CN107405372A - 乳香胶的分离级分用于治疗视神经病变的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及乳香胶的分离级分用于治疗视神经病变的治疗用途。更具体地,本发明涉及使用包含乳香胶的分离级分的组合物治疗视神经病变状况的方法。
Description
发明领域
本发明涉及乳香胶的分离级分用于治疗视神经病变,诸如视神经缺血和青光眼的治疗用途。更特别地,本发明涉及使用包含乳香胶的分离级分的组合物治疗此类视神经病变状况的方法。
发明背景
乳香(Mastic),也被称为乳香胶(gum mastic)或乳香胶(mastic gum),为一种从漆树科(Anacardiaceae)的成员乳香黄连木(Pistacia lentiscus L.)作为渗出物(exudate)获得的树脂(tree resin)。在古代地中海世界,乳香用于治疗多种状况,诸如,胃肠紊乱,诸如胃痛、消化不良和消化性溃疡。已公开,向具有十二指肠溃疡的人类患者及向具有诱导的胃和十二指肠溃疡的实验大鼠口服施用乳香具有治疗作用(Al-Habbal等(1984)Clin Exp Pharmacop Physio 11(5):541-4;Said等(1986)J Ethnopharmacol 15(3):271-8)。
美国专利申请公布第2005/0238740号公开了,从乳香树脂提取的某些级分表现出抗微生物和抗细胞增殖活性。
由以上提及的专利申请的一些发明人撰写的Paraschos等(2007)公开了通过极性溶剂提取粗制乳香并从其去除不溶性聚合物聚-β-月桂烯制备不含聚合物的总乳香提取物(TMEWP),以及从TMEWP分离的酸性和中性级分(Paraschos等(2007)Antimicrob AgentsChemother 51(2):551-559)。
EP专利申请第1520585号公开了从黄连木属(Pistacia)的植物获得的产物用于制备用于治疗或预防癌症的药物的用途。
国际专利申请公布第WO 2005/112967号公开了从乳香纯化具有抗增殖作用的抗癌物质,其被发现于通过将乳香悬浮于选自非酸性脂肪族烃、包含至少25%的水溶性非酸性脂肪族烃的水溶液或其组合的溶剂中并去除不溶性级分而获得的可溶性级分中。
本申请的一些发明人的国际专利申请公布第WO 2013/186766号涉及包含来源于柏科(Cupressaceae)植物材料的分离级分的组合物和制剂,其用于治疗纤维化状况和神经退行性紊乱的用途。
本申请的一些发明人的国际专利申请公布第WO 2010/100650号涉及乳香胶及其中发现的化合物包括聚合月桂烯的治疗用途,以及使用包含聚合月桂烯的组合物治疗神经功能缺损的方法。
本申请的一些发明人的国际专利申请公布第WO 2010/100651号涉及从乳香胶分离的组合物及其治疗用途以及包含聚合月桂烯的分离级分的组合物和维持活性聚合物的生物活性的制剂。
中国专利第CN 103656290号公开了一种用于治疗视神经萎缩及其制备的方法,其主要包括化合物,包括熟地黄、蝉蜕、当归、黄芪、半夏(Breit)、乳香(frankincense)、没药、桑椹、玄参(Scrophulariaceae)以及其他药物按一定重量配比制备的组合。这一公开内容的药物具有舒肝明目(Shugan eyesight)、清热解毒(detoxification)、凉血润肝功能(cooling Run liver function),用于迅速、有效治疗视神经萎缩,且无毒副作用。
视神经包含从视网膜显露、在视神经盘处离开眼睛、并进入将来自眼睛的输入处理为视觉的视觉皮层的神经细胞轴突。视神经病变指由于任何原因引起的视神经损害。这些神经细胞的损害和死亡,导致视神经病变的特性特征(characteristic features)。主要症状为视觉损失,伴随颜色在受影响的眼睛中出现轻微褪色(washed out)。在医学检查中,视神经乳头(optic nerve head)可以通过检眼镜可视化。苍白的盘为长期存在的视神经病变的特征。在许多病例中,仅一只眼睛受到影响,且患者可能在身体检查之前不会意识到色觉损失。
视神经病变可以起因于多种原因,诸如缺血性视神经病变、视神经炎、压迫性视神经病变、浸润性视神经病变、外伤性视神经病变、线粒体视神经病变、营养性视神经病变、中毒性视神经病变、遗传性视神经病变等。目前极少的视神经病变治疗被使用,且大多数对特定类型的视神经病变具有有限的影响。
青光眼为全世界失明的主要原因之一。存在多种不同类型的青光眼,所有这些都共有相同的视网膜神经节细胞(RGC)损失的病理生理学(Neuroprotection in glaucoma,Kaushik S,Pandav SS,Ram JJ Postgrad Med.2003Jan-Mar;49(1):90-5)。最常见的青光眼形式为原发性开角型青光眼(POAG)、原发性闭角型青光眼(PCAG)、原发性先天性青光眼(PCG)。青光眼也可以作为其他病理生理学状况的继发性并发症出现。继发性青光眼的实例为色素性青光眼、类固醇诱导性青光眼、剥脱性青光眼、房角退缩性青光眼、晶状体溶解性青光眼和血管性青光眼。该疾病的共同机制为升高的眼内压(IOP),眼内压对RGC引起压力,并因此导致RGC逐渐损失。已经认识到,延缓或停止RGC损失的治疗方法潜在地有益于保持青光眼中的视觉。事实上,目前可用的治疗关注于通过药物或外科手术干预来减少眼内压(IOP)(Current and emerging medical therapies in the treatment of glaucoma,Bagnis A,Papadia M,Scotto R,Traverso CE,Expert Opin Emerg Drugs.2011Jun;16(2):293-307)。另外,神经再生性疗法可以具有通过细胞存活机制阻止RGC损失的潜力(Glaucoma 2.0:neuroprotection,neuroregeneration,neuroenhancement.,Chang EE,Goldberg JL,Ophthalmology.2012May;119(5):979-86)。然而,这些干预并不总是阻止患者中青光眼的进展和视觉损失。
因此,本领域对在治疗起因于多种原因的视神经病变的状况中有用和有效的组合物存在需求。本领域未提供乳香胶的分离级分可以用于治疗视神经病变状况的任何教导。
发明概述
本发明提供了具有视神经神经再生性特性的组合物及使用该组合物用于治疗视神经病变状况,诸如视神经缺血状况、青光眼等的方法。更具体地,公开了包含从乳香胶提取的分离级分的组合物能够治疗相关状况,诸如起因于视神经缺血和/或创伤的那些。
在一些实施方案中,本发明部分基于以下预料不到的发现:乳香胶的分离级分表现出此类增强的视神经再生性生物活性。本发明还基于以下预料不到的发现:甚至在分离级分中不存在(或具有几乎不可检测水平的)聚合月桂烯的情况下,此类级分对视神经和视神经病变状况表现出增强的有益活性。
已知乳香胶的提取物包含被称为月桂烯的单萜化合物的聚合形式。因此,本文还公开了,不包含可检测水平的聚合月桂烯的乳香胶的分离级分可以用作用于治疗视神经病相关紊乱,诸如创伤性神经病变、缺血性视神经病变、青光眼等的药物组合物中的活性成分。
根据一些实施方案,提供了包含乳香胶的分离级分和药学上可接受的载体的组合物用于治疗视神经病变状况的用途。在一些实施方案中,提供了一种治疗视神经病变状况的方法,所述方法包括将包含乳香胶的分离级分和药学上可接受的载体的组合物施用至有相应需要的受试者。
根据另外的实施方案,提供了乳香胶的分离级分用于制备用于治疗视神经病变的药物的用途。
根据另一个方面,提供了乳香胶的分离级分,用于在治疗视神经病变中使用。
根据一些实施方案,提供了包含乳香胶的分离级分和药学上可接受的载体的药物组合物,用于在治疗视神经病变状况中使用。
在多种实施方案中,组合物可以通过胃肠外途径施用。根据一些实施方案,施用途径为经由肠胃外注射。在多种实施方案中,施用步骤通过选自由以下组成的组的肠胃外途径进行:静脉内(i.v.)、肌内、皮下(sc)、皮内、腹膜内、动脉内、脑内、脑室内、骨内、眼内、玻璃体内和鞘内。
在一些实施方案中,视神经病变状况包括视神经被损害的任何状况。在一些实施方案中,视神经病变状况可以选自诸如但不限于以下的状况:创伤性神经病变(可以起因于任何类型的视神经创伤);缺血性神经病变(诸如,例如,非动脉炎性缺血性视神经病变(NAION)、前部缺血性视神经病变(AION)、后部缺血性视神经病变);辐射性视神经病变(RON))、青光眼、视神经炎、压迫性视神经病变,浸润性视神经病变、线粒体视神经病变、营养性视神经病变、中毒性视神经病变、遗传性视神经病变等;或其组合。每一种可能性为独立的实施方案。
在一些实施方案中,视神经病变状况为NAION。在一些实施方案中,视神经病变状况为青光眼。
在一些实施方案中,视神经病变状况起因于以下或与以下相关:由于视神经中脂蛋白性物质的沉积造成的视神经损害。
在一些实施方案中,视神经病变状况起因于以下或与以下相关:由于视神经中脂蛋白性物质的沉积造成的视神经损害,其中脂蛋白性物质的沉积为贮积疾病的结果。
在一些实施方案中,视神经病变状况起因于以下或与以下相关:由于视神经中脂蛋白性物质的沉积造成的视神经损害,其中脂蛋白性物质的沉积为贮积疾病的结果,并且其中脂蛋白性物质为脂褐素。在一些实施方案中,脂蛋白性物质的沉积在布鲁赫膜(Bruchmembrane)与RPE层之间的子视网膜层中。
在一些实施方案中,乳香胶的分离级分的特征在于,它在至少一种极性有机溶剂和至少一种非极性有机溶剂中是可溶的。在特定实施方案中,乳香胶的分离级分的特征还在于,它基本上不含在所述极性有机溶剂中可溶但在所述非极性有机溶剂中不溶的化合物。
在一些实施方案中,乳香胶的分离级分的特征在于,它在至少一种极性有机溶剂和至少一种非极性有机溶剂两者中是可溶的,并且基本上不含在所述极性有机溶剂中可溶但在所述非极性有机溶剂中不溶的化合物。
根据一些实施方案,乳香胶的分离级分通过包括以下步骤的方法获得:用至少一种极性有机溶剂处理乳香胶并分离在所述极性有机溶剂中可溶的级分。在特定实施方案中,乳香胶的分离级分通过包括以下步骤的方法获得:用至少一种非极性有机溶剂处理乳香胶并分离在所述非极性有机溶剂中可溶的级分。
在一些示例性实施方案中,乳香胶的分离级分通过包括以下步骤的方法获得:
(a)用极性有机溶剂处理乳香胶;
(b)分离在所述极性有机溶剂中可溶的级分;
(c)任选地去除所述极性有机溶剂;
(d)用非极性有机溶剂处理在步骤(b)或(c)中获得的可溶性级分,(e)分离在所述非极性有机溶剂中可溶的级分;以及
(f)任选地去除所述非极性有机溶剂;
其中步骤(d)至(f)可以在步骤(a)至(c)之前。
在一些实施方案中,用于获得乳香胶的分离级分的方法还包括对在步骤(c)或步骤(f)之后获得的可溶性级分进行尺寸分级分离(size fractionation)。在特定实施方案中,尺寸分级分离包括尺寸排阻层析。在特定实施方案中,步骤(c)或(f)包括通过选自由以下组成的组的手段去除溶剂:旋转蒸发、高真空的施加及其组合。在特定实施方案中,步骤(a)至(c)在步骤(d)至(f)之前进行。在特定实施方案中,步骤(d)至(f)在步骤(a)至(c)之前进行。在特定实施方案中,极性有机溶剂包括乙醇,且非极性有机溶剂包括己烷。在特定实施方案中,步骤(a)至(c)和步骤(d)至(f)各自独立地进行多个循环。
在一些实施方案中,适用于获得可用于本发明的方法的提取物的极性有机溶剂包括诸如但不限于以下的极性溶剂:醇、醚、酯、酰胺、醛、酮、腈及其组合。极性有机溶剂的特定实例为甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、1-丁醇、2-丁醇、仲丁醇、叔丁醇、1-戊醇、2-戊醇、3-戊醇、新戊醇、3-甲基-1-丁醇、2-甲基-1-丁醇、3-甲基-2-丁醇、2-甲基-2-丁醇、乙二醇、乙二醇单甲基醚、二乙醚、甲基乙基醚、乙基丙基醚、甲基丙基醚、1,2-二甲氧基乙烷、四氢呋喃、二氢呋喃、呋喃、吡喃、二氢吡喃、四氢吡喃、乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙醛、甲酸甲酯(methylformate)、甲酸乙酯(ethylformate)、丙酸乙酯、丙酸甲酯、二氯甲烷、氯仿、二甲基甲酰胺、乙酰胺、二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮、丙酮、乙基甲基酮、二乙基酮、乙腈、丙腈及其组合。每一种可能性为独立的实施方案。
在一些实施方案中,适用于在分离级分的制备方法中使用的非极性溶剂可以包括诸如但不限于以下的溶剂:无环的或环状的、饱和的或不饱和的脂肪族烃和芳族烃,例如,C5-C10烷烃、C5-C10环烷烃、C6-C14芳族烃、及其组合。前述的每一个可以任选地被一个或更多个卤素取代,例如C7-C14全氟烷烃。非极性有机溶剂的特定实例为戊烷类(pentanes)、己烷类(hexanes)、庚烷类(heptanes)、辛烷类(octanes)、壬烷类(nonanes)、癸烷类(decanes)、环戊烷、环己烷、环庚烷、苯、甲苯、二甲苯、及其异构体和混合物。每一种可能性为独立的实施方案。
在一些实施方案中,乳香胶从选自由以下组成的组的黄连木属(Pistacia)的物种获得:乳香黄连木(P.lentiscus)、大西洋黄连木(P.atlantica)、P.palestina、P.saportae、黑黄连木(P.terebinthus)、阿月浑子(P.vera)和P.integerrima(全缘黄连木)。每一种可能性为独立的实施方案。
在一些实施方案中,组合物可以包含基于组合物的总重量的约0.01%至约25%(w/w)的乳香胶的分离级分。在一些实施方案中,组合物包含基于组合物的总重量的约0.01%至约12%(w/w)的乳香胶的分离级分。在一些实施方案中,组合物包含基于组合物的总重量的约1%至约10%的乳香胶的分离级分。在一些实施方案中,组合物包含基于组合物的总重量的约1%至约5%的乳香胶的分离级分。在一些实施方案中,组合物包含基于组合物的总重量的约1%至约3%的乳香胶的分离级分。在一些实施方案中,组合物包含基于组合物的总重量的约10%的乳香胶的分离级分。在一些实施方案中,组合物包含基于组合物的总重量的约5%的乳香胶的分离级分。在一些实施方案中,组合物包含约0.01%;0.05%;0.1%;0.5%;1%;2%;3%;4%;6%;7%;8%;9%;11%;12%;13%;14%;15%;16%;17%;18%;或19%(w/w)的乳香胶的分离级分。
在一些实施方案中,乳香胶的分离级分不包含可检测量的聚合月桂烯。在一些实施方案中,乳香胶的分离级分基本上不含聚合月桂烯。在一些实施方案中,乳香胶的分离级分包含不可检测量的聚合月桂烯。
在特定实施方案中,组合物包含小于约10%(w/w),且更优选地小于约5%(w/w)的在极性有机溶剂中可溶且在非极性有机溶剂中不溶的萜化合物。在特定实施方案中,组合物基本上不含在极性有机溶剂中可溶且在非极性有机溶剂中不溶的萜化合物。在一些实施方案中,组合物包含小于约10%(w/w)。在一些实施方案中,组合物包含小于约5%(w/w)的单体萜化合物。在特定实施方案中,组合物基本上不含月桂烯单体。
如本文提及的,萜化合物包括单体和寡聚形式的萜化合物,包括多种分类为单萜、二萜和倍半萜的那些化合物。在特定实施方案中,组合物包含小于约10%(w/w),且更优选小于约5%(w/w)的选自由以下组成的组的单萜化合物:β-月桂烯、α-月桂烯、顺-α-罗勒烯(cis-α-ocimene)、二氢月桂烯、柠檬烯、α-蒎烯、β-蒎烯及其组合。
在一些实施方案中,聚合月桂烯的分离级分来源于植物,并且组合物基本上不含在至少一种极性有机溶剂中可溶并且在至少一种非极性有机溶剂中不溶的萜化合物。
在特定实施方案中,药学上可接受的载体包含疏水性载体。在一些实施方案中,药学上可接受的疏水性载体包含至少一种油。在特定实施方案中,油选自由以下组成的组:矿物油、植物油及其组合。在特定实施方案中,植物油选自由以下组成的组:杏仁油、芥花油(canola oil)、椰子油、玉米油、棉籽油、葡萄籽油、橄榄油、花生油、西红花油、芝麻油、大豆油及其组合。在特定实施方案中,矿物油为轻质矿物油。在特定实施方案中,油为棉籽油。在特定实施方案中,疏水性载体包含至少一种蜡。在特定实施方案中,疏水性载体包含至少一种油和至少一种蜡的组合。
在一些实施方案中,组合物呈选自由以下组成的组的形式:胶囊、片剂、脂质体、栓剂、悬浮液、软膏(ointment)、霜剂(cream)、洗剂、溶液、乳液、膜、胶结物(cement)、粉末、胶(glue)、气雾剂和喷雾剂。
在一些实施方案中,组合物为药物组合物。
在一些实施方案中,受试者为人类。在一些实施方案中,受试者为非人类哺乳动物。
根据一些实施方案,提供了一种包含乳香胶的分离级分和药学上可接受的载体的组合物用于治疗视神经病变状况的用途,其中乳香胶的所述级分的特征在于,它在至少一种极性有机溶剂和至少一种非极性有机溶剂中是可溶的,并且其中所述级分基本上不含在所述极性有机溶剂中可溶但在所述非极性有机溶剂中不溶的化合物。
在一些实施方案中,视神经病变状况可以选自创伤性神经病变、缺血性神经病变;辐射性视神经病变(RON)、青光眼、视神经炎、压迫性视神经病变、浸润性视神经病变、线粒体视神经病变、营养性视神经病变、中毒性视神经病变,遗传性视神经病变及其组合。在一些实施方案中,缺血性视神经病变可以选自:非动脉炎性缺血性视神经病变(NAION)、前部缺血性视神经病变(AION)和后部缺血性视神经病变。每一种可能性为独立的实施方案。
在一些实施方案中,视神经病变状况可以起因于贮积疾病或由贮积疾病引起。在一些实施方案中,贮积疾病可以引起视神经中脂蛋白性物质的沉积。在一些实施方案中,沉积于视神经中的脂蛋白性物质为脂褐素。在一些实施方案中,贮积疾病可以引起矿物质的沉积。在一些实施方案中,沉积于视神经中的矿物质包含钙和/或铁。
在一些实施方案中,组合物可以通过胃肠外途径施用。在一些实施方案中,肠胃外途径可以选自由以下组成的组:静脉内、肌内、皮下、皮内、腹膜内、动脉内、子宫内、尿道内、心内、脑内、脑室内、肾内、肝内、腱内、骨内、眼内和鞘内。每一种可能性为独立的实施方案。在一些实施方案中,组合物通过皮下施用来施用。
在一些实施方案中,乳香胶的分离级分可以基本上不含聚合月桂烯。
在一些实施方案中,至少一种极性有机溶剂可以选自由以下组成的组:醇、醚、酯、酰胺、醛、酮、腈及其组合。在一些实施方案中,极性有机溶剂可以选自由以下组成的组:甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、1-丁醇、2-丁醇、仲丁醇、叔丁醇、1-戊醇、2-戊醇、3-戊醇、新戊醇、3-甲基-1-丁醇、2-甲基-1-丁醇、3-甲基-2-丁醇、2-甲基-2-丁醇、乙二醇、乙二醇单甲基醚、二乙醚、甲基乙基醚、乙基丙基醚、甲基丙基醚、1,2-二甲氧基乙烷、四氢呋喃、二氢呋喃、呋喃、吡喃、二氢吡喃、四氢吡喃、乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙醛、甲酸甲酯、甲酸乙酯、丙酸乙酯、丙酸甲酯、二氯甲烷、氯仿、二甲基甲酰胺、乙酰胺、二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮、丙酮、乙基甲基酮、二乙基酮、乙腈、丙腈及其组合。每一种可能性为独立的实施方案。
在一些实施方案中,至少一种非极性有机溶剂可以选自由以下组成的组:各自任选地被一个或更多个卤素取代的无环的或环状的、饱和的或不饱和的脂肪族烃和芳族烃、及其组合。在一些实施方案中,非极性有机溶剂可以选自由以下组成的组:C5-C10烷烃、C5-C10环烷烃、C6-C14芳族烃和C7-C14全氟烷烃,及其组合。在一些实施方案中,非极性有机溶剂可以选自由以下组成的组:戊烷类、己烷类、庚烷类、辛烷类、壬烷类、癸烷类、环戊烷、环己烷、环庚烷、苯、甲苯、二甲苯、及其异构体和混合物。每一种可能性为独立的实施方案。
在一些实施方案中,分离级分可以通过包括以下步骤的方法获得:
(a)用极性有机溶剂处理乳香胶;
(b)分离在所述极性有机溶剂中可溶的级分;
(c)任选地去除所述极性有机溶剂;
(d)用非极性有机溶剂处理在步骤(b)或(c)中获得的可溶性级分,
(e)分离在所述非极性有机溶剂中可溶的级分;以及
(f)任选地去除所述非极性有机溶剂;
其中步骤(d)至(f)可以在步骤(a)至(c)之前。
在一些实施方案中,该方法还可以包括对步骤(c)或步骤(f)中获得的级分进行尺寸分级分离的步骤。在一些实施方案中,步骤(c)和(f)的任一个或两个包括通过选自由以下组成的组的手段去除溶剂:旋转蒸发、高真空的施加及其组合。在一些实施方案中,该方法还可以包括重复步骤(a)至(c)和/或步骤(d)至(f)持续多个循环。
在一些示例性实施方案中,极性有机溶剂可以为乙醇,且非极性有机溶剂可以为己烷。
在一些实施方案中,乳香胶从选自由以下组成的组的黄连木属的物种获得:乳香黄连木、大西洋黄连木、P.palestina、P.saportae、黑黄连木、阿月浑子和P.integerrima。
在一些实施方案中,载体为选自由以下组成的组的疏水性载体:至少一种油、至少一种蜡及其组合。在一些实施方案中,至少一种油选自由以下组成的组:杏仁油、芥花油、椰子油、玉米油、棉籽油、葡萄籽油、橄榄油、花生油、西红花油、芝麻油、大豆油及其组合。
根据一些实施方案,提供了一种治疗视神经病变状况的方法,所述方法包括将治疗有效量的乳香胶的分离级分和药学上可接受的载体施用至有相应需要的受试者,由此治疗视神经病变状况,其中乳香胶的分离级分的特征在于,它在至少一种极性有机溶剂和至少一种非极性有机溶剂中是可溶的,并且其中乳香胶的分离级分基本上不含在所述极性有机溶剂中可溶但在所述非极性有机溶剂中不溶的化合物。
本发明的其他目的、特征和优点从以下描述和附图将变得清楚。
附图简述
图1-根据一些实施方案的获得乳香胶的分离级分的方法中的步骤的示意图;
图2-显示在用乳香胶的分离级分(“RPH-201”)治疗的受试者或用安慰剂治疗的受试者中,在多个时间点(13周、26周和停药(Off-Drug)随访(Follow-Up Visit))的ETDRS字母阅读中从基线的平均增加的条形图;
图3-显示对于用乳香胶的分离级分(“RPH-201”)治疗的受试者或用安慰剂治疗的受试者,如在多个时间点(13周、26周和停药随访)确定的具有10个或更多个字母的增加的受试者的比例的条形图;
图4.-显示由RPh201A诱导的对原代视网膜神经节细胞的神经保护活性的条形图。原代视网膜神经节细胞在正常条件(5%血清)下生长,未记录到凋亡。在血清剥夺条件下,培养物显示出显著量的凋亡。这种作用通过将RPh201添加至培养物中而以剂量依赖性模式救援。
图5A-B–从已经历轴突切断(axotomy)和一个月后用RPh201A(图5A)或媒介物(图5B)处理持续3个月的时间段的大鼠获得的视网膜RGC细胞的荧光显微镜图像(指示RGC存活力)的象形图。在处死动物之前24小时将FITC缀合的Di-Asp(逆行神经跟踪剂(retrogradeneurotracer))插入到视神经中。分离视网膜,在载玻片上平铺片(flat mounted)并用荧光显微镜可视化。放大率×20。
发明详述
根据一些实施方案,提供了包含从乳香胶提取的分离级分的组合物及其用于治疗视神经病变的用途。
本文首次公开了,所公开的如本文描述的乳香胶的分离级分可以用作用于治疗视神经病变(起因于多种结果)的药物组合物中的活性成分,视神经病变为可以导致受影响的受试者中视觉损失的严重状况。
定义
如本文使用的,术语“乳香(mastic)”、“乳香树脂(mastic resin)”、“乳香胶(gummastic)”和“乳香胶(mastic gum)”可互换使用,指从分类为漆树科中的任何树作为渗出物获得的树脂(也被称为油树脂)。黄连木属中的树,最显著地乳香黄连木且特别地栽培品种P.lentiscus L.cv.Chia(在希腊希俄斯岛(Greek island of Chios)上栽培)以其高产量的乳香而闻名。其他品种包括P.lentiscus L.var.emarginata Engl.和P.lentiscusL.var.latifolia Coss。黄连木属的其他物种包括例如,大西洋黄连木、P.palestina、P.saportae、黑黄连木、阿月浑子和P.integerrima。
如本文使用的,术语“聚合物”指包含同一化学结构的重复亚单元(也被称为单体)的化合物或化合物的混合物,其中单体处于共价连接。可以从其形成聚合物的单体的实例为萜,例如单萜诸如月桂烯。聚合物可以具有不同聚合度,并且因此包含多种链长度的聚合形式。聚合物包括均聚物和杂聚物(也被称为共聚物),并且可以具有多种异构构型和非对映异构构型。
如本文使用的,术语“聚合月桂烯(polymeric myrcene)”和“聚月桂烯(polymyrcene)”可互换地指由月桂烯单体形成的聚合物。聚合月桂烯包括具有不同聚合度的聚合形式,和优选地具有聚合度为至少6的月桂烯聚合物。本发明包括,但不限于,聚合β-月桂烯(聚-β-月桂烯)、聚合α-月桂烯(聚-α-月桂烯)、其均聚物、包含与异种单体直接或间接共价连接的月桂烯单体的杂聚物(也被称为共聚物)、其反式和顺式异构体、其D-和L-对映异构体或其组合。聚合月桂烯可以以分离形式从植物来源,特别地从乳香获得,或者可以为化学合成反应的产物。
如本文使用的,术语“乳香胶的分离级分”指在至少一种极性或非极性有机溶剂或其组合中对乳香胶进行提取之后得到的级分。本发明的分离级分在极性和非极性有机溶剂中的任一者或二者中一般是可溶的。
如本文使用的,“萜化合物(terpene compounds)”指含异戊二烯的烃和相关的含氧化合物,诸如醇、醛或酮(类萜(terpenoids))。异戊二烯单元(CH2=C(CH3)-CH=CH2)为此类化合物的基本结构单元。萜烃通常具有分子式(C5H8)n,并且包括分别具有2个、3个、4个异戊二烯单元的单萜、倍半萜、二萜。萜类(Terpenes)可以进一步被分类为无环的或环状的。单萜的实例包括月桂烯、柠檬烯和蒎烯,它们分别为无环的、单环的和双环的单萜的实例。倍半萜的实例包括橙花叔醇(nerolidol)和法呢醇(farnesol)。二萜的实例包括咖啡醇(cafestol)和叶绿醇(phytol)。
如本文使用的,“基本上不含”意指,根据本发明的制剂或药物组合物通常包含小于3%,优选地小于1%,且最优选地小于0.5%的陈述物质。
如本文使用的,“可检测水平”指陈述物质多于约3%、陈述物质多于1%、优选地不多于0.5、且最优选地不多于0.1%的量。一致地,术语“不可检测水平”指陈述物质不多于约3%、不多于1%、优选地不多于0.5、且最优选地不多于0.1%的量。
如本文使用的,“治疗有效量”指基本上诱导、促进或产生所期望的治疗作用的药物成分的量。
如本文使用的,“药学上可接受的载体”指用于增强与其一起配制的药物成分的递送和/或药代动力学特性,但其本身不具有治疗作用、也不诱导或引起受试者中任何不期望或不想要的影响或不良反应的稀释剂或媒介物。
如本文使用的,“药学上可接受的疏水性载体”指乳香胶的分离级分和/或聚合月桂烯被溶解或悬浮于其中的疏水性非极性稀释剂或媒介物。
如本文使用的,术语“视神经病变”和“视神经萎缩”可以互换使用。该术语指由于任何原因引起的视神经损害。该术语还包括起因于视神经病变或与视神经病变相关的任何状况或紊乱,诸如缺血性视神经病变(包括非动脉炎性缺血性视神经病变(NAION)、前部缺血性视神经病变(AION)、后部缺血性视神经病变);辐射性视神经病变(RON));创伤性视神经病变、青光眼、视神经炎、压迫性视神经病变、浸润性视神经病变、线粒体视神经病变、营养性视神经病变、中毒性视神经病变,遗传性视神经病变、起因于贮积疾病的损害等;或其组合。每一种可能性为独立的实施方案。
如本文使用的,术语“贮积疾病”指导致正常或异常性质的物质诸如脂类、蛋白、脂蛋白、碳水化合物以及其他物质的过度积累的任何类型的代谢紊乱。特别重要的为与视神经病理性损害相关的脂褐素的积累。
本文陈述的数值应被理解为所陈述值+/-10%。
术语“约”旨在包括陈述值+/-陈述值的10%。
根据一些实施方案,本发明提供了乳香胶的分离级分及其用于治疗视神经病变的用途。乳香胶的分离级分可以从植物来源,特别地乳香胶获得,或者它可以为化学合成的产物。可以从其获得乳香胶的分离级分的植物物种为黄连木属并且可以选自种乳香黄连木、大西洋黄连木、P.palestina、P.saportae、黑黄连木、阿月浑子和P.integerrima。
根据一些实施方案,用于获得乳香胶的分离级分的方法包括通过一般描述的诸如此类步骤:将收集的植物材料,例如乳香胶,在合适的容器中与合适的溶剂通常极性溶剂组合。合适的极性溶剂包括例如,醇、醚、酯、酰胺、醛、酮、腈及其组合。极性有机溶剂的特定实例为甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、1-丁醇、2-丁醇、仲丁醇、叔丁醇、1-戊醇、2-戊醇、3-戊醇、新戊醇、3-甲基-1-丁醇、2-甲基-1-丁醇、3-甲基-2-丁醇、2-甲基-2-丁醇、乙二醇、乙二醇单甲基醚、二乙醚、甲基乙基醚、乙基丙基醚、甲基丙基醚、1,2-二甲氧基乙烷、四氢呋喃、二氢呋喃、呋喃、吡喃、二氢吡喃、四氢吡喃、乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙醛、甲酸甲酯、甲酸乙酯、丙酸乙酯、丙酸甲酯、二氯甲烷、氯仿、二甲基甲酰胺、乙酰胺、二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮、丙酮、乙基甲基酮、二乙基酮、乙腈、丙腈及其组合。
根据一些实施方案,可以将乳香胶和溶剂组合使得溶剂大大过量,例如10:1或20:1。混合物可以在范围为从几分钟至几个小时的时间内周期性地或连续地搅动。溶剂可以不经任何处理地被倾析,或任选地混合物可以首先经历例如100rpm至2000rpm的低速离心。将不溶性材料从提取物中回收,并且将新鲜的等份溶剂添加至不溶性材料中,使提取和溶解过程重复进行多个循环,以获得尽可能多的极性溶剂可溶性化合物。在最终溶解步骤之后,将包含极性溶剂可溶性材料的提取物组合,并将极性溶剂蒸发(例如通过使用如本领域已知的旋转蒸发),以产生极性溶剂可溶性材料,其可以被称为粗制提取物或“第一步”提取物。
根据一些实施方案,第一步提取物材料可以与非极性有机溶剂组合,并通过1-24小时的时间段的振荡提取。合适的非极性溶剂包括,例如,无环的或环状的、饱和的或不饱和的脂肪族烃和芳族烃,例如,C5-C10烷烃、C5-C10环烷烃、C6-C14芳族烃、及其组合。前述的每一个可以任选地被一个或更多个卤素取代,例如C7-C14全氟烷烃。非极性有机溶剂的特定实例为戊烷类、己烷类、庚烷类、辛烷类、壬烷类、癸烷类、环戊烷、环己烷、环庚烷、苯、甲苯、二甲苯、及其异构体和混合物。
根据一些实施方案,可以将在非极性溶剂存在下保持不溶或沉淀的材料去除并弃去。然后非极性溶剂可溶性级分可以通过蒸发非极性溶剂(例如通过旋转蒸发)获得。该级分可以被称为纯化的或“两步”提取物,相应于乳香胶的分离级分,其特征在于它在极性溶剂和非极性溶剂两者中是可溶的,而将在极性溶剂中可溶但在非极性溶剂中不溶的材料去除。该特征将本发明的分离级分与现有技术的乳香胶提取物区分开,后者通常包含仅在极性溶剂中可溶的多种化合物。根据本发明的教导,此类化合物干扰本文公开的分离级分的有益生物活性。
在一些实施方案中,可以将两步提取物例如通过高真空处理(例如<0.01毫巴持续长达几天)进一步干燥以去除剩余的溶剂和其他挥发性材料,称重并与合适的非极性有机溶剂或其他载体组合以实现其溶解。获得的级分可以直接使用,或使用本领域已知的手段进一步纯化、表征和/或分级分离。
现在参考图1,图1为根据一些实施方案的获得乳香胶的分离级分的方法中的步骤的示意图。如图1中示出的,在步骤2,获得乳香胶树脂(Mastic gum resin)。然后,在步骤4,用极性有机溶剂提取树脂。将极性有机溶剂(诸如,例如乙醇)添加至树脂中并孵育(例如在黑暗中)持续一定时间段,任选地伴随偶尔振荡。将有机极性溶剂(包含提取物)转移至干净的容器中。将新鲜的极性有机溶剂添加至剩余的材料中,孵育一定时间段并转移至干净的容器(包含第一极性溶剂级分)中。然后,在步骤6,极性有机溶剂例如通过蒸发去除。在步骤8,将非极性溶剂(诸如,例如,己烷)添加至极性有机溶剂提取物中持续一定时间段,伴随偶尔振荡,并且优选地在黑暗中孵育。将非极性溶剂(包含提取物)转移到干净的容器中。将新鲜的非极性溶剂添加至剩余的材料中,孵育一定时间段并转移至干净的容器(包含第一非极性级分)中。然后,在步骤10,将非极性溶剂(例如通过在旋转蒸发器中蒸发)去除。然后,在步骤12,可以将油(诸如,例如,棉籽油)添加至提取物中。添加的油的量可以基于该方法的收率来确定。在一些实施方案中,可以添加油以提供20%(w/w)制剂。在一些实施方案中,可以添加油以提供5%(w/w)制剂。在步骤14,将任何剩余的极性和/或非极性溶剂(例如,通过蒸发)去除。任选地,在步骤16,制剂可以稀释至以百分比(w/w)(例如5%(w/w))计的期望的浓度。稀释可以例如通过添加所需量的油来进行。在任选的步骤18,制剂可以例如,通过使用0.2微米过滤器的无菌过滤进一步过滤并灭菌。可以将无菌制剂进一步填充于合适的小瓶/安瓿中并贴上标签(labeled)。
在一些实施方案中,本发明的分离级分可以通过包括以下步骤的方法获得:
(a)用极性有机溶剂处理乳香胶;
(b)分离在所述极性有机溶剂中可溶的级分;
(c)任选地去除所述极性有机溶剂;
(d)用非极性有机溶剂处理在步骤(b)或(c)中获得的可溶性级分,
(e)分离在所述非极性有机溶剂中可溶的级分;以及
(f)任选地去除所述非极性有机溶剂;
其中步骤(d)至(f)可以在步骤(a)至(c)之前。
该方法还可以包括例如通过尺寸排阻层析或本领域已知的任何其他方法对在步骤(c)或步骤(f)之后获得的可溶性级分进行尺寸分级分离。
在一些实施方案中,该方法还可以包括在步骤(c)或(f)的任一个或两个之后去除溶剂。溶剂去除可以通过本领域已知的任何手段进行,例如旋转蒸发,高真空的施加及其组合。在特定实施方案中,步骤(a)至(c)在步骤(d)至(f)之前进行或反之亦然。在特定实施方案中,极性有机溶剂包括乙醇,且非极性有机溶剂包括己烷。步骤(a)至(c)和步骤(d)至(f)可以各自独立地进行多个循环,以优化提取过程和产物的纯化程度。
根据一些实施方案,为了制备用于治疗用途的组合物,可以使用合适的载体,诸如,疏水性载体,包括药学上可接受的油,任选地与蜡组合,如本文描述的。
在一些实施方案中,包含如本文描述的从乳香胶分离的级分的组合物将包含小于约20%(w/w)的单体、寡聚萜化合物,所述单体、寡聚萜化合物在极性有机溶剂中是可溶的并且在非极性有机溶剂中是基本上不溶的,其中以上提及的溶剂指用于制备级分的那些溶剂。更优选地,分离级分包含小于约5%(w/w)的此类萜化合物。甚至更优选地,分离级分基本上不含此类萜化合物。
如本领域已知的,聚合产物的分子量可以以多种方式表示,例如重均分子量或数均分子量。分子量可以通过任何多种手段来确定,诸如光散射、多角度激光光散射(MALLS)、小角度中子散射、X射线散射、沉降速度、粘度测定(viscometry)(Mark-Houwink方程)、质谱(例如MALDI-TOF)和凝胶渗透层析。
聚合月桂烯可以作为起因于碳-碳双键周围的取代基的布置的不同几何异构体存在。此类异构体被指定为顺式或反式构型(也分别被称为Z或E构型),其中顺式(或Z)代表取代基在碳-碳双键的同一侧上,且反式(或E)代表取代基在碳-碳双键的相对侧上。多种几何异构体及其混合物被包括在本发明的范围内。
在一些实施方案中,如本文使用的乳香胶的分离级分基本上不含聚合月桂烯。在一些实施方案中,乳香胶的分离级分不包含任何可检测水平的聚合月桂烯。在一些实施方案中,乳香胶的分离级分具有不可检测水平的聚合月桂烯。
根据一些实施方案,提供了一种用于在治疗视神经病变状况中使用的组合物,该组合物包含治疗有效量的乳香胶的分离级分和药学上可接受的载体。在一些实施方案中,载体为疏水性的。
在一些实施方案中,合适的疏水性载体可以包括至少一种油,诸如,例如矿物油、植物油或其组合。
根据一些实施方案,术语“矿物油”指从石油蒸馏获得的澄清无色几乎无气味(odorless)和无味道(tasteless)的液体。它也可以被称为白油(white oil)、白矿物油、液体矿脂(liquid petrolatum)、液体石蜡或白石蜡油。根据本发明的特定实施方案,矿物油为轻质矿物油,轻质矿物油是可以作为NF(美国国家处方集(National Formulary))等级产品或作为USP(美国药典(US Pharmacopoeia))等级产品获得的商业可用产品。为了用于本发明,矿物油优选地不含芳族化合物和不饱和的化合物。
根据一些实施方案,合适的植物油包括,但不限于,杏仁油、芥花油、椰子油、玉米油、棉籽油、葡萄籽油、橄榄油、花生油、西红花油、芝麻油、大豆油或其组合。每一种可能性为独立的实施方案。根据本发明的特定实施方案,植物油为可以作为NF(美国国家处方集)等级产品或作为USP(美国药典)等级产品获得的商业可用产品。在一些实施方案中,矿物油为轻质矿物油。在一些示例性实施方案中,植物油为棉籽油。在一些实施方案中,植物油为NF(美国国家处方集)等级或USP(美国药典)等级并适用于肠胃外施用的棉籽油。在一些实施方案中,油可以被稳定化。
在一些实施方案中,为了防止由例如氧化引起的降解,抗氧化剂/稳定剂可以被包含在制剂中,并且抗氧化剂以产生所期望功能的量使用,条件是该量不影响溶液的稳定性。抗氧化剂包括,但不限于,自由基清除剂和还原剂,诸如乙酰半胱氨酸、抗坏血酸、丁基化羟基甲苯、绿茶提取物、咖啡酸、半胱氨酸、生育酚、泛醌和没食子酸丙酯,优选地2,6-二-叔丁基-4-甲基苯酚(也称为丁基化羟基甲苯或“BHT”、CAS nr.[128-37-0])。
根据一些实施方案,药学上可接受的载体可以可选地或另外包含合适的油替代物。油替代物包括具有至少10个碳的烷烃(例如,异十六烷(isohexadecane))、苯甲酸酯、脂肪族酯、非致粉刺性酯(noncomodogenic esters)、挥发性硅氧烷化合物(例如,环甲硅油)和挥发性硅氧烷替代物。苯甲酸酯的实例包括C12C15烷基苯甲酸酯、异硬脂酰苯甲酸酯(isostearyl benzoate)、苯甲酸2-乙基己酯(2-ethyl hexyl benzoate)、苯甲酸二丙二醇酯(dipropylene glycol benzoate)、苯甲酸辛基十二烷基酯(octyldodecyl benzoate)、硬脂酰苯甲酸酯(stearyl benzoate)和山嵛苯甲酸酯(behenyl benzoate)。脂肪族酯的实例包括C12C15烷基辛酸酯和马来酸二辛酯(dioctyl maleate)。非致粉刺性酯的实例包括异壬酸异壬酯(isononyl isononanoate)、异壬酸异癸酯(isodecyl isononanoate)、二异硬脂酰二聚二亚油酸酯(diisostearyl dimer dilinoleate)、花生酰丙酸酯(arachidylpropionate)和异壬酸异十三烷基酯(isotridecyl isononanoate)。挥发性硅氧烷代替物的实例包括癸酸异己酯(isohexyl decanoate)、异壬酸辛酯(octyl isononanoate)、辛酸异壬酯(isononyl octanoate)和二乙二醇二辛酸酯(diethylene glycol dioctanoate)。
在一些实施方案中,疏水性载体还可以包含至少一种蜡。蜡包括例如,蜂蜡;植物蜡、甘蔗蜡、矿物蜡和合成蜡。植物蜡包括例如,巴西棕榈蜡、小烛树蜡(candelilla wax)、小冠巴西棕蜡(ouricury wax)和霍霍巴蜡(jojoba wax)。矿物蜡包括例如,石蜡、褐煤蜡(lignite wax)、微晶蜡和地蜡(ozokerite)。合成蜡包括例如聚乙烯蜡。
在一些实施方案中,药物组合物可以被配制成适用于施用途径的许多形式的任何形式,诸如,例如胶囊(包括软胶囊)、片剂、凝胶、脂质体、栓剂、悬浮液、软膏、溶液、乳液或微乳液、膜、胶结物、粉末、胶、气雾剂、喷雾剂和凝胶。
在一些实施方案中,为了制备药物组合物,分离级分可以被适当地配制为包合复合物(inclusion complexes)、纳米乳液、微乳液、粉末和脂质体。在特定实施方案中,包合复合物包含至少一种环糊精。在特定实施方案中,环糊精包括羟丙基-β-环糊精。在特定实施方案中,纳米乳液包含具有小于800nm的平均粒径的液滴。在特定实施方案中,液滴具有小于500nm的平均粒径。在特定实施方案中,液滴具有小于200nm的平均粒径。在特定实施方案中,粉末为喷雾干燥的粉末。在特定实施方案中,脂质体包含多层囊泡。在特定实施方案中,微乳液包含非离子表面活性剂。非离子表面活性剂包括,但不限于,聚氧乙烯蓖麻油(polyoxyl castor oils)、聚氧乙烯脱水山梨醇脂肪酸酯(聚山梨醇酯(polysorbate))、泊洛沙姆、维生素E衍生物、聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯硬脂酸酯、饱和的聚乙二醇化甘油酯或其组合。
根据一些实施方案,分离级分的多种制剂及其制备在本文公开于实施例1中。本发明的药物组合物可以通过达到其预期目的的任何手段施用。在一些实施方案中,施用为通过肠胃外途径。在一些实施方案中,施用为肠胃外、局部施用。在一些实施方案中,肠胃外施用可以选自,但不限于:静脉内、肌内、皮下、皮内、腹膜内、动脉内、子宫内、尿道内、心内、脑内、脑室内、肾内、肝内、腱内、骨内、眼内和鞘内的施用途径。
根据一些实施方案,施用的剂量取决于受试者的年龄、健康和体重,同时治疗(如果有的话)的使用,治疗频率以及期望作用的性质。以任何单位剂型的本发明的分离级分的量包括治疗有效量,其可以根据受体受试者(recipient subject)、施用途径和频率而变化。
根据一些实施方案,存在于药物组合物中的分离的乳香胶级分的量可以方便地在基于组合物的总重量,以重量/重量计(on a weight per weight basis)从约0.01%至约25%,诸如0.01%至约12%的范围内。例如,对于通过注射施用,分离的乳香胶级分在组合物中的百分比可以在从约0.1%至约10%的范围内,例如10%、7.5%、5%、3%、2.5%、1.5%、1%和0.5%。
在一些实施方案中,本发明的药物组合物可以以本领域技术人员本身已知的方式制备,例如通过常规混合、成粒、溶解、提取或冻干方法。
在一些实施方案中,用于肠胃外施用的制剂可以适当地包括活性化合物的悬浮液和微粒分散体。在一些实施方案中,可以施用油性注射悬浮液。合适的亲脂性溶剂或媒介物包括脂肪油,例如,芝麻油,或合成的脂肪酸酯,例如,油酸乙酯、甘油三酸酯、聚乙二醇-400、克列莫佛(cremophor)或环糊精。注射悬浮液可以包含增加悬浮液粘度的物质,包括,例如,羧甲基纤维素钠、山梨糖醇、和/或葡聚糖(dextran)。任选地,悬浮液还可以包含稳定剂。
在一些实施方案中,药物组合物还可以使用包含活性成分的脂质体来制备。如本领域已知的,脂质体通常来源于磷脂或其他脂类物质。脂质体由分散于水性介质中的单层或多层水合液晶形成。可以使用能够形成脂质体的任何无毒的、生理上可接受的和可代谢的脂类。通常,优选的脂类为天然和合成的磷脂和磷脂酰胆碱(卵磷脂)。形成脂质体的方法为本领域已知的,如例如,在Prescott编著,Methods in Cell Biology,第XIV卷,AcademicPress,New York,N.Y.(1976)以及在美国专利第7,048,943号中公开的。
在一些实施方案中,药物组合物可以包含水包油乳液或微乳液,以促进其用于肠胃外使用的配制。此类乳液/微乳液通常包括脂类,表面活性剂,任选地保湿剂(humectant)和水。合适的脂类包括通常已知可用于产生水包油乳液/微乳液的那些,例如脂肪酸甘油酯。合适的表面活性剂包括通常已知可用于产生水包油乳液/微乳液的那些,其中脂类用作乳液中的油组分。非离子表面活性剂可以是优选的,诸如,例如,乙氧基化蓖麻油、磷脂和环氧乙烷与环氧丙烷的嵌段共聚物。合适的保湿剂(如果使用)包括例如丙二醇或聚乙二醇。
根据一些实施方案,药物组合物可以以凝胶的形式配制,凝胶诸如由凝胶形成聚合物诸如角叉聚糖、黄原胶、刺梧桐胶、阿拉伯胶、刺槐豆胶、瓜尔胶形成的水凝胶。水凝胶可以与包含活性成分的水包油乳液组合。
根据另外的实施方案,提供了治疗视神经病变的治疗用途和方法。该方法包括将治疗有效量的包含如本文描述的乳香胶的分离级分的组合物施用至受试者。
在一些实施方案中,施用组合物的步骤可以包括任何可接受的途径,包括肠胃外途径。肠胃外施用包括,例如,静脉内、肌内、皮下、皮内、腹膜内、动脉内、子宫内、尿道内、心内、脑内、脑室内、肾内、肝内、腱内、骨内、眼内和鞘内的施用途径。每一种可能性为独立的实施方案。
在一些实施方案中,组合物可以以每周两次的时间表以均匀间隔皮下施用。在一些实施方案中,组合物可以以每隔一天的时间表皮下施用。在一些实施方案中,组合物可以以每七天一次(一周一次)的时间表皮下施用。在一些实施方案中,组合物可以每天一次皮下施用。
在一些实施方案中,组合物可以作为棉籽油中乳香胶的分离级分的5%(w/w)制剂皮下施用。在一些实施方案中,组合物可以作为稳定化的棉籽油中乳香胶的分离级分的5%(w/w)制剂皮下施用。在一些实施方案中,制剂可以包括20mg药物物质(分离级分)。
在一些实施方案中,组合物可以作为BHT稳定化的棉籽油中乳香胶的分离级分的5%(w/w)制剂皮下施用。在一些实施方案中,组合物可以以每周两次的时间表以均匀间隔作为棉籽油中乳香胶的分离级分的5%(w/w)制剂皮下施用。在一些实施方案中,组合物可以以每周一次的时间表(每周一次)以均匀间隔作为棉籽油中乳香胶的分离级分的5%(w/w)制剂皮下施用。在一些实施方案中,组合物可以以每天一次的时间表以均匀间隔作为棉籽油中乳香胶的分离级分的5%(w/w)制剂皮下施用。
在一些实施方案中,组合物可以以乳香胶的分离级分的5%(w/w)制剂以0.4毫升(ML)的剂量皮下施用。在一些实施方案中,组合物可以以乳香胶的分离级分的5%(w/w)制剂以0.2毫升(ML)的剂量皮下施用。在一些实施方案中,组合物可以以乳香胶的分离级分的5%(w/w)制剂以0.8毫升(ML)的剂量皮下施用。在一些实施方案中,组合物可以以每周两次以均匀间隔作为棉籽油中乳香胶的分离级分的5%(w/w)制剂以0.4毫升(ML)的剂量皮下施用。在一些实施方案中,组合物可以以每周两次以均匀间隔作为棉籽油中乳香胶的分离级分的5%(w/w)制剂以0.2毫升(ML)的剂量皮下施用。在一些实施方案中,组合物可以以每周两次以均匀间隔作为棉籽油中乳香胶的分离级分的5%(w/w)制剂以0.8毫升(ML)的剂量皮下施用。
在一些实施方案中,在任何合适的制剂中,药物物质(乳香胶的分离级分)的剂量可以在5-200mg的范围内。在一些实施方案中,在任何合适的制剂中,药物物质(乳香胶的分离级分)的剂量可以在0.1mg-200mg的范围内。在一些实施方案中,在任何合适的制剂中,药物物质(乳香胶的分离级分)的剂量可以在200mg-600mg的范围内。在一些实施方案中,药物物质可以以20mg药物物质的剂量(在合适的制剂中)施用。在一些实施方案中,药物物质可以以40mg药物物质的剂量(在合适的制剂中)施用。在一些实施方案中,药物物质可以以50mg药物物质的剂量(在合适的制剂中)施用。在一些实施方案中,药物物质可以以60mg药物物质的剂量(在合适的制剂中)施用。在一些实施方案中,药物物质可以以80mg药物物质的剂量(在合适的制剂中)施用。在一些实施方案中,药物物质可以以100mg药物物质的剂量(在合适的制剂中)施用。
在一些实施方案中,组合物可以每天1-4次,每周1-7次施用。在一些实施方案中,组合物可以每周4次施用。在一些实施方案中,组合物可以每周2次施用。在一些实施方案中,组合物可以每周1次施用。
对于本领域技术人员清楚的是,可以设想和设计以上指示的施用途径、时间表、剂量和方案的许多变化。应当理解,施用途径、时间表、剂量和方案中的这些变化也在本发明的范围内。
根据一些实施方案,本文公开的用于治疗视神经病变的方法对于罹患起因于视神经损害或与视神经损害相关的状况的受试者特别有利,所述状况诸如,例如,青光眼、创伤性视神经病变、缺血性视神经病变、青光眼、由肿瘤引起的神经病变、由感染引起的神经病变、线粒体视神经病变、营养性视神经病变、辐射性视神经病变、中毒性视神经病变、由沉积疾病(deposition disease)引起的损害等或其组合。每一种可能性为独立的实施方案。
在一些实施方案中,本文公开的用于治疗视神经病变的用途和方法对于罹患起因于由于沉积疾病造成的视神经损害或与由于沉积疾病造成的视神经损害相关的状况的受试者特别有利,所述状况诸如,视神经中脂蛋白性物质的沉积、脂褐素的沉积。
在一些实施方案中,本文公开的用于治疗视神经病变的用途和方法对于罹患起因于视神经中脂蛋白性物质的沉积或与视神经中脂蛋白性物质的沉积相关的状况的受试者特别有利。
在一些实施方案中,本文公开的用于治疗视神经病变的用途和方法对于罹患起因于由于视神经中脂蛋白性物质的沉积造成的视神经损害或与由于视神经中脂蛋白性物质的沉积造成的视神经损害相关的状况的受试者特别有利,其中脂蛋白性物质的沉积为贮积疾病的结果。
在一些实施方案中,本文公开的用于治疗视神经病变的用途和方法对于罹患起因于由于视神经中脂蛋白性物质的沉积造成的视神经损害或与由于视神经中脂蛋白性物质的沉积造成的视神经损害相关的状况的受试者特别有利,其中脂蛋白性物质的沉积为贮积疾病的结果,并且其中所沉积的脂蛋白性物质为脂褐素。
在一些实施方案中,本文公开的用于治疗视神经病变的用途和方法对于罹患起因于由于视神经中矿物质的沉积造成的视神经损害或与由于视神经中矿物质的沉积造成的视神经损害相关的状况的受试者特别有利,其中矿物质的沉积为贮积疾病的结果,并且其中沉积于视神经中的矿物质包含钙和/或铁。
在一些实施方案中,本文公开的组合物可以用于改善罹患视神经病变状况(诸如,例如,NAION)的受试者中的最佳矫正视力(BCVA)(即用眼镜或隐形眼镜的最佳距离视觉)。在一些实施方案中,在用本文公开的组合物治疗之后,可以改善BCVA的10个或更多个ETDRS(早期治疗糖尿病性视网膜病变研究)。ETDRS图表的特征在于,字母尺寸的比例布局和几何级数(geometric progression)被用作人口研究和临床研究中的视力测量的“黄金标准”。
在一些实施方案中,本文公开的治疗用途和治疗方法适用于人类和非人类哺乳动物。
根据一些实施方案,本发明的方法可以包括使用掺入包含如本文描述的乳香胶的分离级分的组合物的制品(article of manufacture)。
在一些实施方案中,药物组合物可以呈制品上的包衣形式,或者可以被包含在与制品一体的容器(a vessel which is integral to the article of manufacture)内。
在一些实施方案中,药物组合物可以被掺入至藉以将该组合物递送至需要疗法的身体部位的递送装置诸如针、注射装置或喷雾分配器中。
在一些实施方案中,制品包括但不限于针、微针、注射装置和喷雾分配器。
以下实施例被展示以更充分地说明本发明的某些实施方案。然而,它们绝不应该被解释为限制本发明的广泛的范围。本领域技术人员可以容易地设想本文公开的原理的许多变化和修改,而不偏离本发明的范围。
实施例
实施例1乳香胶的分离级分(物质Rph-DS-1)及其多种制剂的制备
方法1-乳香胶的分离级分(本文被称为(药物)物质RPh-DS-1)的制备:
在10L实验室瓶(B1)中,引入乳香树脂(250g),随后添加无水乙醇(4L)。允许混合物在室温(优选地在黑暗中)静置至少12小时。将混合物轻轻振荡10-30秒,以允许乙醇部分均质化,而不干扰在底部的未溶解的树脂颗粒。然后允许混合物静置至少另外2小时。随后将包含混合物的瓶子在轨道振荡器上以100-150rpm振荡至少15分钟,并留下至静置至少15分钟,以允许较大的颗粒沉降。将获得的乙醇溶液(E1)从不溶性材料小心地倾析到干净的10L实验室瓶(B2)中。将新鲜的乙醇(2L)添加至瓶B1中的不溶性材料,并且将混合物在轨道振荡器上以100-150rpm振荡至少15分钟。在静置至少15分钟之后,将第二乙醇溶液(E2)小心倾析到瓶B2中,并且因此与乙醇级分E1组合。将新鲜的乙醇(1L)添加至B1瓶中的剩余物,并且重复相同的顺序,得到乙醇溶液E3。在将乙醇溶液E3与已经组合的溶液E1和E2组合后,在瓶B2中获得总计7L的乙醇溶液(E)。
将瓶B2中的乙醇溶液(E)以等份分配在5个3升蒸发烧瓶(F1-F5)中,并使用旋转蒸发器真空蒸发乙醇,同时避免过度起泡。在乙醇蒸发后,将1.5L正己烷添加至烧瓶F1-F5的每一个中。将混合物在轨道振荡器上以120-150rpm振荡至少1.5小时,并且然后让其静置至少1.5小时。将从每一个烧瓶获得的正己烷溶液通过小心倾析组合到干净的15L实验室瓶(B3)中。将另外的700ml份(700ml portion)的新鲜的正己烷添加至烧瓶F1-F5的每一个中的剩余物,并且重复振荡和静置程序。将第二正己烷溶液组合到烧瓶B3中后,获得约11L的己烷溶液H。将该溶液分配到5个清洁的预称重的3L蒸发烧瓶(F6-F10)中,并且真空蒸发正己烷。蒸发可以分两步进行,首先添加1.5L己烷溶液并蒸发大部分己烷,随后添加剩余的700ml己烷溶液并完成蒸发。在蒸发完成之后,在烧瓶F6-F10中获得的药物物质的总收率范围在乳香树脂起始材料的50%-70%(125-175克)之间,在大多数情况下在55%-65%(137.5–162.5克)之间。如此获得的分离的乳香胶级分(本文被称为(药物)物质RPh-DS-1))具有白色至灰白色或微黄色,并且在室温具有粘性泡沫/半固体稠度。高于35℃至40℃时,该材料将熔化为非常粘稠的液体/油性材料。当冷却至低于15℃时,材料变得更加固态。
利用相同的程序与不同溶剂组合,制备了乳香胶的另外的分离级分。将这些归纳于下文表1中。
表1:
方法2:分离的乳香胶级分(药物物质RPh-DS-1)的制剂;在BHT稳定化的棉籽油中
制备制剂(药物产品)RPh201-A(5%w/w)。
向以上方法1的每一个烧瓶(F6-F10)中的分离的乳香胶级分(药物物质RPh-DS-1)添加所需的量的BHT稳定化的棉籽油(如下文实施例2的方法1中详述来制备)以获得药物物质在BHT稳定化的棉籽油中的5%(w/w)溶液。将烧瓶在轨道振荡器上振荡,直至形成澄清且均质的溶液。随后使每一个烧瓶在30℃水浴温度在真空通过旋转蒸发经历剩余乙醇和正己烷的进一步去除,持续至少2小时。有时需要达到0.1毫巴或更低的真空度,以便对于乙醇有效地去除剩余溶剂低于5000ppm且对于正己烷有效地去除剩余溶剂低于200ppm。乙醇和正己烷的剩余水平通过气相色谱程序测量。
在30℃的水浴温度真空处理3-5小时后,发现剩余乙醇和正己烷的水平分别低于5000ppm和200ppm。然后将油溶液组合到干净的预称重的5L实验室烧瓶中。通常获得的制剂量范围为从2.65-3.25Kg(2.8-3.4升)。使溶液经历无菌过滤,并且在通过无菌性和内毒素测试之后,将该溶液无菌地填充到所期望的小瓶或安瓿中。
方法3:分离的乳香胶级分(药物物质RPh-DS-1)的制剂—在BHT稳定化的棉籽油中
制备制剂(药物产品)RPh201-B(10%w/w)。
乳香胶的分离级分的浓缩制剂(10%(w/w))基本上使用与实施例1的方法2中以上描述的相同程序来制备,但使用一半量的BHT稳定化的棉籽油。这产生分离的乳香胶级分(药物物质)在BHT稳定化的棉籽油中的10%(w/w)制剂(RPh201-B)。该浓缩制剂可以用作产生RPh201-A(5%w/w)的中间体步骤。RPh201-A 5%(w/w)制剂可以随后通过用所需量的BHT稳定化的棉籽油稀释10%(w/w)RPh201-B制剂来获得。
方法4:分离的乳香胶级分(药物物质RPh-DS-1)的制剂—在BHT稳定化的棉籽油中
制备制剂(药物产品)RPh201-C(20%w/w)。
乳香胶的分离级分的浓缩制剂(10%(w/w))基本上使用与实施例1的方法2中以上描述的相同程序来制备,但使用产生分离的乳香胶级分(药物物质)在BHT稳定化的棉籽油中的20%(w/w)制剂的量的BHT稳定化的棉籽油。在BHT稳定化的棉籽油中的该RPh-DS-1的20%(w/w)制剂被称为RPh201-C。该更浓缩的RPH201-C制剂可以用作产生RPh201-A(5%w/w)的中间体步骤。RPh201-A 5%(w/w)制剂随后通过用所需量的BHT稳定化的棉籽油稀释20%(w/w)RPh201-C制剂来获得。
方法5:分离的乳香胶级分(药物物质RPh-DS-1)的制剂—制备具有不同浓度的制
剂
包含0.01%;0.05%;0.1%;0.5%;1%;2%;3%;4%;6%;7%;8%;9%;11%;12%;13%;14%;15%;16%;17%;18%;19%(w/w)的分离的乳香胶级分(药物物质)的制剂类似地通过用所需量的BHT稳定化的棉籽油稀释来制备。代替更浓缩的制剂的稀释,所有示例的浓度也可以通过用适当量的BHT稳定化的棉籽油直接配制分离的乳香胶级分(药物物质RPh-DS-1)而获得。
相同浓度的制剂也使用不含任何BHT作为稳定剂的棉籽油以及使用不同类型的油制备,所述不同类型的油包括:杏仁油、芥花油、椰子油、玉米油、棉籽油、葡萄籽油、橄榄油、花生油、西红花油、芝麻油、大豆油或其组合。
应当理解,多达饱和溶液的任何所期望浓度的制剂可以通过以上方法制备,或通过如对本领域技术人员明显的类似的方法制备。
实施例2:BHT稳定化的棉籽油的制备
方法1:BHT稳定化的棉籽油的制备
在合适的容器中将9克BHT(2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚;欧洲药典等级或美国药典等级,CAS[128-37-0])添加至9.991Kg NF-等级棉籽油(CRODA INC.”超精细棉籽(SuperRefined Cottonseed)NF NP-LQ-(MH);SR40367”),并将混合物在无光(exclusion oflight)下搅拌或振荡,直至获得澄清且均质的溶液。搅拌/振荡时间一般为约15-30小时。获得的材料为用900ppm BHT稳定化的棉籽油。将该材料在氮气层(nitrogen blanket)下在黑暗条件下储存,直至进一步使用。任选地,可以使材料在30℃使用旋转蒸发器和至少0.1毫巴的真空经历1小时的真空处理。获得的溶液用于制备分离级分制剂(药物产品,实施例1,方法1-5)以及安慰剂(参见下文)。
方法2:安慰剂的制备。
使如以上制备的BHT稳定化的棉籽油溶液经历无菌过滤,并在通过无菌性和内毒素测试之后无菌填充所期望的小瓶/安瓿,用作对照/安慰剂处理。
实施例3:乳香胶的分离级分在治疗缺血性视神经病变(ION)中的用途
乳香胶的分离级分的制剂用于治疗被测试受试者中的缺血性视神经病变。使用乳香胶分离级分的5%制剂(以上制剂RPh-201A)或安慰剂处理(以上BHT稳定化的棉籽油溶液),进行治疗缺血性视神经病变(ION)的双盲研究。将乳香胶的分离级分制剂皮下(s.c.)施用于具有不同类型的视神经神经病变的受试者的左上臂或右上臂、右大腿或左大腿、或腹部的右侧或左侧的皮肤皱褶(skinfold)中,所述不同类型的视神经神经病变包括创伤性视神经病变和缺血性视神经病变(非动脉炎性缺血性视神经病变(NAION))。受试者通过s.c.注射制剂(0.4ml的50mg/ml溶液,包含在95%BHT稳定化的棉籽油中的5%的RPh-DS1)每周两次进行治疗,持续连续13-26周的时间。
受试者的基线状况在治疗开始之前被确定,并且在治疗期间和之后进一步进行随访测试,以评价受试者状况。
用于评价治疗作用的参数为:视力和视野的变化、视觉诱发电位的变化和光学相干断层成像(OCT)的变化。其中,以下参数在治疗前、治疗期间和治疗后进行测量/确定:基于ETDRS的具有最佳矫正的视力(VA)测试性能。患者的视野(VF)使用汉弗莱视野(HumphreyVisual Field)(HVF)24-2程序上的24-2全阈值程序来测量。视觉诱发电位(VEP)也被称为视觉诱发响应(VER),用于记录脑中神经元响应于视觉刺激产生的电生理信号。用于选择期望刺激类型的刺激发生器为:闪光VEP、图像VEP和多焦点VEP。高分辨率OCT用于测量视网膜神经纤维层厚度(RNFLT)和受影响象限的变化、黄斑体积等。
另外,在治疗之前、期间和/或之后,还可以对每一个受试者进行诸如以下变量的测量:生命体征(Vital signs)(HR、BP、体温)、临床实验室测试(诸如血液学、临床化学、尿液分析和细胞因子表达)。
测试的受试者包括18岁以上的男性或女性,其被诊断为起因于创伤性视神经病变或缺血性视神经病变-非动脉炎性缺血性视神经病变(NAION)的单侧或双侧的缺血性视神经病变,创伤事件之后持续3年的最长时间段,在事件之后在无任何治疗的情况下已至少6个月并稳定(即,没有改善视野和/或视力)。在双侧视神经神经病变的病例中,考虑最新的事件。受试者被进一步表征为具有等于或差于6/60的矫正视力或小于15度的视野或两者。
在一些实验中,罹患以下状况之一的受试者可以被排除在实验以外:青光眼、由肿瘤引起的神经病变、由感染引起的神经病变、线粒体视神经病变、营养性视神经病变、辐射性视神经病变、中毒性视神经病变、糖尿病性视网膜并发症(Retinal diabeticcomplications)、遗传性视神经病变、具有超过四分之三的完整SCOTOMA的受试者、感染存在的临床证据、受试者正在接受或在六个月内接受过皮质类固醇、免疫抑制药物、细胞毒性剂、放射疗法和化学疗法、受试者在过去两年内具有酗酒或药物滥用的历史、怀孕或哺乳或备孕(childbearing potential)及未使用适当的避孕措施的女性受试者、临床显著和/或不受控制的状况或其他重大的医学疾病、异常的实验室测试结果、临床上显著的不受控制的视网膜疾病(AMD)、已知对制剂的任何组分过敏。
本文提供了从研究获得的中期数据的分析,其中包括23名受试者。该分析在23名招募的受试者中的10名完成所有研究访问之后来进行。
进行中期研究分析以评价在连续至少13周的整个治疗期间每周两次在S.C.施用RPh201-A制剂之后观察到的视力(VA)和视野(VF)的任何变化,其中在不存在药物相关严重不良事件的情况下选择将治疗阶段延长至另外13周(总计26周),和在患有视神经神经病变的受试者治疗结束之后在3个月时进行随访访问时观察到的视力(VA)和视野(VF)的任何变化。
在确认资格后,将受试者以1.5:1的比随机分配至两个治疗臂中的一个,400μL媒介物(棉籽油)中的20mg RPh201-A或单独的媒介物。在试验结束时,总计评价了12名用RPh201-A治疗的受试者和8名用安慰剂治疗的患者。
最初,提供治疗连续13周,并允许延长另外13周,即总计26周(如果患者和/或治疗医师期望)。治疗结束时,所有受试者都被追踪治疗后(off treatment)另外13周。
在中期时间线,总计9名受试者(6名用RPH201-A治疗且3名用安慰剂治疗)完成了所有访问(“初始队列”)。在9名受试者中,8名同意延长其治疗持续另外13周,即从13周至26周。一名受试者拒绝超过13周的继续治疗。所有9名受试者返回其停药访问,这发生在最后一次剂量之后的13周。试验中剩余11名受试者为后期队列的一部分。
在完成初始队列中的受试者的访问之后,对初始队列中的受试者(#001-010,包括在12周之后退出的一名受试者(#004))进行安全性评价的中期评审。所有10名受试者经历至少一次不良事件(AE),其中在数据截止日期之前报告了总计81例AE。报告的AE的最常见的系统器官类别为一般紊乱和施用部位状况(General Disorders and AdministrationSite Conditions)(8名受试者)和神经系统紊乱(Nervous System Disorders)(5名受试者)。
在研究期间未报告死亡。两名受试者中发生了四次严重不良事件(SAE)。受试者#001(用RPh201-A治疗)经历了中度眩晕、目眩和左眼视力轻微下降的并发SAE,所有这些被评价为不相关。受试者#004(用RPh201-A治疗,其在访问12之后从研究中退出)经历严重布鲁氏菌病(brucellosis)的SAE,也被评估为不相关。没有AE导致研究药物的停止或从研究中退出。
在研究期间,未观察到生命体征,包括收缩血压、舒张血压和心率的临床显著的变化,或异常的临床实验室评价。在研究过程中和/或停药随访期间接受RPH201-A治疗的受试者中,未受影响的对侧眼睛并未恶化。
对完成全部访问的10名受试者进行中期效力分析。在10名受试者中,2名在双眼中均有先前的NAION,且每一个受试者的双眼都被包括在分析中。在2名双侧疾病受试者中,1例在RPh201-A组,且1例在对照组。因此,效力分析为11只眼,其中7只为RPh201A治疗组,且4只为对照组。
通过光学相干断层成像(OCT)对以下参数进行效力分析:视力、视野和视网膜神经纤维层厚度。结果表明,与安慰剂治疗的受试者相比,RPh201A治疗的受试者显示出视力改善的趋势,其中大多数在26周时将最佳矫正视力(BCVA)从基线改善了10个或更多个ETDRS(早期治疗糖尿病视网膜病变研究)图表字母。ETDRS图表的特征在于字母尺寸的比例布局和几何级数)被用作人口研究和临床研究中的视力测量的“黄金标准”。
在治疗13周之后,RPH201组比安慰剂组显示较少的BCVA改善(平均值±SEM分别为:从基线改善的17.7±7.0对比36.0±9.9个字母;p=0.1563)。然而,在治疗26周之后,RPh201组比安慰剂组具有从基线较大的BCVA改善(分别为35.2±10.4对比22.2±11.2个改善的字母;p=0.3252)。在13周停药随访时间之后,RPh201和安慰剂两组中的BCVA与基线相比轻微下降,与安慰剂相比,RPh201治疗的受试者中的BCVA仍然较高(分别为28.9±9.1和20.0±12.1个字母;(p=0.5498)。将结果呈现于图2中,图2示出了在治疗(“RPH201”)或未治疗(“安慰剂”)的受试者中,在13周、26周和停药随访访问时辨认的ETDRS字母中从基线的平均增加。
BCVA从基线的平均改善的比较未检测到治疗组之间的显著差异。然而,在26周的治疗之后,与安慰剂组中的4只眼睛中的2只(50%)相比,RPh201组中的6只眼睛中的6只(100%)达到>10个字母(2行)视力的改善。在13周停药随访时,与安慰剂组中的4只眼睛中的2只(50%)相比,RPh201组中的7只眼睛中的5只(71%)显示>10个字母(2行)视力的改善。将结果呈现于图3中,图3示出了在治疗的受试者(“RPH201”)和非治疗的受试者(“安慰剂”)中具有增加10个或更多个字母的受试者的比例。
结论:呈现的结果显示,持续6个月每周两次20mg RPh201A的s.c.施用耐受性良好,并且施用部位反应为最常报告的治疗急性不良作用(TEAE),其中TEAE与生命体征测量不相关。此外,在研究过程中和停药随访期间,接受治疗的受试者中未观察到正常对侧眼睛的恶化。重要地,所有RPh201治疗的受试者在6个月时将BCVA从基线改善了多于10个ETDRS图表字母,这表明该治疗可用于改善患有先前的NAION患者的视觉功能。
实施例4:乳香胶的分离级分在治疗青光眼(使用体外模型)中的用途
这些实验的目的为在经历凋亡的混合的原代大鼠视网膜神经节细胞中使用由RPh201的直接细胞处理或从用RPh201预处理的大鼠采集的血清鉴定RPh201组合物(包括,RPh201A、RPh201B和/或RPh201C)的保护活性。
存在多种青光眼动物模型,包括猪、犬、猴和啮齿动物,这些模型中的大多数牵涉通过高眼压症介导的视神经损害。可用于研究青光眼的其他已建立的模型依赖于遗传突变、视神经的机械创伤、视网膜神经元的中毒性损害或视网膜缺血的诱导后的RGC诱导死亡(Rodent models of glaucoma.Johnson TV,Tomarev SI.Brain Res Bull.2010 Feb 15;81(2-3):349-58)。此类模型允许研究导致RGC死亡的过程,并区分不同类型的初始损害。另外,存在来自部分类似于异质复杂的自然环境并且为研究青光眼机制中的关键原理提供了强大而有用的工具的体外系统的积累的数据。可适于青光眼研究的主要体外系统之一为从新鲜分离的啮齿动物视网膜分离的RGC原代培养物(Y.Otori,Use of purified retinalganglion cells for an in vitro model to study glaucoma,in:J.Tombran-Tink,C.J.Barnstable,M.B.Shields(编著),Ophthal-mology Research:Mechanisms of theGlaucomas,Humana Press,Totowa,NJ,2008,第601–607页)。它被认为是一种用于评价RGC对由特定因素(诸如氧化应激、线粒体功能异常和神经毒性)诱导的青光眼损害的易感性的强大的系统。(Kawasaki等Investigative ophtalmology vis.sci.2002 jun;43(6);1835-42.)。
材料和方法
细胞培养板从Becton Dickson(Bedford,MA)购买。最小必需培养基(MEM)和磷酸盐缓冲盐水(PBS)来自Mediatech(Manassas,VA)。胎牛血清来自Gemini Bio-Products(West Sacramento,CA)。钙黄绿素-AM(Calcein-AM)和1,1'-双十八烷基-3,3,3',3'-四甲基吲哚羰花青高氯酸盐(1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-TetramethylindocarbocyaninePerchlorate)(DiI)来自Molecular Probes(Eugene,OR)。聚-L-赖氨酸、星形孢菌素(Staurosporine)、N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)和谷氨酸来自Sigma Aldrich(St.Louis,MO)。木瓜蛋白酶、卵类粘蛋白和DNA酶I来自Worthington Biochemical(Lakewood,NJ)。膜联蛋白V Alexa Fluor 488来自ThermoFisher(Waltham,MA)。
动物-在研究开始时将8-9周龄的年轻的成年大鼠每周两次注射RPh201持续两周。在最后一次注射72小时之后,将动物用异氟烷麻醉用于血液取样。在末端麻醉下,将动物眼球后(retro orbital)抽血用于血液样品。怀孕的雌性Sprague Dawley从Envigo(Indianapolis,IN)获得。在出生之后2至5天,将幼崽(pups)通过低温麻醉,并且其视网膜神经节细胞(RGC)通过将DiI注射到上丘来标记。在标记之后2至4天,将幼崽通过斩首处死,将其眼睛取出,并用汉克平衡盐溶液(Hank’s Balanced Salt Solution)(HBSS)润洗。然后将视网膜取出,并置于Earl平衡盐溶液(EBSS)中的12单位/mL木瓜蛋白酶和0.005%DNA酶溶液中用于解离。
原代视网膜神经节细胞分离和培养-培养方法从Worthington BiochemicalCorporation修改。在原代RGC分离之前的一小时内,将96孔培养板用聚-L-赖氨酸(10μg/ml)包被至少30分钟,随后抽吸并用HBSS润洗。
将在木瓜蛋白酶和DNA酶溶液中的视网膜伴随恒定搅拌在37摄氏度孵育30分钟。此后,将溶液用10mL血清移液管研磨50次,进一步解离细胞。然后将溶液在室温以300g离心5分钟。
然后,将上清液去除,并将细胞沉淀重悬于在EBSS中的0.005%DNA酶溶液中。不连续的密度梯度用卵类粘蛋白白蛋白抑制剂溶液制备,并将小瓶以70g第二次离心6分钟。将上清液去除,并将细胞重悬于补充有5%FCS的DMEM中。将所得细胞溶液过滤通过40μm细胞过滤器(strainer)。将细胞以2000个细胞/mm2铺板,并在37摄氏度用5%CO2孵育24小时。
血清制备-将全血样品收集在没有EDTA的血清分离管中,并在血液收集之后保持0.5小时,以3000rpm离心5分钟。将血清使用过滤的移液管吸头收集,并立即储存于-80℃。
处理-为了诱导凋亡,将细胞用1mM NDMA处理,或者通过在将细胞最初铺板时血清剥夺来处理。同时,将细胞用从RPh201处理的大鼠、媒介物处理的大鼠采取的血清、RPh201或媒介物来处理。星形孢菌素的10μM溶液用作细胞死亡的阳性对照。
原代RGC存活率的评价-膜联蛋白V Alexa Fluor 488染色已经经历凋亡的细胞的可渗透膜,并且具有495/515nm的激发和发射波长。在初始铺板24小时之后,将5μL膜联蛋白V添加至每一个孔,并且10分钟后细胞通过荧光显微术进行计数。
钙黄绿素AM仅染色活细胞,并且也具有495/515nm的激发和发射波长。作为膜联蛋白V Alexa Fluor 488的对照,一些细胞代之用钙黄绿素AM染色。初始铺板24小时之后,将培养基从一些细胞中去除,并用钙黄绿素AM在1X PBS中的溶液代替。30分钟后,将钙黄绿素溶液去除并用1X PBS代替,并且细胞通过荧光显微术进行计数。
荧光显微术-所有RGC都用DiI染色,DiI具有549nm和565nm的激发和发射波长。发绿色和红色荧光两者的细胞为经历凋亡的RGC,而仅发红色荧光的为活的RGC。活的RGC的数目被报告为也不被膜联蛋白V Alexa Fluor 488染色的总DiI染色细胞的百分比。作为对照,一些细胞用钙黄绿素AM而不是膜联蛋白染色,并且在这种情况下,存活的RGC百分比被报告为被DiI和钙黄绿素两者染色的细胞数目相比于被DiI染色的细胞总数目。
实施例5:乳香胶的分离级分在治疗青光眼(使用体外模型)中的用途
这些实验的目的为在经历凋亡的混合的原代大鼠视网膜神经节细胞中关于神经保护活性鉴定RPh201组合物(包括,RPh201A、RPh201B和/或RPh201C)的保护活性。
材料和方法
细胞培养板来自Becton Dickson(Bedford,MA)。最小必需培养基(MEM)和磷酸盐缓冲盐水(PBS)来自Mediatech(Manassas,VA)。胎牛血清来自Gemini Bio-Products(WestSacramento,CA)。钙黄绿素-AM和1,1'-双十八烷基-3,3,3',3'-四甲基吲哚羰花青高氯酸盐(DiI)来自Molecular Probes(Eugene,OR)。聚-L-赖氨酸、星形孢菌素、N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)和谷氨酸来自Sigma Aldrich(St.Louis,MO)。木瓜蛋白酶、卵类粘蛋白和DNA酶I来自Worthington Biochemical(Lakewood,NJ)。膜联蛋白V Alexa Fluor 488来自ThermoFisher(Waltham,MA)。
动物-怀孕的雌性Sprague Dawley从Envigo(Indianapolis,IN)获得。在出生之后2至5天,将幼崽通过低温麻醉,并且其视网膜神经节细胞(RGC)通过将DiI双侧立体定向注射到上丘来标记。在标记之后2至4天,将幼崽通过斩首处死,将其眼睛取出,并用汉克平衡盐溶液(HBSS)润洗。然后将视网膜取出,并置于Earl平衡盐溶液(EBSS)中的12单位/mL木瓜蛋白酶和0.005%DNA酶溶液中用于解离。
原代视网膜神经节细胞分离和培养-培养方法从Worthington BiochemicalCorporation修改。在原代RGC分离之前的一小时内,将96孔培养板用聚-L-赖氨酸(10μg/ml)包被至少30分钟,随后抽吸并用HBSS润洗。将在木瓜蛋白酶和DNA酶溶液中的视网膜伴随恒定搅拌在37摄氏度孵育30分钟。然后,将溶液用10mL血清移液管研磨50次,进一步解离细胞。然后将溶液在室温以300g离心5分钟。然后,将上清液去除,并将细胞沉淀重悬于在EBSS中的0.005%DNA酶溶液中。不连续的密度梯度用卵类粘蛋白白蛋白抑制剂溶液制备,并将小瓶以70g第二次离心6分钟。将上清液去除,并将细胞重悬于补充有5%FCS的DMEM中。将所得细胞溶液过滤通过40μm无菌塑料网以去除团块。将细胞以2000个细胞/mm2铺板,并在37摄氏度用5%CO2孵育24小时。
处理-为了诱导凋亡,将细胞用在将细胞最初铺板时血清剥夺来处理。同时,将细胞用1μL、2.5μL、5μL和10μL RPh201来处理。星形孢菌素的10μM溶液用作细胞死亡的阳性对照。
原代RGC存活率的评价-膜联蛋白V Alexa Fluor 488-在初始铺板24小时之后,将5μL用Alexa Fluor 488标记的膜联蛋白V添加至每一个孔,并且10分钟后细胞通过荧光显微术进行计数。
钙黄绿素AM-作为膜联蛋白V Alexa Fluor 488的对照,一些细胞代之用钙黄绿素AM染色。初始铺板24小时之后,将培养基从一些细胞中去除,并用钙黄绿素AM在1X PBS中的溶液代替。30分钟后,将钙黄绿素AM溶液去除并用1X PBS代替,并且细胞通过荧光显微术进行计数。
荧光显微术-膜联蛋白V Alexa Fluor 488结合在正经历凋亡的细胞的膜中变得暴露的磷脂酰丝氨酸。它具有495/515nm的激发和发射波长。钙黄绿素AM不是荧光的,但当酯酶裂解与乙酰氧基甲基(AM)酯的酯键时,钙黄绿素AM在活细胞内会变成荧光的。因此,钙黄绿素AM仅染色活细胞,并且也具有495/515nm的激发和发射波长。由于这个原因,两种试剂不用于同一个孔中。
所有RGC都用DiI逆行标记,DiI具有549nm和565nm的激发和发射波长。发绿色(用膜联蛋白V)和红色荧光两者的细胞为经历凋亡的RGC,而仅发红色荧光的为活的RGC。活的RGC的数目被报告为也不被膜联蛋白V Alexa Fluor 488染色的总DiI染色细胞的百分比。作为对照,一些细胞用钙黄绿素AM而不是膜联蛋白V染色,并且在这种情况下,存活的RGC百分比被报告为被DiI和钙黄绿素两者染色的细胞数目相比于被DiI染色的细胞总数目。
神经保护活性的评价-神经保护活性的量的计算是基于测试物质减少由损伤范例诱发的另外凋亡的程度。换言之,如果基线凋亡为10%,损伤引起凋亡变成60%,且测试物质将凋亡减少至35%,则神经保护活性为50%。如果测试物质将凋亡减少回到至10%,则神经保护活性为100%。
该计算式为:
结果与结论
如在图4中呈现的结果显示的,血清剥夺对培养物引起显著的凋亡率。该培养物被RPh201A处理以剂量响应、剂量依赖性作用来救援。血清剥夺为模拟青光眼期间RGC的逆行营养支持的损失的常用模型,其中视神经乳头的压力和/或缺血和/或拉伸减少轴突运输并引起轴突损伤。因此,呈现的结果证明了RPh201A在这种良好建立的体外青光眼模型中的神经保护作用。
实施例6:乳香胶的分离级分在治疗青光眼(使用体内模型)中的用途
存在多种不同类型的青光眼,所有这些都共有相同的视网膜神经节细胞(RGC)损失的病理生理学。该疾病的常见机制为引起视网膜神经节细胞(RGC)的结构和功能损害的升高的眼内压(IOP)。已经认识到,延缓或停止RGC损失的治疗方法潜在地有益于保持青光眼中的视觉。因此,合适的动物模型为与视神经损伤或内部视网膜损伤相关的那些模型。视神经的任何损伤将因此引起RGC死亡。因此,这可以通过完全横切视神经(Allcutt D,BerryM,Sievers J.A qualitative comparison of the reactions of retinal ganglioncell axons to optic nerve crush in neonatal and adult mice.Brain Res 1984;318:231-40;Allcutt D,Berry M,Sievers J.A quantitative comparison of thereactions of retinal ganglion cells to optic nerve crush in neonatal andadult mice.Brain Res 1984;318:219-30),或部分横切视神经实现。通过将内皮素-1输注到神经本身周围的蛛网膜下腔(subarachnoid space)中诱导的视神经乳头的慢性缺血也达到相同的作用(Cioffi GA,Orgul S,Onda E,Bacon DR,Van Buskirk EM.An in vivomodel of chronic optic nerve ischemia:the dose-dependent effects ofendothelin-1on the optic nerve microvasculature.Curr Eye Res 1995;14:1147-53;Orgul S,Cioffi GA,Bacon DR,Van Buskirk EM.An endothelin-1-induced model ofchronic optic nerve ischemia in rhesus monkeys.J Glaucoma 1996;5:135-8.)。在所有提到的模型中,诱导轴突损伤导致RGC死亡。
为了证明RPh201A对在慢性损害之后的RGC的再生作用,使用了大鼠视神经轴突切断模型,其中在手术后一个月开始动物治疗。
方法:
将成年雄性Wistar大鼠(n=5)深度麻醉(赛拉嗪50mg/kg和氯胺酮35mg/kg),并且将它们的右侧ON通过外眦切开术(lateral canthotomy)而暴露。在角膜边界处的眼球侧面切开结膜。在分离外侧和眼球收缩(retractor bulbi)肌肉后,视神经被暴露。通过脑脊膜中的小开口(50–100μm),神经纤维在距离球体2-3mm的距离处完全横切。具有50μm的尖端和光滑的钝边的专门设计的玻璃解剖器确保不会损害神经脉管系统和ON血液供应,并且对脑脊膜的损害最小。所有动物的损伤都是单侧的。
将大鼠分配为两个实验组,各自包含5只动物。在后颈部,一组接受包含体积为0.025ml的RPh201A的皮下注射,对照组注射0.025ml媒介物。
在手术之后一个月,将第一次注射给予所有动物。随后注射被每周两次施用,持续3个月。
在轴突切断之后4个月(治疗开始之后3个月),将荧光逆行神经跟踪剂(Di-Asp)插入到轴突切断的视神经,以染色存活的视网膜神经节细胞(RGC)。
在24小时之后,将操作的大鼠在CO2饱和室中处死,并将受伤的右眼摘除。将视网膜分离,在载玻片上平坦化并用基于二甲苯的封片介质固定。
整体封片的视网膜用荧光显微镜评价,并且手动计数染色的细胞。将结果呈现于图5A-B中,图5A-B示出了视网膜分析的荧光显微镜图像,显示与对照(图5B)相比从RPh201A处理的大鼠(图5A)获得的活的RGC细胞数目较高。
实施例7:乳香胶的分离级分在治疗青光眼(使用体内模型)中的用途
为了证明和评价RPh201在治疗青光眼中的作用,在大鼠中进行高眼内压(intraocular pressure)(IOP),以形成模拟人类青光眼的模型。
注射在眼睛前房中的微珠的使用为在大鼠和其他动物中产生高IOP的建立的模型("The micro beads occlusion model;A paradigm for induced ocular hypertensionin rats and mice.IOVS,2010 Jan;51(1);207-216")。微珠进入前房角的空间,并使水分从眼睛离开,由此增加眼内压。
材料和方法
在研究开始时,年轻的成年S.D.雄性大鼠为8-9周龄。使大鼠适应一周。两组各14只大鼠参与了本研究。组1用RPh201A处理,且组2用作对照并用媒介物处理。将所有28只大鼠在右眼在前房中注射测量直径为15微米的乳胶微珠。注射体积将为包含浓度为每1μL5000个珠的8μL PBS。注射将使用10μL体积和32G针头的Hamilton注射器进行。该程序将根据ARVO动物医学保健规则(ARVO rules of Medical Care in Animals)在使用赛拉嗪2%和盐酸氯胺酮(ketamine HCl)的全身麻醉下进行。
将组1在注射微珠的当天开始用RPh201A进行皮下注射。将组2(对照)用媒介物(棉籽油)进行皮下注射。RPh201A或媒介物的施用每周两次进行。
测量基线IOP然后注射。在注射后三天开始,使用TONOPEN(Reichert Ltd,Germany)每周采取两次IOP测量。使用局部麻醉剂滴眼剂Localin以及用异氟烷的短暂的全身麻醉剂。
每一只大鼠两只眼睛之间8mm Hg的差异被认为足以被认为是青光眼。该研究从高IOP的当天开始继续4周。
在研究结束时,将动物麻醉并用0.1M PBS随后是在0.1M PBS(pH 7.4)中的4%多聚甲醛经心脏灌注10min。将眼球与视神经的后延髓残余部分(stump)取出,并在4%多聚甲醛中后固定(post-fixed)3小时。将如此获得的视神经解剖并加工用于免疫染色或甲苯胺蓝染色(用于计数轴突)。
将视网膜取出并加工为“整体封片的”视网膜用于免疫染色。将其他眼球包埋在石蜡中,以5mm厚度切片,收集在载玻片上,脱石蜡和水合,并加工用于免疫染色以评价RGC的数目。
另外,为了评价超结构作用,将几只动物处死以获得电子显微术结果。
使用RPh201B、RPh201C和根据以上指定的实施例制备的其他任选的组合物重复实验。
实施例8:乳香胶的分离级分在治疗青光眼中的用途
乳香胶的分离级分的制剂用于治疗测试的受试者中的青光眼。使用乳香胶分离级分的5%制剂(以上制剂RPH-201A)或安慰剂处理(以上BHT稳定化的棉籽油溶液),进行治疗缺血性视神经病变(ION)的双盲研究。将乳香胶的分离级分制剂皮下(s.c.)施用至罹患不同程度的青光眼的受试者。将受试者通过s.c.注射RPH-201A制剂每周两次进行治疗,持续连续13-26周的时间。
受试者的基线状况在治疗开始之前被确定,并且在治疗期间和之后进一步进行随访测试,以评价受试者状况。
用于评价治疗作用的参数为:视力和视野的变化、视觉诱发电位的变化和光学相干断层成像(OCT)的变化。其中,以下参数在治疗前、治疗期间和治疗后进行测量/确定:基于ETDRS的具有最佳矫正的视力(VA)测试性能。患者的视野(VF)使用汉弗莱视野(HumphreyVisual Field)(HVF)24-2程序上的24-2全阈值程序来测量。视觉诱发电位(VEP)也被称为视觉诱发响应(VER),用于记录脑中神经元响应于视觉刺激产生的电生理信号。用于选择期望刺激类型的刺激发生器为:闪光VEP、图像VEP和多焦点VEP。高分辨率OCT用于测量视网膜神经纤维层厚度(RNFLT)和受影响象限的变化、黄斑体积。
另外,在治疗之前、期间和/或之后,还可以对每一个受试者进行诸如以下变量的测量:生命体征(HR、BP、体温)、临床实验室测试(诸如血液学、临床化学、尿液分析和细胞因子表达)。
测试的受试者包括18岁以上的男性或女性,其被诊断为由于青光眼导致的视神经损害。
前述具体实施方案的描述将如此完全地揭示本发明的一般性质,使得其他人可以通过应用现有的知识,容易地为多种应用来修改和/或调整此类具体实施方案而不需要过度实验且不背离一般概念,并因此,此类调整和修改应当并且预期被包含在公开的实施方案的等同物的含义和范围内。应当理解,本文采用的措辞或术语是为了描述而非限制的目的。用于进行多种公开的功能的手段、材料和步骤可采取多种替代形式而不背离本发明。
Claims (33)
1.一种包含乳香胶的分离级分和药学上可接受的载体的组合物用于治疗视神经病变状况的用途,其中乳香胶的所述级分的特征在于,它在至少一种极性有机溶剂和至少一种非极性有机溶剂中是可溶的,并且其中所述级分基本上不含在所述极性有机溶剂中可溶但在所述非极性有机溶剂中不溶的化合物。
2.根据权利要求1所述的用途,其中所述视神经病变状况选自创伤性神经病变、缺血性神经病变;辐射性视神经病变(RON)、青光眼、视神经炎、压迫性视神经病变、浸润性视神经病变、线粒体视神经病变、营养性视神经病变、中毒性视神经病变、遗传性视神经病变及其组合。
3.根据权利要求2所述的用途,其中所述缺血性视神经病变选自:非动脉炎性缺血性视神经病变(NAION)、前部缺血性视神经病变(AION)和后部缺血性视神经病变。
4.根据权利要求1所述的用途,其中所述视神经病变状况起因于贮积疾病。
5.根据权利要求4所述的用途,其中所述贮积疾病引起视神经中脂蛋白性物质的沉积。
6.根据权利要求1所述的用途,其中所述组合物通过肠胃外途径施用。
7.根据权利要求6所述的用途,其中所述肠胃外途径选自由以下组成的组:静脉内、肌内、皮下、皮内、腹膜内、动脉内、子宫内、尿道内、心内、脑内、脑室内、肾内、肝内、腱内、骨内、眼内和鞘内。
8.根据权利要求1所述的用途,其中所述乳香胶的分离级分基本上不含聚合月桂烯。
9.根据权利要求1所述的用途,其中所述至少一种极性有机溶剂选自由以下组成的组:醇、醚、酯、酰胺、醛、酮、腈及其组合。
10.根据权利要求9所述的用途,其中所述极性有机溶剂选自由以下组成的组:甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、1-丁醇、2-丁醇、仲丁醇、叔丁醇、1-戊醇、2-戊醇、3-戊醇、新戊醇、3-甲基-1-丁醇、2-甲基-1-丁醇、3-甲基-2-丁醇、2-甲基-2-丁醇、乙二醇、乙二醇单甲基醚、二乙醚、甲基乙基醚、乙基丙基醚、甲基丙基醚、1,2-二甲氧基乙烷、四氢呋喃、二氢呋喃、呋喃、吡喃、二氢吡喃、四氢吡喃、乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙醛、甲酸甲酯、甲酸乙酯、丙酸乙酯、丙酸甲酯、二氯甲烷、氯仿、二甲基甲酰胺、乙酰胺、二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮、丙酮、乙基甲基酮、二乙基酮、乙腈、丙腈及其组合。
11.根据权利要求1所述的用途,其中所述至少一种非极性有机溶剂选自由以下组成的组:各自任选地被一个或更多个卤素取代的无环的或环状的、饱和的或不饱和的脂肪族烃和芳族烃、及其组合。
12.根据权利要求11所述的用途,其中所述非极性有机溶剂选自由以下组成的组:C5-C10烷烃、C5-C10环烷烃、C6-C14芳族烃和C7-C14全氟烷烃,及其组合。
13.根据权利要求11所述的用途,其中所述非极性有机溶剂选自由以下组成的组:戊烷类、己烷类、庚烷类、辛烷类、壬烷类、癸烷类、环戊烷、环己烷、环庚烷、苯、甲苯、二甲苯、及其异构体和混合物。
14.根据权利要求1所述的用途,其中所述分离级分通过包括以下步骤的方法获得:
(a)用极性有机溶剂处理乳香胶;
(b)分离在所述极性有机溶剂中可溶的级分;
(c)任选地去除所述极性有机溶剂;
(d)用非极性有机溶剂处理在步骤(b)或(c)中获得的可溶性级分,
(e)分离在所述非极性有机溶剂中可溶的级分;以及
(f)任选地去除所述非极性有机溶剂;
其中步骤(d)至(f)可在步骤(a)至(c)之前。
15.根据权利要求14所述的用途,其中所述方法还包括对在步骤(c)或步骤(f)中获得的级分进行尺寸分级分离的步骤。
16.根据权利要求14所述的用途,其中步骤(c)和(f)的任一个或两个包括通过选自由以下组成的组的手段去除溶剂:旋转蒸发、高真空的施加及其组合。
17.根据权利要求1所述的用途,其中所述极性有机溶剂包括乙醇,且所述非极性有机溶剂包括己烷。
18.根据权利要求11所述的用途,其中所述方法还包括重复步骤(a)至(c)和/或步骤(d)至(f)持续多个循环。
19.根据权利要求1所述的用途,其中所述乳香胶从选自由以下组成的组的黄连木属(Pistacia)的种获得:乳香黄连木(P.lentiscus)、大西洋黄连木(P.atlantica)、P.palestina、P.saportae、黑黄连木(P.terebinthus)、阿月浑子(P.vera)和P.integerrima。
20.根据权利要求1所述的用途,其中所述载体为选自由以下组成的组的疏水性载体:至少一种油、至少一种蜡及其组合。
21.根据权利要求20所述的用途,其中所述至少一种油选自由以下组成的组:杏仁油、芥花油、椰子油、玉米油、棉籽油、葡萄籽油、橄榄油、花生油、西红花油、芝麻油、大豆油及其组合。
22.一种治疗视神经病变状况的方法,所述方法包括将治疗有效量的乳香胶的分离级分和药学上可接受的载体施用至有相应需要的受试者,由此治疗所述视神经病变状况,其中所述乳香胶的分离级分的特征在于,它在至少一种极性有机溶剂和至少一种非极性有机溶剂中是可溶的,并且其中所述乳香胶的分离级分基本上不含在所述极性有机溶剂中可溶但在所述非极性有机溶剂中不溶的化合物。
23.根据权利要求22所述的方法,其中所述视神经病变状况选自创伤性神经病变、缺血性神经病变;辐射性视神经病变(RON)、青光眼、视神经炎、压迫性视神经病变、浸润性视神经病变、线粒体视神经病变、营养性视神经病变、中毒性视神经病变,遗传性视神经病变及其组合。
24.根据权利要求23所述的方法,其中所述缺血性视神经病变选自:非动脉炎性缺血性视神经病变(NAION)、前部缺血性视神经病变(AION)和后部缺血性视神经病变。
25.根据权利要求22所述的方法,其中所述视神经病变状况起因于贮积疾病。
26.根据权利要求25所述的方法,其中所述贮积疾病引起视神经中脂蛋白性物质的沉积。
27.根据权利要求22所述的方法,其中所述组合物通过肠胃外途径施用,所述肠胃外途径选自静脉内、肌内、皮下、皮内、腹膜内、动脉内、子宫内、尿道内、心内、脑内、脑室内、肾内、肝内、腱内、骨内、眼内和鞘内。
28.根据权利要求22所述的方法,其中所述载体为选自由以下组成的组的疏水性载体:至少一种油、至少一种蜡及其组合。
29.根据权利要求28所述的方法,其中所述至少一种油选自由以下组成的组:杏仁油、芥花油、椰子油、玉米油、棉籽油、葡萄籽油、橄榄油、花生油、西红花油、芝麻油、大豆油及其组合。
30.根据权利要求22所述的方法,其中所述至少一种极性有机溶剂选自由以下组成的组:醇、醚、酯、酰胺、醛、酮、腈及其组合。
31.根据权利要求22所述的方法,其中所述至少一种非极性有机溶剂选自由以下组成的组:各自任选地被一个或更多个卤素取代的无环的或环状的、饱和的或不饱和的脂肪族烃和芳族烃、及其组合。
32.根据权利要求22所述的方法,其中所述乳香胶的分离级分基本上不含聚合月桂烯。
33.根据权利要求22所述的方法,其中所述分离级分通过包括以下步骤的方法获得:
(a)用极性有机溶剂处理乳香胶;
(b)分离在所述极性有机溶剂中可溶的级分;
(c)任选地去除所述极性有机溶剂;
(d)用非极性有机溶剂处理在步骤(b)或(c)中获得的可溶性级分,
(e)分离在所述非极性有机溶剂中可溶的级分;以及
(f)任选地去除所述非极性有机溶剂;
其中步骤(d)至(f)可在步骤(a)至(c)之前。
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