CN103145681A - 一种提取花青素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种提取花青素的方法。该方法包括:1)将含花青素的原料、分相盐、去离子水和亲水性有机溶剂混匀避光进行双水相提取,收集上相提取液;2)将步骤1)所得上相提取液浓缩,得到花青素粗提液;3)将步骤2)所得花青素的粗提液过大孔树脂柱进行吸附,吸附饱和后用水清洗所述大孔树脂,除杂直至水洗液为无色,再用洗脱液进行洗脱,收集洗脱液,干燥,得到所述花青素。该方法所得紫甘薯花青素符合紫甘薯色素标准,食用安全可靠,开发了一种新型、温和、易于产业化的花青素提取方法,并且增加了大孔树脂循环使用次数,提高了生产效率与紫甘薯花青素的提取率,降低了花青素的生产成本。
Description
技术领域
本发明涉及一种提取花青素的方法。
背景技术
近年来,由于合成色素的致突变、致畸和致癌等危害性,天然色素作为安全的食用色素日益受到人们的青睐。花青素(anthocyanins)是一类广泛存在于植物中的水溶性天然色素,属类黄酮化合物,因其具有较高的安全性,大多数国家(如中国、日本、美国、欧共体)都允许将其作为食品着色剂,美国FDA还将其列入无须食品添加剂许可证的着色剂。
20世纪80年代我国开始引进紫甘薯品种,之后培育出适合我国栽培的新品种,如紫薯135、烟紫337,烟紫176、徐薯4号、京薯16号、渝紫1号、群紫1号等。目前我国东北、河北、山东、江苏、广西、广东等省都有大面积种植。紫甘薯中含有大量的花青素,其主要成分为多种单酰化和双酰化的矢车菊色素和芍药色素。紫甘薯花青素具有较好的光热稳定性及抗氧化活性,并具有提高免疫力、视力和保护肝功能等生理功能,在食品、化工、化妆品及医药行业均具有较高的应用价值。
发明内容
本发明的目的是提供一种提取花青素的方法。
本发明提供的提取花青素的方法,包括如下步骤:
1)将含花青素的原料、分相盐、去离子水和亲水性有机溶剂混匀避光进行双水相提取,收集上相提取液;
2)将步骤1)所得上相提取液浓缩,得到花青素的粗提液;
3)将步骤2)所得花青素的粗提液过大孔树脂柱进行吸附,吸附饱和后用水清洗所述大孔树脂,除杂直至水洗液为无色,再用洗脱液进行洗脱,收集洗脱液,干燥,得到所述花青素。
上述方法的步骤1)中,所述含花青素的原料选自紫甘薯、紫玉米、紫马铃薯、紫甘蓝、蓝莓和葡萄中的至少一种,具体可为紫甘薯粉;该紫甘薯粉可按照如下步骤制备而得:将紫甘薯清洗、切片、干燥、粉碎而得;
所述含花青素的原料的目数为40-100目;
所述分相盐选自硫酸铵、硫酸镁、硫酸钾、磷酸氢二钾和磷酸二氢钾的至少一种;
所述亲水性有机溶剂选自乙醇、丙酮和甲醇中的至少一种。
双水相中分相盐、去离子水和亲水性有机溶剂的质量比为18-22∶51-61∶21-27,具体为20∶55∶25;
所述含花青素的原料与双水相体系的比例为1g∶10mL-100mL,具体为1g∶40mL;
所述双水相提取步骤中,离心转速为3000g/min-7000g/min,具体为5000g/min;温度为20-60℃,具体为25℃,时间为20-100分钟,具体为60分钟;pH值为1-5,具体为3。
所述步骤2)中,花青素的粗提液的固含量(也即固形物的质量百分含量)为1-20%,具体为20%;
所述浓缩步骤中,温度为40-60℃,具体为45℃。所用方法可为旋转蒸发;
所述步骤3)中,所述大孔树脂的型号为AB-8、NKA-2、NKA-9、X-5、X-8或D101;
吸附步骤中,大孔树脂柱的高度为20cm-100cm,具体为30cm;
直径为1cm-4cm,具体为3cm;
吸附温度为4℃-25℃,具体为4℃;
花青素的粗提液的流速为0.5mL/min-3.0mL/min,具体为1.0mL/min;
所述大孔树脂柱中填充的大孔树脂与花青素的粗提液的比例为0.01g-1.0g∶1mL,具体为0.05g∶1mL;
花青素的粗提液的pH值为1-4,具体为3。
洗脱步骤中,洗脱液为质量百分浓度为50-90%的乙醇水溶液,具体为70%的乙醇水溶液;
洗脱温度为4℃-25℃,具体为4℃;
洗脱液的流速为0.5mL/min-3.0mL/min,具体为1.0mL/min;
洗脱液的pH值为1-4,具体为3;
所述大孔树脂柱中填充的大孔树脂的质量与所述洗脱液的比例为100g∶200-800mL,具体为100g∶400mL。
干燥步骤中,干燥方法为喷雾干燥、真空干燥或冷冻干燥,应使其水分含量控制在10%以下。
本发明克服了现有方法存在的有机溶剂用量大、提取温度高、时间长、花青素纯度低等缺陷,提供一种提取花青素的新方法。该方法以紫甘薯为原料,经干燥粉碎得紫甘薯粉,然后利用双水相提取紫甘薯花青素,具有以下优点:
1、本方法与传统溶剂提取法的提取率相似,但所需有机溶剂较少,分离较快,在室温下即可进行提取,提取条件温和、时间短、能耗较低、纯度高和杂质少;
2、紫甘薯花青素中蛋白质和总糖含量降低了30%以上,有利于进一步分离纯化、生产高品质花青素;
3、双水相提取属于液-液提取的一种,只需要液-液提取法所涉及的混合、搅拌、分离等装置,无需增加新设备,易于产业化。
附图说明
图1为紫甘薯花青素双水相体系在试管中的状态。
图2为苯酚-硫酸法测定上相、下相总糖含量时葡萄糖的标准曲线。
图3为提取过程中硫酸铵质量分数对紫甘薯花青素提取率和回收率的影响。
图4为提取过程中硫酸铵质量分数对花青素、蛋白质和总糖分配系数的影响。
图5为大孔树脂对花青素的动态解析曲线。
图6为冷冻干燥所得紫甘薯花青素。
图7为实施例5所得产物的全光谱扫描谱图。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明的方法进行说明,但本发明并不局限于此。
下述实施例中所述实验方法,如无特殊说明,均为常规方法;所述试剂和材料,如无特殊说明,均可从商业途径获得。
下述实施例中所用的紫甘薯品种为“烟176”,购自河北省农林科学院。所用大孔树脂柱均购自SOLARBIO公司,型号为AB-8型号,平均孔径为0.3-1.25mm,比表面积为480m2/g,比照吸附量为55mg/g酚占干基。该大孔树脂柱的高度为30cm,直径为3cm。
实施例1、双水相提取步骤中硫酸铵用量
分别取1.8、1.9、2.0、2.1、2.2g无水硫酸铵加入一定质量pH值3.0的去离子水配成质量为7.5g的硫酸铵溶液,此硫酸铵溶液与2.5g无水乙醇混合(硫酸铵的质量分数分别为18%、19%、20%、21%和22%),加入0.5g100目的紫甘薯粉,充分搅拌均匀,形成双水相体系,室温下避光提取1h后,按照如下公式计算紫甘薯花青素的提取率、回收率、分配系数和蛋白质、总糖的分配系数。
花青素提取率(Y)=Ct1×Vt/M总
回收率(R)=Ct1×Vt/(Ct1×Vt+Cb1×Vb)
花青素分配系数(K1)=Ct1/Cb1
蛋白质分配系数(K2)=Ct2/Cb2
总糖分配系数的测定方法为苯酚-硫酸法,总糖以葡萄糖为标准计,所用标准曲线如图2所示,计算公式如下:
总糖分配系数(K3)=Ct3/Cb3
上述公式中,t1,Cb1为上相和下相花青素的浓度(mg/ml);
Ct2,Cb2为上相和下相蛋白质的浓度(mg/ml);
Ct3,Cb3为上相和下相总糖的浓度(mg/ml);
Vt,Vb为上相和下相的体积;
M总为总的花青素的含量;
所得结果分别如图3和图4所示。对于同一质量分数的乙醇,花青素提取率(Y)和回收率(R)均随着硫酸铵质量分数的增大而增大;但是,当硫酸铵质量分数大于为21%时,花青素提取率(Y)、回收率(R)和分配系数(K)变化不明显,并且花青素分配系数(K)可达到12,提取率(Y)可达到70%以上,这是因为乙醇的质量分数相同时,硫酸铵的质量分数增大,分相能力也增大,上相中乙醇的质量分数也就随之增加,而花青素在乙醇中的溶解度比水大,故花青素提取率(Y)、回收率(R)和分配系数(K)也随之增加。从图4中可以看出60%的总糖和40%的蛋白质分配在下相,减少了上相即花青素中的蛋白质和总糖的含量。因而,双水相提取步骤中硫酸铵的质量百分含量选20%为宜。
实施例2、pH值对大孔树脂静态吸附率的影响
1)取2.0g硫酸铵加入5.5g pH值为3.0的去离子水配成硫酸铵溶液后,与2.5g无水乙醇混合,加入到0.5g100目的紫甘薯粉(其中花青素的质量百分含量为0.31%)中,充分搅拌均匀,形成双水相体系,室温下避光进行双水相提取1h,在转速为5000g/min的条件下离心20min后,分液漏斗分相,收集上相提取液,如图1所示;
由图可知,上相和下相分界清晰,上相颜色较深,而下相颜色较浅,说明花青素较好的分配在上相。
2)将步骤1)所得上相提取液用旋转蒸发的方式,温度为45℃,转速为55r/min浓缩至固含量为20%,得到花青素的粗提液;
3)将步骤2)所得花青素的粗提液1500mL过AB-8型大孔树脂柱(含大孔树脂75g)于4℃进行吸附,粗提液的进样流速为1.0mL/min,pH值分别调节为1.0、2.0、3.0、4.0,吸附饱和,期间每隔20min取样,测定花青素溶液的吸光度A,计算吸附率,结果如表1所示。
吸附率=(A0-A终)/A0
式中A0:花青素溶液在吸附前的吸光度;
A终:吸附完全后的吸光度。
表1、紫甘薯花青素在不同pH值的吸附率
由表1可知,花青素的粗提液的pH值在1-3范围内时,树脂的吸附率随酸度变化差异不显著(p<0.05),与pH值为4时存在显著性差异,因此,实验中花青素的粗提液的pH值调节为3。
实施例3、AB-8型大孔树脂循环使用次数对花青素的回收率的影响
将实施例2步骤2)所得花青素的粗提液1500mL过AB-8型大孔树脂柱(含大孔树脂75g)于4℃进行吸附,粗提液的进样流速为1.0mL/min,pH值为3.0,吸附饱和后用水清洗所述大孔树脂,除杂直至水洗液为无色,再用pH值为3.0、质量百分浓度为70%的乙醇水溶液作为洗脱液进行洗脱,洗脱液流速为1.0mL/min收集洗脱液。此为循环1次;对大孔树脂进行水洗,直至无乙醇流出。
然后重复以上步骤,按照如下公式计算回收率:
花青素的回收率=洗脱液中矢车菊素-3-葡萄糖苷含量/粗提液矢车菊素-3-葡萄糖苷含量×100%,
所得结果见表2。
表2、AB-8大孔树脂循环使用次数对花青素的回收率的影响
由表2可知,循环使用次数在7次以内对花青素的回收率影响不大。
实施例4、紫甘薯花青素溶液的动态解吸
将实施例2步骤2)所得花青素的粗提液1500mL过AB-8型大孔树脂柱(含大孔树脂75g)于4℃进行吸附,粗提液的进样流速为1.0mL/min,pH值为3.0,吸附饱和后用水清洗所述大孔树脂,除杂直至水洗液为无色,再用pH值为3.0、质量百分浓度为70%的乙醇水溶液作为洗脱液进行洗脱,洗脱液流速为1.0mL/min收集洗脱液,动态解吸曲线如图5所示。
由图可知,在解吸过程中当解吸液体积到达70mL时解吸液的吸光度最高,达到150mL时大部分花青素被解吸下来。
实施例5、紫甘薯花青素矢车菊素-3-葡萄糖苷的提取
1)取2.0g硫酸铵加入5.5g pH值为3.0的去离子水配成硫酸铵溶液后,与2.5g无水乙醇混合,加入到0.5g100目的紫甘薯粉(其中花青素的质量百分含量为0.31%)中,充分搅拌均匀,形成双水相体系,室温下避光进行双水相提取1h,在转速为5000g/min的条件下离心20min后,分液漏斗分相,收集上相提取液。
2)将步骤1)所得上相提取液用旋转蒸发的方式,温度为45℃,转速为55r/min浓缩至固含量为20%,得到花青素的粗提液;
3)将步骤2)所得花青素的粗提液1500mL过AB-8型大孔树脂柱(含大孔树脂75g)于4℃进行吸附,粗提液的进样流速为1.0mL/min,pH值为3.0,吸附饱和后用水清洗大孔树脂,除杂直至水洗液为无色,再用pH值为3.0、质量百分浓度为70%的乙醇水溶液作为洗脱液进行洗脱,洗脱液流速为1.0mL/min收集洗脱液,将洗脱液旋转蒸发除去乙醇;用冷冻干燥的方法,温度为-45℃,真空度为10Pa,时间为24h进行干燥,得到最终产物,实物照片如图6所示。由图可知,所得花青素为紫红色,色泽均一。
称取上述所得花青素1g,溶于100mL去离子水中,进行全光谱扫描,全光谱扫描,所得结果如图7所示。
由上可知,该产物在300nm和520nm有两个吸收峰,520nm是花青素的特征吸收峰,300nm有吸收峰说明该花青素结构是被酰基化的。由此可知,该产物结构正确,为花青素,矢车菊素-3-葡萄糖苷的含量为2.97%。
紫甘薯花青素的提取率为91.02%,分配系数为19.62;
步骤2)花青素的粗提液中,紫甘薯花青素的色价为8.07;
步骤3)紫甘薯花青素纯品的色价为25.4。
按照下述方法对所得花青素中的矢车菊素-3-葡萄糖苷、色价、pH值、铅、砷的含量进行测定:
1、矢车菊素-3-葡萄糖苷含量测定:准确称取一定量的固体样品,用去离子水溶解后,稀释定容至50mL,此为待测样品的储备液。吸取两份等量的储备液,分别用pH1.0的缓冲溶液和pH4.5的缓冲溶液稀释定容至50mL,此为试样液。储备液的最大取样量应不超过10mL,以保证不超出缓冲溶液的缓冲能力。用pH1.0的缓冲溶液对储备液进行适当稀释,直到520nm下的吸光度值在分光光度计的线性范围内。采用这个稀释倍数,制备两份试样液,一个用pH1.0的缓冲溶液稀释,另一个用pH4.5的缓冲溶液稀释。在520nm和700nm波长下测定吸光光度值,以水做空白。样品制备完毕后要求在20min~50min的时间以内测定吸光光度值。
注:在700nm波长下测定吸光光度值是为了校正混浊对测定结果的干扰。如果稀释后的样品过于混浊,测定前采用离心或过滤的方法进行澄清处理。采用的过滤器不能吸收花青素。
结果计算:
矢车菊-3-葡萄糖苷含量(%)=A×DF/(ε×L)×103×MW×V×10-3/m,
式中,A=(A520nm-A700nm)pH1.0-(A520nm-A700nm)pH4.5;
MW(分子量)-矢车菊-3-葡萄糖苷的分子量,449.2g/mol;
DF-样品储备液的稀释倍数;
L-光路长,cm;
ε-矢车菊-3-葡萄糖苷的摩尔消光系数,269000L×mol-1×cm-1;
103-由g换算成mg的转换系数;
V-储备液的体积,mL;
m-样品的重量,mg。
2、色价的测定:精确称取样品0.1g~0.2g,用pH3.0柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液定容至100mL(吸光光度值应控制在0.3~0.7之间),用1cm比色皿以缓冲溶液作空白,在530nm±5nm下测定吸光光度值。
E1% 1cm(530±5)nm=A/m
式中:A-吸光光度值;
m-样品的质量,g;
E1% 1cm-色价,即浓度为1%的被测样品溶液在1cm比色皿内在530nm±5nm范围内的最大吸收峰的吸光光度值。
3、pH值的测定:称取1g样品,用100mL容量瓶以去离子水定容至刻度,摇匀,用精度为0.01pH的酸度计测定样液pH值。
4、灰分测定:灰分测定参照GB5009.4-2010的方法。具体步骤为:取大小适宜的瓷坩埚置马弗炉中,在550℃±25℃下灼烧0.5h,冷却至200℃左右,取出,放入干燥器中冷却30min,准确称量。重复灼烧至前后两次称量相差不超过0.5mg为恒重。然后,取3g~10g(精确至0.0001g)样品置于瓷坩埚中,先在电热板上以小火加热使样品充分炭化至无烟,然后置于马弗炉中,在550℃±25℃灼烧4h。冷却至200℃左右,取出,放入干燥器中冷却30min,称量前如发现灼烧残渣有炭粒时,应向试样中滴入少许水湿润,使结块松散,蒸干水分再次灼烧至无炭粒即表示灰化完全,方可称量。重复灼烧至前后两次称量相差不超过0.5mg为恒重。按下式计算。
X1=100×(m1-m2)/(m3-m2)
X1-试样中灰分含量,g/100g;
m1-坩埚和灰分的质量,g;
m2-坩埚的质量,g;
m3-坩埚和试样的质量,g。
注:在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的5%。
5、铅的测定:参照GB5009.12-2010中第一法石墨炉原子吸收光谱法测定。将各仪器性能调至最佳状态。参考条件为波长283.3nm,狭缝0.2nm~1.0nm,灯电流5mA~7mA,干燥温度120℃,持续20s;灰化温度450℃,持续15s~20s,原子化温度:1700℃~2300℃,持续4s~5s,背景校正为氘灯或塞曼效应。绘制标准曲线,吸取上面配制的铅标准使用液10.0ng/mL(或μg/L),20.0ng/mL(或μg/L),40.0ng/mL(或μg/L),60.0ng/mL(或μg/L),80.0ng/mL(或μg/L)各10μL,注入石墨炉,测得其吸光值并求得吸光值与浓度关系的一元线性回归方程为y=0.0001x-0.0098(R2=0.9981)。分别吸取样液和试剂空白液各10μL,注入石墨炉,测得其吸光值,代入标准系列的一元线性回归方程中求得样液中铅含量。试样中铅含量按下式进行计算。
X=(c1-c0)×V×1000/(m×1000×1000)
式中:
X-试样中铅含量,mg/kg或mg/L;
c1-测定样液中铅含量,ng/mL;
c0-空白液中铅含量,ng/mL;
V-试样消化液定量总体积,mL;
m-试样质量或体积,g。
6、砷的测定(砷斑法):称取1g±0.01g实验室样品,加盐酸试剂5mL,再加水至30mL溶解后,按GB/T5009.76第二法砷斑法测定。量取3mL±0.05mL砷标准溶液(含0.003mg砷),制备砷限量标准液。供试品溶液与砷标准溶液3mL(含砷0.003mg)制成的对照液比较,不得更深。
所得结果见表3。
表3、紫甘薯花青素成分表
紫甘薯色素作为着色剂的标准如下:矢车菊素-3-葡萄糖苷(w/%)≥1%,pH为2.0-5.0,色价≥5.0,灰分≤4%,铅(Pb)(mg/kg)≤3.0,砷(以As计)(mg/kg)≤2.0,由表3可知,紫甘薯花青素符合上述标准,可以作为着色剂使用。
Claims (10)
1.一种提取花青素的方法,包括如下步骤:
1)将含花青素的原料、分相盐、去离子水和亲水性有机溶剂混匀避光进行双水相提取,收集上相提取液;
2)将步骤1)所得上相提取液浓缩,得到花青素的粗提液;
3)将步骤2)所得花青素的粗提液过大孔树脂柱进行吸附,吸附饱和后用水清洗所述大孔树脂,除杂直至水洗液为无色,再用洗脱液进行洗脱,收集洗脱液,干燥,得到所述花青素。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:所述步骤1)中,所述含花青素的原料选自紫甘薯、紫玉米、紫马铃薯、紫甘蓝、蓝莓和葡萄中的至少一种;或,
所述含花青素的原料的目数为40-100目;或,
所述分相盐选自硫酸铵、硫酸镁、硫酸钾、磷酸氢二钾和磷酸二氢钾的至少一种;或,
所述亲水性有机溶剂选自乙醇、丙酮和甲醇中的至少一种。
3.根据权利要求1或2所述的方法,其特征在于:所述步骤1)双水相中,分相盐、去离子水和亲水性有机溶剂的质量比为18-22∶51-61∶21-27,具体为20∶55∶25;或,
所述含花青素的原料与双水相的用量比为1g∶10mL-100mL,具体为1g∶40mL。
4.根据权利要求1-3任一所述的方法,其特征在于:所述双水相提取步骤中,离心转速为3000g/min-7000g/min,具体为5000g/min;或,
温度为20-60℃,具体为25℃;或,
时间为20-100分钟,具体为60分钟;或,
pH值为1-5,具体为3。
5.根据权利要求1-4任一所述的方法,其特征在于:所述步骤2)中,花青素的粗提液的固含量为1%-20%,具体为20%;或,
所述浓缩步骤中,温度为40℃-60℃,具体为45℃。
6.根据权利要求1-5任一所述的方法,其特征在于:所述步骤3)中,所述大孔树脂的型号为AB-8、NKA-2、NKA-9、X-5、X-8或D101。
7.根据权利要求1-6任一所述的方法,其特征在于:所述步骤3)中,大孔树脂柱的高度为20cm-100cm,具体为30cm;或,
直径为1cm-4cm,具体为3cm。
8.根据权利要求1-7任一所述的方法,其特征在于:所述步骤3)吸附步骤中,吸附温度为4℃-25℃;或,
花青素的粗提液的流速为0.5mL/min-3.0mL/min,具体为1.0mL/min;或,
所述大孔树脂柱中填充的大孔树脂与花青素的粗提液的用量比为0.01g-1.0g∶1mL,具体为0.05g∶1mL;或,
花青素的粗提液的pH值为1-4,具体为3。
9.根据权利要求1-8任一所述的方法,其特征在于:所述步骤3)洗脱步骤中,洗脱液为质量百分浓度为50-90%的乙醇水溶液,具体为70%的乙醇水溶液;或,
洗脱温度为4℃-25℃,具体为4℃;或,
洗脱液的流速为0.5mL/min-3.0mL/min,具体为1.0mL/min;或,
洗脱液的pH值为1-4,具体为3;或,
所述大孔树脂柱中填充的大孔树脂的质量与所述洗脱液的用量比为100g∶200-800mL,具体为100g∶400mL。
10.根据权利要求1-9任一所述的方法,其特征在于:所述步骤3)干燥步骤中,干燥方法为喷雾干燥、真空干燥或冷冻干燥。
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