KR102509892B1 - 리포솜 작제물을 사용한 황반 및 망막의 세포에의 우레아의 전달 - Google Patents

리포솜 작제물을 사용한 황반 및 망막의 세포에의 우레아의 전달 Download PDF

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Abstract

안구의 유리체망막 경계면에 우레아를 전달하기 위한 리포솜 작제물이 제공된다. 리포솜 작제물은 소형 단층 소포(SUV)의 응집체이고, 유리체 전반에 걸쳐 분산되기보다는 안구의 뒤에 가라앉도록, 유리체액보다 더 큰 밀도를 갖는다.

Description

리포솜 작제물을 사용한 황반 및 망막의 세포에의 우레아의 전달
관련 출원에 대한 상호 참조문헌
본 출원은 2016년 8월 18일자로 출원된 미국 가출원 제62/376,862호의 이익을 주장하며, 이 기초출원의 전체 내용은 전문이 모든 목적을 위하여 본 명세서에서 참고로 포함된다.
안구(eye)는 구체(globe) 안에서 그리고 둘레에서 혈액 및 다른 유체가 일정하게 대량으로 순환하는 매우 활동적인 장기이다. 망막은 눈의 뒤편에 막을 형성하고(line) 빛을 감지하는 간상체(rod) 및 추상체(cone)로 불리는 특수한 광수용체 세포를 함유하는 신경층이다. 망막은 광 신호를 시신경을 통해 뇌의 시각 피질로 보낸다. 원추 세포는 황반으로 불리는 망막의 작은 구역에 가장 집중되어 있다. 맥락막은 망막과 안구의 백색 외층(white outer layer), 공막(sclera) 사이의 고도의 혈관 구조이다. 맥락막은 망막에 대한 산소 및 영양소의 공급원뿐만 아니라 전방(anterior chamber)으로부터 수양액(aqueous humor)의 배수 시스템(drainage system) 둘 모두로서 작용한다. 안구는 유리체(vitreous 또는 vitreous body)로 불리는 겔-유사 물질로 채워져 있다. 유리체는 상당한 농도의 히알루로난 및 콜라겐, 플러스 소량의 다양한 다른 단백질과 함께, 대부분 물인 둥근-형상의 구조이다. 유리체의 후방부는 망막과 직접 접촉한다. 섬유소 가닥들의 네트워크는 망막으로부터 연장되고, 유리체 내로 삽입되어 이를 망막에 부착시킨다[문헌[Sebag, Graefe's Arch. Clin . Exp . Ophthalmol . 225:89-93 (1987)] 참조].
망막의 병인에 대한 현재 승인된 약물의 표준 투여는 26 내지 30 게이지 니들을 이용하여 100 마이크로리터 용량의 수정체 내 주사로서, 이는 안구의 중간층의 구조, 즉, 편평부(pars plana)를 통해 전달되고 유리체의 중앙 부분에서 방출된다. 약동학적 분석에 의해, 유리체 내로 주사된 약물이 수 시간 내에 안구의 외부 조직으로 소멸되고, 전체적으로, 24시간 후에 제거된다는 것이 규명되었다. 통상적인 100 마이크로리터 주사는 작은 농도가 고려되는 주요한 영역, 즉, 황반으로 이동하기 전에, 50 대 1의 비율로 희석된다.
안구로 전달될 수 있는 약물의 부피가 장기의 크기에 의해 제한되고 안과용 제형이 유리체 내로 도입된 직후에 비교적 빠르게 소멸되기 때문에, 황반 및 인접한 조직으로의 치료 용량의 약물을 전달하고 유지시키는 것은 안과용 약물 개발자 및 임상의에게 큰 도전이다. 만성 질병, 예를 들어, 예컨대, 당뇨병성 망막증의 치료를 위해 연장된 기간에 걸쳐 안구의 뒤쪽으로 치료학적 유효 용량의, 특히, 고도로 수용성인 활성제, 예를 들어, 우레아를 전달할 수 있는 안과용 약물 제형이 요구되고 있다.
본 발명의 실시형태의 주요 양태들 중 일부는 하기에서 요약된다. 추가적인 양태는 본 개시내용의 본 발명의 실시형태의 상세한 설명, 실시예, 도면, 및 청구범위 부문에 기술된다. 본 개시내용의 각 부문에서의 설명은 다른 부문과 함께 읽도록 의도된다. 또한, 본 개시내용의 각 부문에 기술된 다양한 실시형태들은 다양한 상이한 방식으로 결합될 수 있으며, 모든 이러한 조합은 본 발명의 범위 내에 속하도록 의도된다.
본 개시내용은 리포솜 작제물 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물로서, 리포솜 작제물은 소형 단층 소포(SUV)의 응집체를 포함하며, SUV는 SUV 내에 캡슐화된 우레아를 포함하며, SUV는 약 1.05보다 큰 비중, 약 220㎚ 미만의 z-평균 직경, 및 약 0.30 미만의 다분산 지수값(PdI)을 갖는 약제학적 조성물을 제공한다. 일부 실시형태에서, z-평균 직경은 약 200㎚ 미만이다. 약제학적으로 허용되는 담체는 우레아를 선택적으로 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, 약제학적 조성물은 에멀션 또는 현탁액의 형태를 갖는다.
SUV는 중심 구획을 둘러싸는 지질 이중층(즉, 라멜라)을 갖는다. 일 양태에서, 라멜라는 하나 이상의 인지질을 포함하고, 콜레스테롤을 포함하지 않는다. 다른 양태에서, 라멜라는 (i) 하나 이상의 인지질 및 (ii) 약 70 ㏖% 미만 콜레스테롤, 또는 1 내지 9 ㏖% 콜레스테롤, 또는 34 내지 69 ㏖% 콜레스테롤, 또는 42 내지 69 ㏖% 콜레스테롤, 또는 10 내지 20 ㏖% 콜레스테롤, 또는 20 내지 30 ㏖% 콜레스테롤, 또는 30 내지 40 ㏖% 콜레스테롤, 또는 40 내지 50 ㏖% 콜레스테롤, 또는 50 내지 60 ㏖% 콜레스테롤, 또는 60 내지 69 ㏖% 콜레스테롤을 포함한다. 특정 실시형태에서, 라멜라는 콜레스테롤, 다이올레오일 포스파티딜콜린(DOPC), 다이올레일 포스파티딜에탄올아민(DOPE), 다이올레오일 트라이메틸암모늄 프로판(DOTAP), 다이팔미토일 포스파티딜콜린(DPPC), 다이팔미토일 포스파티딜글리세롤(DPPG), 다이스테아로일 포스파티딜콜린(DSPC), 포스파티딜콜린(PC) 및 팔미토일 올레오일 포스파티딜콜린(POPC) 중 하나 이상을 포함한다.
특정 실시형태에서, 라멜라는 58 ㏖% DPPC 및 42 ㏖% 콜레스테롤; 58 ㏖% DOPC 및 42 ㏖% 콜레스테롤; 58 ㏖% POPC 및 42 ㏖% 콜레스테롤; 29 ㏖% DPPC, 42 ㏖% 콜레스테롤, 및 29 ㏖% DPPG; 80 ㏖% POPC 및 20 ㏖% DOTAP; 67 ㏖% DMPC 및 33 ㏖% DMPG; 또는 33 ㏖% DPPC, 13 ㏖% DSPC, 32 ㏖% DOPC, 17 ㏖% 18:2 PC, 5 ㏖% 20:4 PC로 필수적으로(essentially) 이루어진다. 바람직한 실시형태에서, 라멜라는 58 ㏖% DOPC 및 42 ㏖% 콜레스테롤로 필수적으로 이루어진다.
특정 양태에서, SUV는 표면 개질기, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함한다.
SUV는 적어도 약 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 또는 90%의 캡슐화 효율을 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, SUV는 적어도 약 20%의 캡슐화 효율을 갖는다.
일부 실시형태에서, SUV의 패킹된 펠릿은 패킹된 펠릿 1 밀리리터당 적어도 약 0.1㎎, 및 바람직하게는, 적어도 약 0.2㎎, 0.25㎎, 0.3㎎, 0.35㎎, 0.4㎎, 0.45㎎, 또는 0.5 ㎎의 캡슐화된 우레아를 포함한다. 캡슐화된 우레아의 양은 전달을 위한 요망되는 투여량에 따를 것이다.
또, 유리체망막 경계면에 우레아를 전달하는 방법으로서, 대상체의 유리체에 본 발명의 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 방법이 제공된다.
일 실시형태는 후방 유리체 박리(posterior vitreous detachment: PVD)를 유도시킴으로써 치료되거나 예방될 수 있는 안구의 질병 또는 장애에 걸리거나 걸리기 쉬운 대상체에서 후방 유리체 박리(PVD)를 유도시키는 방법으로서, 대상체의 유리체에 본 발명의 리포솜 작제물을 포함하는 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다. 특정 실시형태에서, 질병 또는 장애는 예를 들어, 당뇨병성 망막증(diabetic retinopathy) 또는 수정체황반 부착(vitreomacular adhesion: VMA)일 수 있다.
또한, 대상체에서 당뇨병성 망막증 또는 VMA를 치료하는 방법으로서, 대상체의 유리체에 본 발명의 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
본 발명의 방법은 수정체내 주사에 의해 본 발명의 약제학적 조성물의 투여를 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 수정체내 주사는 부분 플라나(pars plana)를 통한 것이다. 본 발명의 방법은 대상체가 앙와위(supine position)로 존재하는 투여를 포함할 수 있다.
특정 실시형태는 리포솜 작제물의 방출 특징을 제공한다. 일부 양태에서, 우레아의 적어도 80%는 투여 후 24시간 내에 리포솜 작제물로부터 방출된다. 일부 양태에서, 우레아의 적어도 80%는 투여 후 8시간 내에 리포솜 작제물로부터 방출된다. 일부 실시형태에서, 우레아의 적어도 80%는 투여 후 4시간 내에 리포솜 작제물로부터 방출된다.
본 발명의 실시형태는 후방 유리체 박리(PVD)를 유도하거나 PVD를 유도함으로써 치료되거나 예방될 수 있는 안구의 질병 또는 장애를 치료하거나 예방하기 위한, 본 발명의 리포솜 작제물 또는 조성물의 용도를 포함한다. 본 발명의 일 실시형태는 당뇨병성 망막증 또는 수정체황반 부착(VMA)을 치료하거나 예방하기 위한 본 발명의 리포솜 작제물을 포함하는 약제학적 조성물의 용도를 포함한다.
추가적인 양태는 본 발명의 리포솜 작제물 또는 약제학적 조성물을 포함하는 키트이다.
도 1A 내지 도 1E는 제형 1(본 명세서에 개시된 바와 같음)(도 1a), 제형 3(본 명세서에 개시된 바와 같음)(도 1b), 제형 8(본 명세서에 개시된 바와 같음)(도 1c), 제형 11(본 명세서에 개시된 바와 같음)(도 1d), 또는 제형 12(본 명세서에 개시된 바와 같음)(도 1e)로 이루어진 손상되지 않은 리포솜 작제물 및 용해된 리포솜 작제물로부터의 24시간 기간에 걸친 카복시플루오레세인 누출을 도시한 것이다. 제형은 표 1에 기술되어 있다.
도 2a 내지 도 2d는 1x PBS(도 2a, 도 2b) 또는 토끼 유리체액(도 2c, 도 2d)에서 우레아-캡슐화된 리포솜 작제물의 24시간 기간에 걸친 안정성을 도시한 것이다. 그래프에서, 제형 #1, #2, #3, #4, 및 #5는 각각 표 1에 기술된 제형 1, 2, 3, 12, 및 14에 해당한다.
도 3a 내지 도 3c는 (표 1에 기술된) 제형 2로부터 제조되고 4℃(도 3a), 실온(도 3b), 또는 37℃(도 3c)에서 저장된 우레아-캡슐화된 리포솜 작제물의 7일 기간에 걸친 안정성을 도시한 것이다.
도 4는 캡슐화된 우레아를 포함하는 리포솜 작제물의 생산을 위한 역상 증발 방법의 순서도를 도시한 것이다.
도 5는 4개의 리포솜 작제물 배취에 대한 시험관내 우레아 배출 데이터를 도시한 것이다.
도 6a 및 도 6b는 100㎕ 용량(40% 리포솜 부피/60% 우레아 완충제 부피) 중 캡슐화된 우레아의 양과 DOPC(도 6a) 또는 콜레스테롤(도 6b)의 농도 간의 관계를 도시한 것이다.
도 7a 및 도 7b는 투약 직후(0일차) 및 그후 명시된 시점에서의 그룹 2a 동물의 대표적인 기저부 사진을 도시한 것이다. 좌측 안구(OS)는 평형 염 용액의 유리체내 주사를 수용하였으며, 우측 안구(OD)는 용액 중 96㎎ 우레아의 유리체내 주사를 수용하였다. 우측 안구의 맥관 구조의 헤이즈 외관(Hazy appearance)은 약물 제품의 존재로 기인한 것이다. 4, 7 및 14일차의 OD 패널에서의 화살표는 약물 제품을 지시하는 것이다.
도 8a 및 도 8b는 명시된 투약 후 시점에 그룹 2b 동물의 대표적인 광 간섭성 단층촬영(optical coherence tomography: OCT) 이미지를 도시한 것이다. 상응하는 기저부 이미지는 각 서브-패널의 좌측에 도시되어 있으며, 녹색선은 OCT 이미지의 위치를 지시하는 것이다. 좌측 안구(OS)는 평형 염 용액의 유리체내 주사를 수용하였으며, 우측 안구(OD)는 용액 중 192㎎ 우레아의 유리체내 주사를 수용하였다.
도 9는 우레아 용액의 OD 주사 후 1일 및 35일차에 그룹 3(25㎎ 우레아), 그룹 4(50㎎ 우레아), 및 그룹 5(2.5㎎ 우레아) 동물의 대표적인 기저부 사진을 도시한 것이다.
도 10a 및 도 10a는 명시된 시점에 그룹 3(25㎎ 우레아)(도 10a) 및 그룹 4(50㎎ 우레아)(도 10b) 동물의 대표적인 OCT 이미지를 도시한 것이다. 상응하는 기저부 이미지는 각 서브-패널의 좌측에 도시되어 있다. PVD의 몇몇 예는 화살표로 지시되어 있다.
도 11a 및 도 11b는 우레아 용액의 OD 주사 전 및 주사 후 35일차에 그룹 3(25㎎ 우레아)(도 11a) 및 그룹 4(50㎎ 우레아)(도 11b) 동물의 대표적인 B-스캔 이미지를 도시한 것이다.
도 12a 및 도 12b는 32일차 망막전위도(electroretinograph)를 도시한 것이다. 도 12a는 청색광에 노출된, 어두움-적응된 대조군(상부 패널) 및 그룹 8(하부 패널) 동물의 그래프를 도시한 것이다. 도 12b는 적색광에 노출된, 어두움-적응된 대조군(상부 패널) 및 그룹 8(하부 패널) 동물의 그래프를 도시한 것이다.
본 발명의 실시형태는 망막 및 황반에 우레아의 전달을 위한 신규한 제형을 제공한다. 본 발명의 실시형태의 리포솜 작제물은 안구의 질병 또는 장애를 치료, 예방, 진단, 및/또는 모니터링하기 위해 안구 내의 타깃 영역에 우레아를 선택적이고 특이적으로 방출할 수 있다.
본 발명의 실시형태의 실시는 달리 명시하지 않는 한, 당해 분야의 기술 내에 속하는, 제약학, 제형 과학, 단백질 과학, 세포 생물학, 세포 배양, 분자 생물학, 형질전환 생물학, 미생물학, 재조합 DNA, 및 면역학의 보편적인 기술을 이용한다. 이러한 기술은 문헌에서 충분히 설명되어 있다[예를 들어, Handbook of Pharmaceutical Excipients (7th ed., Rowe et al. eds., 2012); Martin's Physical Pharmacy and Pharmaceutical Sciences (6th ed., Sinko, 2010); Remington: The Science and Practice of Pharmacy (21st ed., Univ. Sci. Philadelphia ed., 2005); Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al. eds., 2016); Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4th ed., Green and Sambrook eds., 2012); Lewin's Genes XI (11th ed., Krebs et al. eds., 2012); DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I and II (2d ed., Glover and Hames eds., 1995); Protein Engineering: A Practical Approach (1st ed., Rees et al. eds. 1993); Culture Of Animal Cells (6th ed. Freshney, 2010); Antibodies: A Laboratory Manual (2nd ed., Greenfield ed., 2013); Antibody Engineering (2d ed., Borrebaeck ed., 1995) 참조].
본 발명의 실시형태를 더욱 용이하게 이해하기 위하여, 먼저 특정 용어들이 정의된다. 본 개시내용 전반에 걸쳐 추가적인 정의들이 기술된다. 달리 규정하지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명이 관련되어 있는 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 예를 들어, 문헌[Dictionary of Pharmaceutical Medicine (3rd ed. Nahler and Mollet eds., 2013); The Dictionary of Cell and Molecular Biology (5th ed. J.M. Lackie ed., 2013), Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology (2d ed. R. Cammack et al. eds., 2008), 및 The Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology (2d ed. P-S. Juo, 2002)]은 당업자에게 본 명세서에서 사용되는 일부 용어들의 일반적인 정의를 제공할 수 있다.
본 명세서에 제공된 임의의 제목(heading)은 본 발명의 다양한 양태 또는 실시형태에 대한 제한이 아니며, 이는 명세서를 전체적으로 참조하여 얻을 수 있다. 이에 따라, 바로 아래에 규정된 용어들은 본 명세서 전체를 참조하여 더욱 충분히 규정된다.
I. 정의
본 명세서 및 첨부된 청구항에서 사용되는 단수 형태는 문맥이 달리 명확하게 기술하지 않는 한, 복수의 지시대상을 포함한다. 단수 용어뿐만 아니라, 용어 "하나 이상" 및 "적어도 하나"는 교대로 사용될 수 있다.
또한, "및/또는"은 다른 것과 함께 또는 이의 없이 2개의 특정된 특징 또는 성분들 각각의 특정 개시내용으로서 취해질 수 있다. 이에 따라, "A 및/또는 B"와 같은 구에서 사용되는 용어 "및/또는"은 A 및 B, A 또는 B, A(단독), 및 B(단독)를 포함하는 것으로 의도된다. 마찬가지로, "A, B, 및/또는 C"와 같은 구에서 사용되는 용어 "및/또는"은 A, B, 및 C; A, B, 또는 C; A 또는 B; A 또는 C; B 또는 C; A 및 B; A 및 C; B 및 C; A(단독); B(단독); 및 C(단독)를 포함하는 것으로 의도된다.
실시형태가 언어 "포함하는(comprising)"과 함께 기술될 때, "~로 이루어진(consisting of)" 및/또는 "~로 필수적으로 이루어진(consisting essentially of)"의 용어에 기술된 달리 유사한 실시형태가 포함된다.
단위, 접두사 및 기호는 국제 단위 체계(
Figure 112019022475453-pct00001
International de Unites: SI) 승인형으로 표현된다. 수치 범위는 소정 범위를 규정하는 수치를 포함하며, 본 명세서에 제공된 임의의 개개 수치는 본 명세서에 제공된 다른 개개 수치를 포함하는 범위에 대한 종결점으로서 역할을 할 수 있다. 예를 들어, 1, 2, 3, 8, 9, 및 10과 같은 한 세트의 수치는 또한, 1 내지 10, 1 내지 8, 3 내지 9 등의 범위의 개시내용이다. 달리 명시하지 않는 한, 아미노산 서열은 아미노에서 카복시 방향으로 왼쪽에서 오른쪽으로 쓰여지며, 핵산 서열은 5'에서 3' 방향으로 왼쪽에서 오른쪽으로 쓰여진다. 아미노산은 이의 통상적으로 공지된 3문자 기호에 의해 또는 IUPAC-IUB 생화학 명명 위원회(IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission)에 의해 권고된 1문자 기호에 의해 언급된다. 마찬가지로, 뉴클레오타이드는 이의 통상적으로 허용되는 단일 문자 코드에 의해 언급된다.
"리포솜"은 중앙 구획을 둘러싸고 있는 지질 이중층을 갖는 구형 소포이다. 리포솜은 지질 이중층의 구조를 기초로 하여 분류될 수 있다. 단층 소포는 중앙 구획을 둘러싸는 하나의 이중층을 갖는 반면, 다층 소포(MLV)는 중앙 구획을 둘러싸는 하나 초과의 이중층을 갖는다. 리포솜은 또한, 크기를 기초로 하여 분류될 수 있다. 소형 단층 소포(SUV)는 통상적으로, 약 20 내지 100㎚의 직경을 가지며, 대형 단층 소포(LUV)는 통상적으로 100㎚ 초과의 직경을 가지며, 거대 단층 소포(GUV)는 통상적으로, 약 250㎚ 초과의 직경을 갖는다. MLV는 통상적으로, 약 100 내지 500㎚의 직경을 갖는다.
"캡슐화 효율"은 하기 방정식에 의해 계산된, 상청액에서의 활성제에 대한, 리포솜의 세척된 펠릿 내에 갇힌 활성제의 백분율이다:
캡슐화% = 100 × [(캡슐화된 활성제의 양)/(로딩 용액 중 활성제의 초기 양)]
캡슐화 효율은 무게, 부피, 또는 농도를 기초로 하여 계산될 수 있다.
"캡슐화 퍼센트(percent encapsulated)"는 100 × [(캡슐화된 활성제의 양)/(활성제의 총량)].
본 명세서에서 사용되는 "리포솜 작제물"은 SUV의 응집체를 포함하는 입자이다. 본 발명의 리포솜 작제물은 리포솜 작제물로 자가-조립하는 개개 SUV이며, 이는 안구의 유리체보다 더욱 조밀하다. 이론으로 제한하고자 하는 것은 아니지만, 개개 SUV는 전하-공유에 의해 특징되는 분자간 힘에 의해 함께 유지된다. 예상치 못하게, 리포솜 작제물은 이러한 것이 유리체 전반에 걸쳐 전달 동안 분산되거나 파괴되지 않도록, 투여 직후에 이의 구형, 겔-유사 구조를 유지하지만, 대신에 유리체를 통해 침투하고 망막을 덮을 수 있다. 리포솜 작제물은 응집을 향상시키기 위해 에멀션화제 또는 결합제를 포함할 수 있다. 리포솜 작제물은 pH의 변화와 같은 특정 조건 하에서 가수분해될 수 있는, SUV들 간의 직접 또는 간접 2차 결합을 촉진시키는 표면 기(예를 들어, PEG)를 포함할 수 있다.
입자 크기는 산란광의 강도를 기초로 한 평균 직경인 "z-평균 직경"으로 표현될 수 있다. "다분산 지수(PdI)"는 입자 크기 분포의 폭의 추정치이다. 입자 크기 분포는 또한, 샘플에서 입자의 질량 백분율을 기초로 한, "D-값"으로 표현될 수 있다. "D90"은 샘플 질량의 90%가 더 작은 입자로 이루어진 직경이다. "D50"은 샘플 질량의 50%가 더 작은 입자로 이루어진 직경이다. "D10"은 샘플 질량의 10%가 더 작은 입자로 이루어진 직경이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "유리체," "유리체 바디," "유리액(vitreous humor)," 및 "유리체액(vitreous fluid)"은 수정체 뒤의, 안구(eyeball)의 공동의 대략 4/5를 차지하는 젤라틴성 물질을 지칭하기 위해 교대로 사용된다. 유리체의 후방부는 "유리체망막 경계면"으로 불리는 영역에서 망막과 직접 접촉한다. 리포솜 작제물의 밀도는 유리체망막 경계면으로의 우레아의 타깃화된 전달을 가능하게 하고, 우레아가 안구의 다른 영역에 악영향을 미칠 가능성을 감소시킨다.
"단리된(isolated)" 분자, 즉, 단리된 폴리펩타이드 또는 단리된 폴리뉴클레오타이드는 정제된 것을 포함하는, 자연계에서 발견되지 않은 형태이다. 일부 실시형태에서, 단리된 분자는 실질적으로 순수하다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "실질적으로 순수한"은 75% 초과, 바람직하게는, 80% 또는 90% 초과, 및 가장 바람직하게는, 95% 초과의 순도를 지칭한다.
"표지"는 "표지된" 분자를 생성시키기 위해, 분자에 직접적으로 또는 간접적으로 접합될 수 있는 검출 가능한 화합물이다. 표지는 그 자체로 검출 가능할 수 있거나(예를 들어, 방사성 동위원소 표지 또는 형광 표지), 검출 가능한 기질 화합물 또는 조성물의 화학적 변형을 촉매화 할 수 있다(예를 들어, 효소 표지).
용어 "억제하다," "차단하다," 및 "저해하다"는 교대로 사용되고, 활성의 완전 차단을 포함하는, 생물학적 활성의 임의의 통계학적으로 유의미한 감소를 지칭한다. 예를 들어, "억제"는 생물학적 활성의 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%의 감소를 지칭할 수 있다.
용어 "활성제," "치료제," 및 "약물"은 질병의 예방, 진단, 완화, 치료, 또는 치유에서 사용되는, 식품 이외의 임의의 물질을 지칭하기 위해 교대로 사용된다. 활성제는 보호제 및 진단제를 포함한다. 활성제는 문헌[The Merck Index, 15th Edition (2013); Pei-Show Juo, Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, (2001); U.S. Pharmacopeia Dictionary of USAN & International Drug Names (2014); 및 Physician's Desk Reference, 70th Edition (2016)] 중 적어도 하나에 개시된 임의의 물질을 포함할 수 있다(또한, 문헌[Stedman's Medical Dictionary, 28th Edition (2013)] 참조).
용어 "약제학적 조성물"은 활성제가 효과적인 형태로 존재하고, 즉, 생물학적으로 활성적이고, 환경에서 그리고 치료 효과를 일으키는 농도에서 방출될 수 있도록 제형화되고, 조성물이 투여되는 대상체에 대해 허용 가능하지 않게 독성을 나타내는 추가적인 성분을 함유하지 않는 제조물을 지칭한다. 이러한 조성물은 멸균일 수 있고, 약제학적으로 허용되는 담체, 예를 들어, 생리 식염수를 포함할 수 있다. 적합한 약제학적 조성물은 완충제(예를 들어, 아세테이트, 포스페이트 또는 시트레이트 완충제), 계면활성제(예를 들어, 폴리소르베이트), 안정화제(예를 들어, 인간 알부민), 보존제(예를 들어, 벤질 알코올), 생체 이용률을 향상시키기 위한 흡수 증진제, 및/또는 다른 보편적인 가용화제 또는 분산제 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
"대상체" 또는 "개체" 또는 "동물" 또는 "환자" 또는 "포유동물"은 진단, 예후 또는 치료가 요망되는, 임의의 대상체, 특히, 포유류 대상체를 의미한다. 포유류 대상체는 예를 들어, 인간, 비-인간 영장류, 개, 고양이, 돼지, 소, 말, 랫트 및 마우스를 포함하는 설치류, 토끼 등을 포함하는, 인간, 애완 동물, 농장 동물, 스포츠 동물 및 실험실 동물을 포함한다.
활성제의 "유효량"은 상세하게 기술된 목적을 수행하기에 충분한 양이다. "유효량"은 기술된 목적과 관련하여, 경험적으로 및 일상적인 방식으로 결정될 수 있다.
"치료하는" 또는 "치료" 또는 "치료하기 위한" 또는 "완화시키는" 또는 "완화시키기 위한"과 같은 용어는 진단된 병리학적 질환 또는 장애의 증상을 치료, 감속, 줄임, 및/또는 진행을 정지시키는 치료학적 수단을 지칭한다. 이에 따라, 치료를 필요로 하는 대상은 이미 장애를 갖는 대상을 포함한다. 특정 실시형태에서, 대상체는 환자가 질병 또는 장애와 관련된 증상의 완전, 일부, 또는 일시적 완화 또는 제거를 나타내는 경우에 본 명세서에 제공된 방법에 따라 안구의 질병 또는 장애에 대해 성공적으로 "치료"된다.
"예방하다" 또는 "예방"은 타깃화된 병인학적 질환 또는 장애를 예방하고/하거나 이의 발달을 늦추는 예방적(prophylactic, preventative) 수단을 지칭한다. 이에 따라, 예방을 필요로 하는 대상은 장애에 걸리기 쉽거나 장애에 민감한 대상을 포함한다. 특정 실시형태에서, 안구의 질병 또는 장애는 본 명세서에 제공된 방법에 따라, 환자가 예를 들어, 본 발명의 방법으로 수행되지 않은 환자보다, 더 적은 질병 또는 장애와 관련된 심각한 증상, 또는 질병 또는 장애와 관련된 증상의 후속 발병을 일시적으로 또는 영구적으로 발달하는 경우에 성공적으로 예방된다.
II. 리포솜 작제물 ( Liposome Constructs)
본 발명의 실시형태의 리포솜 작제물의 하위단위인 리포솜은 천연 또는 합성 기원의 이중층에 의해 둘러싸인 코어로 이루어진 SUV이다. 리포솜은 하나의 인지질 또는 하나 초과의 인지질의 혼합물을 포함할 수 있다. 인지질은 상이한 사슬 길이, 상이한 전하를 가질 수 있고, 포화되거나 불포화될 수 있다. 콜레스테롤의 도입은 막의 강성을 개선시킴으로써 리포솜의 안정성을 향상시킨다. 일부 실시형태에서, 리포솜은 주요 성분으로서 콜레스테롤 및 지질-접합된 친수성 폴리머를 사용할 수 있다. 성분들의 선택 및 이의 상대적 비율은 리포솜의 구조적 안정성, 이의 방출 시간, 캡슐화된 카고(cargo)(즉, 우레아)의 양, 및 캡슐화를 위해 사용되는 공정에 영향을 미친다.
특히, 리포솜 하위단위는 콜레스테롤, 다이아라키도노일 포스파티딜콜린(DAPC), 다이베헤노일 포스파티딜콜린(DBPC), 다이라우로일 포스파티딜콜린, (DLPC), 다이미리스토일 포스파티드산(DMPA), 다이미리스토일 포스파티딜콜린(DMPC), 다이미리스토일 포스파티딜글리세롤(DMPG), 다이미리스토일 포스파티딜이노시톨(DMPI), 다이미리스토일 포스파티딜세린(DMPS), 다이올레오일 포스파티드산(DOPA), 다이올레오일 포스파티딜콜린(DOPC), 다이올레일 포스파티딜에탄올아민(DOPE), 다이올레오일 포스파티딜글리세롤(DOPG), 다이올레오일 포스파티딜이노시톨(DOPI), 다이올레오일 포스파티딜세린(DOPS), 다이올레오일 트라이메틸암모늄 프로판(DOTAP), 다이팔미토일 포스파티드산(DPPA), 다이팔미토일 포스파티딜콜린(DPPC), 다이팔미토일 포스파티딜콜린-포스파티딜콜린(DPPC-PC), 다이팔미토일 포스파티딜에탄올아민(DPPE), 다이팔미토일 포스파티딜글리세롤(DPPG), 다이팔미토일 포스파티딜이노시톨(DPPI), 다이팔미토일 포스파티딜세린(DPPS), 다이스테아로일 포스파티드산(DSPA), 다이스테아로일 포스파티딜콜린(DSPC), 모노시알로간글리오시드, 다이스테아로일 포스파티딜에탄올아민(DSPE), 다이스테아로일 포스파티딜이노시톨(DSPI), 다이스테아로일 포스파티딜세린(DSPS), 달걀 포스파티딜콜린(EPC), 수소화된 달걀 포스파티딜콜린(HEPC), 수소화된 포스파티딜콜린(HPC), 수소화된 대두 포스파티딜콜린(HSPC), 모노올레오일 포스파티딜에탄올아민(MOPE), 미리스토일 팔미토일 포스파티딜콜린(MPPC), 포스파티드산(PA), 포스파티딜콜린(PC), 포스파티딜에탄올아민(PE), 포스파티딜글리세롤(PG), 포스파티딜인시톨(PI), 팔미토일 올레오일 포스파티딜콜린(POPC), 포스파티딜세린(PS), 팔미토일 스테아로일 포스파티딜콜린(PSPC), 팔미토일 스테아로일 포스파티딜글리세롤(PSPG), 대두 포스파티딜콜린(SPC), 스핀고미엘린(SPM), 및/또는 상기의 폴리에틸렌 글리콜(PEG)-접합된 유도체 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 문헌[Chang et al., Int'l J. Nanomed. 7:49-60 (2012)]에는 리포솜 제형에서 다수의 지질 구조가 개시되어 있다. 본 발명의 바람직한 제형은 표 1에 제공된다.
SUV의 크기는 중요하다. SUV는 바람직하게는, 동적 광 산란에 의해 측정하는 경우에, 약 50㎚ 내지 약 250㎚, 바람직하게는, 약 140 내지 220㎚, 또는 약 100 내지 200㎚, 또는 약 120 내지 190㎚, 또는 약 150 내지 200㎚, 또는 약 160 내지 180㎚, 또는 약 165 내지 200㎚의 z-평균 직경을 갖는다. 이상적으로, SUV는 비교적 좁은 크기 분포를 갖는다. 일부 실시형태에서, PdI는 약 0.02 내지 0.30이다. 일부 실시형태에서, PdI는 약 0.30, 0.25, 0.20, 0.15, 0.125, 0.10, 또는 0.050 미만이다. 일부 실시형태에서, 샘플에서 90%의 SUV는 약 300㎚, 약 270㎚, 약 250㎚, 또는 약 220㎚ 미만의 직경을 갖는다. 일부 실시형태에서, 10%의 SUV는 동적 광 산란에 의해 측정하는 경우, 약 120㎚, 약 100㎚, 약 50㎚, 약 20㎚, 또는 약 10㎚ 미만의 직경을 갖는다. 바람직하게는, 샘플에서 90%, 95%, 또는 100%의 SUV는 동적 광 산란에 의해 측정하는 경우 약 250㎚ 미만, 또는 약 200㎚ 미만, 또는 약 175㎚ 미만, 또는 약 150㎚ 미만의 직경을 갖는다.
SUV는 이러한 것들 내에 캡슐화된 우레아를 포함하며, 즉, 우레아는 SUV의 중심 구획에서의 "카고(cargo)"이다.
본 발명의 다양한 실시형태의 SUV는 유리체액의 비중보다 더 큰 비중을 갖는다. 바람직한 실시형태에서, SUV는 약 1.05, 약 1.06, 약 1.07, 약 1.08, 약 1.09, 약 1.1, 약 1.15, 또는 약 1.2보다 큰 비중을 갖는다.
제타 전위는 분산액 또는 용액에서 유사한 전하의 입자들 간의 정전기적 반발력을 측정한다. 제타 전위가 낮을 때, 입자들 간의 인력은 반발력을 초과할 수 있어서, 더욱 많은 응집을 야기시킨다. 제타 전위가 높을 때, 입자들은 집합(aggregation)에 저항한다. 일부 실시형태에서, SUV는 전기영동 광 산란을 이용하여 계산하는 경우, 약 -70 mV 내지 약 70 mV의 제타 전위를 갖는다. 일부 실시형태에서, 제타 전위는 0 mV 이하이다. 일부 실시형태에서, 제타 전위는 0 ± 5 mV이다. 일부 실시형태에서, 제타 전위는 약 -70, -65, -60, -55, -50, -45, -40, -35, -30, -25, -20, -15, -10, -5, -4, -3, -2, -1, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 또는 70 mV이다. 제타 전위는 당해 분야에 공지된 방법을 이용하여, 예를 들어, 염의 첨가에 의해 그리고/또는 pH를 조절함으로써 조정될 수 있다.
일 실시형태에서, 리포솜 작제물은 에멀션화제 또는 응집을 향상시키기 위한 결합제를 포함한다. 예시적인 에멀션화제는 비제한적으로, 아카시아, 글리세릴 모노올레에이트, 글리세릴 모노스테아레이트, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노스테아레이트, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노라우레이트, 소듐 라우릴 설페이트, 소듐 다이옥틸 설포숙시네이트, 소르비탄 올레에이트, 소르비탄 팔미테이트, 소르비탄 스테아레이트, 및 트라이에탄올아민 올레에이트를 포함한다.
SUV/리포솜 작제물은 표면 개질기 및/또는 표면 항원을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 표면 개질기는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)이다. 리포솜 표면의 페그화 수준은 예를 들어, 1 ㏖% 내지 20 ㏖%, 또는 그 이상에서 달라질 수 있다. 일부 실시형태에서, 표면 항원은 로다민이다.
리포솜의 안정성은 지질 이중층의 표면 전하, 크기, 표면 수화, 및 유동성과 같은 다양한 성질에 따른다. 표면 전하는 리포솜과 안구 막의 상호작용을 결정한다. 리포솜 막은 양전하, 음전하, 또는 무(no)(중성) 전하를 가질 수 있다. 마찬가지로, SUV의 라멜라를 포함하는 개개 지질은 각각 순 양전하, 순 음전하 또는 순 중성 전하를 가질 수 있다. 전하의 국부 영역(Local region)은 심지어 순 전하가 중성인 경우에도, SUV의 성질에 영향을 미칠 수 있다.
리포솜 작제물은 pH, 온도, 광, 산화, 효소 분해, 방사선, 또는 이들의 조합과 같은 자극에 반응할 수 있다.
본 발명의 실시형태의 리포솜 작제물은 패킹된 리포솜 작제물 펠릿 1㎕당 적어도 약 0.05㎎, 0.1㎎, 0.2㎎, 0.3㎎, 0.4㎎, 0.5㎎, 0.6㎎, 0.7㎎, 0.8㎎, 0.9㎎, 또는 1㎎ 우레아를 함유할 수 있다. 패킹된 리포솜 작제물 펠릿은 리포솜 작제물을 함유한 샘플을 약 5분 동안 약 90,000 g으로 초원심분리하고 상청액을 디켄팅함으로써 제조된다.
본 발명의 실시형태의 리포솜 작제물은 유리체망막 경계면에서 우레아의 체류 시간을 연장할 수 있고, 이의 카고를 요망되는 속도로 방출시키도록 최적화될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 실시형태의 리포솜 작제물(예를 들어, 지속-방출 약물 전달 시스템)은 단일 투여 후 적어도 약 2, 4, 6, 12, 18, 24, 48, 또는 72시간, 또는 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6주 동안 우레아를 방출시킬 수 있다. 일 실시형태에서, 리포솜 작제물은 투여 후 4 내지 8시간에 캡슐화된 우레아의 약 10% 이하를 방출시킬 수 있다. 일 실시형태에서, 리포솜 작제물은 투여 후 8 내지 12시간에 캡슐화된 우레아의 약 50% 이하를 방출시킬 수 있다. 일 실시형태에서, 리포솜 작제물은 투여 후 1시간에 캡슐화된 우레아의 적어도 약 75%를 방출시킬 수 있다. 일 실시형태에서, 리포솜 작제물은 투여 후 8시간에 캡슐화된 우레아의 적어도 약 80%를 방출시킬 수 있다. 일 실시형태에서, 리포솜 작제물은 투여 후 24시간에 캡슐화된 우레아의 적어도 약 80%를 방출시킬 수 있다. 방출률은 리포솜 작제물의 제형을 변경시킴으로써 요망되는 투여량에 따라 변경될 수 있다.
일부 양태에서, 리포솜 작제물을 포함하는 조성물이 다단계-방출 프로파일을 갖는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 실시형태에서, 일부 우레아가 주사 직후에 방출되고 일부 우레아가 주사 후 다양한 시점에, 예를 들어, 6시간마다, 12시간마다, 매일, 격일로, 3일에 한 번씩, 매주, 매달, 등에 방출되는 것이 구상될 수 있다. 이에 따라, 조성물은 SUV의 혼합된 집단을 포함할 수 있으며, 여기서, SUV는 지질 이중층(들)의 크기, 전하, 조성, 지질 이중층(들)의 개질(들), 또는 이들의 조합과 같은 하나 이상의 상이한 성질을 가지며, 이에 의해, 우레아의 방출률을 변경시킬 수 있다.
리포솜 작제물은 망막 또는 황반의 세포에서 발현되는 항원에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포는 뮬러 세포, 망막 신경절 세포, 망막 축색 세포, 내부 제한 막 세포, 망막 색소 상피 세포, 또는 망막 성상세포이다. 일부 실시형태에서, 항원은 세포의 표면 상에서 발현된다. 일부 실시형태에서, 항원은 뮬러 세포의 표면 상에서 특이적으로 발현된다. 일부 실시형태에서, 항원은 비멘틴, 글루타민 합성효소, 섬유아세포 성장 인자 수용체 1(FGFR1), 섬유아세포 성장 인자 수용체 4(FGFR4), 섬유아세포 성장 인자 수용체 9(FGFR9), 헤파린 결합 성장 인자, 신경교 섬유질 산성 단백질(GFAP), CD16, CD17, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD25, CD26, CD27, CD28, CD29, CD30, CD31, CD32, CD33, CD34, CD35, CD36, CD37, CD38, CD39, CD40, CD41, CD42, CD43, CD44, 인터류킨 1(IL-1), 인터류킨 2(IL-2), 인터류킨 3(IL-3), 인터류킨 4(IL-4), 인터류킨 5(IL-5), 인터류킨 6(IL-6), 인터류킨 7(IL-7), 인터류킨 8(IL-8), 및 레틴알데하이드 결합 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된다. 항체는 리포솜의 표면에 부착될 수 있다. 일부 실시형태에서, 항체는 리포솜의 표면 상의 PEG에 부착된다.
III. 리포솜 작제물의 제조
SUV는 당해 분야에 공지된 방법, 예를 들어, 용매 증발, 역상 증발, 탈수-재수화, 세제 투석, 박막 수화(Bangham 방법), 세제 제거, 용매(예를 들어, 에터/에탄올) 주입, 에멀션 방법, 고밀도 가스 방법(dense gas method), 초임계 유체 방법, 등에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 지질 혼합물은 유기 용매 중에 용해되고, 이후에, 건조되어 지질 막을 형성할 수 있다. 건조된 지질 막은 이후에, 수화되고, 예를 들어, 단층 리포솜으로 이루어진 리포솜 작제물을 형성시키는 공극 크기를 줄이고 표준화된 균일한 직경을 갖는 오리피스(orifice)를 통해 이를 압출시킴으로써 사이징될 수 있다.
우레아를 포함하는 리포솜 작제물을 제조하기 위하여, 지질 막은, 리포솜 작제물을 형성하는 SUV의 내부 내에 캡슐화되도록, 우레아의 용액으로 수화될 수 있다. 칼럼 크로마토그래피 또는 투석을 이용한 갇히지 않은 우레아의 제거 후, 리포솜은 전술한 바와 같이 사이징될 수 있다. 바람직하게는, 우레아는 포화 용액 또는 과포화 용액에 존재한다.
우레아를 포함하는 리포솜 작제물을 제조하는 대안적인 방법은 pH 구배 방법을 이용하여 사전-형성된 SUV 내에 우레아를 로딩하는 것이며, 여기서, 리포솜의 수성 내부는 리포솜 작제물을 둘러싸는 외부 매질보다 낮은 pH를 갖는다. 우레아는 리포솜 리포솜 작제물 내에서 이동하고 농축할 것이다. 리포솜 작제물의 내부 내에 우레아를 로딩하는 다른 방법은 암모늄 설페이트 구배 방법을 이용한다.
당해 분야에 공지되고 본 발명의 범위 내에 속하는 리포솜 작제물 내에 활성제를 로딩하는 여러 상이한 방법이 존재한다.
IV. 리포솜 작제물을 포함하는 조성물 및 사용 방법
과거에, 활성제가 전달 직후에 유리체에서 분산되고 충분한 농도가 안구의 뒤쪽에 도달하지 못하기 때문에, 망막의 표면에 활성제를 투여하는 것은 매우 어려웠다. 수용성 약물, 예를 들어, 우레아는 이와 관련하여 특별한 과제를 제기한다. 본 발명의 약제학적 조성물은 이의 물리적 특징으로 인하여 이러한 문제를 해소한다. 특히, SUV는 충분히 작아서 이러한 것이 멸균-여과될 수 있으면서, 여전히 치료학적 유효량의 우레아를 가둘 수 있다. 이러한 것은 유리체액 전반에 걸쳐 분산하기 보다는, 투여 직후에 리포솜 작제물에서 함께 머물 수 있도록 주사 시에 충분히 응집하며, 이러한 것은 망막 표면 상에 침강하고 망막 표현을 뒤덮을 수 있도록 유리체보다 더 조밀하다. "빈" SUV(즉, 캡슐화된 우레아가 없음)가 수정체내 주사 후에 응집할 것이지만, 이러한 것은 수정체액의 온화한 교반 하에서 용이하게 분산한다. 그러나, 캡슐화된 우레아와 동일한 SUV는 수정체내 주사 후 응집하고 수정체액의 온화한 교반 하에서 분산되지 않는 리포솜 작제물을 형성한다. 본 발명의 다수의 상이한 우레아-함유 리포솜 작제물은 수정체액의 온화한 교반 하에서 견디는 응집을 나타내며, 이는 수정체 전반에 걸쳐 분산된 위치로부터보다는 수정체내에서 약물을 응집된 데폿으로부터 공간적으로 방출되게 한다. 이에 따라, 본 발명의 약제학적 조성물은 유리체망막 경계면으로 활성제를 효율적으로 전달하기 위한 신규한 제형을 제공한다.
본 발명의 리포솜 작제물은 SUV의 응집을 형성시키며, 이러한 응집은 SUV 내의 우레아의 캡슐화에 의해 안정화된다. 조성물의 밀도는 이를 유리체액에서 가라앉게 하며, 이는 바로 누워 있는 위치에서 대상체에 대한 전달에 의해 선택적으로 촉진되어, 전체 안구에서보다 오히려, 망막 경계면에 타깃화된 전달을 그리고 망막 경계면에서 우레아의 방출을 야기시킨다. 이에 따라, 본 개시내용은 우레아에 대한 대상체의 망막의 노출을 증가시키는 방법으로서, 대상체의 안구에 우레아를 포함하는 리포솜 작제물을 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
특정 양태에서, 본 개시내용은 전술한 바와 같은 리포솜 작제물을 포함하고, 선택적으로, 하나 이상의 담체, 희석제, 부형제, 또는 다른 첨가제를 추가로 포함하는 조성물을 제공한다. 조성물은 약 5.0 내지 약 8.5의 pH일 수 있으며, 바람직하게는, pH는 약 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 또는 8.5이다. 이러한 조성물은 우레아를 포함하는 리포솜 작제물을 포함할 수 있다.
SUV에 캡슐화되는 것 이외에, 우레아는 우레아는 또한 리포솜 작제물을 포함하는 담체 또는 완충제에 존재할 수 있다. 담체 또는 완충제 중 비캡슐화된 우레아의 농도는 조성물의 요망되는 특징에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 조성물은 캡슐화된 우레아와 비캡슐화된 우레아의 농도 간에 평형을 유지하도록 제형화될 수 있으며, 이에 따라, 캡슐화되는 우레아의 농도가 안정적으로 유지된다. 또한, 저장 담체 또는 완충제 중 비캡슐화된 우레아의 농도는 투여되는 조성물 중 이의 농도와는 다를 수 있다. 예를 들어, 담체 또는 완충제는 초기 볼루스 용량이 투여 시에 요망되는 경우에 더 높은 농도의 비캡슐화된 우레아를 포함할 수 있다.
조성물은 다양한 형태, 예를 들어, 용액, 마이크로입자, 나노입자, 하이드로겔, 등, 또는 이들의 조합으로 존재할 수 있다. 일부 실시형태에서, 리포솜 작제물은 겔, 예를 들어, 히알루론산 겔에 분산된다. 바람직한 실시형태에서, 리포솜 작제물은 에멀션 또는 현탁액의 형태로 존재한다.
본 명세서에서 논의되는 바와 같이, 리포솜 작제물에 캡슐화된 우레아는 망막의 질병 또는 장애, 특히, 당뇨병성 망막증의 생체내 치료를 위해 치료학적 유효량으로 투여될 수 있다. 이와 관련하여, 개시된 리포솜 작제물이 투여를 용이하게 하고 우레아의 안정성을 증진시키기 위해 제형화될 수 있다는 것이 인식될 것이다. 이에 따라, 본 발명의 실시형태의 리포솜 작제물은 약제학적 조성물로 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는, 비독성의 멸균 담체, 예를 들어, 생리 식염수, 비독성 완충제, 보존제 등을 포함할 수 있다. 본 출원의 목적을 위하여, 우레아의 "치료학적 유효량"은 이득(benefit)을 달성하기에, 예를 들어, PVD를 유도하기에 충분한 양을 의미한다.
통상적으로, 적합한 약제학적 조성물은 하나 이상의 완충제(예를 들어, 아세테이트, 포스페이트, 시트레이트), 계면활성제(예를 들어, 폴리소르베이트), 안정화제(예를 들어, 인간 알부민), 및/또는 염(예를 들어, 산부가염, 염기부가염) 등을 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제의 형태 및 특징은 조합되는 활성 성분의 양 및 다른 널리 공지된 변수에 의해 지시될 수 있다. 본 명세서에 제공된 약제학적 조성물에서 사용될 수 있는 적합한 수성 및 비-수성 담체의 예는 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 등), 및 이들의 적합한 혼합물, 식물성 오일, 예를 들어, 올리브 오일, 및 주사 가능한 유기 에스터, 예를 들어, 에틸 올레에이트를 포함한다. 적절한 유동성은 예를 들어, 코팅 물질, 예를 들어 레시틴의 사용에 의해, 분산물의 경우에 특정 입자 크기의 유지에 의해, 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다.
이러한 조성물은 또한, 애주번트(adjuvant), 예를 들어, 보존제, 습윤제, 에멀션제, 및 분산제를 함유할 수 있다. 미생물 존재의 방지는 멸균 절차 및 다양한 항박테리아제 및 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀 소르브산, 등의 포함에 의해 보장될 수 있다. 등장화제, 예를 들어, 당, 소듐 클로라이드, 등이 또한, 조성물에 첨가될 수 있다. 또한, 주사 가능한 약제학적 형태의 장기 흡수는 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴의 포함에 의해 초래될 수 있다.
본 명세서에 제공된 약제학적 조성물은 또한, 약제학적으로 허용되는 항산화제를 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 항산화제의 예는 (1) 수용성 항산화제, 예를 들어, 아스코르브산, 시스테인 염산염, 소듐 바이설페이트, 소듐 메타바이설파이트, 소듐 설파이트, 등; (2) 유용성 항산화제, 예를 들어, 아스코르빌 팔미테이트, 부틸화된 하이드록시아니솔(BHA), 부틸화된 하이드록시톨루엔(BHT), 레시틴, 프로필 갈레에이트, 알파-토코페롤 등; 및 (3) 금속 킬레이트제, 예를 들어, 시트르산, 에틸렌다이아민 테트라아세트산(EDTA), 소르비톨, 타르타르산, 인산 등을 포함한다.
이에 따라, 본 개시내용은 언구의 질병 또는 장애, 예를 들어, 당뇨병성 망막증을 치료하는 방법으로서, 이를 필요로 하는 대상체에 본 명세서에 제공된 바와 같은, 우레아를 캡슐화하는 리포솜 작제물을 포함하는 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하며, 여기서, 충분한 양의 우레아는 망막에 도달하고 질병을 치료하고/하거나 요망되는 종료점에 도달하기에, 예를 들어, PVD를 유도하기에 충분한 시간 동안 망막과 접촉하는 방법을 제공한다. 이를 위하여, 본 발명의 실시형태의 방법은 망막에 리포솜 작제물의 이동을 용이하게 하기 위해 대상체를 대상체의 뒤쪽에 정위시키는 것을 추가로 포함할 수 있다. 리포솜 작제물이 유리체보다 더욱 조밀하게 때문에, 이러한 방식으로 대상체를 정위화시켜 리포솜 작제물은 안구의 뒤쪽에 위치되어 있는 망막에 침적되며, 이에 의해 망막에 타깃화된 전달을 달성한다.
본 명세서에 제공된 리포솜 작제물은 황반을 포함하는, 망막에 대한 우레아의 전달에 의해 다루어질 수 있는 임의의 질병 또는 장애의 치료 또는 예방을 위해 유용하다. 본 발명의 실시형태의 리포솜 작제물 및 방법을 사용하여 치료되거나 예방될 수 있는 질병 또는 장애의 예는 연령-관련 황반 변성(AMD), 분지 또는 중앙 망막 정맥 폐색, 중심 장액성 맥락망막병증, 맥락막 박리, 선천성 X-염색체 연관 망막층간분리증, 당뇨 황반 부종(DME), 당뇨병성 망막증(DR), 망막바깥 막, 가족성 삼출 유리체망막병증, 감염성 망막염, 황반 부종, 황반 원공, 황반 주름, 지속 태아 맥관 구조, 추정 안구 히스토플라즈마증 증후군, 유지된 렌즈 파편(retained lens fragment), 망막아종, 망막 파열 또는 박리, 색소성 망막염, 미숙아 망막증, 사상충증(온코세르카증(onchocerciasis)), 유리체황반 부착(VMA), 유리체황반 견인 증후군, 및 습성 황반 변성 중 하나 이상을 포함한다. 일부 경우에, 안구에서의 질환, 예를 들어, PVD를 유도시키는 것이 바람직할 수 있다. 여러 질병 상태는 PVD를 유도시킴으로써 예방되거나 개선될 수 있으며, 이는 병리학적 혈관신생으로부터 망막을 보호할 수 있다.
리포솜 작제물의 투여에 대한 임상 반응은 표준 스크리닝 기술, 예를 들어, 광 간섭성 단층촬영(OCT), 기저부 사진법, 또는 플루오레세인 혈관 조영법을 이용하여 평가될 수 있다. 임상 반응은 또한, 질병 또는 장애와 관련된 증상의 개선에 의해 평가될 수 있다. 일부 실시형태에서, 리포솜 작제물의 타깃화는 리포솜 작제물 상에 또는 리포솜 작제물에서의 형광 마커를 관찰함으로써 분석될 수 있다.
리포솜 작제물, 또는 리포솜 작제물을 포함하는 조성물을 대상체의 유리체에 투여하는 방법은 당업자에게 널리 공지되어 있거나 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 예를 들어, 투여는 유리체내 주사, 수정체내 이식, 이온이동법, 또는 마이크로전자기계 디바이스를 통해 이루어질 수 있다. 바람직하게는, 투여는 유리체내 주사를 통해, 예를 들어, 예컨대, 18 내지 31 게이지 니들을 통해 이루어진다. 일부 경우에, 투여는 27-게이지 니들 또는 30-게이지 니들을 통해 이루어진다. 통상적으로, 유리체 주사를 통해 전달되는 부피는 약 50㎕ 내지 약 150㎕, 바람직하게는 약 100㎕이다.
투약 형태를 생성시키기 위해 담체 물질과 조합될 수 있는 본 발명의 실시형태의 리포솜 작제물의 농도는 우레아의 캡슐화 효율, 치료가 예방적 또는 치료적인지의 여부, 투여되는 다른 약제, 및 환자가 인가 또는 동물인지의 여부를 포함하는, 여러 다른 인자에 따라 달라질 것이다. 투여되는 리포솜 작제물의 양은 이러한 본 개시내용에 따라, 과도한 실험 없이 당업자에 의해 용이하게 결정된다. 치료 투여량은 안전성 및 효능을 최적화하기 위해 당업자에게 공지된 일상적인 방법을 이용하여 적정될 수 있다.
리포솜 작제물을 포함하는 조성물은 단일 용량 또는 다중 용량으로서 투여될 수 있다. 조성물은 PVD 유도과 같은, 타깃화된 종결점을 달성하기 위해 필요한 만큼 여러 번 투여될 수 있다. 주사 간격은 달라질 수 있다. 예를 들어, 조성물은 6, 12, 24, 48, 또는 72시간마다, 1, 2, 3, 또는 4주마다, 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 9, 12, 18, 24, 36, 또는 48달마다 투여될 수 있다. 투약 요법은 최적의 요망되는 반응(예를 들어, 치료적 또는 예방적 반응)을 제공하도록 조정될 수 있다.
약제학적 조성물은 또한, 병용 요법으로 투여되고/되거나 다른 제제와 조합될 수 있다.
본 개시내용은 망막 또는 황반의 질병 또는 장애를 치료하거나 예방하기 위한, 본 명세서에 기술된 바와 같은, 우레아를 캡슐화하는 리포솜 작제물을 포함하는 약제학적 조성물의 용도를 제공한다. 본 개시내용은 또한, 망막 또는 황반의 질병 또는 장애를 치료하거나 예방하기 위한 약제의 제조에서의, 본 명세서에 기술된 바와 같은 우레아를 포함하는 리포솜 작제물의 용도를 제공한다. 본 개시내용은 또한, 단독으로 또는 다른 치료법과 결합하여, 안구의 질병, 장애, 또는 손상과 관련된 하나 이상의 증상의 예방, 관리, 치료, 또는 개선을 위한, 우레아를 포함하는 리포솜 작제물을 포함하는 약제학적 조성물의 용도를 포함한다.
VII. 키트
또한, 본 개시내용의 범위 내에는 본 명세서에 제공된 바와 같은 리포솜 작제물 및/또는 조성물 및 사용 설명서를 포함하는 키트가 존재한다. 키트는 적어도 하나의 추가적인 시약, 또는 하나 이상의 추가적인 리포솜 작제물을 추가로 함유할 수 있다. 키트는, 통상적으로, 키트의 함유물의 의도된 사용을 지시하는 표지를 포함한다. 용어 "표지"는 키트 상에 공급되거나 키트와 함께 공급되거나 그밖에 키트에 포함되어 있는 임의의 서면, 또는 기록된 자료를 포함한다.
본 개시내용은 본 명세서에 기술된 방법을 수행하기 위해 사용될 수 있는, 하나 이상의 리포솜 작제물을 포함하는 키트를 추가로 제공한다. 특정 실시형태에서, 키트는 하나 이상의 용기에 적어도 한 타입의 본 발명의 리포솜 작제물을 포함한다. 일부 실시형태에서, 키트는 모든 대조군, 검정을 수행하기 위한 지침, 및 분석 및 결과의 제시를 위한 임의의 필요한 소프트웨어를 포함하는, 검출 검정을 수행하는 데 필요하고/하거나 충분한 모든 성분들을 함유한다. 당업자는, 개시된 리포솜 작제물이 당해 분야에 널리 공지된 규명된 키트 포맷들 중 하나에 용이하게 도입될 수 있다는 것을 용이하게 인지할 것이다.
본 개시내용에 인용된 모든 참고문헌은 전문이 본 명세서에 참고로 포함된다. 또한, 본 명세서에 인용되거나 언급된 임의의 제품에 대한 임의의 제조업체 설명서 또는 카탈로그가 참고로 포함된다. 이러한 텍스트에 참고로 포함된 문헌, 또는 여기에서의 임의의 교시는 본 발명의 실무에서 사용될 수 있다. 이러한 텍스트에 참고로 포함된 문헌은 종래 기술인 것으로 인정되지 않는다.
실시예
본 발명의 실시형태는 하기 비제한적인 실시예를 참조로 하여 추가로 정의될 수 있으며, 이러한 실시예는 본 발명의 특정 리포솜 작제물의 제조 및 본 발명의 리포솜 작제물을 사용하는 방법을 상세히 기술한다. 물질 및 방법 둘 모두에 대한 여러 변형이 본 개시내용의 범위를 벗어나지 않으면서 실시될 수 있다는 것이 당업자에게 명백할 것이다.
실시예 1. 후보 제형의 연구
본 발명자는 처음에 표 1에 나타낸, 여러 리포솜 제형을 고려하였다.
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모든 지질을 Avanti Polar Lipids, Inc.(앨라베마주 엘라베스터)로부터 수득하였다. 제형 1, 3, 8, 11 및 12를 카복시플루오레세인으로 제조하였다. 간단하게, 100mM 카복시플루오레세인 용액을 1x PBS(HyClone™ 카탈로그 번호 SH0256, GE Healthcare, 매사추세츠주 말버러 소재) 중에서 제조하였고, 1% NaOH로 pH를 6.5 내지 7.5까지 조정하였다. 이러한 용액을 여과하고, 사용하여 자가-켄칭(self-quenching) 리포솜을 제조하였다. 지질 막을 질소의 스트림 하에서 건조시키고, 이후에, 최소 2시간 동안 진공에 의해 건조시키고, 100mM 카복시플루오레세인 용액으로 재수화시켰다. 재수화된 리포솜을 0.2㎛ 필터 막(Millex®, MilliporeSigma, 독일 다름슈타트 소재)을 통해 압출하였다. 리포솜을 Sephadex G75 칼럼(Sigma Aldrich, 미주리주 세인트루이스 소재) 상에서 크기-배제 크로마토그래피에 의해 캡슐화되지 않은 카복시플루오레세인으로부터 분리하였다.
각 제형을 24시간에 걸쳐 PBS, HBSS, 및 토끼 유리체액에서 리포솜 안정성 및 카복시플루오레세인 누출률에 대해 시험하였다. PBS, HBSS(HyClone™ 카탈로그 번호 SH30256, GE Healthcare, 매사추세츠주 말버러 소재) 또는 토끼 유리체액(BTS Research, 캘리포니아주 샌디에이고 소재 또는 Absorption Systems LP, 펜실베니아주 엑스턴 소재) 중 어느 하나에서 혼합된 리포솜으로부터의 카복시플루오레세인 누출의 시간-과정을 결정하기 위해, 3개의 80㎕ PBS 또는 HBSS 분취액을 자동 피펫터(automatic pipetter)로 ELISA 스트립(카탈로그 번호 446473, Thermo Scientific, 매사추세츠주 월섬 소재)에 첨가하였다. 3개의 100㎕ 유리체액 분취액을 멸균 1㎖ 피펫으로 첨가하였다. 20㎕의 리포솜 제형을 3개의 각 유체의 상부 상에 첨가하였다. 10㎕의 RIPA 완충제(카탈로그 번호 89901, Thermo Scientific, 매사추세츠주 월섬 소재)를 동일한 샘플에 3회 첨가하여 PBS, HBSS, 및 유리체액에서 최대 형광 방출을 결정하였다. 100㎕ PBS, 80㎕ HBSS + 20㎕ PBS, 또는 100㎕ 유리체액 + 20㎕ PBS를 갖는 음성 대조군을 포함하였다. 플레이트를 자가-접착 플라스틱 필름으로 시일링하고, 형광 방출을 결정하기 전에 VMax Kinetic Microplate Reader(Molecular Devices, 캘리포니아주 서니베일 소재)에서 3회 사이클 동안 격렬하게 교반하였다. 게인(gain)을, 시간 0에서 PBS 및 RIPA 완충제와 함께 리포솜을 함유한 웰에서 50% 최대 방출을 생성시키기 위해 요구되는 게인으로부터 결정한 바와 같이, 800으로 설정하였다.
샘플을 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하고, 방출을 매 분마다 판독하였다. 이후에, 샘플을 다른 22 내지 24시간 동안 15분마다 판독하였다. 리포솜을 RIPA 완충제로 용해시키고, PBS, HBSS, 및 토끼 유리체액에서 최대 형광 방출에 대해 24시간에 걸쳐 시험하였다. 모든 시험된 리포솜 제형은 24시간의 과정에 걸쳐 안정적이었다. 용해된 리포솜 샘플은 24시간에 걸쳐 증가된 형광 방출을 갖는데, 이는 손상되지 않은 리포솜이 성공적으로 캡슐화된 카복시플루오레세인을 가짐을 나타낸다(도 1a 내지 도 1e).
실시예 2. 우레아 캡슐화 및 안정성 연구
우레아는 중간 정도 내지 심각한 당뇨병성 망막증에 걸린 환자에서 후방 유리체 박리(PVD)를 유도시키는 것으로 보이지만; 그러나, 임상적 적용은 지속된 기간 동안 안구의 뒤쪽에 충분한 약물을 전달할 수 없는 것에 의해 방해를 받았다.
제형 1, 2, 3, 12, 및 14(표 1)를 제조하였다. 콜레스테롤을 제외한 모든 지질을 클로로포름 용액에서 수득하였다. 콜레스테롤 분말을 클로로포름 용액에 요망되는 비율로 첨가하였다. 콜레스테롤을 질소 스트림을 통해 증발시키고, 클로로포름-지질 샘플을 동결-건조 증발시켰다. 얻어진 지질 케이크를 100㎕의 1 g/㎖ 우레아(Invitrogen 카탈로그 번호 15505035, 캘리포니아주 칼즈배드 소재) 용액으로 수화시키고, 4℃에서 30분 동안 수화시키고, 0.8㎛ 및 0.2㎛ 필터로의 2-단계 압출 공정을 이용하여 압출하였다. 캡슐화 효율을 찾기 위하여, 1 g/㎖ 우레아 용액의 분취액을 수득하고, 로딩 완충제 중 우레아의 질량을 측정하였다. 압출 후에, 리포솜을 실온에서 5분 동안 원심분리기(Airfuge®, Beckman Coulter, 인디애나주 인디애나폴리스 소재)에서 90,000g으로 펠릿화하고, 완충제를 디켄팅하였다. 펠릿을 100㎕의 탈이온수에서 재-현탁시키고, 추가 실험 및/또는 분석을 위해 사용하였다.
100㎕의 PBS로의 세척 후에, 재-현탁된 샘플 부피를 측정하고, 사용하여 표 2에 나타낸, 리포솜 펠릿 부피를 결정하였다.
Figure 112019022475453-pct00003
캡슐화된 우레아의 양 및 우레아 로딩(캡슐화) 효율을 각 제형에 대해 결정하였다. 0.2㎛ 필터 압출 후에, 리포솜 샘플을 실온에서 5분 동안 90,000 g으로 초-원심분리하여(Airfuge®, Beckman Coulter, 인디애나주 인디애나폴리스 소재) 패킹된 리포솜 펠릿에서의 캡슐화된 우레아로부터 용액 중 자유 우레아를 분리하였다. 상청액을 디켄팅하였다. (100㎕ DI H2O에 재-현탁된) 패킹된 펠릿 물질 내에 캡슐화된 우레아의 양을 측정하고 로딩 완충제 중 우레아의 질량으로 나눔으로써 캡슐화 효율에 대한 상한치를 확인하였다. 각 펠릿을 재-현탁 1x PBS(MP Biomedicals, 캘리포니아주 샌타애나 소재)로 세척하고, 이후에, 5분 동안 90,000 g으로 초-원심분리하여 리포솜 작제물의 외측과 관련된 우레아의 분획을 제거하였다. 상청액을 제거하고, 펠릿을 100㎕ 탈이온수에서 현탁시키고, 5초 동안 비등시키고, 이후에, 2회 냉동-해동 사이클을 수행하여 리포솜 작제물을 탈안정화시켰다. 펠릿 데이터를 3개의 1㎕ 샘플을 사용하여 3회 생성시켰다. 상청액 데이터를 3개의 1㎕ 샘플을 사용하여 3회 생성하였다. 초기 로딩 완충제 중 우레아에 대한 캡슐화된 우레아(펠릿)의 비율을 우레아 검정 키트(Abnova Corp. 카탈로그 번호 KA1652, 대만 타이페이시 소재)를 이용하여 규명하였다. 리포솜 입자와 관련이 있지만, 실제로 캡슐화되지 않은 임의의 우레아를 제거하기 위하여 패킹된 펠릿을 100㎕의 PBS로 2회 세척하였다. 로딩 완충제 중 우레아의 질량으로 나누어진 세척된 패킹된 펠릿 물질(100㎕ DI H2O에서 재-현탁됨) 내에서 캡슐화된 우레아의 양은 캡슐화 효율의 하한치를 제공한다. 본 발명자는 로딩 공정 동안 적어도 X 및 Y 미만의 캡슐화 효율을 달성하였다.
캡슐화된 우레아의 로딩 효율 및 전체 질량의 하한치는 표 3에 나타내었다. 캡슐화된 우레아의 로딩 효율 및 전체 질량의 상한치는 표 4에 나타내었다.
Figure 112019022475453-pct00004
Figure 112019022475453-pct00005
1x PBS 및 토끼 유리체액(Absorption Systems LP, 펜실베니아주 엑스턴 소재)에서 리포솜의 24시간 안정성 시험을 실온에서 모두 5개의 제형(제형 1, 2, 3, 12 및 14)에 대해 수행하였다. 리포솜 제형을 전술한 바와 같이 제조하였다. 1x PBS에서의 안정성 시험을 위하여, 100㎕의 1x PBS를 표 2에서 제공된 바와 같이, 습윤 리포솜 펠릿 부피에 첨가하였다. 안정성 시험에 대한 리포솜 샘플의 부피(100㎕)는 유리체액에서 대략 1:1이었다. 샘플을 실온에서 유지시켰다.
자유 우레아 및 캡슐화된 우레아의 농도를 캡슐화 후 6, 12, 및 24시간에 전술한 바와 같이 측정하였다. 캡슐화된 우레아를 각 시점에 보고하였고, 플롯팅하여 우레아의 방출 프로파일을 나타내었다(도 2a 내지 도 2d). 제형 2(58 ㏖% DOPC, 42 ㏖% 콜레스테롤)는 24시간에 대략 25%의 캡슐화된 우레아를 방출하면서, 1x PBS 및 유리체액 둘 모두에서 24시간에 걸쳐 최상의 우레아 방출 특징을 나타내었다.
실시예 3. 제형 2(58 ㏖% DOPC , 42 ㏖% 콜레스테롤) 리포솜 작제물의 특징 분석 및 최적화
입자 크기 분석
Microtrac(펜실베니아주 몽고매리빌 소재) 150 기기 및 Microtrac 입자 크기 분석기 소프트웨어, 버전 10.1.3을 이용하여 입자 크기 분석을 수행하였다. 우레아가 없는 제형 2의 입자 크기 분석은, 90%의 리포솜 작제물이 250㎚ 이하였고, 10%가 100㎚ 미만임을 나타내었다. 이에 따라, 우레아가 없는 제형 2의 리포솜 작제물 입자 크기는 약 100㎚ 내지 약 250㎚의 범위이었다. 캡슐화된 우레아를 갖는 제형 2의 입자 크기 분석은 90%의 리포솜 작제물이 300㎚ 이하였고, 10%가 90㎚ 이하임을 나타내었다. 이에 따라, 캡슐화된 우레아를 갖는 제형 2의 리포솜 작제물 입자 크기는 약 90㎚ 내지 약 300㎚의 범위이었다.
완충제 제형의 최적화
최적의 완충제 조성물을 4℃에서 96시간 동안 리포솜 작제물의 캡슐화 효율 및 안정성에 대해 평가하였다. 캡슐화된 우레아를 갖는 제형 2 리포솜 작제물을 표 5에 나타낸, 6개의 상이한 완충제 조성물로 제조하였다.
Figure 112019022475453-pct00006
각 완충제 제형은 전술한 바와 같이, 첨가되어 지질 케이크를 건조시키고(제형 2) 이후에 압출된, 수성 수화 매질이다. 캡슐화된 우레아의 로딩 효율 및 전체 질량은 표 6에 나타내었다.
Figure 112019022475453-pct00007
탈이온수 및 우레아의 완충제 조성물은 가장 높은 우레아 캡슐화 효율을 가졌으며, 우레아를 갖는 0.5x PBS 및 1x PBS 완충제는 다음으로 최상이었다. 그러나, 시트르산(pH 6.5), 10% 수크로스, 및 0.95 g/㎖ 우레아를 함유한 완충제에서 리소폼 작제물의 안전성은 96시간 후에 캡슐화된 우레아의 변화를 나타내지 않았다. 2x PBS 우레아 완충제는 최소 안정성을 나타내었으며, 캡슐화된 우레아 농도는 대략 30% 손실되었다.
시린지 안정성 시험
제형 2 리포솜 작제물을 사용하여 높은 부피-대-부피 농도의 리포솜 작제물로 리포솜 작제물 거동을 평가하였다. 시린지를 통해 리포솜 작제물을 흡입하는 효과를 시험하기 위하여, 펠릿을 전술한 바와 같이 제조하였고, 2개의 펠릿을 합하고, 100㎕ 0.5x PBS의 총 부피로 재-현탁시키고, 27-게이지 또는 30-게이지 니들을 통해 흡입하였다. 캡슐화된 우레아 및 자유 우레아의 양을 전술한 바와 같이 결정하였고, 표 7에 나타내었다.
Figure 112019022475453-pct00008
2개의 펠릿의 조합은 캡슐화된 우레아의 양을 증가시켰지만, 캡슐화 효율을 증가시키지는 못하였다. 리포솜 작제물 무결성의 상실은 27-게이지 또는 30-게이지 니들에서 관찰되지 않았다. 그러나, 3개의 펠릿이 100㎕ 전체 부피에서 조합되었을 때, 샘플 손실은 흡입 시에 대략 40%이었고, 27-게이지 니들로부터 분산되었다.
온도 안정성 시험
4℃, 실온, 및 37℃에서 0.5x PBS에서의 7일 온도-제어된 안정성 시험을 전술한 바와 같이 제조되고 분석된, 제형 2 우레아 캡슐화된 리포솜 작제물에 대해 수행하였다. 결과는 표 8 및 도 3a 내지 도 3c에 나타내었으며, 여기서, 100㎕ 샘플에서 전체 캡슐화된 우레아(㎎)가 측정되었다.
Figure 112019022475453-pct00009
실시예 4. 우레아 -캡슐화된 리포솜 작제물 제형의 제조 및 추가 특징분석
1,2-다이올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DOPC) 및 콜레스테롤을 사용하여, 리포솜을 우레아의 존재 하에서 형성하여 우레아-캡슐화된 리포솜 작제물을 생성하였다. 사용된 물질은 표 9에 요약되어 있다.
Figure 112019022475453-pct00010
200㎚ 이하의 입자 크기를 갖는 우레아-캡슐화된 리포솜 작제물을 제조하기 위해 역상 증발, 이후 마이크로 유동화(Model M110 EH, Microfluidics Corp., 매사추제츠주 웨스트우드 소재)를 수행하였다. 공정 단계를 최적화하기 위하여 여러 배취를 제조하고, 작은 배취, F4B는 최적화된 방법에 따라 제조된 제1 배취이고(도 4), 특징 분석되었다. 후속 배취를 특징 분석하기 위하여, 하기에 기술되는 표준 시리즈의 시험을 사용하였다.
100㎕ 샘플의 수성 부분의 부피를 원심분리 여과를 통해 펠릿 부피로부터 분리하고, 측정하고, 펠릿 부피를 계산하였다. 전체 우레아 및 자유 우레아 농도를 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의해 측정하고, 캡슐화된 우레아 농도 및 캡슐화 효율(우레아 도입 정도)을 계산하기 위해 사용하였다. 제타 전위 및 입자 크기 및 분포를 Zetasizer(Malvern Instruments Ltd., 영국 우스터셔주 소재)를 이용하여 레이저 광 산란(LLS)에 의해 측정하였다. 30G 니들을 통한 주사능력은 전체 우레아 농도 및 자유 우레아 농도를 시험하고 다시 캡슐화된 우레아 농도를 계산함으로써 확인되었다. 0.2㎛ 필터를 통한 여과 동안 손실된 부피는 여과 전 및 후에 샘플의 부피를 측정함으로써 확인되었다. 배취의 비중을 공지된 부피에 대해 중량 측정에 의해 측정하고, 유리체액 또는 PBS에서의 응집을 시각적으로 평가하였다. 마지막으로, 캡슐화된 우레아의 시험관내 방출을 37℃에서 7일에 걸쳐 20 kDa 투석 카셋트를 이용하여, 100㎕:5㎖의 샘플 부피:완충제 부피 비율로 측정하였다. 전체 우레아 농도를 HPLC에 의해 측정하고, 방출된 캡슐화된 우레아의 양을 각 개개 시점에서 초기 자유 우레아 농도 및 전체 우레아 농도를 기초로 하여 계산하였다.
배취 F5 및 F5B의 조성물은 58 ㏖% DOPC 및 42 ㏖% 콜레스테롤이었으며, 배취 크기는 17 그램(1500 내지 1600 용량)이었다. 600 ㎎/㎖ 우레아 포화용액을 사용하여 우레아-캡슐화된 리포솜 작제물을 제조하였다. 마이크로-유동화 후에, 배취를 균질화하여 리포솜의 입자 크기를 허용 가능한 크기까지 추가로 감소시켰다. 0.8㎛ 여과 후에, 배취를 2개의 부피로 분취하였으며, 이를 10 kDa 컷-오프(cut-off) 한외여과 막(MilliporeSigma, 독일 다름슈타트 소재, 카탈로그 번호 PLGC04310)을 구비한 교반 셀 디바이스(Amicon, 50㎖, 최대 압력 75 psi)를 이용하여 40% 리포솜:60% 포화된 우레아 완충제(vol/vol 비율)까지 별도로 농축시키고, 멸균 여과하였다. 배취 F5의 최종 부피는 105㎖이었으며, 배취 F5B의 최종 부피는 51㎖이었다. 배취 F11 내지 F13은 또한, 58 ㏖% DOPC 및 42 ㏖% 콜레스테롤의 조성물을 갖는다.
배취 F6의 조성물은 91 ㏖% DOPC 및 9 ㏖% 콜레스테롤이었으며, 배취 크기는 3 그램(1500 내지 1600 용량)이었다. 450 ㎎/㎖ 우레아 포화 용액을 사용하여 우레아-캡슐화된 리포솜 작제물을 제조하였다. 배취를 농축시키고, 배취 F5 및 F5B에 대해 기술된 바와 같이 멸균 여과하였다.
배취 F8의 조성물은 70 ㏖% DOPC 및 30 ㏖% 콜레스테롤이었으며, 배취 크기는 3 그램(1500 내지 1600 용량)이었다. 450 ㎎/㎖ 우레아 포화 용액을 사용하여 우레아 캡슐화된 리포솜 작제물을 제조하였다. 배취를 농축시키고, 배취 F5 및 F5B에 대해 기술된 바와 같이 멸균 여과하였다.
배취 F9의 조성물은 45 ㏖% DOPC 및 55 ㏖% 콜레스테롤이었으며, 배취 크기는 3 그램(1500 내지 1600 용량)이었다. 450 ㎎/㎖ 우레아 포화 용액을 사용하여 우레아-캡슐화된 리포솜 작제물을 제조하였다. 배취를 20분 동안 마이크로유동화하고, 배취의 입자 크기를 3분마다 측정하였다. 20분의 마이크로유동화 후에, 리포솜 입자 크기는 200㎚ 타깃보다 훨씬 높은, 1200㎚에 도달하였다. 샘플 부피를 마이크로유동화 후에 밤새 저장하였을 때, 상 분리를 관찰하였다. 샘플을 0.8㎛ 필터로 성공적으로 통과시키기 위하여, 배취의 균질화를 5분 동안 비드비터(beadbeater)로 수행하였다. 배취를 농축시키고, 배취 F5 및 F5B에 대해 기술된 바와 같이 멸균 여과하였다. 0.2㎛ 필터를 통한 멸균 여과는 매우 어려웠으며, 배취 부피의 적어도 1/3이, 대량의 큰 입자로부터의 문제(complication)로 인하여, 가공 동안 손실되었다.
배취 F10의 조성물은 58 ㏖% DOPC 및 42 ㏖% 콜레스테롤이었으며, 형광 표지를 갖는 대략 6%(w/w)의 콜레스테롤을 함유하였다. 배취를 역상 증발, 이후 전술한 바와 같이, 마이크로유동화, 초음파처리, 및 여과에 의해 제조하였다.
특징분석 시험의 결과는 표 10에 나타내었다. 입자 크기 및 분포는 표 11에 나타내었다. 시험관내 배출 데이터는 표 12, 표 13 및 도 5에 도시되어 있다.
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Figure 112019022475453-pct00013
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DOPC의 농도가 제형에서 증가됨에 따라, 캡슐화된 우레아의 양은 감소된다(도 6a). 반대로, 콜레스테롤의 농도가 제형에서 증가됨에 따라, 캡슐화된 우레아의 양은 증가한다(도 6b). 제형으로부터의 우레아의 방출률은 비교적 유사하며, 200분 후에, 최소량의 우레아는 일정한 속도로 방출된다. 수집된 데이터를 기초로 하여, 58 ㏖ DOPC 및 42 ㏖% 콜레스테롤을 갖는 제형 F5/F5B는 연장된 방출 우레아 제형에 대한 타깃화된 특징을 갖는다. 리포솜 작제물 제형에서 전달될 때 안구에서의 우레아의 체류 시간은 순수한 우레아의 체류 시간보다 8배 더 길다.
추가적인 리포솜 작제물 배취를 선택적으로, 냉동/해동 사이클링과 함께, 에탄올 주입에 의해 제조하였고, 전술한 바와 같이 특징 분석하였다. 결과는 표 14 및 표 15에 나타내었다.
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Figure 112019022475453-pct00016
실시예 5. 수정체내로 투여된 우레아의 독성 및 내약성
본 실시예는 뉴질랜드 백토끼의 안구 내에 수정체내(IVT) 주사 후 캡슐화된 우레아의 내약성 및 독성의 평가뿐만 아니라 PVD 유도에 대한 이의 효능, 및 수정체내 주사된 우레아를 캡슐화한 리포솜 작제물의 침강 패턴(settling pattern)을 제공한다.
암컷 뉴질랜드 백토끼를 Western Oregon Rabbit Co.(오레곤주 필로매스 소재)로부터 얻었고, USDA 동물 복지법의 규정 및 연구소의 동물 관리 및 사용 위원회의 검토 및 승인 하에 따라 하우징하고 관리하였다.
연구에 배치하기 전에, 각 동물에게 안구 검사(슬릿-램프 생체형미경검사 및 간접 검안경검사)를 수행하였다. 안구 결과를 변형된 McDonald-Shadduck Scoring System(McDonald et al. "Eye Irritation," in Advances in Modern Toxicology: Dermatoxicology, at 579-582 (Marzulli et al. Eds., 1977))에 따라 스코어링하였다. 연구 배취를 위한 허용 기준은 모든 변수에 대해 "0"의 스코어이다.
그룹 1(서브그룹 1a, 1b, 1c): 급성/ 우레아 캡슐화된 리포솜
6마리의 암컷 뉴질랜드 백토끼(서브그룹당 2마리)에 양쪽 안구(OU) 내에 단일 용량으로서 우레아-캡슐화된 리포솜 작제물(58 ㏖% DOPC, 42 ㏖% 콜레스테롤)을 수정체내로(IVT) 투여하였다. 동물을 케타만 염산염(30 ㎎/kg), 자일라진(5 ㎎/kg), 및 아세프로마진(3 ㎎/kg)의 근육내(IM) 주사, 이후 산소(1 ℓ/분) 중 흡입(1 내지 2.5%)에 의한 아이소플루란으로 마취하였다. 1 내지 2 방울의 국소 프로파라카인 염산염 마취제(0.5%)를 수술 절차 이전에 동물의 안구에 적용하였다. 동물을 투약 후 3시간 동안 이의 두부를 안정화시키면서 마취를 유지시켰으며, 하나의 안구는 위를 향하고 다른 하나의 안구는 아래를 향한다.
3시간 후에, 임상 안구 검사를 수행하였으며, 동물을 안락사시켰다. 유리체액(VH)을 3개의 분획으로서 수집하였다. 동공을 각각 1 방울의 10% 페닐에프린 및 1% 트로피카마이드(tropicamide)를 사용하여 확장시켰다. 2개의 18G 니들을 3시 및 9시 위치에서 안구 내에 삽입하고, VH로 발전하였으며, 하나는 수정체 쪽으로 향하는 경사면을 가지며, 다른 하나는 망막을 향하는 경사면을 갖는다. 300㎕의 VH를 각 니들을 통해 인출하고, 그 후에, 각 니들을 안구로부터 제거하였다. 안구를 이후에, 수확하고, 적출하였다. 적출 후에, 나머지 VH를 제3 분획으로서 수집하였다. 각 동물에서 각 안구로부터의 샘플은 분리된 채로 잔류하였고, 풀링되지 않았다. 안구 조직의 중량을 기록하였다. 개개 VH 분획을 별도로 계량하였다. VH 분획을 실온에서 20 내지 30분 동안 16,100 x g으로 원심분리하였다. 상청액을 분리하였다. 리포솜 작제물을 함유한 펠릿 및 상청액을 드라이아이스 상에서 별도로 급속 냉동시키고, -60 내지 -80℃에서 저장하였다. 망막을 또한, 이러한 동물로부터 수집하고, 드라이아이스 상에서 급속 냉동시키고, -60 내지 -80℃에서 저장하였다.
그룹 2(서브그룹 2a, 2b): 만성/자유 우레아
2마리의 추가적인 동물(서브그룹당 1마리)에 우측 안구(OD) 내로 단일 또는 이중 용량의 자유 우레아 용액 IVT를, 및 좌측 안구(OS) 내로 평형 염 용액(BSS)을 투여하였다. 동물을 케타민 염산염(30 ㎎/kg) 및 자일라진(5 ㎎/kg)의 IM 주사로 마취하였다. 1 내지 2 방울의 국소 프로파라카인 염산염 마취제(0.5%)를 수술 절차 이전에 동물의 안구에 적용하였다.
임상적 안구 검사, 기저부 사진법, 및 광 간섭성 단층촬영(OCT)을 투약 후 0 내지 3, 4(AM 및 PM), 8(±1), 14, 21, 및 28일차에 이러한 동물에서 수행하였다. OCT를 위하여, 동공을 영상화하기 대략 10 내지 15분 전에 각각 1 방울의 10% 페닐에프린 및 1% 트로피카마이드로 확장시켰다. 이미지를 Spectralis® 기기(Heidelberg Engineering, Inc., 독일 하이델베르크 소재)를 이용하여 취득하였다.
연구 설계는 표 16에 요약되어 있다.
Figure 112019022475453-pct00017
임상 시험 및 관찰
우레아 캡슐화된 리포솜 또는 자유 우레아 용액을 수용한 동물에 대하여 체중에 대한 부작용 및 일반적인 건강에 대한 심각한 부작용이 관찰되지 않았다. 두 동물 그룹 모두에서, 안구 자극 및 붓기(swelling)는 투약일 이후에 생존 동물에서 다음 며칠에 걸쳐 분해된 IVT 주사 직후에 관찰되었다.
모든 동물은 기준선 사전-스크리닝 시험 동안 안구 이상을 나타내지 않았다. 후방 유리체 박리(PVD)는 치료된 우측 안구(OD)에서 두 그룹 2a 동물(자유 우레아 용액, 단일 용량) 및 그룹 2b 동물(자유 우레아 용액, 이중 용량) 둘 모두의 2일차 시험을 제외하고 임상적 안구 검사 동안 관찰되지 않았다. 그러나, PVD는 임상적 안구 검사 동안 용이하게 볼 수 없었다. OCT 영상화는 임상적 안구 검사에 의해 나타나지 않은 PVD의 추가적인 경우를 나타내었다. 안구 검사 및 영상화가 항상 이를 검출하지는 못하였지만, PVD가 투약 2일 내에 자유 우레아 용액으로 치료된 두 동물 모두의 안구에서 나타났고, 본 연구의 나머지 동안 지속되었다는 결론을 얻을 수 있다. 그룹 1 동물이 OCT 영상화를 얻지 못하였기 때문에, 우레아-캡슐화된 리포솜 작제물로 치료 후 PVD의 경우는 검출되지 않을 수 있다.
기저부 사진법
서브그룹 2a 및 서브그룹 2b 동물 둘 모두는 0 일차에서 3 일차까지 OD 유리체의 혼탁(clouding)을 나타내었다. 이러한 혼탁은 서브그룹의 OS 유리체에서 관찰되지 않았다. 혼탁이 비히클-치료된 안구에서 나타나지 않았기 때문에, 혼탁은 우레아로 인한 수정체 단백질 변화를 가장 달성할 수 있다. 추가적으로, 혼탁은 우레아-치료된 안구에서의 유리체가 투약 3일 후에 투명해지기 시작하기 때문에, 감염으로 인한 것은 아닐 것이다.
독성은 두 용량 모두에서 관찰되었다. 3일차부터, 기저부 영상화는 서브그룹 2a 및 2b 둘 모두에서 전달 부위(하 비강 유리체 세그먼트)에서 심각한 망막 폴딩 및 혈관 출혈 OD를 나타내었다. 다시, 이러한 결과는 OS에서 관찰되지 않았다. 폴딩 및 출혈은 3일차 내지 7일차 사이에서 최고조에 달하였고, 이후에, 침강되기 시작하였다. 29일차까지, 망막 폴딩의 일부 작은 그러나 영구적인 영역이 존재하였지만, 출혈은 기저부 이미지에서 더 이상 검출되지 않았다. 이의 선택적 국소화 및 시간 과정을 고려하여, 망막 폴딩 및 출혈 둘 모두는 우레아-관련될 수 있었다. 대표적인 이미지는 도 7a 및 도 7b에 도시되어 있다.
광 간섭성 단층촬영
OCT 영상화는 3일차에 서브그룹 2a 동물의 우측 안구(OD)에서 PVD를 나타내었다. 서브그룹 2b 동물에서, PVD는 4(AM 및 PM), 7 및 14일차에 OD에서 관찰되었다. PVD는 다른 영상화 시점에서 이러한 동물 OD에서 나타나지 않았다. 그러나, PVD가 비가역적이기 때문에, PVD는 임상적 안구 검사 동안 두 동물 모두의 OD에서 나타난 경우, PVD가 2일차 후의 모든 시점에서 두 동물 OD 모두에서 실제로 존재한다고 가정될 수 있고; 가장 가능하게는, 이러한 일차에서의 OCT 영상화는 PVD를 나타내는 영역을 캡처하지 못하였다. 동물은 임의의 시점에서 좌측 안구(OS)에서 PVD를 나타내지 않았다.
OCT 이미지는, 또한, 기저부 영상화에서 나타난 망막 폴딩의 영역이 망막이 주로 신경절 세포층에서 및 소수의 경우에, 내부 핵 세포층에서 분리된 구역임을 나타내었다. 망막 박리는 3일 내지 7일에 최고조를 나타내었고, 이후에, 망막 재-부착에 의해 반영된 것처럼 침전되기 시작하였다. 과-형광 세포의 실질적인 수는 재-부착 후 망막에서 관찰되었으며, 이는 면역 세포 침투를 나타내는 것으로 보인다.
대표적인 이미지는 도 8a 및 도 8b에 도시되어 있다.
실시예 6. 수정체내로 투여된 자유 우레아의 내약성 및 용량 반응
본 실시예는 뉴질랜드 백토끼의 안구(non-GLP) 내에 IVT 주사 후에 자유 우레아의 감소된(실시예 5와 비교하여) 농도의 내약성의 평가, 및 다양한 용량 강도 각각의 주사 후 PVD를 유도시키는데 걸리는 시간의 결정을 제공한다.
5 마리의 암컷 뉴질랜드 백토끼에는 두 안구 모두(OU) 내에 우레아 용액 IVT의 2.5, 5, 10, 25 및 50 ㎎/안구 용량의 단일 투여를 제공하였다.
연구에 배치하기 전에, 각 동물에게 안구 검사(슬릿-램프 생체형미경검사 및 간접 검안경검사)를 수행하였다. 안구 결과를 변형된 McDonald-Shadduck Scoring System에 따라 스코어링하였다. 연구 배취를 위한 허용 기준은 모든 변수에 대해 "0"의 스코어이다.
모든 절차를 멸균 기술을 이용하여 수행하였다. 동물을 IVT 주사, OCT, 및 B-스캔 영상화를 위하여, 케타민 염산염(영상화를 위해 50 ㎎/kg, IVT 주사를 위해 15 내지 30 ㎎/kg) 및 자일라진(5 ㎎/kg)의 IM 주사로 마취시켰다. 1 마리의 동물에 대하여, 영상화의 연장된 기간으로 인하여 기준선 영상화 동안 마취를 흡입된 아이소플루란(1.5 내지 2 ℓ/분 산소에서 1 내지 1.5%)을 통해 연장시켰다. 다른 동물에 대하여, 동물은 동일한 날에 이전에 기준선 영상화(케타민/자일라진 마취제를 포함함)를 수행되었기 때문에, 흡입된 아이소플루란(1.5 ℓ/분 산소에서 2%)을 사용하여 IVT 주사를 위해 동물을 마취시켰다. 1 내지 2 방울의 국소 프로파라카인 염산염 마취제(0.5%)를 수술 절차 이전에 동물의 안구에 적용하였다.
IVT 주사 이전에, 안구를 베타딘으로 세정하고, 이후에, BSS로 린스하였다. 5/8 인치 니들을 이용하여, 윤부로부터 3 내지 4 mm 떨어지게 주사를 수행하였다. 니들이 삽입된 직후에, 우레아 용액 또는 BSS를 주사하였다. 니들을 제거하고, 안구를 BSS로 린스하였다. 동물은 투약 직후에 회복되었고, 회복 동안 모니터링되었다. 삼중 항생제 안구 연구를 회복 동안 안구에 투여하였다.
연구 설계는 표 17에 요약되어 있다.
Figure 112019022475453-pct00018
동물을 35일차(± 4)에 안락사시키고, 이의 안구(전체 구체)를 수집하고, 조직병리학적 분석으로 처리하였다.
임상 시험 및 관찰
일반적인 건강 관찰을 0일차에 출발하여 매일 수행하였으며, 투약 이전 및 종료 이전에 체중을 기록하였다. 모든 동물은 연구 과정에 걸쳐 가벼운 체중 손실을 경험하였다. 체중 손실은 반복된 마취 과정, 반복된 취급 및 구속으로부터의 스트레스, 또는 시험 물품과 관련된 불편함, 또는 이러한 인자들의 조합으로부터 발행될 수 있다. 일반 동물 건강에 대한 약물 및/또는 연구 절차의 다른 부작용이 관찰되지 않았다.
안구 검사(슬릿-램프 생체형미경검사 및 간접 검안경검사)를 -3 또는 0(시험/대조 물품 투여 이전 기준선), 1, 4, 7 또는 8, 14, 21, 및 35일차에 수행하였다. 4일차 시험을 근무일의 개시에 수행하였다. 21일차 시험을 단지 그룹 1, 2 및 5에서 수행하였다. 안구 결과를 변형된 McDonald-Shadduck Scoring System에 따라 스코어링하였다. 모든 동물은 기준선 사전-스크리닝 시험 동안 안구 이상을 가지지 않았다. 관찰은 PVD의 발달 및 시간 과정의 평가를 포함하였다.
투여 후 21일차까지 일부 또는 모든 임상적 안구 검사 시점에서 모든 동물의 하나 또는 둘 모두의 안구에서 화장된 맥락막 및/또는 망막 혈관을 관찰하였다. 확장은 일반적으로, 주사 영역에서 제한되었다. 이러한 결과가 때때로 단지 BSS가 주사된 좌측 안구(OS)를 포함하는, 두 안구 모두에서 주목되기 때문에, 이러한 것은 우레의 효과보다는 IVT 주입 절차에 대한 반응일 가능성이 있다.
그룹 2(10 ㎎/안구 우레아) 동물에서의 경미한 결막 부종 및 우레아 투여 후 일자에서 관찰된 그룹 5(2.5 ㎎/안구 우레아) 동물에서 주사 부위 주변에서의 경미한 망막 출혈은 IVT 주사 절차로 인한 것일 수 있다.
시험 물품 투여 후 일자에 우레아-치료된 우측 안구(OD)에서 관찰된 그룹 4(50 ㎎/안구 우레아) 동물에서 후방 유정체낭 주변의 고리-형상 불투명도는 고농도의 우레아에 의한 수정체 조직의 자극으로 인한 것일 수 있다.
임의의 시험 동안에 PVD의 증거가 주목되지 않았다. PVD는 임상 안과 시험을 통해 시각화하기 어려웠다. 그러나, OCT 영상화는 PVD의 경우를 식별할 수 있었다(하기 참조).
기저부 사진법
기저부의 이미지를 -3 또는 0(약물 또는 BSS 투여 전 기준선), 1, 4, 7 또는 8, 14, 21, 및 35일차에 촬영하였다. 4일차 이미지를 근무일의 개시에 촬영하였다. 단지 그룹 1, 2 및 5의 21일차 이미지를 촬영하였다. 동물을 영상화를 위해 마취하지 않았다.
안구 비정상은 기저부 이미지에서 관찰되지 않았다. 대표적인 이미지는 도 9에 도시되어 있다.
광 간섭성 단층촬영
OCT를 -3 또는 0(시험/대조 물품 투여 전 기준선), 1, 4, 7 또는 8, 14, 21, 및 35일차에 수행하였다. 4일차 이미지를 근무일 시작에 촬영하였다. 단지 그룹 1, 2 및 5의 21일차 이미지를 촬영하였다. 동물을 상술한 바와 같이 마취시켰다. 매일 토끼당 총 8개의 이미지를 획득하였다.
우레아 투여 후의 일자에 출발하는 그룹 3 및 4 동물의 OCT 이미지에서 그리고, 우레아 투여 7일 후에 그룹 2 동물에서 망막 퇴화, 망막하액 및 망막염의 징후가 관찰되었다.
OCT 영상화는 표 18에 기술된 바와 같이, 치료된 안구(OD)에서 PVD를 나타내었다. PVD는 무세포 성분을 갖는 하부 진한/검정색 구역을 갖는 유리체 공동에서 세포 성분의 부분 라인으로서 관찰되었다. 대표적인 이미지는 도 10a 및 도 10b에 도시되어 있다.
Figure 112019022475453-pct00019
높은 우레아 농도는 PVD의 조기 발병 및 더욱 강력한 발달과 관련이 있었다. 그러나, 이러한 농도는 또한, 망막 퇴화, 망막하액 축적, 및 치료된 안구에서의 망막염 질환을 형성시켰다. 낮은 우레아 농도는 망막 무결성을 유지하였지만, 일부 및 덜 강력한 PVD와 관련이 있었다. PVD 및 망막 병리는 BSS-치료된 안구(OS)에서 나타나지 않았으며, 이는 두 결과 모두가 우레아-관련성이 있음을 확인한다.
모든 동물은 일부 또는 모든 시점에 유리체액에서 입자를 나타내었다. 입자는 주사된 우레아에 의해 망막 막으로부터 유리체액 내로 빠져나올 수 있다. 또한, 대부분의 동물에서 다양한 시점에 시신경에서의 입자가 보였다. 시신경 헤드에서 입자의 관찰은 부수적인 것으로 보이는데, 그 이유는 이러한 입자가 종종 안구의 병리의 부재 하에서도 관찰되기 때문이다. 그러나, 우레아의 존재는 입자를 이러한 영역 내로 추가로 끌어당김으로써 이러한 결과를 어느 정도 악화시킬 수 있다.
B-스캔 영상화
B-스캔 초음파 이미지를 -3 또는 0(시험/대조 물품 투여 전 기준선) 및 35일차에 촬영하였다. 그룹 4 동물의 35일차 B-스캔 이미지는 우측 안구(OD)에서 PVD의 증거를 나타내었지만, 좌측 안구(OS)에서는 나타나지 않았다. 다른 동물의 B-스캔 이미지에서, PVD가 검출되지 못할 수 있다. 대표적인 이미지는 도 11a 및 도 11b에 도시되어 있다.
조직병리학적 분석
수집된 조직의 조직병리학적 분석은 안구에 대한 우레아 또는 BSS의 부작용의 증거를 발견하지 못하였다. PVD는, 조직 취급 및 가공 절차 동안 기계적 파괴로 인해 망막으로부터의 유리체액의 분리가 용이하게 일어날 수 있기 때문에, 조직병리학적 분석 동안 결론적으로 평가하기 어려웠다.
실시예 7. 후방 안구 공간에서 리포솜 작제물의 국소화 및 효과
본 실시예는 광범위한 투약 농도의 유리체내 주사 직후 후방 안구 공간에서 리포솜 작제물의 물리적 위치의 관찰 및 치료 후 약물의 국소 효과를 평가하기 위해 제공한 것이다.
8마리의 암컷 뉴질랜드 백토끼를 다양한 농도의 리포솜-캡슐화된 및 자유 우레아를 함유한 조성물의 단일 유리체내 투약(0일차) 후에 1일차 또는 32일차 동안 관찰하였다. 리포솜은 제형 2(58 ㏖% DOPC, 42 ㏖% 콜레스테롤)이었다. 연구 설계는 표 19에서 요약되어 있다. 각 그룹은 1의 N을 갖는다.
Figure 112019022475453-pct00020
Figure 112019022475453-pct00021
본 연구의 전과정 시기 동안에, 명백한 약물-관련 임상 관찰, 체중 변화, 또는 비정상적인 음식 섭취가 존재하지 않는다. 주기적인 안과 검사에서는 수정체 혼탁(1일차, 7일차, 및 32일차, 아마도 약물에 의해 기여됨), 단백성 유리체 악화(proteinaceous vitreal flare)(32일차) 및 수정체 세포(vitreal cell)(32일차)를 나타내었다. 이러한 안과적 변화는 일반적으로 용량-의존성인 것으로 나타났다.
OCT 스캔은 Bioptigen Envisu를 통해 촬영되었으며, 고해상도 기저부 이미지는 MicronX를 통해서 약물 제품 개소를 캡처하고, 투약된 안구의 디지털 화상은 32일의 과정에 걸쳐 아이폰으로 촬영되었다. 모든 동물에 대한 기준선 이미지는 OCT, MicronX 및 디지털 카메라를 통해 획득되었다. 그룹 1 내지 그룹 4에 대하여, OS 안구의 치료는 단지 동물이 안구를 위쪽으로 향하게 하면서 옆으로 놓이게 하고, 약물 제품을 안구의 뒤쪽에 침전되게 하였다.
PVD는 모든 치료된 안구에서 농도 용량이 높을수록 반응 시간이 더 빠른 것으로 관찰되었다. 4주의 연구 전반에 걸쳐 유리체방 내측에 입자의 존재(혼탁)는 일반적으로, 사진술, 망막 영상화, 및 OCT에 의해 확인되었다. 또한, 투약 후에, 국소화된 불규칙적으로 형상화된 망막층(특히, 내부층)은 본 연구의 과정에 걸쳐 모든 용량 수준에서 OCT에 의해 관찰되었다. 망막 변화는 조밀하게 분포된 입자를 갖는 유리에 영역에 매우 근접하여 더 많이 일어날 수 있다.
가장 높은 리포솜 및 우레아 농도를 갖는 안구(그룹 8)가 낮은 반응 진폭을 나타낸다는 것을 제외하고, 32일차에 망막전위법(ERG)에서 명백한 비정상적인 광-유도 전기 반응이 관찰되지 않았으며(도 12a 및 도 12b), 이는 수용체의 기능의 감소를 나타낼 수 있다.
유리체 세포의 안과적 결과와 거의 일치하여, 조직병리학적 평가는 후안방 내에서 염증(경증 내지 중증, 거의 경증)을 나타내었다. 전체 구체의 적어도 2개의 완전한 시상 부문은 모든 연구 동물의 각 안구에 대해 시험되었다. 망막, 시신경, 유리체, 및 전방에 특별히 주의를 기울였다. 관련된 병변은 주로 호중구로 이루어진 급성 염증으로 이루어졌으며, 일반적으로 방의 뒤쪽 부근의, 후방에서 단핵구 세포, 적혈구 및 피브린의 산란이 일어난다. 울혈(congestion), 충혈, 및 일부 염증은 또한, 표면 망막에 존재하였다. 유리체의 미세한 가닥은 모든 안구에서 볼 수 있었고, 일반적으로, 망막 표면으로부터 분리된 것으로 보였다. 이러한 염증성 변화는 중증도에서 다양할 수 있고, 우레아의 농도와 직접적으로 관련된 것으로 보이지 않았다. 또한, 1일차 및 32일차의 결과들 간에 거의 차이가 없었다. 증가된 우레아 농도가 염증의 중증도와 관련이 있다고 가정하는 것이 논리적일 것이지만, 이는 분명하지 않다. 이는 매우 작은 그룹 크기로 인한 것일 수 있다. 망막으로부터 유리체 분리는 모든 그룹의 모든 안구에서 확인되었다. 그러나, 분리가 정상적인 조직 처리의 결과일 수 있기 때문에, 이러한 것이 약물과 관련이 있는지 여부는 분명하지 않다.
***
본 발명의 상기 특정 실시형태의 설명은 과도한 실험 없이, 그리고 본 발명의 일반적인 개념으로부터 벗어나지 않으면서, 당해 분야의 기술 내의 지식을 적용함으로써, 이러한 특정 실시형태를 다양한 적용을 위해 용이하게 변형시키고/시키거나 개조할 수 있다는 본 발명의 일반적인 특성을 완전히 나타낼 것이다. 이에 따라, 이러한 개작(adaptation) 및 변형(modification)은 본 명세서에 개시된 교시 및 지침을 기초로 하여, 개시된 실시형태의 의미 및 균등물의 범위 내에 속하는 것으로 의도된다. 본 명세서의 용어 또는 구가 교시 및 지침에 비추어 당업자에 의해 해석될 수 있도록, 본 명세서의 구 또는 용어가 설명의 목적을 위한 것으로서, 제한적이지 않은 것으로 이해되어야 한다. 본 발명은 하기 청구범위에 의해 추가로 기술된다.

Claims (22)

  1. 리포솜 작제물 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 대상체 안구의 유리체 망막 경계면에 전달하기 위한 약제학적 조성물로서, 상기 리포솜 작제물은 소형 단층 소포(small unilamellar vesicle: SUV)의 응집체를 포함하며, 상기 SUV는 58 ㏖% DOPC 및 42 ㏖% 콜레스테롤로 이루어진 라멜라를 포함하며, 상기 SUV는 상기 SUV 내에 캡슐화 된 우레아를 포함하며, 상기 SUV는 1.05보다 큰 비중, 220㎚ 미만의 z-평균 직경, 및 0.150 미만의 다분산 지수값(polydispersity index value: PdI)을 갖는, 약제학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 SUV가 200㎚ 미만의 z-평균 직경을 갖는, 약제학적 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 SUV의 라멜라가 표면 개질기를 포함하는, 약제학적 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 표면 개질기가 폴리에틸렌 글리콜(PEG)인, 약제학적 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 SUV가 적어도 20%의 캡슐화 효율을 갖는, 약제학적 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 SUV의 패킹된 펠릿이 패킹된 펠릿 1㎖당 적어도 100㎎ 캡슐화 된 우레아를 포함하는, 약제학적 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 약제학적으로 허용되는 담체가 우레아를 포함하는, 약제학적 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 에멀션 또는 현탁액 형태인, 약제학적 조성물.
  9. 제1항에 있어서, 황반 또는 망막의 질병 또는 장애에 걸리거나 걸리기 쉬운 대상체 치료용 약제학적 조성물.
  10. 제1항에 있어서, 대상체에서 당뇨병성 망막증(diabetic retinopathy) 또는 수정체 황반 부착(vitreomacular adhesion: VMA) 치료용 약제학적 조성물.
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