连接的直肠探针（YSI USA model400）监测体中心温度。当直肠温度为37-38℃时开始缺血性损害。

考虑到RPh-Ac级分组成对细胞的有利作用（如上文所示例的），对RPh-Ac级分中所包括的多种化合物关于其体内作用进行了试验。

受试验的化合物和组合所用的缩略语：

OA：齐墩果酮酸

MDA：乳香二烯酸

IMDA：异乳香二烯酸

对不同的组的大鼠用25微升指定的试验品进行一周两次的皮下注射。第一次注射在中风诱导后3小时提供。

以下的制剂用作注射的试验品：

-运载体：棉籽油

-IMDA：0.65%（w/w）含于棉籽油中

-MDA：0.65%（w/w）含于棉籽油中

-IMDA和MDA：各0.65%（w/w）含于棉籽油中

-IMDA、MDA和OA：各0.65%（w/w）含于棉籽油中

利用大鼠MCAO模型试验了以下的治疗能力：单独的MDA；单独的IMDA；MDA+IMDA的组合；和OA+MDA+IMDA的组合。用每种试验化合物对诱导中风的大鼠进行处理并利用胶带清除试验检验其感觉运动能力的改善。在该试验中，将小胶带附着在大鼠的前爪并用作触觉刺激。记录清除胶带的时间。在诱导中风前进行胶带清除以评价每组的基线时间，并在损害后的第27天，一周两次注射试验品后进行胶带清除。

结果：

如图14A中的图所示，其显示了大鼠从对侧爪清除胶带的时间（以秒计），在胶带清除试验中，与运载体处理的大鼠相比较，单独的IMDA能够提高处理的大鼠的得分。单独的MDA仅比运载体对照略微改善。然而，IMDA+MDA或OA+MDA+IMDA的组合（右粗斜线）显著提高了治疗的效力，且动物在第27天（D27）回到其基线（第0天，D0）的表现。

因为IMDA自身几乎恢复了大鼠的基线评分，分析了有利试验品与基线的比率。如图14B中所示，IMDA，其显著地改善了大鼠的感觉运动状况，仍较基线评分差10倍。这表明IMDA自身的作用有限且不能完全地恢复基线感觉运动功能。然而，惊人地是，IMDA和MDA的组合或IMDA、MDA和OA的组合进一步提高了效力，使感觉运动能力显著提高至比所记录的基线甚至更低的水平。这些结果清楚地表明IMDA、MDA和OA的组合的强协同作用。

本文所呈现的结果强有力地支持了异乳香二烯酸和乳香二烯酸的组合或异乳香二烯酸、乳香二烯酸和齐墩果酮酸的组合的治疗潜力，且表明了这些化合物对于治疗神经功能缺损和再生神经元组织的相互的强协同作用。

实施例6.大鼠中的伤口愈合

对实施例5的MCAo模型中所用的大鼠，将外科伤口的愈合用作实施例5中所用的试验制剂的伤口愈合潜力的指示。

图15中所示的照片拍摄了MCAO模型的第7天中的伤口，大鼠用以下进行处理：运载体（纯棉籽油，左图）、RPh-Ac（中图）和齐墩果酮酸、乳香二烯酸和异乳香二烯酸的混合物（右图）。照片明显地表明，用RPh-Ac处理（中图）或用齐墩果酮酸、乳香二烯酸和异乳香二烯酸的混合物处理（右图）的动物的伤口与运载体处理的动物的伤口相比较处于愈合的更高阶段。

实施例7.环糊精的复合物的制备

环糊精由于其与许多药物形成包合复合物的能力，可显著地提高生物药剂的水溶性，尤其是被定义为水不可溶性的那些诸如特定的类萜化合物。环糊精是水溶性化合物，其可与水难溶性分子形成可逆复合物而产生可溶性的分子包合复合物。当药物-环糊精组合的包合复合物稀释于足够大量体积的水或血液中时，其快速地解离，释放出掩蔽的药物活性剂。

本文所描述的分离的酸性级分与β-HPCD的复合将如以下进行：

a.将预称重的乳香级分溶于最少量的非极性溶剂诸如己烷、庚烷或类似的非极性溶剂中。

b.向β-HPCD粉末滴加非极性溶剂。

c.在50-80℃下干燥直至非极性溶剂蒸发。

d.用需要的量的水混合。

e.用声裂法和加热溶解。

f.通过0.2-0.45μm过滤器过滤。

实施例8.乳香的分离的酸性级分的纳米乳液的制备

通过高压乳化技术来制备液体水包油纳米乳液制剂，即将所有脂质成分和活性成分溶于脂质油相并用水相乳化以期导致稳定的、球状的和均匀分散的含药物脂质纳米液滴的形成。乳液液滴尺寸减缩对于生成具有高稳定性的药物制剂是必要的。优选的纳米乳液液滴具有均匀分散在水相中的小于1微米（通常在0.1-0.2μm的范围中）的平均液滴尺寸。纳米乳液液滴的大型内部疏水性油核心的独特性为水不溶性化合物提供了高增溶能力。

1.油相的制备

油相由13%类脂E-75、0.026%αTP-琥珀酸酯（αTP-succinate）、作为抗氧化剂的对羟基苯甲酸丙酯和86.9%810组成。将如实施例1中所制备的乳香级分溶于油相。用轻度的加热混合组分直至获得均质的完全溶解的溶液。

2.水相的制备

水相由0.1%EDTA、0.5%Tween-80、2.3%甘油、作为防腐剂的对羟基苯甲酸甲酯和97.1%水组成。由NaOH1N调节pH至7.4。

3.混合油相和水相

将油相（3.7g）加热并添加到70ml的水相（预加热的）。在室温下轻轻搅拌混合物10-15分钟。

4.水包油粗乳液的制备

利用中等尺寸的分配器和高剪切均化装置在20,000rpm下进行5分钟来制备水包油乳液。

5.通过高压均质器对乳液进行尺寸调节至亚微米范围

通过利用 Microlab70高压均质器在800巴压力下使乳液经受高剪切均质而将步骤4后获得的乳液的液滴尺寸减缩至亚微米（纳米尺寸）范围。应进行总共5-6个循环以获得具有小于200nm的平均粒径的均质纳米乳液液滴。利用N4MD粒径分析器（ Electronics,UK）通过光子相关光谱法（PCS）来确定粒径。当大多数的颗粒（>90%）小于200nm时，确定尺寸调节工序完成。

6.无菌过滤

利用0.2μm PES无菌过滤器在无菌条件下将纳米乳液过滤至无菌小瓶中，并于40℃贮存。

实施例9.喷雾干燥粉末的制备

考虑到成本效益和扩大规模，用于制造乳香级分-脂质混合物产物的适宜方案是通过对来自含全部脂质成分的非极性溶剂分散体与含有亲水性成分的水的混合物的制剂进行直接喷雾干燥。对所选的喷雾干燥方法进行优化以获得精细的自由流动的粉末。将乳香级分溶于含脂质成分卵磷脂、三癸精（癸酸三甘油酯）、生育酚琥珀酸酯的脂质相中，并在非极性溶剂中加热（～40℃），直至获得良好的分散体。通过将粉末在纯水中溶胀而制备煅制二氧化硅在水中的分散体（5%）。然后可将所得的浆料（预加热至40℃）缓慢地倒入到非极性溶剂脂质分散体中并在40℃下搅拌混合物约1小时直至获得均质的分散体。然后利用Yamato GA32喷雾干燥器对混合物进行喷雾干燥。典型的喷雾干燥条件是：流速7ml/分钟，入口温度130℃，出口温度70℃，和干燥空气流速0.5m³/分钟。预期获得含有乳香级分-脂质混合物的均质干燥粉末。

预期通过直接喷雾干燥工艺制备的乳香级分-脂质混合物表现出良好的水分散性，从而适宜于用于具有良好的口服生物利用度的增强的口服递送的固体剂型诸如硬明胶胶囊或片剂的制备。

实施例10.脂质体制剂的制备

在圆底烧瓶中，将含有溶解的乳香的分离的酸性级分的脂质溶于100ml二氯甲烷中，并在室温下搅拌30分钟，直至获得澄清透明的溶液。利用旋转蒸发装置在39℃蒸发溶剂。典型的条件包括在大气压下在4.5rpm下旋转烧瓶5分钟，然后在低真空下进行10-30分钟（直至溶剂完全蒸发），最后在全真空下进行15分钟。在蒸发工序结束后将产生均匀的脂质薄膜。将该脂质薄膜溶于15ml等渗缓冲液中。通过利用多腕振荡器剧烈振荡10-30分钟，直至形成多层囊泡（MLV）的均一的乳状分散体且无明显的残余脂质薄膜，制备脂质体。为获得平衡的和均质的脂质体制剂，可在270rpm下在30℃下再振荡烧瓶30-90分钟。

实施例11.含乳香的分离的酸性级分的微乳液的制备

可利用胃肠外用药中常用的多种表面活性剂来形成注射施用、口服施用和局部施用可接受的油包水和水包油微乳液。适宜于形成微乳液制剂的药学上可接受的表面活性剂包括非离子表面活性剂，包括聚氧乙烯40氢化蓖麻油（以商品名Cremophor出售），聚氧乙烯35蓖麻油（以商品名EL出售），聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯（聚山梨醇酯）、泊洛沙姆维生素E-TPGS1,000（VE-TPGS1,000），聚氧乙烯烷基醚，HS-15，TO，Peglicol6-油酸酯，聚氧乙烯硬脂酸酯或饱和聚氧乙烯甘油酯，其均为商业上可获得的。优选的表面活性剂包括聚氧乙烯40氢化蓖麻油聚氧乙烯35氢化蓖麻油（EL）、聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯（聚山梨醇酯）、泊洛沙姆和维生素E-TPGS1,000。存在于组合物中的表面活性剂的总量一般从约100至约700mg/g，优选地从约300至约500mg/g。

含分离的酸性级分的微乳液的制备可通过如下进行：将分离的酸性级分在适宜小瓶中溶于适量的油中，如中等链甘油三酯（Miglyol）。然后将小瓶加盖。将该小瓶置于约50-60℃的水浴中并轻轻振荡，直到全部药物材料彻底溶解。将小瓶冷却至室温，然后添加适量的表面活性剂（如EL或VE-TPGS），若有，接着添加脂肪酸甘油单酯和甘油二酯的混合物。然后将小瓶加盖，并置于约50-60℃的水浴中。轻轻振荡小瓶，得到澄清均匀的溶液。该溶液可被装入HPMC胶囊中，并在口服给药前于室温下贮存。可选地，可将替代的聚合物粉末（如HPMC）在适当的搅动（即，搅拌、振荡）下添加到溶液中，得到均匀的聚合物悬浮液。然后可将生成的组合物装入软明胶胶囊或硬明胶胶囊，并在口服给药前于室温下贮存。可选地，可将微乳液制剂用作局部施用或通过0.2μm膜过滤，以在胃肠外施用。

当在水性介质中稀释微乳液时，其具有良好的水分散性和自乳化性，形成具有增强的生物利用度的微小的纳米胶束。

以上具体实施方案的描述将如此完全地揭示本发明的总体性质，即其他人通过利用现有知识不需要过分实验并可容易地将这些具体实施方式修改和/或修正以用于多种用途而不脱离总体构思，并且，因此，这种修正和修改应当并且意图被认为在所公开的实施方案的等同实施方案的意义和范围内。应理解的是，本文所用的用语或术语的目的是为说明，而非限制。用于实施多种所公开的功能的手段、材料和步骤可采取多种替代形式而不脱离本发明。

Claims (21)

1.一种组合物在制备用于治疗外科伤口的药物中的用途，所述组合物包括有效量的乳香的分离的酸性级分，和药学上可接受的载体；其中所述级分的特征在于其在为乙醇的极性有机溶剂中和在为正己烷的非极性有机溶剂中是可溶的，且其中所述级分基本上不含在所述极性有机溶剂中可溶但在所述非极性有机溶剂中不可溶的化合物，所述基本上不含意为所述级分含有低于5％的在所述极性有机溶剂中可溶但在所述非极性有机溶剂中不可溶的所述化合物，

其中所述分离的酸性级分通过包括以下的步骤的方法获得：

(a)用所述极性有机溶剂处理所述乳香；

(b)分离在所述极性有机溶剂中可溶的级分；

(c)任选地去除所述极性有机溶剂；

(d)用所述非极性有机溶剂处理步骤(b)或(c)中获得的可溶性级分；

(e)分离在所述非极性有机溶剂中可溶的级分；

(f)任选地去除所述非极性有机溶剂；

(g)将步骤(f)获得的级分溶于为二烷基醚的有机溶剂中；

(h)用碱性水溶液处理步骤(g)中获得的溶液以获得碱性水性级分；

(i)用酸溶液对步骤(h)中获得的所述碱性水性级分进行酸化以获得酸化的水性级分；

(j)用二乙醚萃取步骤(i)中获得的酸化的水性级分；

(k)任选地将步骤(j)中获得的有机级分与干燥剂接触以去除残余的水；

(l)从步骤(i)、(j)或(k)中的任一步骤中获得的级分中去除二乙醚和/或多余的酸；以及

(m)将步骤(l)中获得的分离的级分溶于药学上可接受的载体中；其中所述分离的酸性级分包括乳香二烯酸、异乳香二烯酸、齐墩果酮酸、模绕酮酸、3-O-乙酰基乳香二烯醇酸和3-O-乙酰基异乳香二烯醇酸。

2.如权利要求1所述的用途，其中所述乳香获自选自由乳香黄连木(P.lentiscus)、大西洋黄连木(P.atlantica)、P.palestina、P.saportae、黑黄连木(P.terebinthus)、阿月浑子(P.vera)和全缘叶黄连木(P.integerrima)组成的组的黄连木属(Pistacia)的物种。

3.根据权利要求1所述的用途，其中所述载体是选自由至少一种油、至少一种蜡及其组合组成的组的疏水载体。

4.根据权利要求3所述的用途，其中所述至少一种油选自由棉籽油、杏仁油、油菜籽油、椰子油、玉米油、葡萄籽油、橄榄油、花生油、藏红花油、芝麻油、大豆油及其组合组成的组。

5.如权利要求1所述的用途，其中所述药物为适宜于通过选自由以下组成的组的途径施用的形式：口服的、肌内的、皮下的、皮内的、阴道的、直肠的、肺病灶内的、腹膜内的、动脉内的、大脑内的、脑室内的、骨内的和鞘内的。

6.如权利要求1所述的用途，其中所述药物为适宜于通过颅内的途径施用的形式。

7.如权利要求1所述的用途，其中所述药物为适宜于局部施用的形式。

8.如权利要求1所述的用途，其中所述药物为适宜于通过选自由以下组成的组的途径施用的形式：鼻内的、眼内的和耳的。

9.如权利要求1所述的用途，其中所述药物为适宜于胃肠外施用的形式。

10.一种组合物在制备用于治疗中风和/或外科伤口的药物中的用途，所述组合物由作为活性组分的乳香二烯酸、异乳香二烯酸和齐墩果酮酸的混合物和药学上可接受的载体组成。

11.如权利要求10所述的用途，其中所述乳香二烯酸、异乳香二烯酸和齐墩果酮酸中的至少一种是化学合成反应的产物。

12.如权利要求10所述的用途，其中所述乳香二烯酸、异乳香二烯酸和齐墩果酮酸中的至少一种来自植物来源。

13.如权利要求12所述的用途，其中所述植物来源来自黄连木属。

14.如权利要求13所述的用途，其中所述黄连木属的物种选自由乳香黄连木、大西洋黄连木、P.palestina、P.saportae、黑黄连木、阿月浑子和全缘叶黄连木组成的组。

15.如权利要求10所述的用途，所述药物为适宜于通过选自由以下组成的组的途径施用的形式：口服的、肌内的、皮下的、皮内的、阴道的、直肠的、肺病灶内的、腹膜内的、动脉内的、大脑内的、脑室内的、骨内的和鞘内的。

16.如权利要求10所述的用途，其中所述药物为适宜于通过颅内的途径施用的形式。

17.如权利要求10所述的用途，所述药物为适宜于局部施用的形式。

18.如权利要求10所述的用途，所述药物为适宜于胃肠外施用的形式。

19.如权利要求10所述的用途，其中所述药物为适宜于通过选自由以下组成的组的途径施用的形式：鼻内的、眼内的和耳的。

20.一种用于治疗中风的组合物，所述组合物由作为活性组分的乳香二烯酸和异乳香二烯酸以及药学上可接受的载体组成。

21.一种用于治疗中风和/或外科伤口的组合物，其中所述组合物由作为活性组分的齐墩果酮酸、乳香二烯酸和异乳香二烯酸以及药学上可接受的载体组成。