CN109922794A - 使用脂质体构建体将尿素递送至黄斑和视网膜的细胞 - Google Patents

使用脂质体构建体将尿素递送至黄斑和视网膜的细胞 Download PDF

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Abstract

提供了用于将尿素递送至眼睛的玻璃体视网膜界面的脂质体构建体。所述脂质体构建体是小层状囊泡(SUV)的附聚物并且具有比玻璃体液更大的密度，以使得它们下沉至眼睛后部而不是分散在整个玻璃体中。

Description

使用脂质体构建体将尿素递送至黄斑和视网膜的细胞
相关申请的交叉引用
本申请要求2016年8月18日提交的美国临时申请号62/376,862的权益，所述申请的全部内容出于所有目的以引用的方式整体并入本文。
背景技术
眼睛是非常活跃的器官，在眼球内和周围具有恒定高体积的血液和其他流体循环。视网膜是一层神经，其排列在眼睛后部并且含有感测光的专门感光细胞(称为视杆细胞和视锥细胞)。视网膜通过视神经将光信号发送至脑的视觉皮层。视锥细胞最集中在视网膜的称为黄斑的小区域中。脉络膜是视网膜与眼睛的白色外层(巩膜)之间的高度血管结构。脉络膜充当视网膜的氧和营养物的来源，以及来自前房的房水的引流系统。眼睛充满称为玻璃质或玻璃体的凝胶状物质。玻璃体是大部分为水且具有显著浓度的透明质酸和胶原加上较少量的各种其他蛋白质的球形结构。玻璃体的后部与视网膜直接接触。纤维状线的网络从视网膜延伸并插入玻璃体中以使其附着至视网膜。参见Sebag，Graefe′sArch.Clin.Exp.Ophthalmol.225：89-93(1987)。
目前批准的用于视网膜病变的药物的标准施用是使用26-30号针进行100微升剂量的玻璃体内注射，通过眼睛中间层中的结构(睫状体平坦部)递送并且释放在玻璃体的中央部分中。通过药代动力学分析已经确定，注射到玻璃体中的药物在几小时内消散至眼睛的外部组织并在24小时后完全除去。在小浓度移动至主要目标区域(黄斑)之前，典型的100微升注射被稀释50倍至1倍。
因为可递送至眼睛的药物的体积受到器官尺寸的限制，并且因为眼科制剂一旦被引入玻璃体中就会相对快速地消散，所以向黄斑和邻近组织递送和维持治疗剂量的药物对眼科药物开发者和临床医生来说是巨大挑战。对于眼科药物制剂存在需要，所述眼科药物制剂能够在治疗慢性疾病(例如，糖尿病视网膜病变)的延长时间段内向眼睛后部递送治疗有效剂量的(特别是)高度水溶性的活性剂如尿素。
发明内容
以下概述了本发明实施方案的一些主要方面。在本发明的实施方案的详细描述、本公开的实施例、附图和权利要求书部分中描述了另外的方面。本公开的每个部分中的描述意图结合其他部分来阅读。此外，在本公开的每个部分中描述的各种实施方案可以各种不同的方式组合，并且所有此类组合意图落入本发明的范围内。
本公开提供了一种药物组合物，其包含脂质体构建体和药学上可接受的载体，其中所述脂质体构建体包含小单层囊泡(SUV)的附聚物，其中所述SUV包含囊封在所述SUV内的尿素，其中所述SUV具有大于约1.05的比重、小于约220nm的z-平均直径以及小于约0.30的多分散性指数值(PdI)。在一些实施方案中，所述z-平均直径小于约200nm。药学上可接受的载体可任选地包含尿素。
在一个实施方案中，所述药物组合物呈乳液或悬浮液的形式。
所述SUV具有围绕中心隔室的脂质双层(即，片层)。在一个方面，所述片层包含一种或多种磷脂且不含胆固醇。在另一方面，所述片层包含(i)一种或多种磷脂和(ii)小于约70mol％胆固醇、或1-9mol％胆固醇、或34-69mol％胆固醇、或42-69mol％胆固醇、或10-20mol％胆固醇、或20-30mol％胆固醇、或30-40mol％胆固醇、或40-50mol％胆固醇、或50-60mol％胆固醇、或60-69mol％胆固醇。在某些实施方案中，所述片层包含以下中的一种或多种：胆固醇、二油酰基磷脂酰胆碱(DOPC)、二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二油酰基三甲基铵丙烷(DOTAP)、二棕榈酰基磷脂酰胆碱(DPPC)、二棕榈酰基磷脂酰甘油(DPPG)、二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)、磷脂酰胆碱(PC)和棕榈酰基油酰基磷脂酰胆碱(POPC)。
在特定实施方案中，所述片层基本上由以下组成：58mol％DPPC和42mol％胆固醇；58mol％DOPC和42mol％胆固醇；58mol％POPC和42mol％胆固醇；29mol％DPPC、42mol％胆固醇和29mol％DPPG；80mol％POPC和20mol％DOTAP；67mol％DMPC和33mol％DMPG；或33mol％DPPC、13mol％DSPC、32mol％DOPC、17mol％18∶2PC、5mol％20∶4PC。在一个优选的实施方案中，所述片层基本上由58mol％DOPC和42mol％胆固醇组成。
在某些方面，所述SUV包含表面改性基团，如聚乙二醇(PEG)。
所述SUV可具有至少约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％的囊封效率。在一些实施方案中，所述SUV具有至少约20％的囊封效率。
在一些实施方案中，所述SUV的填充丸粒中每微升填充丸粒包含至少约0.1mg且优选至少约0.2mg、0.25mg、0.3mg、0.35mg、0.4mg、0.45mg或0.5mg的囊封的尿素。囊封的尿素的量将取决于所需的递送剂量。
还提供了一种用于将尿素递送至玻璃体视网膜界面的方法，所述方法包括向受试者的玻璃体施用本发明的药物组合物。
一个实施方案涉及一种在患有或易患眼睛的疾病或病症的受试者中诱导玻璃体后脱离(PVD)的方法，所述疾病或病症可通过诱导PVD来治疗或预防，所述方法包括向所述受试者的玻璃体施用包含本发明的脂质体构建体的药物组合物。在特定实施方案中，所述疾病或病症可以是例如糖尿病视网膜病变或玻璃体黄斑粘连(VMA)。
进一步提供了一种治疗受试者的糖尿病视网膜病变或VMA的方法，所述方法包括向所述受试者的玻璃体施用本发明的药物组合物。
本发明的方法可包括通过玻璃体内注射施用本发明的药物组合物。在一个实施方案中，玻璃体内注射是通过睫状体平坦部进行。本发明的方法可包括施用，其中所述受试者处于仰卧位。
具体实施方案提供脂质体构建体的释放特征。在一些方面，在施用后24小时内，至少80％的尿素从所述脂质体构建体释放。在一些方面，在施用后8小时内，至少80％的尿素从所述脂质体构建体释放。在一些方面，在施用后4小时内，至少80％的尿素从所述脂质体构建体释放。
本发明的实施方案包括本发明的脂质体构建体或组合物用于诱导玻璃体后脱离(PVD)或用于治疗或预防可通过诱导PVD而得以治疗或预防的眼睛的疾病或病症的用途。本发明的一个实施方案包括包含本发明的脂质体构建体的药物组合物用于治疗或预防糖尿病视网膜病变或玻璃体黄斑粘连(VMA)的用途。
另一方面是一种包括本发明的脂质体构建体或药物组合物的药盒。
附图说明
图1A-1E示出来自由制剂1(如本文所公开)(图1A)、制剂3(如本文所公开)(图1B)、制剂8(如本文所公开)(图1C)、制剂11(如本文所公开)(图1D)或制剂12(如本文所公开)(图1E)制备的完整和溶解的脂质体构建体在24小时时间段内的羧基荧光素渗漏。制剂在表1中描述。
图2A-2D示出在1x PBS(图2A、2B)或兔玻璃体液(图2C、2D)中的尿素囊封的脂质体构建体的24小时时间段内的稳定性。所述图中的制剂#1、#2、#3、#4和#5分别对应于表1中描述的制剂1、2、3、12和14。
图3A-3C示出由制剂2(在表1中描述)并且在4℃(图3A)、室温(图3B)或37℃(图3C)下储存的尿素囊封的脂质体构建体在7天时间段内的稳定性。
图4示出用于产生包含囊封的尿素的脂质体构建体的反相蒸发方法的流程图。
图5示出四批脂质体构建体的体外尿素释放数据。
图6A-6B示出100μL剂量(40％脂质体vol./60％尿素缓冲液vol.)中囊封的尿素的量与DOPC(图6A)或胆固醇(图6B)的浓度之间的关系。
图7A-7B示出在剂量后立即(第O天)以及在此后的所指示时间点组2a动物的代表性眼底照片。左眼(OS)接受玻璃体内注射平衡盐溶液；右眼(OD)接受玻璃体内注射溶液中的96mg尿素。右眼中血管系统的模糊外观是由于药物产品的存在。第4天、第7天和第14天OD图中的箭头指示药物产品。
图8A-8B示出在所指示的剂量后时间点组2b动物的代表性光学相干断层扫描(OCT)图像。在每个子图的左侧示出相应的眼底图像，其中绿色线指示OCT图像的位置。左眼(OS)接受玻璃体内注射平衡盐溶液；右眼(OD)接受玻璃体内注射溶液中的192mg尿素。
图9示出在OD注射尿素溶液后第1天和第35天，组3(25mg尿素)、组4(50mg尿素)和组5(2.5mg尿素)动物的代表性眼底照片。
图10A-10B示出在所指示的时间点，组3(25mg尿素)(图10A)和组4(50mg尿素)(图10B)动物的代表性OCT图像。在每个子图的左侧示出相应的眼底图像。PVD的一些实例用箭头表示。
图11A-11B示出在OD注射尿素溶液之前和35天之后组3(25mg尿素)(图11A)和组4(50mg尿素)(图11B)动物的代表性B型扫描图像。
图12A-12B示出第32天视网膜电图。图12A示出暴露于蓝光的暗适应的对照动物(上图)和组8动物(下图)的图。图12B示出暴露于红光的暗适应的对照动物(上图)和组8动物(下图)的图。
具体实施方式
本发明的实施方案提供了用于将尿素递送至视网膜和黄斑的新颖制剂。本发明的实施方案的脂质体构建体可选择性地且特异性地在眼睛内的目标区域释放尿素以治疗、预防、诊断和/或监测眼睛的疾病或病症。
除非另外指示，否则本发明的实施方案的实践将采用药学、配方科学、蛋白质化学、细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术，所述技术都在本领域的技术范围内。此类技术在文献中被充分解释。参见例如Handbook of Pharmaceutical Excipients(第7版，Rowe等人编辑，2012)；Martin’sPhysical Pharmacy and Pharmaceutical Sciences(第6版，Sinko，2010)；Remington：TheScience and Practice of Pharmacy(第21版，Univ.Sci.Philadelphia ed.，2005)；Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel等人编辑，2016)；MolecularCloning：A Laboratory Manual(第4版，Green和Sambrook编辑，2012)；Lewin’s Genes XI(第11版，Krebs等人编辑，2012)；DNA Cloning：A Practical Approach，第I卷和第II卷(第2版，Glover和Hames编辑，1995)；Protein Engineering：A Practical Approach(第1版，Rees等人编辑1993)；Culture Of Animal Cells(第6版Freshney，2010)；Antibodies：ALaboratory Manual(第2版，Greenfield编辑，2013)；Antibody Engineering(第2版，Borrebaeck编辑，1995)。
为了使本发明的实施方案可更容易理解，首先定义某些术语。另外的定义在整个本公开中阐述。除非另外定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语具有与本发明涉及领域的普通技术人员通常所理解的相同的意义。例如，Dictionary of PharmaceuticalMedicine(第3版Nahler和Mollet编辑，2013)；The Dictionary of Cell and MolecularBiology(第5版J.M.Lackie编辑，2013)；Oxford Dictionary of Biochemistry andMolecular Biology(第2版R.Cammack等人编辑，2008)以及The Concise Dictionary ofBiomedicine and Molecular Biology(第2版P-S.Juo，2002)可提供本文使用的一些术语的一般定义。
本文所提供的标题不是对本发明的各个方面或实施方案的限制，所述方面或实施方案可通过参考整个说明书来获得。因此，通过参考说明书全文，更充分地定义了紧接着在下文中定义的术语。
I.定义
如本说明书以及随附权利要求书中所用，除非上下文另外明确指示，否则单数形式的“一个/种(a/an)”和“所述”包括复数指示物。术语“一个/种(a)”(或“一个/种(an)”)以及术语“一个或多个/一种或多种(one or more)”和“至少一个/种(at least one)”可在本文中可互换地使用。
此外，“和/或”应被视为为在有或没有另一者的情况下，两个指定的特征或组分中的每一者的具体公开内容。因此，如诸如“A和/或B”的短语中所用的术语“和/或”意图包括“A和B”、“A或B”、“A”(单独)和“B”(单独)。同样，如诸如“A、B和/或C”的短语中所使用的术语“和/或”意图包括A、B和C；A、B或C；A或B；A或C；B或C；A和B；A和C；B和C；A(单独)；B(单独)；以及C(单独)。
无论在什么情况下用语言“包含”描述实施方案时，还包括关于“由......组成”和/或“主要由......组成”描述的其他类似实施方案。
单位、前缀和符号以它们的国际单位制(SI)公认的形式来表示。数字范围包括限定所述范围的数字，并且本文提供的任何单个值都可用作包括本文提供的其他单个值的范围的端点。例如，一组值如1、2、3、8、9和10也是1-10、1-8、3-9等数字范围的公开内容。除非另外指明，否则氨基酸序列从左至右以氨基至羧基取向书写，并且核酸序列从左至右以5’至3’取向书写。氨基酸通过其通常已知的三字母符号或通过IUPAC-IUB生物化学命名委员会所推荐的单字母符号来提及。同样地，核苷酸通过它们的普遍公认的单字母代码来提及。
“脂质体”是具有围绕中心隔室的脂质双层的球形囊泡。脂质体可基于脂质双层的结构进行分类。单层囊泡在中心隔室周围具有一个双层，而多层囊泡(MLV)在中心隔室周围具有多于一个双层。脂质体也可基于尺寸分类：小单层囊泡(SUV)的直径通常是约20-100nm；大单层囊泡(LUV)的直径通常大于100nm；并且巨大单层囊泡(GUV)的直径通常大于约250nm。MLV的直径通常是约100-500nm。
“囊封效率”是通过以下等式计算的相对于上清液中的活性剂，包埋在脂质体的洗涤丸粒内的活性剂的百分比：
囊封％＝100x[(囊封的活性剂的量)/(负载溶液中活性剂的初始量)]
可基于重量、体积或浓度来计算囊封效率。
“囊封的百分比”是100x[(囊封的活性剂的量)/(活性剂的总量)]。
如本文所用，“脂质体构建体”是包含SUV的附聚物的颗粒。本发明的脂质体构建体是自组装成脂质体构建体的单独SUV，其比眼睛的玻璃体更致密。不希望受理论束缚，单独SUV通过以电荷共享为特征的分子间力保持在一起。出人意料地，所述脂质体构建体一旦施用就维持其球状凝胶状结构，以使得它们在递送到整个玻璃体期间不会分散或破裂，而是可下沉通过玻璃体并覆盖视网膜。所述脂质体构建体可包含乳化剂或粘合剂以增强附聚。所述脂质体构建体可包含促进SUV之间的直接或间接二级结合的表面基团(例如，PEG)，所述表面基团可在某些条件(如pH的变化)下水解。
粒度可表示为“z-平均直径”，其是基于散射光的强度的平均直径。“多分散性指数(PdI)”是粒度分布的宽度的估计值。样品中的粒度分布也可用“D值”表示，其是基于样品中颗粒的质量百分比。“D90”是样品质量的90％由较小颗粒组成时的直径。“D50”是样品质量的50％由较小颗粒组成时的直径。“D10”是样品质量的10％由较小颗粒组成时的直径。
如本文所用，术语“玻璃体(vitreous)”、“玻璃体(vitreous body)”、“玻璃体液(vitreous humor)”和“玻璃体液(vitreal fluid)”可互换使用来指在晶状体后面的占据眼球腔约五分之四的凝胶状材料。玻璃体的后部在称为“玻璃体视网膜界面”的区域中与视网膜直接接触。所述脂质体构建体的密度允许尿素靶向递送至玻璃体视网膜界面，并且降低尿素将不利地影响眼睛的其他区域的可能性。
“分离的”分子(例如分离的多肽或分离的多核苷酸)是呈未在自然界中发现的形式的分子，包括已经纯化的那些分子。在一些实施方案中，分离的分子是基本上纯的。如本文所用，术语“基本上纯的”是指纯度大于75％、优选大于80％或90％且最优选大于95％。
“标记”是可与分子直接或间接缀合以便产生“标记的”分子的可检测化合物。所述标记可单独检测(例如，放射性同位素标记或荧光标记)，或者可催化可检测的底物化合物或组合物的化学改变(例如，酶标记)。
术语“抑制”、“阻断”和“遏制”可互换地使用并且是指任何统计上显著的生物活性降低，包括活性的完全阻断。例如，“抑制”可指生物活性降低至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。
术语“活性剂”、“治疗剂”和“药物”可互换使用来指用于预防、诊断、缓解、治疗或治愈疾病的除食物之外的任何物质。活性剂包括保护剂和诊断剂。活性剂可包括以下中的至少一者中公开的任何物质：The Merck Index，第15版(2013)；Pei-Show Juo，ConciseDictionary of Biomedicine and Molecular Biology，(2001)；U.S.PharmacopeiaDictionary of USAN&Intemational Drug Names(2014)；以及Physician′s DeskReference，第70版(2016)。还参见Stedman′s Medical Dictionary，第28版(2013)。
术语“药物组合物”是指制剂，其中活性剂处于有效形式，即具有生物活性并且被配制成使得其可在环境中并且以产生治疗作用的浓度释放，并且其不含对所述组合物将施用于的受试者具有不可接受的毒性的另外组分。这种组合物可以是无菌的，并且可包含药学上可接受的载体，如生理盐水。合适的药物组合物可包含以下中的一种或多种：缓冲剂(例如乙酸盐、磷酸盐或柠檬酸盐缓冲剂)、表面活性剂(例如聚山梨醇酯)、稳定剂(例如人白蛋白)、防腐剂(例如苯甲醇)、用于增强生物利用度的吸收促进剂和/或其他常规的增溶剂或分散剂。
“受试者”或“个体”或“动物”或“患者”或“哺乳动物”是指需要诊断、预后或治疗的任何受试者，特别是哺乳动物受试者。哺乳动物受试者包括人、家养动物、农场动物、运动动物和实验室动物，包括例如人、非人灵长类动物、犬科动物、猫科动物、猪科动物、牛科动物、马科动物、啮齿类动物，包括大鼠和小鼠、兔等。
活性剂的“有效量”是足以执行明确说明的目的的量。关于所阐述的目的，可根据经验并且以常规方式确定“有效量”。
术语如“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”或“治疗(to treat)”或“缓解(alleviating)”或“缓解(to alleviate)”是指治愈、减缓、减轻所诊断的病理病况或病症的症状和/或阻止其进展的治疗措施。因此，需要治疗的那些包括已患有病症的那些。在某些实施方案中，如果患者显示例如全部，部分或暂时缓解或消除与疾病或病症相关的症状，则根据本文提供的方法成功地“治疗”受试者的眼睛疾病或病症。
“预防(Prevent)”或“预防(prevention)”是指预防和/或减缓靶向病理病况或病症的发展的防治性或预防性措施。因此，需要预防的那些包括倾向于患有或疑似患有所述病症的那些。在某些实施方案中，如果与未经受本发明方法的患者相比，患者短暂或永久性地发展例如与眼睛的疾病或病症相关的更少或较不严重的症状或者与所述疾病或病症相关的症状的更迟发作，则根据本文提供的方法成功地预防所述疾病或病症。
II.脂质体构建体
作为本发明实施方案的脂质体构建体的亚基的脂质体是由天然或合成来源的双层包围的核心组成的SUV。所述脂质体可包含一种或多于一种磷脂的混合物。所述磷脂可具有不同的链长、不同的电荷，并且可以是饱和的或不饱和的。胆固醇的并入通过改进膜的刚性来增强脂质体的稳定性。在一些实施方案中，所述脂质体可利用胆固醇和脂质缀合的亲水性聚合物作为主要组分。组分的选择及其相对比例影响脂质体的结构稳定性、它们的释放时间、囊封的货物(即尿素)的量以及用于囊封的方法。
特别地，所述脂质体亚基可包含以下中的一种或多种：胆固醇、二花生四烯酰基磷脂酰胆碱(DAPC)、二山嵛酰基磷脂酰胆碱(DBPC)、二月桂酰基磷脂酰胆碱(DLPC)、二肉豆蔻酰基磷脂酸(DMPA)、二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱(DMPC)、二肉豆蔻酰基磷脂酰甘油(DMPG)、二肉豆蔻酰基磷脂酰肌醇(DMPI)、二肉豆蔻酰基磷脂酰丝氨酸(DMPS)、二油酰基磷脂酸(DOPA)、二油酰基磷脂酰胆碱(DOPC)、二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二油酰基磷脂酰甘油(DOPG)、二油酰基磷脂酰肌醇(DOPI)、二油酰基磷脂酰丝氨酸(DOPS)、二油酰基三甲基铵丙烷(DOTAP)、二棕榈酰基磷脂酸(DPPA)、二棕榈酰基磷脂酰胆碱(DPPC)、二棕榈酰基磷脂酰胆碱-磷脂酰胆碱(DPPC-PC)、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二棕榈酰基磷脂酰甘油(DPPG)、二棕榈酰基磷脂酰肌醇(DPPI)、二棕榈酰基磷脂酰丝氨酸(DPPS)、二硬脂酰基磷脂酸(DSPA)、二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)、单唾液酸神经节苷脂、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(DSPE)、二硬脂酰基磷脂酰肌醇(DSPI)、二硬脂酰基磷脂酰丝氨酸(DSPS)、卵磷脂酰胆碱(EPC)、氢化卵磷脂酰胆碱(HEPC)、氢化磷脂酰胆碱(HPC)、氢化大豆磷脂酰胆碱(HSPC)、单油酰基磷脂酰乙醇胺(MOPE)、肉豆蔻酰基棕榈酰基磷脂酰胆碱(MPPC)、磷脂酸(PA)、磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰肌醇(PI)、棕榈酰基油酰基磷脂酰胆碱(POPC)、磷脂酰丝氨酸(PS)、棕榈酰基硬脂酰基磷脂酰胆碱(PSPC)、棕榈酰基硬脂酰基磷脂酰甘油(PSPG)、大豆磷脂酰胆碱(SPC)、鞘磷脂(SPM)和/或前述物质的聚乙二醇(PEG)缀合的衍生物。Chang等人，Int′l J.Nanomed.7：49-60(2012)公开了脂质体制剂中的许多脂质结构。本发明的优选制剂提供于表1中。
SUV的尺寸至关重要。如通过动态光散射所测量，所述SUV优选具有约50nm与约250nm之间、优选约140-220nm或约100-200nm或约120-190nm或约150-200nm或约160-180nm或约165-200nm的z-平均直径。理想地，所述SUV具有相对窄的尺寸分布。在一些实施方案中，PdI在约0.02与0.30之间。在一些实施方案中，PdI小于约0.30、0.25、0.20、0.15、0.125、0.10或0.050。在一些实施方案中，样品中90％的SUV具有小于约300nm、约270nm、约250nm或约220nm的直径。在一些实施方案中，如通过动态光散射所测量，10％的SUV具有小于约120nm、约100nm、约50nm、约20nm或约10nm的直径。优选地，如通过动态光散射所测量，样品中90％、95％或100％的SUV具有小于约250nm、或小于约200nm、或小于约175nm、或小于约150nm的直径。
所述SUV包含囊封在它们之内的尿素，即尿素是SUV的中心隔室中的“货物”。
本发明的各种实施方案的SUV具有的比重大于玻璃体液的比重。在一个优选的实施方案中，所述SUV具有大于约1.05、约1.06、约1.07、约1.08、约1.09、约1.1、约1.15或约1.2的比重。
ζ电位测量分散体或溶液中具有相似电荷的颗粒之间的静电排斥。ζ电位的大小指示相邻的、带类似电荷的颗粒之间的静电排斥程度。当ζ电位低时，颗粒之间的吸引力可超过排斥力，从而导致更多的附聚。当ζ电位高时，颗粒抵抗聚集。在一些实施方案中，如使用电泳光散射所计算，所述SUV具有约-70mV与约70mV之间的ζ电位。在一些实施方案中，ζ电位小于或等于0mV。在一些实施方案中，ζ电位是0±5mV。在一些实施方案中，ζ电位是约-70、-65、-60、-55、-50、-45、-40、-35、-30、-25、-20、-15、-10、-5、-4、-3、-2、-1、1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65或70mV。可使用本领域已知的方法，如通过添加盐和/或通过改变pH来调节ζ电位。
在一个实施方案中，所述脂质体构建体包含乳化剂或粘合剂以增强附聚。示例性乳化剂包括但不限于阿拉伯胶、单油酸甘油酯、单硬脂酸甘油酯、聚氧乙烯脱水山梨糖醇单硬脂酸酯、聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯、聚氧乙烯脱水山梨糖醇单月桂酸酯、十二烷基硫酸钠、二辛基磺基琥珀酸钠、脱水山梨糖醇油酸酯、脱水山梨糖醇棕榈酸酯、脱水山梨糖醇硬脂酸酯和三乙醇胺油酸酯。
所述SUV/脂质体构建体可包含表面改性基团和/或表面抗原。在一些实施方案中，表面改性基团是聚乙二醇(PEG)。脂质体表面的聚乙二醇化水平可例如从1mol％至20mol％或更高变化。在一些实施方案中，表面抗原是罗丹明。
脂质体的稳定性取决于各种性质，如表面电荷、尺寸、表面水合和脂质双层的流动性。表面电荷决定了脂质体与眼膜的相互作用。脂质体膜可具有正电荷、负电荷或无(中性)电荷。同样地，构成SUV的片层的单独脂质可各自具有净正电荷、净负电荷或净中性电荷。即使在净电荷为中性的情况下，电荷的局部区域也可影响SUV的性质。
所述脂质体构建体可对刺激有反应，所述刺激如pH、温度、光、氧化、酶降解、辐射或它们的组合。
本发明实施方案的脂质体构建体每μL填充脂质体构建体丸粒中可含有至少约0.05mg、0.1mg、0.2mg、0.3mg、0.4mg、0.5mg、0.6mg、0.7mg、0.8mg、0.9mg或1mg尿素。通过将含有脂质体构建体的样品以约90,000g超速离心约5分钟并倾析上清液来制备填充的脂质体构建体丸粒。
本发明实施方案的脂质体构建体能够延长尿素在玻璃体视网膜界面的停留时间，并且可进行优化以便以所需的速率释放其货物。例如，本发明实施方案的脂质体构建体(例如，持续释放药物递送系统)可在单次施用后释放尿素持续至少约2、4、6、12、18、24、48或72小时或至少约1、2、3、4、5或6周。在一个实施方案中，所述脂质体构建体可在施用后4-8小时释放约10％或更少的囊封的尿素。在一个实施方案中，所述脂质体构建体可在施用后8-12小时释放约50％或更少的囊封的尿素。在一个实施方案中，所述脂质体构建体可在施用后1小时释放至少约75％的囊封的尿素。在一个实施方案中，所述脂质体构建体可在施用后8小时释放至少约80％的囊封的尿素。在一个实施方案中，所述脂质体构建体可在施用后24小时释放至少约80％的囊封的尿素。可通过改变脂质体构建体的配方，根据所需的剂量来改变释放速率。
在一些方面，可能希望包含脂质体构建体的组合物具有分层释放概况。在这些实施方案中，可设想一些尿素在注射后立即释放，而一些尿素在注射后的不同时间点(例如每6小时、每12小时、每天、每两天、每三天等)释放。因此，所述组合物可包含SUV的混合群体，其中所述SUV具有一种或多种不同的性质，如脂质双层的尺寸、电荷、组成、脂质双层的改性或其组合，从而改变尿素的释放速率。
所述脂质体构建体可包含抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段特异性地结合至视网膜或黄斑细胞中表达的抗原。在一些实施方案中，所述细胞是Muller细胞、视网膜神经节细胞、视网膜轴突细胞、内界膜细胞、视网膜色素上皮细胞或视网膜星形细胞。在一些实施方案中，所述抗原在细胞的表面上表达。在一些实施方案中，所述抗原在Muller细胞的表面上特异性地表达。在一些实施方案中，所述抗原是选自由以下组成的组：波形蛋白、谷氨酰胺合成酶、成纤维细胞生长因子受体1(FGFR1)、成纤维细胞生长因子受体4(FGFR4)、成纤维细胞生长因子受体9(FGFR9)、肝素结合生长因子、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、CD16、CD17、CD18、CD 19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD25、CD26、CD27、CD28、CD29、CD30、CD31、CD32、CD33、CD34、CD35、CD36、CD37、CD38、CD39、CD40、CD41、CD42、CD43、CD44、白细胞介素1(IL-1)、白细胞介素2(IL-2)、白细胞介素3(IL-3)、白细胞介素4(IL-4)、白细胞介素5(IL-5)、白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素7(IL-7)、白细胞介素8(IL-8)和视黄醛结合蛋白。所述抗体可附着至脂质体的表面。在一些实施方案中，所述抗体附着至脂质体表面上的PEG。
III.脂质体构建体的制备
SUV可通过本领域已知的方法来制备，所述方法如溶剂蒸发、反相蒸发、脱水-再水合、洗涤剂透析、薄膜水合(Bangham方法)、洗涤剂消减、溶剂(例如，乙醚/乙醇)注射、乳液方法、致密气体方法、超临界流体方法等。例如，可将脂质混合物溶解于有机溶剂中且然后干燥以形成脂质薄膜。然后可将干燥的脂质薄膜水合并设定尺寸，例如通过将所述脂质薄膜通过孔径减小的孔口挤出，这产生由单层脂质体组成并具有标准化的均匀直径的脂质体构建体。
为了制备包含尿素的脂质体构建体，可用尿素溶液将脂质薄膜水合，以使得所述脂质薄膜变得囊封在形成脂质体构建体的SUV的内部之内。在使用柱色谱法或透析除去未包埋的尿素后，所述脂质体可如上所述设定大小。优选地，尿素呈饱和溶液或过饱和溶液的形式。
制备包含尿素的脂质体构建体的替代方法是使用pH梯度方法将尿素负载到预先形成的SUV中，其中所述脂质体的水性内部具有比围绕脂质体构建体的外部介质更低的pH。尿素将迁移并浓缩在脂质体构建体内。将尿素负载到脂质体构建体内部中的另一种方法采用硫酸铵梯度方法。
存在许多不同的将活性剂负载到本领域已知的脂质体构建体中的方法，并且在本发明的范围内。
IV.包含脂质体构建体的组合物和使用方法
过去，将活性剂施用至视网膜的表面一直是非常困难的，因为所述活性剂在递送后立即分散在玻璃体中，并且足够的浓度未到达眼睛后部。水溶性药物如尿素在这方面提出了特别的挑战。由于它们的物理特性，本发明的药物组合物解决了这一问题。特别地，所述SUV足够小以至于它们可被无菌过滤，但仍然可包埋治疗有效量的尿素。它们在注射时充分附聚，以使得它们一旦施用就在脂质体构建体中保持在一起，而不是分散在整个玻璃体液中，并且它们比玻璃体更致密，以使得它们可沉降到视网膜表面上并覆盖视网膜表面。虽然“空的”SUV(即没有囊封的尿素)将在玻璃体内注射后附聚，但它们在温和的玻璃体液搅动下容易地分散。然而，具有囊封的尿素的相同SUV形成脂质体构建体，所述脂质体构建体在玻璃体内注射后附聚并且在玻璃体液的温和搅动下不分散。本发明的多种不同的含尿素的脂质体构建体显示出能够耐受玻璃体液的温和搅动的附聚，这允许药物在玻璃体内空间上从附聚的贮库中释放，而不是从整个玻璃体中的分散位置释放。因此，本发明的药物组合物提供了用于将活性剂有效递送至玻璃体视网膜界面的新颖制剂。
本发明的脂质体构建体形成SUV的附聚，所述附聚通过在SUV内囊封尿素来稳定。组合物的密度使其下沉在玻璃体液中，其任选地通过递送至处于仰卧位的受试者来促进，从而使得靶向递送至视网膜界面处而不是整个眼睛中并在视网膜界面处而不是整个眼睛中释放尿素。因此，本公开提供了一直增加受试者的视网膜暴露于尿素的方法，其中所述方法包括将包含尿素的脂质体构建体施用于受试者的眼睛。
在某些方面，本公开提供了组合物，所述组合物包含如上所述的脂质体构建体，任选地还包含一种或多种载体、稀释剂、赋形剂或其他添加剂。所述组合物的pH可以是约5.0至约8.5；优选地，pH是约5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0或8.5。此类组合物可包括包含尿素的脂质体构建体。
除了囊封在SUV中之外，尿素还可存在于包含脂质体构建体的载体或缓冲液中。所述载体或缓冲液中未囊封的尿素的浓度可根据组合物的所需特征而变化。例如，可配制组合物以维持囊封的尿素与未囊封的尿素的浓度之间的平衡，以使得囊封的尿素的浓度保持稳定。此外，储存载体或缓冲液中未囊封的尿素的浓度可与施用的组合物中的其浓度不同。例如，如果在施用时需要初始推注剂量，则所述载体或缓冲液可包含更高浓度的未囊封的尿素。
所述组合物可呈多种形式，如溶液、微颗粒、纳米颗粒、水凝胶等，或它们的组合。在一些实施方案中，所述脂质体构建体分散在凝胶中。在一个优选的实施方案中，所述脂质体构建体呈乳液或悬浮液的形式。
如本文所论述，囊封在脂质体构建体中的尿素可以治疗有效量施用，以用于体内治疗视网膜疾病或病症，特别是糖尿病视网膜病变。在这方面，应理解可配制所公开的脂质体构建体以便有助于施用并且促进尿素的稳定性。因此，本发明实施方案的脂质体构建体可以药物组合物形式施用。
根据本发明的药物组合物可包含药学上可接受的、无毒的无菌载体，如生理盐水、无毒缓冲液、防腐剂等。出于本申请的目的，“治疗有效量”的尿素是指足以实现益处(例如诱导PVD)的量。
通常，合适的药物组合物可包含一种或多种缓冲剂(例如乙酸盐、磷酸盐、柠檬酸盐)、表面活性剂(例如聚山梨醇酯)、稳定剂(例如人白蛋白)和/或盐(例如酸加成盐、碱加成盐)等。药学上可接受的载体或稀释剂的形式和特征可由与其组合的活性成分的量和其他众所周知的变量决定。可用于本文提供的药物组合物中的合适水性和非水性载体的实例包括水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)以及它们的合适的混合物、植物油如橄榄油以及可注射有机酯如油酸乙酯。适当流动性可例如通过使用包衣材料如卵磷脂、在分散剂的情况下通过维持一定粒度、以及通过使用表面活性剂来维持。
这些组合物还可含有佐剂，如防腐剂、润湿剂、乳化剂以及分散剂。可通过灭菌程序并且通过包括不同抗细菌剂和抗真菌剂(例如，对羟苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚山梨酸等)两者来确保防止微生物的出现。等渗剂，诸如糖、氯化钠等也可添加到所述组合物中。此外，可通过包含延迟吸收的剂(如单硬脂酸铝和明胶)来实现可注射药物形式的延长吸收。
本文提供的药物组合物还可包含药学上可接受的抗氧化剂。药学上可接受的抗氧化剂的实例包括：(1)水溶性抗氧化剂，如抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，如抗坏血酸棕榈酸酯、丁基羟基苯甲醚(BHA)、丁基羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；以及(3)金属螯合剂，如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸等。
因此，本公开提供了一种治疗眼睛的疾病或病症(例如糖尿病视网膜病变)的方法，其中所述方法包括向有需要的受试者施用包含如本文提供的囊封尿素的脂质体构建体的药物组合物，其中足够量的尿素到达视网膜并保持与视网膜接触足以治疗所述疾病和/或到达所需终点(如诱导PVD)的一段时间。为此，本发明实施方案的方法还可包括将受试者定位成处于仰卧位置，即在他或她的背上，以促进脂质体构建体组合物迁移至眼睛的后部。因为所述脂质体构建体比玻璃体更致密，所以以这种方式定位受试者利用重力并使脂质体构建体“下沉”至位于眼睛后部的视网膜，从而实现靶向递送至视网膜。
本文提供的脂质体构建体可用于治疗或预防可通过将尿素递送至视网膜(包括黄斑)来解决的任何疾病或病症。可使用本发明实施方案的脂质体构建体和方法治疗或预防的疾病或病症的实例包括以下中的一种或多种：年龄相关性黄斑变性(AMD)、分支或中央视网膜静脉阻塞、中心性浆液性脉络膜视网膜病变、脉络膜脱离、先天性X连锁视网膜劈裂症、糖尿病性黄斑水肿(DME)、糖尿病视网膜病变(DR)、视网膜前膜、家族性渗出性玻璃体视网膜病变、感染性视网膜炎、黄斑水肿、黄斑裂孔、黄斑皱褶、持续性胎儿血管、眼假组织胞质菌病综合征、残留晶状体碎片、成视网膜细胞瘤、视网膜撕裂或脱离、视网膜色素变性、早产儿视网膜病变、河盲症(盘尾丝虫病)、玻璃体黄斑粘连(VMA)、玻璃体黄斑牵引综合征和湿性黄斑变性。在一些情况下，可能希望在眼睛中诱导病状，例如PVD。通过诱导PVD可预防或改善许多疾病状态，PVD可保护视网膜免于病理性血管生成。
可使用标准筛选技术，例如光学相干断层扫描(OCT)、眼底照相或荧光素血管造影术来评估对脂质体构建体的施用的临床反应。还可通过与疾病或病症相关的症状的改善来评估临床反应。在一些实施方案中，可通过观察脂质体构建体之上或之中的荧光标记来分析脂质体构建体的靶向。
将脂质体构建体或包含脂质体构建体的组合物施用至受试者的玻璃体的方法是本领域技术人员熟知的或可由本领域技术人员容易地确定。例如，施用可经由玻璃体内注射、玻璃体内植入、离子电渗疗法或微机电装置进行。优选地，经由玻璃体内注射，例如像经由18-31号针进行施用。在一些情况下，经由27号针或30号针进行施用。通常经由玻璃体注射递送的体积是约50μL与约150μL之间，优选约100μL。
可与载体材料组合以产生剂型的本发明实施方案的脂质体构建体的浓度将根据许多不同因素而变化，所述因素包括尿素的囊封效率、治疗是预防性还是治疗性的、施用的其他药物以及患者是人还是动物。鉴于本公开，本领域普通技术人员无需过度实验即可容易地确定待施用的脂质体构建体的量。可使用本领域技术人员已知的常规方法滴定治疗剂量以优化安全性和功效。
包含脂质体构建体的组合物可单剂量或多剂量施用。可根据需要多次施用组合物以实现靶向终点，如PVD诱导。注射间隔时间可不同。例如，所述组合物可每6、12、24、48或72小时，或者每1、2、3或4周或每1、2、3、4、5、6、9、12、18、24、36或48个月施用。可调节剂量方案以提供最佳的所需反应(例如治疗性或预防性反应)。
药物组合物还可在联合疗法中施用和/或与其他剂组合施用。
本公开提供了如本文所述的包含囊封尿素的脂质体构建体的药物组合物用于治疗或预防视网膜或黄斑的疾病或病症的用途。本公开还提供了如本文所述的包含尿素的脂质体构建体在制造用于治疗或预防视网膜或黄斑的疾病或病症的药物中的用途。本公开还涵盖单独或与其他疗法组合的包含含有尿素的脂质体构建体的药物组合物用于预防、管理、治疗或改善与眼睛的疾病、病症或损伤相关的一种或多种症状的用途。
VII.药盒
包括如本文提供的脂质体构建体和/或组合物和使用说明书的药盒也在本公开的范围内。所述药盒还可含有至少一种另外的试剂，或一种或多种另外的脂质体构建体。药盒通常包括指示所述药盒的内容物的预期用途的标签。术语“标签”包括在药盒上或与药盒一起或另外伴随药盒提供的任何书面或记录材料。
本公开还提供了包括一种或多种脂质体构建体的药盒，所述药盒可用于实施本文所述的方法。在某些实施方案中，药盒包括在一个或多个容器中的至少一种类型的本发明的脂质体构建体。在一些实施方案中，所述药盒含有进行检测测定所必需的和/或足够的所有部件，包括所有对照物、用于进行测定的指导以及用于结果的分析和呈现的任何必要的软件。本领域的技术人员将容易地认识到，所公开的脂质体构建体可容易地并入本领域中熟知的已建立的药盒形式之一。
本公开中引用的所有参考文献特此以引用的方式整体并入。此外，本文引用或提及的任何产品的任何制造商的说明书或目录均以引用的方式并入。以引用的方式并入本文中的文献或其中的任何教义可用于本发明的实践中。以引用的方式并入本文的文件不被承认为现有技术。
实施例
本公开的实施方案可通过参考以下非限制性实施例来进一步限定，所述非限制性实施例详细描述了本发明的某些脂质体构建体的制备和用于使用本发明的脂质体构建体的方法。对于本领域技术人员将显而易见的是：可在不背离本公开内容的范围的情况下实践对材料和方法两者的许多修改。
实施例1.候选制剂的研究
最初考虑了若干脂质体制剂，在表1中示出。
表1
所有脂质均购自Avanti Polar Lipids，Inc.(Alabaster，AL)。用羧基荧光素制备制剂1、3、8、11和12。简言之，在1x PBS(HyCloneTM目录号SH0256，GE Healthcare，Marlborough，MA)中制备100mM羧基荧光素溶液，并用1％NaOH将pH调节至6.5-7.5。过滤此溶液并用于制备自淬灭脂质体。将脂质薄膜在氮气流下干燥、随后在真空下干燥至少2小时，并用100mM羧基荧光素溶液再水合。将再水合的脂质体通过0.2μm过滤膜(MilliporeSigma，Darmstadt，Germany)挤出。在Sephadex G75柱(Sigma Aldrich，St.Louis，MO)上通过尺寸排阻色谱法使脂质体与未囊封的羧基荧光素分离。
在24小时内测试每种制剂在PBS、HBSS和兔玻璃体液中的脂质体稳定性和羧基荧光素渗漏率。为了确定来自PBS、HBSS(HyCloneTM目录号SH30256，GE Healthcare，Marlborough，MA)或兔玻璃体液(BTS Research，San Diego，CA或Absorption Systems LP，Exton，PA)中混合的脂质体的羧基荧光素渗漏的时程，将一式三份80μL的PBS或HBSS等分试样用自动移液器添加至ELISA条带(目录号446473，Thermo Scientific，Waltham，MA)；用无菌1mL移液管添加100μL的玻璃体液等分试样。将20μL的脂质体制剂一式三份添加在每种流体之上。将10μL的RIPA缓冲液(目录号89901，Thermo Scientific，Waltham，MA)一式三份添加至相同的样品以确定PBS、HBSS和玻璃体液中的最大荧光发射。包括100μL PBS、80μLHBSS+20μL PBS或100μL玻璃体液+20μL PBS的阴性对照。将板用自粘塑料薄膜密封，并在VMax动力学微板读数器(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)中剧烈振荡3个循环，然后测定荧光发射。增益被设定为800，如由在时间0的具有PBS和RIPA缓冲液的含有脂质体的孔中产生50％最大发射所需的增益确定。
将样品在37℃下孵育2小时；每分钟读取发射。然后每15分钟读取样品另外22-24小时。用RIPA缓冲液溶解脂质体，并在24小时内测试PBS、HBSS和兔玻璃体液中的最大荧光发射。所有测试的脂质体制剂在24小时过程内是稳定的。溶解的脂质体样品在24小时内具有增加的荧光发射，从而证明完整的脂质体已成功囊封羧基荧光素(图1A-1E)。
实施例2.尿素囊封和稳定性研究
尿素已被证明可诱导患有中度至重度糖尿病视网膜病变的患者的玻璃体后脱离(PVD)；然而，由于无法将足够的药物持续递送至眼睛后部，因此临床应用受到阻碍。
制备了制剂1、2、3、12和14(表1)。除胆固醇外的所有脂质均在氯仿溶液中获得；将胆固醇粉末以所需比例添加至氯仿溶液中。经由氮气流蒸发胆固醇，随后冷冻干燥蒸发氯仿-脂质样品。将所得脂质饼用100μL的1g/mL尿素(Invitrogen目录号15505035，Carlsbad，CA)溶液水合，在4℃下搅拌30分钟，并且使用0.8μm和0.2μm过滤器的两步挤出工艺挤出。为了发现囊封效率，获得1g/mL尿素溶液的等分试样并测量负载缓冲液中的尿素质量。在挤出后，将脂质体在超速离心机(Beckman Coulter，Indianapolis，IN)中以90,000g在室温下沉淀5分钟，并倾析缓冲液。将丸粒重新悬浮在100μL去离子水中并用于进一步实验和/或分析。
在用100μL PBS洗涤后，测量重新悬浮的样品体积并用于确定脂质体丸粒体积，如表2中所示。
表2
测定每种制剂的囊封的尿素的量和尿素负载(囊封)效率。在0.2μm过滤器挤出之后，将脂质体样品在室温下以90,000g超速离心(Beckman Coulter，Indianapolis，IN)5分钟，以使溶液中的游离尿素与填充的脂质体丸粒中的囊封的尿素分离。倾析上清液。通过测量囊封在填充的丸粒质量中的尿素的量(重新悬浮于100μL DI H2O中)并除以负载缓冲液中的尿素质量而发现囊封效率的上限。洗涤每个丸粒，重新悬浮1xPBS(MP Biomedicals，Santa Ana，CA)，然后以90,000g超速离心5分钟以消除与脂质体构建体的外部缔合的尿素部分。除去上清液，并将丸粒悬浮在100μL去离子水中并煮沸5秒，然后进行两次冻融循环以使脂质体构建体不稳定。使用三个1μL样品一式三份地产生丸粒数据。使用三个1μL样品一式三份地产生上清液数据。使用尿素测定试剂盒(Abnova Corp.目录号KA1652，Taipei City，Taiwan)确定初始负载缓冲液中囊封的尿素(丸粒)与尿素的比例。将填充的丸粒用100μL PBS第二次洗涤，以除去与脂质体颗粒缔合但未真正囊封的任何尿素。囊封在洗涤的填充丸粒质量(重新悬浮于100μL DI H2O)中的尿素的量除以负载缓冲液中的尿素的质量提供囊封效率的下限。在负载过程中，实现了至少X和小于Y的囊封效率。
负载效率和囊封的尿素的总质量的下限示于表3中。负载效率和囊封的尿素的总质量的上限示于表4中。
表3
表4
对于所有五种制剂(制剂1、2、3、12和14)，在室温下进行1x PBS和兔玻璃体液(Absorption Systems LP，Exton，PA)中的脂质体的24小时稳定性测试。如上所述制备脂质体制剂。对于在1x PBS中的稳定性测试，将100μL的1x PBS添加至湿脂质体丸粒体积中，如表2中所提供。用于稳定性测试的脂质体样品(100μL)的体积在玻璃体液中是大约1∶1。将样品保持在室温下。
如上所述在囊封后6、12和24小时测量游离和囊封的尿素的浓度。在每个时间点报告囊封的尿素并绘图以显示尿素的释放概况(图2A-2D)。制剂2(58mol％DOPC，42mol％胆固醇)在1x PBS和玻璃体液两者中均显示24小时内的最佳尿素释放特征，在24小时时释放大约25％的囊封尿素。
实施例3.制剂2(58mol％DOPC，42mol％胆固醇)脂质体构建体的表征和优化
粒度分析
使用Microtrac(Montgomeryville，PA)150仪器和Microtrac粒度分析仪软件10.1.3版进行粒度分析。无尿素的制剂2的粒度分析显示90％的脂质体构建体在250nm下，并且10％在100nm下。因此，不合尿素的制剂2的脂质体构建体粒度范围为约100nm至约250nm。含囊封的尿素的制剂2的粒度分析显示90％的脂质体构建体在300nm下，并且10％在90nm下。因此，含囊封的尿素的制剂2的脂质体构建体粒度范围为约90nm至约300nm。
缓冲液制剂的优化
针对包封效率和脂质体构建体在4℃下96小时的稳定性评估最佳缓冲液组合物。用6种不同的缓冲液组合物制备具有包封的尿素的制剂2脂质体构建体，如表5中所示。
表5
缓冲液编号 缓冲液配方
1 0.95g/mL尿素于diH2O中
2 0.95g/mL尿素于0.5x PBS中
3 0.95g/mL尿素于1x PBS中
4 0.95g/mL尿素于2x PBS中
5 0.95g/mL尿素+柠檬酸(pH 6.5)
6 0.95g/mL尿素+柠檬酸(pH 6.5)+10％蔗糖
每种缓冲液制剂是水性水合介质，将其添加至干燥的脂质饼(制剂2)中，然后如上所述挤出。囊封的尿素的负载效率和总质量示于表6中。
表6
去离子水和尿素的缓冲液组合物具有最高的尿素囊封效率；含尿素的0.5x PBS和1x PBS缓冲液是次佳的。然而，脂质体构建体在含有柠檬酸(pH 6.5)、10％蔗糖和0.95g/mL尿素的缓冲液中的稳定性未显示96小时后囊封的尿素的变化。2x PBS尿素缓冲液显示最低的稳定性，囊封的尿素浓度损失为大约30％。
注射器稳定性测试
制剂2脂质体构建体用于评价具有更高体积-体积浓度的脂质体构建体的脂质体构建体行为。为了测试通过注射器抽吸脂质体构建体的效果，如上所述制备丸粒，将两个丸粒合并，重新悬浮至100μL0.5x PBS的总体积，并通过27号或30号针抽吸。如上所述测定囊封的和游离的尿素的量，并且在表7中示出。
表7
组合两个丸粒增加了囊封的尿素的量，但未增加囊封效率。用27号针或30号针未观察到脂质体构建体完整性的损失。然而，当3个丸粒以100μL总体积组合时，当从27号针抽吸和分配时，样品损失是大约40％。
温度稳定性测试
对于制剂2尿素囊封的脂质体构建体，进行在4℃、室温和37℃下在0.5x PBS中的7天温度受控的稳定性测试，所述脂质体构建体如上所述制备和分析。结果显示在表8和图3A-3C中，其中测量100μL样品中的总囊封的尿素(mg)。
表8
实施例4.囊封尿素的脂质体构建体制剂的制备和进一步表征
使用1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)和胆固醇，在尿素存在下形成脂质体以产生囊封尿素的脂质体构建体。所使用的材料总结在表9中。
表9
化合物 等级 制造商 批号
尿素 USP EMD K46524030524
DOPC NA Avanti Polar Lipids 181PC-318
胆固醇 NA Avanti Polar Lipids CH-102
乙醇 USP Spectrum 15120345
PBS NA Hyclone Lab 169611
进行反相蒸发，然后进行微流化(Model M110 EH，Microfluidics Corp.，Westwood，MA)以制备粒度小于200nm的囊封尿素的脂质体构建体。为了优化工艺步骤，制备了若干批次，并且一小批F4B是按照优化方法(图4)制备的第一批并进行了表征。下文描述的标准系列测试用于表征后续批次。
经由离心过滤将100μL样品的水性部分的体积与丸粒体积分离，测量并计算丸粒体积。通过高效液相色谱(HPLC)测量总尿素和游离尿素浓度，并用于计算囊封的尿素浓度和囊封效率(尿素并入程度)。使用Zetasizer(Malvern Instruments Ltd.，Worcestershire，UK)通过激光散射(LLS)测量ζ电位和粒度和分布。通过测试总尿素浓度和游离尿素浓度并再次计算囊封的尿素浓度来确认通过30G针的可注射性。通过在过滤之前和之后测量样品的体积来确定在通过0.2μm过滤器过滤期间损失的体积。对于已知体积，通过重量分析测量批料的比重，并且目测评价玻璃体液或PBS中的附聚。最后，使用20kDa透析盒在37℃、7天内测量囊封的尿素的体外释放，其中样品体积∶缓冲液体积比例示100μL∶5mL。通过HPLC测量总尿素浓度，并且基于初始游离尿素浓度和每个相应时间点的总尿素浓度来计算释放的囊封尿素的量。
批次F5和F5B的组成是58mol％DOPC和42mol％胆固醇；批料大小是17克(1500-1600个剂量)。使用600mg/mL饱和尿素溶液来制备囊封尿素的脂质体构建体。在微流化之后，将批料进一步均质化以将脂质体的粒度减小至可接受的尺寸。在0.8μm过滤后，将批料等分成两个体积，使用具有10kDa截留超滤膜(MilliporeSigma，Darmstadt，Germany，目录号PLGC04310)的搅拌池装置(Amicon，50mL，最大压力75psi)将其分别浓缩至40％脂质体∶60％饱和尿素缓冲液(vol/vol比例)，并无菌过滤。批次F5的最终体积是105mL，批次F5B的最终体积是51mL。批次F11-F13也具有58mol％DOPC和42mol％胆固醇的组成。
批次F6的组成是91mol％DOPC和9mol％胆固醇；批料大小是3克(1500-1600个剂量)。使用450mg/mL饱和尿素溶液来制备囊封尿素的脂质体构建体。将批料浓缩并如针对批次F5和F5B所描述进行无菌过滤。
批次F8的组成是70mol％DOPC和30mol％胆固醇；批料大小是3克(1500-1600个剂量)。使用450mg/mL饱和尿素溶液来制备囊封尿素的脂质体构建体。将批料浓缩并如针对批次F5和F5B所描述进行无菌过滤。
批次F9的组成是45mol％DOPC和55mol％胆固醇；批料大小是3克(1500-1600个剂量)。使用450mg/mL饱和尿素溶液来制备囊封尿素的脂质体构建体。将批料微流化20分钟，每3分钟测量批料的粒度。在微流化20分钟后，脂质体粒度达到1200nm，远高于200nm靶标。在微流化后将样品体积储存过夜时观察到相分离。用珠磨机进行批料的均质化5分钟，以使样品成功通过0.8μm过滤器。将批料浓缩并如针对批次F5和F5B所描述进行无菌过滤。通过0.2μm过滤器的无菌过滤非常困难，并且由于大量大颗粒的复杂性，在加工过程中损失至少1/3的批料体积。
批次F10的组成是58mol％DOPC和42mol％胆固醇，大约6％(w/w)具有荧光标记的胆固醇。如上所述，通过反相蒸发、然后微流化、超声处理和过滤来制备批料。
表征测试的结果显示在表10中。粒度和分布显示在表11中。体外释放数据显示在表12、表13和图5中。
表13
批次 囊封的尿素半衰期(分钟)
F5B 41
F6 28
F8 95
F9 45
随着制剂中DOPC的浓度增加，囊封的尿素的量减少(图6A)。相反，随着制剂中胆固醇的浓度增加，囊封的尿素的量增加(图6B)。来自制剂的尿素的释放速率相对类似，并且在200分钟后，以稳定的速率释放最少量的尿素。基于收集的数据，具有58mol DOPC和42mol％胆固醇的制剂F5/F5B具有延长释放尿素制剂的目标特征。当在脂质体构建体制剂中递送时，尿素在眼中的停留时间比纯尿素在眼中的停留时间长8倍。
通过乙醇输注，任选地伴随冷冻/解冻循环制备另外的脂质体构建体批次，并如上所述进行表征。结果显示在表14和表15中。
实施例5.玻璃体内施用的尿素的毒性和耐受性
此实施例提供了在玻璃体内(IVT)注射到新西兰白兔眼中后囊封的尿素的耐受性和毒性的评价，以及其用于诱导PVD的功效，以及玻璃体内注射的囊封尿素的脂质体构建体的沉降模式。
雌性新西兰白兔从Western Oregon Rabbit Co.(Philomath，OR)获得，并且按照USDA动物福利法案的规定和在机构动物护理和使用委员会的审查和批准下进行圈养和护理。
在进行研究之前，每只动物进行眼科检查(裂隙灯活组织显微镜检查和间接检眼镜检查)。根据改良的McDonald-Shadduck评分系统(McDonald等人“Eye Irritation，”inAdvances in Modem Toxicology：Dermatoxicology，在579-582(Marzulli等人编辑，1977))对眼部发现进行评分。进行研究的接受标准是对于所有变量分数为“0”。
第1组(亚组1a、1b、1c)：急性/囊封尿素的脂质体
向六只雌性新西兰白兔(每个亚组两只)玻璃体内(IVT)施用单剂量的囊封尿素的脂质体构建体(58mol％DOPC，42mol％胆固醇)到双眼(OU)中。用肌肉内(IM)注射盐酸氯胺酮(30mg/kg)、甲苯噻嗪(5mg/kg)和乙酰丙嗪(3mg/kg)、然后通过吸入氧气中(1％-2.5％)异氟烷(1L/min)来麻醉动物。在外科手术之前，将1至2滴局部用盐酸丙美卡因麻醉剂(0.5％)施用于动物的眼睛。使动物在剂量后保持麻醉，头部稳定3小时，一只眼睛面朝上，并且另一只眼睛面朝下。
在三小时后，进行临床眼科检查，对动物实施安乐死。收集玻璃体液(VH)作为3个级分。使用10％苯肾上腺素和1％托品酰胺各一滴使瞳孔扩张。两个18G针在3点钟和9点钟位置插入眼睛并进入VH，一个斜面向上指向晶状体，并且另一个斜面向下指向视网膜。通过每个针吸取300μL的VH，然后从眼睛中取出每个针。然后收获眼睛并摘除眼球。在摘除眼球后，收集剩余的VH作为第三级分。来自每只动物的每只眼睛的样品保持分开并且不合并。记录眼组织的重量。分别称重各个VH级分。将VH级分在室温下以16,100xg离心20-30分钟。分离上清液。将含有脂质体构建体和上清液的丸粒在干冰上分别快速冷冻并储存在-60℃至-80℃。还从这些动物收集视网膜，在干冰上快速冷冻并储存在-60℃至-80℃。
第2组(亚组2a，2b)：慢性/游离尿素
将另外两只动物(每个亚组一只)施用单剂量或双剂量的游离尿素溶液IVT到右眼(OD)中并且平衡盐溶液(BSS)到左眼(OS)中。用IM注射盐酸氯胺酮(30mg/kg)和甲苯噻嗪(5mg/kg)麻醉动物。在外科手术之前，将1至2滴局部用盐酸丙美卡因麻醉剂(0.5％)施用于动物的眼睛。
在剂量后0-3、4(AM和PM)、8(±1)、14、21和28天，在这些动物中进行临床眼科检查、眼底照相和光学相干断层扫描(OCT)。对于OCT，在成像前大约10-15分钟，用10％苯肾上腺素和1％托品酰胺各一滴使瞳孔扩张。使用仪器(Heidelberg Engineering，Inc.，Heidelberg，Germany)取得图像。
研究设计总结在表16中。
OS：左眼；OD：右眼；OU：双眼；BSS：平衡盐溶液；IVT：玻璃体内注射；NA：不适用
*测试或对照物品以相隔34(OD)或35(OS)分钟施用的两次100μL注射递送。在第二次注射之前，评估眼内压以确保其恢复至足够低的值以允许下一次注射。
临床检查和观察
对于接受囊封尿素的脂质体或游离尿素溶液的动物，未观察到对体重的不利影响和对一般健康状况的严重不利影响。在两组动物中，在IVT注射后立即观察到眼部刺激和肿胀，其在接下来的几天内在给药当天后存活的动物中消退。
在基线预筛选检查期间，所有动物均没有眼部异常。在临床眼科检查中未观察到玻璃体后脱离(PVD)，除了第2a组动物(游离尿素溶液，单剂量)和第2b组动物(游离尿素溶液，双剂量)处理的右眼(OD)中的第2天检查外。然而，在临床眼科检查期间，PVD并不容易看到；OCT成像揭示临床眼科检查未揭示的PVD的另外情况。可得出结论，PVD在给药的2天内用游离尿素溶液处理的两只动物的眼睛中发展并且持续研究的剩余时间，即使眼科检查和成像并不总是检测到它。由于第1组动物未进行OCT成像，因此可能未检测到在用囊封尿素的脂质体构建体处理后的PVD的情况。
眼底照相
从第0天到第3天，亚组2a和亚组2b动物均表现出OD玻璃体的混浊。在任一亚组的OS玻璃体中均未观察到这种混浊。混浊最可能是由于尿素所致的玻璃体蛋白质变化的影响，因为在媒介物处理的眼睛中未观察到浑浊。另外，浑浊可能不是由于感染，因为尿素处理的眼睛中的玻璃体在剂量后3天开始清澈。
在两种剂量下均观察到毒性。从第3天起，眼底成像揭示在亚组2a和2b中在递送部位(鼻下玻璃体段)的严重视网膜折叠和血管出血OD。再次，OS未观察到这一发现。折叠和出血在第3天与第7天之间达到峰值，且然后开始消退。到第29天，存在视网膜折叠的一些小而持久的区域，但在眼底图像中不再检测到出血。鉴于其选择性定位和时程，视网膜折叠和出血两者都可能与尿素相关。代表性图像在图7A-7B中示出。
光学相干断层扫描
OCT成像显示在第3天亚组2a动物的右眼(OD)中的PVD。在亚组2b动物中，在第4天(AM和PM)、第7天和第14天OD观察到PVD。在其他成像时间点，在这些动物OD中未观察到PVD。然而，因为PVD是不可逆的，可假定在第2天之后的所有时间点PVD确实存在于两只动物OD中，此时在临床眼科检查期间在两只动物中OD都注意到PVD；最可能的是，在那些天的OCT成像未捕获表现出PVD的区域。两只动物在任何时间点都未在左眼(OS)中表现出PVD。
OCT图像还显示在眼底成像中观察到的视网膜折叠区域是视网膜主要在神经节细胞层脱离的区域，并且在较少的情况下，在内核细胞层处。视网膜脱离在第3天与第7天之间达到峰值，且然后开始消退，如通过视网膜重新附着所反映。在重新附着后在视网膜中观察到大量的超荧光细胞，最可能表明免疫细胞浸润。
代表性图像在图8A-8B中示出。
实施例6.玻璃体内施用的游离尿素的耐受性和剂量反应
此实施例提供在IVT注射到新西兰白兔的眼(非GLP)中后游离尿素的浓度降低(与实施例5相比)的耐受性的评价，以及确定在注射每种剂量强度后诱导PVD所需的时间。
以2.5、5、10、25和50mg/眼的剂量向五只雌性新西兰白兔给予单次施用尿素溶液IVT到双眼(OU)中。
在进行研究之前，每只动物进行眼科检查(裂隙灯活组织显微镜检查和间接检眼镜检查)。眼部发现
根据改良的McDonald-Shadduck评分系统进行评分。进行研究的接受标准是对于所有变量分数为“0”。
所有程序均使用无菌技术进行。用IM注射盐酸氯胺酮(50mg/kg用于成像，15-30mg/kg用于IVT注射)和甲苯噻嗪(5mg/kg)麻醉动物用于IVT注射、OCT和B型扫描成像。对于一只动物，由于延长的成像持续时间，在基线成像期间经由吸入的异氟烷(在1.5-2L/min氧气中1％-1.5％)延长麻醉。对于另一种动物，使用吸入的异氟烷(在1.5L/min氧气中2％)来将动物麻醉以用于IVT注射，因为所述动物在同一天早些时候进行了基线成像(其包括氯胺酮/甲苯噻嗪麻醉)。在外科手术之前，将1至2滴局部用盐酸丙美卡因麻醉剂(0.5％)施用于动物的眼睛。
在注射IVT之前，用优碘清洁眼睛，且然后用BSS冲洗。使用5/8英寸针，远离角膜缘3至4mm注射。一旦已经插入针，就注入尿素溶液或BSS。移除针，并用BSS冲洗眼睛。在给药后使动物立即恢复并在恢复期间监测。在恢复期间向眼睛施用三重抗生素眼用软膏。
研究设计总结在表17中。
表17
在第35(±4)天对动物实施安乐死，并且收集它们的眼睛(整个眼球)并进行组织病理学分析。
临床检查和观察
从第0天开始每天进行一般健康观察，并且在给药之前和终止之前记录体重。所有动物在研究过程中都经历了轻微的体重损失。体重损失可能是由于反复麻醉程、来自反复操作和束缚的应力或与测试物品相关的不适或这些因素的组合造成。未观察到药物和/或研究程序对一般动物健康的其他不利影响。
在第-3天或第0天(在测试/对照物品施用前的基线)、第1天、第4天、第7天或第8天、第14天、第21天和第35天进行眼科检查(裂隙灯活组织显微镜检查和间接检眼镜检查)。第4天检查在工作日开始时进行。第21天检查仅对第1、2和5组进行。根据改良的McDonald-Shadduck评分系统对眼部检查结果进行评分。在基线预筛选检查期间，所有动物均没有眼部异常。观察结果包括评估PVD的发展和时程。
在给药后直至21天的一些或所有临床眼科检查时间点，在所有动物中在一只或两只眼睛中观察到扩张的脉络膜和/或视网膜血管。扩张通常局限于注射区域。由于这一发现有时在双眼中注意到，包括仅注射BSS的左眼(OS)，这可能是对IVT注射程序的反应，而不是尿素的作用。
在尿素施用后的第二天观察到的第2组(10mg/眼尿素)动物的轻度结膜肿胀和第5组(2.5mg/眼尿素)动物的注射部位周围的轻度视网膜出血可能是由于IVT注射程序。
在测试物品施用后第二天在尿素处理的右眼(OD)中观察到的第4组(50mg/眼尿素)动物的后晶状体囊周围的环状不透明可能是由于高浓度的尿素对晶状体组织的刺激所致。
在任何检查中都未注意到PVD的证据。PVD难以经由临床眼科检查可视化；然而，OCT成像能够鉴别PVD病例(参见下文)。
眼底照相
在第-3天或第0天(在药物或BSS施用之前的基线)、第1天、第4天、第7天或第8天、第14天、第21天和第35天取得眼底的图像。第4天图像在工作日开始时取得。仅取得第1、2和5组的第21天图像。未对动物进行麻醉来进行成像。
在眼底图像中无法观察到眼部异常。代表性图像在图9中示出。
光学相干断层扫描
在第-3天或第0天(在测试/对照物品施用前的基线)、第1天、第4天、第7天或第8天、第14天、第21天和第35天进行OCT。第4天图像在工作日开始时取得。仅取得第1、2和5组的第21天图像。如上所述将动物麻醉。获得每只兔子每天总计8个图像。
在尿素施用后第二天开始的第3组和第4组动物的OCT图像中以及在尿素施用后7天的第2组动物中观察到视网膜变性、视网膜下液和视网膜炎的迹象。
如在表18中所述，OCT成像揭示了处理的眼(OD)中的PVD。作为玻璃体腔中的细胞组分的部分线观察到PVD，具有带有无细胞组分的下面的暗/黑色区域。代表性图像在图10A-10B中示出。
表18
较高的尿素浓度与PVD的早期发作和更强劲发展相关；然而，这些浓度也在处理的眼睛中产生视网膜变性、视网膜下液积聚和视网膜炎病状。较低的尿素浓度维持视网膜完整性，但与部分和不太强劲的PVD相关。在BSS处理的眼睛(OS)中未观察到PVD和视网膜病变，从而证实两种发现都可能与尿素相关。
所有动物在一些或所有时间点都在玻璃体液中表现出颗粒。通过注射的尿素可将颗粒从视网膜中拉出到玻璃体液中。在不同时间点在大多数动物中还观察到视神经乳头中的颗粒。视神经乳头中颗粒的观察结果可能是偶然的，因为即使在没有眼病变的情况下也经常观察到此类颗粒；然而，尿素的存在可能通过将颗粒进一步拉入此区域而在某种程度上加剧了这一发现。
B型扫描成像
在第-3天或第0天(测试/对照物品施用前的基线)和第35天取得B型扫描超声图像。第35天第4组动物的B型扫描图像显示右眼(OD)中PVD的证据，而不是左眼(OS)。在其他动物的B型扫描图像中，未检测到PVD。代表性图像在图11A-11B中示出。
组织病理学分析
收集的组织的组织病理学分析未发现尿素或BSS对眼睛的不利影响的证据。在组织病理学分析期间难以最终评估PVD，因为在组织处理和加工程序期间由于机械破坏而可能容易发生玻璃体液与视网膜的分离。
实施例7.脂质体构建体在后眼部空间中的定位和作用
此实施例提供在玻璃体内注射广泛范围的剂量浓度后立即观察脂质体构建体在后眼部空间中的物理位置，并且评价在处理后药物的局部作用。
在含有各种浓度的脂质体囊封的尿素和游离尿素的组合物的单次玻璃体内剂量(第0天)后观察8只雌性新西兰白兔1天或32天。脂质体是制剂2(58mol％DOPC，42mol％胆固醇)。实验设计总结于表19中。每组的N为1。
表19
*尿素浓度显示为每50μL产品(mg囊封的尿素，mg游离尿素)。
**用于眼睛内部测试物品停留的照相。还取得了代表性剂量前照片。
OCT：光学相干断层扫描；OD：右眼；OS：左眼
在研究的活体阶段，不存在明显的药物相关的临床观察结果、体重变化或异常食物摄入。定期眼科检查揭示玻璃体混浊(第1天、第7天和第32天，可能由药物贡献)，蛋白质性玻璃体闪辉(第32天)和玻璃体细胞(第32天)。这些眼科变化似乎通常是剂量依赖性的。
经由Bioptigen Envisu进行OCT扫描，经由MicronX捕获药物产品位置的高分辨率眼底图像，并且在32天的过程中用iPhone取得给药眼睛的数字图像。经由OCT、MicronX和数码相机获得所有动物的基线图像。对于组1-4，OS眼的处理仅允许动物保持侧卧，他们的眼睛朝上并允许药物产品沉降至眼睛后部。
在每个处理的眼睛中观察到PVD，具有更快的反应时间和更高的浓度剂量。通常通过照相、视网膜成像和OCT确认在整个4周的研究中在玻璃体腔内存在颗粒(混浊)。此外，在给药后，在研究过程中在所有剂量水平下通过OCT观察到局部、不规则形状的视网膜层(尤其是内层)。视网膜变化更可能发生在靠近玻璃体区域的地方，颗粒分布密集。
在第32天，在视网膜电图(ERG)中未观察到明显的异常光引发的电反应，除了具有最高脂质体和尿素浓度的眼(第8组)显示出较低的反应幅度(图12A-12B)，这可能表明光感受器功能下降。
与玻璃体细胞的眼科发现大致一致，组织病理学评价揭示后房内的炎症(轻度至重度，大多数为轻度)。对于所有研究动物的每只眼睛，检查整个眼球的至少两个完整的矢状切片。特别注意视网膜、视神经、玻璃体和前房。相关病变由急性炎症组成，主要由中性粒细胞组成，后房中(通常靠近室后部)散布游离的单核细胞、红细胞和纤维蛋白。浅表视网膜中也存在淤血、充血和一些炎症。在所有眼睛中都可见细小的玻璃体束，并且通常看起来与视网膜表面脱离。这些炎症变化的严重程度各不相同，并且似乎与尿素浓度没有直接关系。此外，第1天和第32天的发现之间差异很小。假定增加的尿素浓度与炎症严重程度相关将是合乎逻辑的，但这并不明显。这可能是由于非常小的组大小。在所有组的所有眼睛中发现玻璃体与视网膜的分离。然而，尚不清楚它们是否与药物有关，因为分离可能是正常组织加工的结果。
***
本发明具体实施方案的前述描述将充分地揭示本发明的一般特性，以使得其他人通过应用本领域中的知识，在无过度实验且不背离本发明的一般概念的情况下，可容易地针对各种应用对这类具体实施方案进行修改和/或改变。因此，基于本文呈现的教示和指导，此类改变和修改意图在所公开实施方案的等效物的含义和范围内。应了解，本文的措辞或术语是出于描述而非限制的目的，以使得本说明书的术语或措辞应由熟练的技术人员根据教义和指导进行解释。通过以下权利要求进一步描述本发明。

Claims (22)

1.一种药物组合物，所述药物组合物包含脂质体构建体和药学上可接受的载体，其中所述脂质体构建体包含小单层囊泡(SUV)的附聚物，其中所述SUV包含囊封在所述SUV内的尿素，其中所述SUV具有大于约1.05的比重、小于约220nm的z-平均直径以及小于约0.150的多分散性指数值(PdI)。
2.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述SUV具有小于约200nm的z-平均直径。
3.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述SUV包含片层，所述片层包含一种或多种磷脂且不含胆固醇。
4.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述SUV包含片层，所述片层包含一种或多种磷脂和1-9mol％的胆固醇。
5.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述SUV包含片层，所述片层包含一种或多种磷脂和42-69mol％的胆固醇。
6.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述SUV包含片层，所述片层包含以下中的一种或多种：胆固醇、二油酰基磷脂酰胆碱(DOPC)、二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二油酰基三甲基铵丙烷(DOTAP)、二棕榈酰基磷脂酰胆碱(DPPC)、二棕榈酰基磷脂酰甘油(DPPG)、二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)、磷脂酰胆碱(PC)和棕榈酰基油酰基磷脂酰胆碱(POPC)。
7.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述SUV包含片层，所述片层基本上由以下组成：
a.58mol％DPPC和42mol％胆固醇；
b.58mol％DOPC和42mol％胆固醇；
c.58mol％POPC和42mol％胆固醇；
d.29mol％DPPC、42mol％胆固醇和29mol％DPPG；
e.80mol％POPC和20mol％DOTAP；
f.67mol％DMPC和33mol％DMPG，或
g.33mol％DPPC、13mol％DSPC、32mol％DOPC、17mol％18:2PC、5mol％20:4PC。
8.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述SUV包含片层，所述片层基本上由58mol％DOPC和42mol％胆固醇组成。
9.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述SUV包含表面改性基团。
10.如权利要求9所述的药物组合物，其中所述表面改性基团是聚乙二醇(PEG)。
11.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述SUV具有至少20％的囊封效率。
12.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述SUV的填充丸粒中每mL填充丸粒包含至少约100mg囊封的尿素。
13.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述药学上可接受的载体包含尿素。
14.如权利要求1所述的药物组合物，所述药物组合物呈乳液或悬浮液的形式。
15.一种用于将尿素递送至玻璃体视网膜界面的方法，所述方法包括向受试者的玻璃体施用如权利要求1所述的药物组合物。
16.一种在患有或易患黄斑或视网膜的疾病或病症的受试者中诱导玻璃体后脱离(PVD)的方法，所述方法包括向所述受试者的玻璃体施用如权利要求1所述的药物组合物。
17.一种治疗受试者的糖尿病视网膜病变或玻璃体黄斑粘连(VMA)的方法，所述方法包括向所述受试者的玻璃体施用如权利要求1所述的药物组合物。
18.如权利要求15至17中任一项所述的方法，其中所述施用是经由玻璃体内注射进行。
19.如权利要求15至17中任一项所述的方法，其中所述受试者在施用所述药物组合物期间处于仰卧位。
20.如权利要求1所述的药物组合物诱导受试者的眼睛中的玻璃体后脱离(PVD)的用途。
21.如权利要求1所述的药物组合物用于将尿素递送至受试者眼睛的玻璃体视网膜界面的用途。
22.如权利要求1所述的药物组合物用于治疗糖尿病视网膜病变或玻璃体黄斑粘连(VMA)的用途。
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Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20200048305A1 (en) * 2018-08-10 2020-02-13 South Dakota Board Of Regents Glutathione-cholesterol derivatives as brain targeting agents
WO2020186313A1 (en) * 2019-03-20 2020-09-24 University Of Technology Sydney Liposomes and uses thereof
JP7384656B2 (ja) * 2019-12-20 2023-11-21 株式会社トプコン 眼科情報処理装置、眼科装置、眼科情報処理方法、及びプログラム
JP2022151437A (ja) * 2021-03-26 2022-10-07 均 石井 網膜炎治療薬。
FI20225982A1 (fi) * 2022-11-02 2024-05-03 Univ Helsinki Uudet formulaatiot

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5629344A (en) * 1993-09-09 1997-05-13 West Virginia University Research Corporation Urea opthalmic ointment and solution
CN1633308A (zh) * 2002-02-13 2005-06-29 玻璃体－视网膜技术公司 使用脲和脲衍生物治疗眼病
CN102573800A (zh) * 2009-08-10 2012-07-11 台湾微脂体股份有限公司 包含磷脂和胆固醇的眼部药物递送系统

Family Cites Families (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4394149A (en) * 1978-02-24 1983-07-19 Szoka Jr Francis C Plant nutriment compositions and method of their application
DE3542773A1 (de) 1985-12-04 1987-06-11 Roehm Pharma Gmbh Hautwirksame pharmaka mit liposomen als wirkstofftraeger
US4839175A (en) * 1986-07-28 1989-06-13 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced retention on mucosal tissue
US5811118A (en) 1987-05-22 1998-09-22 The Liposome Company, Inc. Methods of treatment using unilamellar liposomal arachidonic acid metabolite formulations
US5077057A (en) * 1989-04-05 1991-12-31 The Regents Of The University Of California Preparation of liposome and lipid complex compositions
AU633078B2 (en) * 1989-04-04 1993-01-21 Alcon Laboratories, Inc. The use of liposomes for the delivery of therapeutic agents to wounds, cuts and abrasions
US5843473A (en) * 1989-10-20 1998-12-01 Sequus Pharmaceuticals, Inc. Method of treatment of infected tissues
US5885260A (en) * 1991-05-30 1999-03-23 Mehl, Sr.; Thomas L. Freeze-dried liposome delivery system for application of skin treatment agents
DE4341472A1 (de) * 1993-12-02 1995-06-08 Schering Ag Verfahren zur Erhöhung der Stabilität von hydrophile Wirkstoffe enthaltenden Liposomensuspensionen
MXPA01008729A (es) 1999-03-02 2003-06-24 Vitreo Retinal Technologies In Agentes para administracion intravitrea para tratar o prevenir desordenes del ojo.
US20030199574A1 (en) * 2000-03-02 2003-10-23 Vitreo-Retinal Technologies, Inc. Treatment of ophthalmic disorders using urea and urea derivatives
US20080171795A1 (en) * 2005-03-21 2008-07-17 Life-Care Innovations Pvt. Ltd. Novel Inter and Intra Multilamellar Vesicular Composition
JP5514098B2 (ja) 2008-02-29 2014-06-04 公益財団法人名古屋産業科学研究所 後眼部到達用リポソーム及び後眼部疾患用医薬組成物
CN105106934A (zh) 2009-11-10 2015-12-02 急速制药公司 用于抑制细胞粘附至rgd结合位点或引导诊断剂或治疗剂至rgd结合位点的组合物和方法
EP2394640A1 (en) 2010-05-21 2011-12-14 MediGene AG Improved liposomal formulations of lipophilic compounds
EP2462921A1 (en) * 2010-11-11 2012-06-13 Novaliq GmbH Liquid pharmaceutical compositions for the treatment of a posterior eye disease
EP2654779B1 (en) * 2010-12-23 2018-02-28 Ludwig Institute for Cancer Research, Ltd. Liposomal formulation of nonglycosidic ceramides and uses thereof
CA2853685C (en) 2011-11-04 2019-09-03 Nitto Denko Corporation Single use system for sterilely producing lipid-nucleic acid particles
US20150038464A1 (en) * 2012-02-24 2015-02-05 The United States Government As Represented By The Department Of Veterans Affairs Methods of increasing light responsiveness in a subject with retinal degeneration
CA2903255C (en) 2013-03-13 2018-08-28 Mallinckrodt Llc Modified docetaxel liposome formulations
EP3265063A4 (en) * 2015-03-03 2018-11-07 Cureport, Inc. Dual loaded liposomal pharmaceutical formulations
US20180161291A1 (en) * 2015-06-05 2018-06-14 Kato Pharmaceuticals, Inc. Extended release urea compositions

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5629344A (en) * 1993-09-09 1997-05-13 West Virginia University Research Corporation Urea opthalmic ointment and solution
CN1633308A (zh) * 2002-02-13 2005-06-29 玻璃体－视网膜技术公司 使用脲和脲衍生物治疗眼病
CN102573800A (zh) * 2009-08-10 2012-07-11 台湾微脂体股份有限公司 包含磷脂和胆固醇的眼部药物递送系统
CN105148278A (zh) * 2009-08-10 2015-12-16 台湾微脂体股份有限公司 包含磷脂和胆固醇的眼部药物递送系统

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