CN103142468A - 用于眼角膜移植的他克莫司眼用剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

用于眼角膜移植的他克莫司眼用剂及其制备方法，属于药物制剂领域，具体涉及用于角膜移植的他克莫司眼用前体囊泡剂及其制备方法。前体囊泡剂是由下列质量百分比的原料组成：他克莫司0.04~0.8%，表面活性剂4.0~41.0%，胆固醇1.6~8.0%，卵磷脂4.0~41.0%，醇1.2~30%，其余为水或0.1%甘油水溶液或PH7.4磷酸缓冲液，表面活性剂是为司盘、吐温、聚氧乙烯醚蓖麻油、泊洛沙姆中的一种，醇为乙醇、异丙醇、丁醇、丙醇中的一种。他克莫司前体囊泡剂具有限量的水分，提高了制剂贮存稳定性；产品将前体囊泡剂的优点、眼部给药系统的特点及他克莫司药物的主治病症有机结合，达到提高疗效，减少副作用，给方便等优点；制备工艺简便，适合工业化生产。

Description

用于眼角膜移植的他克莫司眼用剂及其制备方法

技术领域

本发明属于药物制剂领域，更具体涉及一种用于眼角膜移植的他克莫司眼用前体囊泡剂及其制备方法。

背景技术

角膜疾病是目前主要的致盲角膜病，角膜移植手术是治疗此类疾病最直接和有效的方法，而角膜移植手术后的免疫排斥反应是失败的主要原因。目前临床采用皮质类固醇、免疫抑制剂和环孢素A等一些药物来降低免疫排斥反应发生率。糖皮质激素是防治术后移植排斥反应的主要手段，但是其长期应用不仅可以导致多种并发症，而且往往不能有效的抑制高危角膜移植术后的排斥反应。环孢素A在眼科的应用越来越广泛，但是环孢素滴眼液为油溶性溶剂，其滴入后患者顺应性不好，且易发生过敏。临床试验表明，他克莫司在心、肺、肠、骨髓等移植中的应用有很好的疗效。同时其在治疗自身免疫性疾病、眼过敏性疾患，以及角膜移植后的免疫排斥反应均有良好的疗效。

他克莫司（Tacrolimus，FK506）是一种大环内酯类新型免疫抑制剂，由一个半酮基，α、β双酮基及23个环组成，其分子式为C44H69NO12·H2O，分子量为822.5。室温下呈白色结晶或晶状粉末，在固体状态下相对稳定，不溶于水，溶于甲醇、丙酮、氯仿、乙醇、乙酸乙酯等非极性溶剂。呈亲脂疏水性，其熔点为127~129°C。

目前，他克莫司在临床广泛上应用于器官移植的抗排斥反应和治疗自身免疫系统疾病，在眼科领域已用于角膜移植术后与免疫相关眼病的治疗。他克莫司属钙调蛋白磷酸酶抑制剂，其免疫抑制作用机制与环孢素A相似，但抑制T 细胞活性的能力比环孢素 A强100倍。其作用机制是通过抑制相关细胞因子转录因子的活性来抑制淋巴细胞活化。他克莫司通过与细胞内蛋白FKBP-12结合，形成由他克莫司-FKBP-12、钙、钙调蛋白和钙调磷酸酶构成的复合物，从而抑制钙调磷酸酶的激活，阻止活化T细胞核转录因子(NF-AT)的去磷酸化和易位，NF-AT这种核成分会启动基因转录形成淋巴因子。他克莫司还可以抑制编码IL-3、IL-4、IL-5、GM-CSF和TNF-α的基因的转录，所有这些因子都参与早期阶段的T细胞活化，细胞因而受到抑制，从而发挥强大的免疫抑制作用。经FK506治疗的角膜植片，排斥反应的相关因子和细胞表达明显降低。

目前，藤泽药品工业公司的他克莫司胶囊、注射液已广泛用于治疗肝、肾和骨髓移植的急性排斥治疗，现已经作为预防、治疗排斥反应以及自身免疫性疾病的一线药物。他克莫司获批准上市的外用制剂为他克莫司软膏（tacrolimus ointment，商品名普特彼），其适应症是中至重度特应性皮炎患者，作为短期或间歇性长期治疗。基于眼部给药的敏感性和刺激性，未见有他克莫司软膏直接眼部局部给药用于治疗移植后免疫排斥反应的报道。

他克莫司吸收的个体差异较大，广泛分布于各组织中，入血后大部分通过胆汁排泄，对肝功能不全的患者需调整剂量。同时，他克莫司与其他免疫抑制剂一样存在毒副作用：可引起肾功能损伤、高血压、高血糖、白细胞增多及高钾低镁血症；肾毒性、神经毒性和消化道副作用较明显。他克莫司的副作用与给药途径相关，静脉给药的副作用大于口服，文献报道中动物实验结果表明，眼局部给药可明显减少全身用药时的副作用。目前他克莫司用于角膜移植免疫排斥反应的临床使用方式有两种：全身用药和局部用药。其中，全身用药包括腹腔内注射和肌肉注射。

目前我国尚无上市的他克莫司眼用制剂，据文献“中国医院药学杂志 2005,14（11）：715-716”报道了他克莫司滴眼液的制备及临床应用，其他克莫司滴眼液由他克莫司、羟丙甲纤维素、氯化钠和硫柳汞等组成，在文献“中国医院药学杂志 2009,29（22）1951-1952” 报道了他克莫司滴眼液的质量控制及稳定性考察，这类滴眼液稳定性很差，经典恒温加速试验预测储存有效期结果表明，他克莫司滴眼液在25°C的有效期仅为46.69天，在4°C贮存的有效期约为2.55年。由文献报道结果可知，他克莫司水溶液稳定性较差，不利于产品的运输和贮存。另外，滴眼液用于局部滴眼时，易被快速清除，并且由于他克莫司具有分子量大和不溶于水的理化特点，使其局部应用时的眼内吸收差，不能产生有效的眼内药物浓度。

随着新剂型新技术的研究，文献报道他克莫司眼用新剂型有脂质体、环糊精包合物、纳米粒和缓释胶原药膜等。他克莫司脂质体制剂的主要缺点是灭菌消毒困难，制备复杂且成本较高，易氧化产生毒性，所以临床应用较为困难；他克莫司环糊精包合物滴眼液用于眼部局部给药后，眼表药物易被快速清除，药物难维持较长时间药效；他克莫司纳米粒制剂可以延长药物在角膜的滞留时间并且提高药物进入角膜浓度，但是纳米粒制剂在制备过程中易带入有机溶剂，残留溶剂不被临床所接受；他克莫司缓释胶原药膜是外型类似角膜接触镜的半透明柔软的薄膜，由猪或牛巩膜提取而成，其不易实现工业化生产，患者顺应性差。

他克莫司的强疏水性和遇水不稳定的特点决定了它在局部眼用时存在的问题：遇水易于异构化，眼内通透性差，难于在眼内达到有效治疗水平，使其生物利用度较低。因此，为克服上述问题研制和开发一种良好的他克莫司眼部局部应用的制剂：可以提高他克莫司的稳定性，延长药物作用时间；有效增强药物在眼角膜移植术后治疗和预防免疫排斥反应的疗效，减少眼睛局部用药的刺激性、并且避免他克莫司全身应用的毒副作用；易于实现工业化大生产，具有较强实用性。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于眼角膜移植的眼局部用药制剂及提供其制备方法。

为达到本发明的目的，采用的技术方案是提供一种眼角膜移植的他克莫司眼用剂，它是将他克莫司制成眼用前体囊泡剂，前体囊泡剂是由下列质量百分比的原料组成，

他克莫司      0.04~0.8%

表面活性剂    24.0~41.0%

胆固醇        1.6~8.0%

卵磷脂        24.0~41.0%

醇            1.2~30%

其余为水或体积百分浓度为0.1%的甘油水溶液或PH7.4的磷酸缓冲液，

所说的表面活性剂是为司盘20、司盘40、司盘60、司盘80、吐温20、吐温60、吐温80、聚氧乙烯醚蓖麻油、泊洛沙姆中的一种，

所说的醇为乙醇、异丙醇、丁醇、丙醇中的一种。

为达到本发明的另一目的，本发明所提供的眼角膜移植的他克莫司眼用剂的制备方法是：

（1）按下列质量百分比的原料配备

他克莫司      0.04~0.8%

表面活性剂    24.0~41.0%

胆固醇        1.6~8.0%

卵磷脂        24.0~41.0%

醇            1.2~30%

其余为水或体积百分浓度为0.1%的甘油水溶液或PH7.4的磷酸缓冲液，

所说的表面活性剂是为司盘20、司盘40、司盘60、司盘80、吐温20、吐温60、吐温80、聚氧乙烯醚蓖麻油、泊洛沙姆中的一种，

所说的醇为乙醇、异丙醇、丁醇、丙醇中的一种；

（2）称取表面活性剂、醇、卵磷脂、胆固醇、他克莫司于容器中，搅拌下加热至65±5°C，搅拌均匀至各组分完全溶解，呈均一透明状，作为溶液1；

（3）搅拌下向溶液1中滴加水或体积百分浓度为0.1%的甘油水溶液或PH7.4的磷酸缓冲液，在65°±5°C下继续搅拌加热至溶液混合均匀，将混合液取出继续搅拌至室温，呈黏稠凝胶态即得他克莫司前体囊泡剂。

依照中国药典2010版缓冲液项下规定配制PH7.4的磷酸缓冲液，配制方法为：甲液：取无水磷酸二氢钠8g，加水溶解，并稀释至1000ml。乙液：取无水磷酸氢二钠9.47g，加水溶解，并稀释至1000ml。取上述甲液6ml与乙液400ul混合，摇匀，即得。

成品制剂可另配有瓶装的生理盐水，根据成品制剂的不同规格，分别分装至5ml、10ml、20ml滴眼液塑料瓶中，病人使用前将瓶装生理盐水全部加入他克莫司前体囊泡制剂中，振摇使前体囊泡制剂充分遇水水化为囊泡，最终为含他克莫司0.01%~1%囊泡滴眼液。

本发明采用安全、无刺激性的表面活性剂作为主要组分，适合应用到眼部敏感部位，具有无刺激性、生物相容性好、长期使用无毒副作用等优点。他克莫司作为高疏水性的大环内酯类药物，遇水会不稳定，易于异构化。本发明将他克莫司制备成眼用前体囊泡制剂，制剂体系含限量的水，既增强了药物在载体中的溶解度，又避免药物遇见水快速异构化。前体囊泡制剂外观呈现凝胶态，使用前加生理盐水振摇即能迅速自组装成囊泡而将药物包载起来，囊泡滴眼液滴入眼睛具有增强治疗，刺激性小的特性。该体系是一种有效的眼用新剂型，有广阔的开发前景。

本发明的优点：

1、囊泡剂是继脂质体之后具有更多优良特性的药物载体，不仅可以增加药物的角膜通透性，而且能起到缓释、靶向、降低毒性等作用，在眼部给药系统中显示出了良好的开发潜能。前体囊泡剂具有限量的水分，提高了制剂贮存稳定性，为难溶性药物及稳定性差的药物研究提供了新的思路。2、本发明的产品将前体囊泡剂的优点、眼部给药系统的特点及他克莫司药物的主治病症有机结合，达到提高疗效的目的，降低毒性，减少副作用，给药方便、非侵入性、无痛等特点，可提高患者的顺应性；3、制备工艺简便，适合工业化生产。

下面通过实施例进一步阐述本发明的技术方案和进步。

制备得到的前体囊泡制剂稳定性好，遇水水化后得到的囊泡平均粒径约为1um，制备工艺简单，重复性好。该体系具有相当好的热力学稳定性，不仅适合于实验室研究，更易于实现工业化大生产。总之，该囊泡体系适合于他克莫司等难溶性药物的传递及载体应用。

具体实施方式

下面提供了本发明制剂有代表性的实施例，这些实施例仅仅用于说明本发明，而不对保护范围造成限制。

实施例1  他克莫司眼用前体囊泡剂的制备

制备工艺：

称取吐温-80 24.3g、乙醇 27g、大豆卵磷脂 24.3g、胆固醇 2.7g，在水浴65±5°C加热并不断搅拌至各组分完全溶解呈均一透明状，在磁力搅拌下向混合液中加入他克莫司原料药0.08g ，继续在65±5°C下搅拌至药物完全溶解在混合液中，作为溶液1；磁力搅拌下向溶液1中逐滴加入注射用水21.62g，65±5°C继续加热搅拌至溶液混合均匀，将混合液从水浴中取出并磁力搅拌至其温度降至室温，混合物呈黏稠凝胶态即得100g他克莫司前体囊泡剂。

将他克莫司前体囊泡自动灌装至5ml、10ml、20ml滴眼瓶中，三种规格，装量分别为2.5g、6.25g、12.5g，临床使用时随成品制剂另分别附2ml、5ml和10ml注射用生理盐水，临用前将生理盐水加入他克莫司前体囊泡滴眼液瓶中，振摇使其完全水化即得含他克莫司药量为0.1%的囊泡剂，可直接用于滴眼。

实施例2  他克莫司眼用前体囊泡制剂的制备：

制备工艺： 

称取司盘-80、乙醇、大豆卵磷脂、胆固醇，在水浴65±5°C加热并不断搅拌至各组分完全溶解呈均一透明状，搅拌下向混合液中加入他克莫司原料药，继续在65±5°C下搅拌至药物完全溶解在混合液中，作为溶液1；搅拌下向溶液1中逐滴加入注射用水，65±5°C继续加热搅拌至溶液混合均匀，将混合液从水浴中取出并搅拌至其温度降至室温，混合物呈黏稠凝胶态即得224g他克莫司前体囊泡剂。

将他克莫司前体囊泡自动灌装至5ml、10ml、20ml滴眼瓶中，三种规格，装量分别为2g、5g、10g，临床使用时随成品制剂另分别附2ml、5ml和10ml注射用生理盐水，临用前将生理盐水加入他克莫司前体囊泡滴眼液瓶中，振摇使其完全水化即得他克莫司囊泡液，含药量为0.5%，可直接用于滴眼。

实施例3  他克莫司眼用前体囊泡制剂的制备

制备工艺： 

称取泊洛沙姆-188、乙醇、蛋黄卵磷脂、胆固醇，在水浴65±5°C加热并不断搅拌至各组分完全溶解呈均一透明状，在搅拌下向混合液中加入他克莫司原料药0.5g ，继续在65±5°C下搅拌至药物完全溶解在混合液中，作为溶液1；搅拌下向溶液1中逐滴加入0.1%甘油水溶液，65±5°C继续加热搅拌至溶液混合均匀，搅拌下让其温度降至室温，混合物呈黏稠凝胶态即得100g他克莫司前体囊泡剂。

将他克莫司前体囊泡自动灌装至5ml、10ml、20ml滴眼瓶中，三种规格，装量分别为2g、5g、10g，临床使用时随成品制剂另分别附2ml、5ml和10ml注射用生理盐水，临用前将生理盐水加入他克莫司前体囊泡滴眼液瓶中，振摇使其完全水化即得他克莫司囊泡液，含药量为0.5%，可直接用于滴眼。

实施例4  他克莫司眼用前体囊泡制剂的制备

制备工艺： 

称取司盘60、乙醇、蛋黄卵磷脂、胆固醇，在水浴65±5°C加热并搅拌至各组分完全溶解呈均一透明状，向混合液中加入他克莫司原料药0.4g ，继续在65±5°C下搅拌至药物完全溶解在混合液中，作为溶液1；搅拌下向溶液1中逐滴加入PH7.4磷酸盐缓冲溶液15g，至溶液混合均匀，搅拌下让其温度降至室温，混合物呈黏稠凝胶态即得100g他克莫司前体囊泡剂。

将他克莫司前体囊泡剂自动灌装至5ml、10ml、20ml滴眼瓶中，三种规格，装量分别为2.5g、6.25g、12.5g，临床使用时随成品制剂另分别附2ml、5ml和10ml注射用生理盐水，临用前将生理盐水加入他克莫司前体囊泡滴眼液瓶中，振摇使其完全水化即得他克莫司囊泡液，含药量为0.5%，可直接用于滴眼。

实施例5  他克莫司眼用前体囊泡制剂的制备

称取如下原料：

制备工艺： 

称取聚氧乙烯醚蓖麻油、乙醇、卵磷脂、胆固醇，在水浴65±5°C加热并搅拌至各组分完全溶解呈均一透明状，搅拌下向混合液中加入他克莫司原料药0.5g ，至药物完全溶解在混合液中，作为溶液1；搅拌下向溶液1中逐滴加入纯水3.5g，继续加热搅拌至溶液混合均匀，搅拌下让其温度降至室温，混合物呈黏稠凝胶态即得100g他克莫司前体囊泡剂。

将他克莫司前体囊泡自动灌装至5ml、10ml、20ml滴眼瓶中，三种规格，装量分别为2g、5g、10g，临床使用时随成品制剂另分别附2ml、5ml和10ml注射用生理盐水，临用前将生理盐水加入他克莫司前体囊泡滴眼液瓶中，振摇使其完全水化即得他克莫司囊泡液，含药量为0.5%，可直接用于滴眼。

实施例6  他克莫司眼用前体囊泡制剂的制备

制备工艺： 

称取泊洛沙姆407、乙醇、卵磷脂、胆固醇，在水浴65±5°C加热并不断搅拌至各组分完全溶解呈均一透明状，在搅拌下向混合液中加入他克莫司原料药，继续搅拌至药物完全溶解在混合液中，作为溶液1；搅拌下向溶液1中逐滴加入PH7.4的磷酸盐缓冲溶液，继续加热搅拌至溶液混合均匀，然后搅拌下让其温度降至室温，混合物呈黏稠凝胶态即得他克莫司前体囊泡剂。

将他克莫司前体囊泡自动灌装至5ml、10ml、20ml滴眼瓶中，三种规格，装量分别为2.5g、6.25g、12.5g，临床使用时随成品制剂另分别附2ml、5ml和10ml注射用生理盐水，临用前将生理盐水加入他克莫司前体囊泡滴眼液瓶中，振摇使其完全水化即得他克莫司囊泡液，含药量为1%，可直接用于滴眼。

 实施例7  他克莫司眼用前体囊泡制剂的制备

称取吐温20、乙醇、卵磷脂、胆固醇于容器中，水浴65±5°C下加热并不断搅拌至各组分完全溶解呈均一透明状，在搅拌下向混合液中加入他克莫司原料药0.08g，搅拌至药物完全溶解在混合液中，作为溶液1；搅拌下向溶液1中逐滴加入体积百分浓度为0.1%的甘油水溶液，继续加热搅拌至溶液混合均匀后让其温度降至室温，混合物呈黏稠凝胶态即得他克莫司前体囊泡剂。

将他克莫司前体囊泡自动灌装至5ml、10ml、20ml滴眼瓶中，三种规格，装量分别为2.5g、6.25g、12.5g，临床使用时随成品制剂另分别附2ml、5ml和10ml注射用生理盐水，临用前将生理盐水加入他克莫司前体囊泡滴眼液瓶中，振摇使其完全水化即得他克莫司囊泡液，含药量0.01%，可直接用于滴眼。

实施例8  他克莫司眼用前体囊泡制剂的制备

称取如下原料：

称取司盘40、乙醇、大豆卵磷脂、胆固醇，水浴加热并搅拌至各组分完全溶解呈均一透明状，在搅拌下向混合液中加入他克莫司原料药，至药物完全溶解在混合液中，作为溶液1；搅拌下向溶液1中逐滴加入体积百分浓度为0.1%的甘油水溶液，继续加热搅拌至溶液混合均匀，并搅拌至其温度降至室温，混合物呈黏稠凝胶态即得他克莫司前体囊泡剂。

将他克莫司前体囊泡自动灌装至5ml、10ml、20ml滴眼瓶中，三种规格，装量分别为2.5g、6.25g、12.5g，临床使用时随成品制剂另分别附2ml、5ml和10ml注射用生理盐水，临用前将生理盐水加入他克莫司前体囊泡滴眼液瓶中，振摇使其完全水化即得他克莫司囊泡液，含药量为0.1%，可直接用于滴眼。

实施例9  他克莫司眼用前体囊泡制剂的制备

称取吐温60、乙醇、大豆卵磷脂、胆固醇于容器，水浴65±5°C加热并搅拌至各组分完全溶解呈均一透明状，搅拌下向混合液中加入他克莫司原料药，继续搅拌至药物完全溶解在混合液中，作为溶液1；搅拌下向溶液1中逐滴加入纯水，加热搅拌至溶液混合均匀，并让其温度降至室温，混合物呈黏稠凝胶态即得他克莫司前体囊泡剂。

将他克莫司前体囊泡自动灌装至5ml、10ml、20ml滴眼瓶中，三种规格，装量分别为2.5g、6.25g、12.5g，临床使用时随成品制剂另分别附2ml、5ml和10ml注射用生理盐水，临用前将生理盐水加入他克莫司前体囊泡滴眼液瓶中，振摇使其完全水化即得他克莫司囊泡液，含药量为0.1%，可直接用于滴眼。

实施例10  他克莫司眼用前体囊泡制剂的制备

称取泊洛沙姆188、乙醇、大豆卵磷脂、胆固醇于容器，水浴65±5°C下加热并不断搅拌至各组分完全溶解呈均一透明状，在搅拌下向混合液中加入他克莫司原料药0.08g，继续在65±5°C下搅拌至药物完全溶解在混合液中，作为溶液1；搅拌下向溶液1中滴加PH7.4的磷酸盐缓冲液12g，继续加热搅拌至溶液混合均匀，并让其温度降至室温，混合物呈黏稠凝胶态即得他克莫司前体囊泡剂。

将他克莫司前体囊泡自动灌装至5ml、10ml、20ml滴眼瓶中，三种规格，装量分别为2.5g、6.25g、12.5g，临床使用时随成品制剂另分别附2ml、5ml和10ml注射用生理盐水，临用前将生理盐水加入他克莫司前体囊泡滴眼液瓶中，振摇使其完全水化即得他克莫司囊泡液，含药量为0.1%，可直接用于滴眼。

下面用试验例来说明本发明的前体囊泡剂的有益效果

试验例1他克莫司前体囊泡理化性状研究

取本发明前体囊泡剂实施例3的产品 0.2g，加入10ml生理盐水进行稀释振摇即可得到他克莫司囊泡,超声3min后取100ul稀释至1ml，Malven粒径仪对囊泡粒径进行测定。经过测定，前体囊泡水化后形成囊泡的粒径在1um左右。

表1           他克莫司囊泡理化性状

 

试验例2他克莫司前体囊泡粘度测定实验

制备得到的前体囊泡制剂为粘稠凝胶状液体，采用旋转式流变仪评价样品的流变学性质，取本发明实施例3产品进行试验，考察温度25°C下，不同剪切速度对凝胶粘度的影响。

表2          他克莫司前体囊泡凝胶态粘度测量

从流变学实验结果可知，他克莫司前体囊泡制剂在室温条件下，其粘度随剪切速率的增大而减小，具有剪切变稀的性质，呈现出假塑性流体行为。

试验例3本发明的前体囊泡制剂对家兔眼部的刺激性实验

实验目的：观察动物眼睛接触他克莫司前提囊泡制剂后所产生的刺激反应情况，为临床安全用药提供依据。

    实验样品：取本发明他克莫司前体囊泡剂实施例10的产品进行试验。

实验方法：以新西兰兔为模型动物，根据《化学药物刺激性、过敏性和溶血性研究技术指导原则》，用眼刺激性试验法评价他克莫司眼用前体囊泡的粘膜刺激性。

健康新西兰大白兔4只，无眼疾，雌雄各半。实验前24小时内对每只动物的双眼进行检查，2%荧光素钠溶液滴眼，裂隙灯检查角膜的完整性。采用同体左右侧自身对比法进行实验，每只兔子右眼涂敷0.1g前体囊泡剂，左眼滴入生理盐水0.1ml作为空白对照，给药后轻合眼睑10s，使制剂与眼睛局部有充分接触。给动物连续给药21天，每天给药前以及最后一次给药后1、2、4、24、48、72小时对眼部进行检查，检查仪器为裂隙灯显微镜。观察眼睛的局部反应情况，按表1的眼部刺激反应评分标准对角膜、虹膜及结膜分别进行评分。将每一个观察时间每一动物的眼角膜、虹膜和结膜的刺激反应分值相加得总积分，将一组的积分总和除以动物数，即得该受试动物对眼刺激性的最后分值。然后按表2的评价标准，判断制剂是否具有刺激性。

表3            眼刺激反应分值标准

表4               眼刺激性评价标准

实验结果：

观察各组兔眼给药后的状况进行评分，统计评分结果后进行计算分析。各实验时间点兔刺激性分值见表5。

表5      他克莫司前体囊泡长期给药对兔眼刺激评分结果（n=4）

刺激性实验评分结果表明，他克莫司眼用前体囊泡制剂长期给药后，经评分标准判定兔给药眼与对照眼刺激反应积分差异不大，各兔各时间点刺激反应积分均<3，结果表明他克莫司前体囊泡对眼睛没有刺激性。

试验例4他克莫司前体囊泡对大鼠眼角膜移植排斥反应的药效学实验：

实验目的：建立大鼠眼角膜移植模型，探究他克莫司前体囊泡水化后囊泡滴眼液对角膜移植后免疫排斥反应的药效作用。

实验样品：取本发明他克莫司前体囊泡剂实施例10中含药量0.1%他克莫司囊泡液；1%环孢素滴眼液（中山大学中山眼科中心制剂室，规格：10ml:0.1g）；0.1%他克莫司滴眼液（中山大学中山眼科中心制剂室，规格：10ml:10mg）。

实验方法：

本发明建立了SD与Wistar大鼠异种异体穿透性眼角膜移植动物模型，将他克莫司前体囊泡经水化后的囊泡滴眼液用于大鼠角膜移植模型中，探究其对角膜移植术后免疫排斥反应的抑制作用。据文献报道，他克莫司用于滴眼等局部给药方式时，所含药物浓度有0.05%、0.1%、0.3%、0.5%、1%，并且他克莫司的治疗效果随药物浓度升高而逐渐增强。本试验选用于滴眼的囊泡滴眼液载药量为0.1%，给药4次/日，滴入剂量为20ul/次。本试验选择1%环孢素滴眼液和0.1%他克莫司滴眼液为阳性对照药，生理盐水为空白对照组，给药4次/日，滴入剂量为20ul/次，观察前体囊泡经水化后囊泡眼用的疗效。

穿透性角膜移植模型的建立：术前10min注射过量氯胺酮处死供体Wistar鼠，以直径3.25mm环钻钻取供眼中央角膜植片，置于1%透明质酸钠中备用。

受体SD大鼠均选择右眼为术眼，术前3天术眼滴用妥布霉素滴眼液，每日4次。术前裂隙灯检查术眼情况。肌肉注射水合氯醛进行全身麻醉，术前15min起点匹罗卡品滴眼液。常规消毒铺巾，无菌操作。

在手术显微镜下取3.25mm角膜中央全层植片立即植入3.0mm角膜中央穿透性植床，用10-0进口尼龙线间断缝合8针，线结不埋藏。术毕前房内注入少量粘弹剂（1%透明质酸钠），形成前房，眼内均匀涂抹妥布霉素眼膏，睑缘缝合。术后第1天拆除睑缘缝线，术后3天局部常规应用妥布霉素滴眼液每日4次，3d后根据分组应用不同滴眼液。

试验动物分组及给药：角膜移植术后第3天，排除由于手术因素造成的感染、前房出血、前房消失或术后发生虹膜嵌顿、前房积血及晶体浑浊眼，并及时补充动物。随机分为五组，每组7只。A组：生理盐水组（阴性对照）；B组：环孢素A组；C组：自制制剂组（实验组）；D组：自制空白载体组；E组：他克莫司0.1%滴眼液组。各组给药均从术后第三天开始，每日4次，每次100ul，直至排斥反应发生。

观察方法及指标：术后第1天起，每天在裂隙灯下观察角膜植片的情况，对浑浊、水肿及新生血管三项指标进行评分。三项评分之和为当日排斥反应指数（rejection index,RI）。当RI》6时，视为免疫排斥反应发生，角膜植片评分参照Holland的评分标准，记录角膜植片存活时间。

表6               Holland’s分级：

统计学处理： 采用SPSS statistics 19统计软件包进行单因素方差分析和LSD-t统计学检验，P<0.05为有统计学意义。

试验结果：对各组角膜植片存活时间及统计学分析见表7。从角膜植片存活时间统计分析可知，他克莫司囊泡组与生理盐水组比较，角膜植片存活时间延长，统计学分析有差异性，同时，他克莫司囊泡组与市售环孢素滴眼液组相比，角膜植片存活时间有统计学差异。结果表明他克莫司前体囊泡经水化形成载药0.1%囊泡后给药能显著抑制大鼠角膜移植的免疫排斥反应。

表7     各组大鼠角膜植片存活时间

 注：*与生理盐水组相比，P<0.05

对各组大鼠角膜移植后角膜植片混浊、水肿、新生血管观察状况进行评分，对观察期内每天的评分分数进行综合分析处理，观察结果如表8-表10所示。

表8    角膜移植后观察期内角膜透明度各天评分

表9  角膜移植后观察期内角膜水肿各天评分

表10  角膜移植后观察期内角膜新生血管各天评分

从各组角膜植片存活时间统计表及移植后观察期内植片的透明度、水肿和新生血管的观察结果可知，与空白对照组和生理盐水组相比，0.1%他克莫司囊泡组都显示出了良好的治疗效果，延长角膜植片的存活时间，起到良好的药效作用。根据文献报道以及处方筛选结果可知，他克莫司载药量为0.01%~1%时，用于局部滴眼都能表现出明显的免疫抑制作用，并且随浓度增高药效逐渐增强。

试验例5 制剂稳定性研究

实验目的：考察原料药或药物制剂在温度、湿度、光线的影响下随时间变化的规律，为药品的生产、包装、贮存、运输条件提供科学依据，同时通过试验建立药品的有效期。

实验样品：取本发明他克莫司前体囊泡剂实施例3产品；实施例3中他克莫司前体囊泡剂经水化后囊泡剂，各自分别取3批进行实验。

实验方法：影响因素试验用一批制剂进行，平行做3份。取他克莫司前体囊泡，将样品敞口置于所处环境中。考察其在高温、高湿和强光条件下，前体囊泡制剂性状变化，加生理盐水稀释成囊泡后主药他克莫司含量的变化，以及有关物质的生成情况。实验设置对照组为他克莫司囊泡组，即将制剂所配的水相加入到他克莫司前体囊泡滴眼液瓶中，振摇使他克莫司前体囊泡完全水化为囊泡后，按影响因素条件要求进行实验。

高温试验：分别将供试品他克莫司前体囊泡和他克莫司囊泡开口置于西林瓶中，分别在60°C和40°C温度下放置10天，于第5天和第10天取样，按稳定性重点考察项目进行检测。

高湿试验：分别将他克莫司前体囊泡和他克莫司囊泡供试品置于恒湿密闭容器中，在25°C分别于相对湿度90%±5%条件下放置10天，于第5天和第10天取样，按稳定性重点考察项下项目要求检测，同时准确称量试验前后供试品的重量，以考察供试品的吸湿潮解性能。

强光照射试验：分别将他克莫司前体囊泡和他克莫司囊泡放置于强光照射试验箱中，于照度为4500lx±500lx的条件下放置10天，于第5天和第10天取样，按稳定性重点考察项目进行检测。

加速试验：加速试验是在超常条件下进行的，通过加快市售包装中药品的物理或化学变化速度来考察药品稳定性，对药品在运输、保存过程中可能会遇到的短暂的超常条件下的稳定性进行模拟考察，并初步预测样品在规定的贮存条件下的长期稳定性。前体囊泡的加速试验选用的实验条件如下：40°C±2°C、RH75%±5%条件下；25°C±2°C、RH60%±5%条件下；4°C±2°C、RH75%±5%条件下分别贮存，在试验期间第0、1、2、3个月末取样检测考察指标，测定他克莫司前体囊泡的载药量和包封率在贮存期间的变化。

试验结果：

表11         他克莫司前体囊泡稳定性实验研究结果(n=3)

 表12         他克莫司水化后囊泡的稳定性研究结果（n=3）

表13         他克莫司前体囊泡加速试验研究结果（n=3）

从稳定性实验结果可知，他克莫司前体囊泡制剂稳定性良好，在60°C高温下放置10天，取出制剂加生理盐水水化为囊泡后，载药量和包封率与0天相比仍没有显著性变化，从液相图谱可知药物主峰分离良好，无大量有关物质的产生。而他克莫司囊泡组的影响因素结果表明，在4°C下保存时，第5天和第10天的载药量无明显变化；60°C和光照条件下保存时，第5天和第10天与第0天相比可见载药量明显降低，表明囊泡形式存在时，药物需在4°C条件下储存。稳定性结果表明，他克莫司前体囊泡系统含限量的水，限制了他克莫司药物在制剂中的异构化，与他克莫司囊泡组相比，增强了药物储存稳定性。

从加速实验结果可知，他克莫司前体囊泡在40°C加速条件下保存3个月，载药量和包封率与第0天相比仍无明显降低，与文献报道他克莫司滴眼液稳定性相比，他克莫司前体囊泡剂稳定性更好，在室温下避光能长期保存。

试验例6他克莫司前体囊泡体外释放研究

实验目的：与市售他克莫司软膏进行对比，考察他克莫司前体囊泡的体外透角膜特性， 并且比较二者角膜滞留量的差异。

实验样品：本发明他克莫司前体囊泡剂实施例10中产品；市售他克莫司0.1%软膏（美国 Fujisawa Healthcare,Inc.，规格 10g:10mg）。

实验方法：

按处方剂量制备他克莫司前体囊泡，使用前加生理盐水振摇使其水化成囊泡，囊泡含药量为0.1%。

试验方法：使用Franz透皮扩散仪进行渗透实验，水浴温度为34°C,离体兔眼角膜固定于供给室与接收室之间，有效透过面积为50.24mm²,接收液为25%乙醇/人工泪液，接收室体积为5ml。分别将含药量0.1%软膏0.1g与载药0.1%囊泡100ul置于供给池中离体兔眼角膜一侧，开启透皮扩散仪电动磁力搅拌器以250rpm/min的速度搅拌，分别于0.5h、1h、2h、3h、4h、8h、12h、24h取接收液1ml，过滤后进HPLC进行含量测定，同时补充等量空白接收液于接收池中。体外透角膜试验终止后，从扩散池中取出兔眼角膜，用水洗涤表面，棉花擦干，剪碎，加甲醇2ml匀浆，离心10 min，取上清液，用0.22 μm滤膜过滤，取续滤液，采用高效液相色谱法测定角膜中他克莫司的滞留量（Qm）。

试验结果：体外释放实验中24h内，他克莫司前体囊泡在角膜中的累积透过百分量为（68.56±0.10）%；他克莫司软膏在角膜中的累积透过百分量为（41.41±0.07）%。每个时间点他克莫司囊泡的累积透过量均比他克莫司软膏高，经t检验，24h两者的数据有x统计学差异，P<0.05，体外累积释放实验说明他克莫司囊泡更有利于药物透过角膜，提高治疗作用。体外释放24h角膜滞留量结果，他克莫司囊泡的滞留量高于软膏，二者数据有统计学差异， P<0.05，角膜滞留量结果表明，他克莫司囊泡能提高药物在角膜滞留量，延长药物作用时间，提高治疗效果。

表14      他克莫司前体囊泡、软膏各时间点累积释放度（%）

表15 他克莫司前体囊泡、软膏体外实验角膜累积滞留量结果

 

*  P＜0.05

结论：他克莫司前体囊泡及软膏的体外透角膜试验表明，他克莫司囊泡更有利于药物透过角膜，提高治疗作用；角膜滞留量结果表明，他克莫司囊泡能提高药物在角膜滞留量，延长药物作用时间，提高治疗效果。

Claims (2)

1. 一种用于眼角膜移植的他克莫司眼用剂，其特征在于将他克莫司制成前体囊泡剂，前体囊泡剂是由下列质量百分比的原料组成：

他克莫司      0.04~0.8%

表面活性剂    24.0~41.0%

胆固醇        1.6~8.0%

卵磷脂        24.0~41.0%

醇            1.2~30%

其余为水或体积比0.1%甘油水溶液或PH7.4磷酸缓冲液，

所说的表面活性剂是为司盘20、司盘40、司盘60、司盘80、吐温20、吐温60、吐温80、聚氧乙烯醚蓖麻油、泊洛沙姆中的一种，

所说的醇为乙醇、异丙醇、丁醇、丙醇中的一种。

2.一种用于眼角膜移植的他克莫司眼用剂的制备方法是：

（1）按下列质量百分比的原料配备：

他克莫司      0.04~0.8%

表面活性剂    24.0~41.0%

胆固醇        1.6~8.0%

卵磷脂        24.0~41.0%

醇            1.2~30%

其余为水或体积比0.1%甘油水溶液或PH7.4磷酸缓冲液，

所说的表面活性剂是为司盘20、司盘40、司盘60、司盘80、吐温20、吐温60、吐温80、聚氧乙烯醚蓖麻油、泊洛沙姆中的一种，

所说的醇为乙醇、异丙醇、丁醇、丙醇中的一种；

（2）称取表面活性剂、醇、卵磷脂、胆固醇、他克莫司加热至65±5°C，搅拌均匀至各组分完全溶解，呈均一透明状，作为溶液1；

（3）搅拌下向溶液1中滴加水或体积百分浓度为0.1%的甘油水溶液或PH7.4的磷酸缓冲液，65°C继续搅拌加热至溶液混合均匀，将混合液取出继续搅拌至室温，呈黏稠凝胶态即得他克莫司前体囊泡剂。