CN103109183A - 通过靶向的miR-29表达建立的慢性淋巴细胞白血病小鼠模型 - Google Patents

通过靶向的miR-29表达建立的慢性淋巴细胞白血病小鼠模型 Download PDF

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Abstract

描述了小鼠模型及其用于检测、治疗、表征和诊断多种疾病的用途。

Description

通过靶向的miR-29表达建立的慢性淋巴细胞白血病小鼠模型
相关申请的交叉参考
这是根据37 CFR 1.371提交的于xxx,xx,xxxx提交的国际申请PCT/US20xx/xxxxxx的国家阶段申请，其要求2010年6月24日提交的美国临时申请系列号61/358,383的优先权，其全部公开内容明确地通过引用方式并入本文。
关于联邦政府支持的研究的声明
本发明是在国立卫生研究所的基金号PO1-CA81534的政府支持下做出的。政府享有本发明的某些权利。
序列表
本申请包含通过EFS-Web以ASCII格式提交的序列表，其通过引用方式全文并入本文。所述ASCII版本，创建于2011年6月17日，被命名为604_52020_Seq_List_OSU-10162.txt，大小为1,399字节。
本发明的技术领域和工业实用性
本发明涉及小鼠模型及其用于检测、治疗、表征和诊断多种疾病的用途。
背景
慢性淋巴细胞白血病(CLL)是最常见的人类白血病，占所有病例的约30%，在美国每年观测到10,000例新病例。在特征上，CLL是老年人的疾病，在40岁以上的年龄，发病率每10岁线性递增。已经知道该疾病的特征在于CD5+B细胞的克隆扩增。
微小RNA(microRNA)是一类内源性非编码RNA，占所有真核基因的1%-3%，大小为19-25nt，其在转录或翻译水平调节基因表达。大约一半的人类微小RNA位于参与癌症中的变异的脆性位点和基因组区域，微小RNA的表达谱的改变发生于多数癌症中，这提示了单个的微小RNA可能作为肿瘤阻抑子或癌基因发挥作用。
13q14删除是最常见的CLL异常，在大约一半的病例中通过细胞遗传分析可检测出来。对于13q14.3处的删除的分析引起人们发现了2个物理上相连的微小RNA：miR-15a和miR-16-1，它们是这些删除的靶点。因此，miR-15a和miR-16-1表达在大多数CLL病例中降低，进一步研究表明miR-15a/miR-16-1负性地调节Bcl2的表达。这些发现表明：微小RNA在CLL中具有重要作用，miR-15/16的下调和随后的Bcl2的上调促成CLL发病。因为miR-15/16被鉴定为惰性(indolent)CLL的肿瘤阻抑子，已经透彻地研究了CLL中的微小RNA表达谱，报告了标志物谱，描述了13种区分侵袭性CLL和惰性CLL的微小RNA。
相对于惰性CLL，miRNA-29表达在侵袭性CLL中下调，相信miR-29可能通过靶向数个癌基因、包括TCL1、MCL1和CDK6而作为肿瘤阻抑子发挥作用。另一方面，一份报告显示miR-29表达在转移性乳腺癌中上调，最近的一项研究报告了miR-29过表达可在小鼠中引起急性骨髓性白血病(AML)。
为了阐明miR-29在B-细胞白血病中的作用，我们制备了在B细胞中过表达miR-29的转基因小鼠，现在报告该小鼠模型的表型。
使用能够阐明miR-29在B细胞白血病中的作用的有效模型将是有用的。
概述
在一个方面，本文提供了转基因动物，其基因组包含核酸构建体，所述核酸构建体包含可操作地连接于编码miR-29的核酸序列的、能够指导在B细胞中表达的至少一种转录调节序列。
在另一个方面，本文提供了产生具有淋巴组织增生病症的动物的方法。
在另一个方面，本文提供了测定一种治疗方式影响淋巴组织增生病症的能力的方法。
在另一个方面，本文提供了转基因小鼠，其基因组包含编码人B-CLL的核酸序列，其中所述序列可操作地连接于VH启动子和IgH-Eμ增强子，其中所述转基因小鼠相对于对照小鼠产生扩增的CD5+B细胞群体。
在另一个方面，本文提供了转基因小鼠，其基因组包含编码人miR-29的核酸序列，其中所述序列可操作地连接于VH启动子和IgH-Eμ增强子，其中所述转基因小鼠产生显示出人B-CLL的特征的淋巴细胞白血病。
在另一个方面，本文提供了在B细胞中过表达miR-29的转基因小鼠和此种小鼠的用途。
在另一个方面，本文提供了转基因小鼠，其中小鼠miR-29a/b簇的表达由VH启动子-IgH-Eμ增强子以及人源化海肾绿色荧光蛋白(hrGFP)和猿猴病毒40(SV40)多聚(A)位点控制。
在另一个方面，本文提供了测定用于治疗慢性淋巴细胞白血病的治疗剂的功效的方法，包括测定miR-29a是否上调，其中miR-29的上调指示相对于侵袭性B-CLL和正常CD19+B细胞是惰性人B-CLL。
在另一个方面，本文提供了转基因小鼠，其基因组包含核酸构建体，所述核酸构建体包含能够指导在小鼠的B细胞中表达的至少一种转录调节序列，其中所述转录调节序列可操作地连接于编码miR-29基因产物的核酸，所述miR-29基因产物包含与miR-29具有至少90%序列同一性的核苷酸序列，其中所述小鼠显示出B细胞恶性肿瘤。
在另一个方面，本文提供了测定试剂是否影响B细胞恶性肿瘤的方法。
在另一个方面，本文提供了测定试剂在治疗B细胞恶性肿瘤中的治疗功效的方法。
在阅读了下列附图和详细描述之后，本发明的其他系统、方法、特征和优点对于本领域技术人员将是明显的或将变得明显。所有此种另外的系统、方法、特征和优点都意在包括在本说明书内，在本申请的范围内，并受到随附的权利要求的保护。
附图说明
专利或申请文件可包含一幅或多幅彩色附图和/或一幅或多幅照片。本专利或专利申请公开物的具有彩色附图和/或照片的版本将根据请求和在缴纳了必要费用之后由专利局提供。
图1A-1F：CLL中的miR-29表达和Ep-miR-29转基因创始小鼠的产生。
图1A：侵袭性和惰性CLL中的miR-29a表达；图1B：侵袭性和惰性CLL中的miR-29b表达。
图1C：Ep-miR-29构建体
图1D-图1E：Ep-miR-29创始者的脾淋巴细胞中的miR-29a(图1D)和miR-29b(图1E)的表达。
图1F：Ep-miR-29创始者的脾淋巴细胞中的GFP的表达。
图2A-2H：Eμ-miR-29小鼠产生CLL。
图2A-2C：从脾(图2A)、外周血(图2B)和骨髓(图2C)分离的miR-29转基因淋巴细胞(Tg)和对照淋巴细胞的流式细胞术分析。
图2D-2F：miR-29转基因小鼠和WT对照中的CD5+B细胞群体的分析。
图2G：显示出深度CLL的代表性Eμ-miR-29转基因小鼠和相同年龄的WT对照的肉眼病理。
图2H：通过Southern印迹分析IgH基因构型：分离自5个代表性病例的脾淋巴细胞DNA显示出至少50%的CD5+CD19'B细胞。星号标示出了克隆重排。
图3A-3L：Eμ-miR-29小鼠的组织病理学分析。箭头标示出了破碎细胞(smudge cell)。黑色箭头标示出了非典型性淋巴样细胞。绿色箭头标示出了正常淋巴样滤泡。
图4A-4L：来自Eμ-miR-29转基因小鼠的白血病细胞的细胞周期分析。
图4A-4D：BrdU掺入WT B220++B细胞的DNA中。
图4E-4J：BrdU掺入转基因B220+CD5+和B220+CD5-B细胞DNA中。
图4K：WT和转基因动物的血清中的Ig水平。
图4L：注射SRBC 7天之后WT和转基因动物的血清中的抗-SRBC特异性抗体的水平。
图5A-5C：miR-29转基因表达加速Eμ-TCL1小鼠中的CLL。
图5A：来自脾的Eμ-TCL1/Eμ-miR-29和Eμ-TCL1转基因淋巴细胞的流式细胞术分析。
图5B：Eμ-TCL1/Eμ-miR-29和Eμ-TCL1转基因脾淋巴细胞中的CD5+B细胞的百分率。
图5C：来自Eμ-TCL1/Eμ-miR-29和Eμ-TCL1转基因小鼠的脾重量。
图6A-6F：Eμ-miR-29转基因小鼠中的miR-29靶的分析。
图6A：miR-29转基因和WT小鼠的CD19+B细胞中的Cdk6、DNMT3A、PTEN和Mcl1表达的western印迹分析。
图6B：miR-29转基因和WT小鼠的CD19+B细胞中的PXDN、BCL7A和ITIH5的微阵列表达数据。
图6C：miR-29a[SEQ ID NO:1]和PXDN的3'UTR[SEQ IDNO:2]，BCL7A的3'UTR[SEQ ID NO:3]和ITIH5的3'UTR[SEQ IDNO:4]的序列比对。
图6D：萤光素酶测定中miR-29靶向PXDN而不是BCL7A和ITIH5的表达。
图6E：miR-29对于Pxdn蛋白表达的影响。
图6F：CLL中的PXDN表达。
图7A-7L：Eμ-miR-29小鼠的肝和肾中的慢性淋巴细胞白血病(CLL)侵袭的组织病理学分析。
详细描述
在本公开内容的通篇，通过引证方式引用了多篇出版物、专利和专利公开文本。这些出版物、专利和专利公开文本的公开内容在此通过引用方式并入本公开内容以更全面地描述本发明所属技术领域的技术水平。
本发明至少部分基于本发明人的关于阐释miR-29在B细胞白血病中的作用的发现。
在第一个方面，本文提供了在B细胞中过表达miR-29的转基因小鼠；本文现在报告的是该小鼠模型的表型。相对于侵袭性B-CLL和正常CD19+B细胞，miR-29a在惰性人B-CLL中上调。
为了研究miR-29在B-CLL中的作用，本发明人在本文中制备了在小鼠B细胞中过表达miR-29的Eμ-miR-29转基因小鼠。流式细胞术分析揭示从2月龄开始，这些小鼠的脾中存在显著扩增的CD5+群体，85%(34/40)的miR-29转基因小鼠显示出扩增的CD5+B细胞群体，其为B-CLL的特征。平均而言，这些转基因小鼠中有50%的B细胞是CD5阳性的。
在2岁时，小鼠显示出显著增大的脾，CD5+B细胞群体增加至约100%。在20只生长至24-26月龄的的Eμ-miR-29转基因小鼠中，有4只(20%)产生了frank白血病并死于该病。这些结果显示：miR-29的失调可引起惰性B-CLL的发病。
实施例
本发明在下列实施例中进一步定义，其中所有的小数和分数都是以重量计，温度为摄氏度，除非另有指明。应该理解，这些实施例虽然指明了本发明的优选实施方式，但是仅仅是以例示方式给出的。从上述讨论和这些实施方式，本领域技术人员能够确定本发明的基本特征，在不脱离其精神和范围的情况下，能够对本发明做出多种改变和修饰，以使其适于多种用途和状况。本说明书中引用的所有出版物，包括专利和非专利文献，都明确地通过引用方式并入。以下实施例旨在例示本发明的一些优选实施方式，不应被揭示为限制如权利要求中定义的本发明的范围，除非这样指明。
因此本发明的价值可通过参考本文的实施例而可见。
材料和方法
Eμ-miR-29转基因小鼠和人CLL样品。将包含小鼠miR-29ab簇的1.0kb片段克隆进入质粒的BamHI和SalI位点，所述质粒包含小鼠VH启动子(V186.2)和IgH-Eμ增强子，以及hrGFP和SV40多聚(A)位点。将miR-29a/b簇序列插入到该构建体的内含子内。在俄亥俄州立大学转基因小鼠室产生转基因小鼠。使用引物miR-29d:gct gac gtt gga gcc acaggt aag[SEQ ID No:5];miR-29r:aca aat tcc aaa aat gac ttc cag[SEQID No:6]通过PCR在尾巴DNA上进行基因分型。
从被诊断患有CLL的患者获得知情同意之后，从ChronicLymphocytic Leukemia Research Consortium获取人CLL样品。研究得到了俄亥俄州立大学机构审查委员会的批准。进行了RNA提取。根据生产商的说明书，使用用于实时PCR的miR-29a,miR-29b和PXDN测验法(Applied Biosystems)进行实时PCR实验。对照人脐带血CD19+B细胞购自Allcells和Lonza。
miR-29转基因淋巴细胞的表征
从脾和骨髓分离了淋巴细胞。进行了SRBC免疫应答、Ig水平和B细胞群体增殖的流式细胞术测定。为了分析IgH基因重排，使用EcoRI消化和小鼠JH4探针进行了脾淋巴细胞DNA的Southern印迹分析。
对于组织学和免疫组织化学，将小鼠进行尸体剖检，将脾、肝和肾固定于10%缓冲的福尔马林中，包含于石蜡中，然后切成4-μm的切片。根据标准程序对切片进行H&E染色。
miR-29靶标的分析
根据生产商的说明书，使用B细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec)分离B细胞。从脾提取蛋白质。使用Cdk6(H-96;Santa CruzBiotechnology),DNMT3A(2160;Cell Signaling Technology),Pten(mmac1;Lab Vision),Mcl1(S-19;Santa Cruz Biotechnology),Pxdn(Novus)和GAPDH(2118;Cell Signaling Technology)抗体进行了western印迹分析。对于萤光素酶测定，将PXDN、BCL7A和ITIH5cDNA的片段(其中包括互补于miR-29的区域)，插入至pGL3载体：使用萤光素酶的终止密码子的紧邻下游的XbaI位点。MiR-29a、miR-29b和混杂对照RNA双链体购自Ambion。包含全长人PXDN的表达构建体购自OriGene。进行了转染。
结果
CLL中的miR-29表达和Eμ-miR-29转基因小鼠模型的产生
为了测定CLL和正常CD19+B细胞中的miR-29表达水平，本发明人在本文中研究了29例侵袭性CLL样品、33例惰性CLL样品和2例正常CD19+B细胞对照中的miR-29a和miR-29b的表达。
图1A和图1B显示了这些样品中的实时RT-PCR结果。惰性CLL中的miR-29a表达比正常CD19+B细胞中高4.5倍，而侵袭性CLL样品显示出3.2倍的升高。类似地，相对于正常CD19+B细胞，惰性CLL中的miR-29b的表达升高4倍，侵袭性CLL中升高3.5倍。相对于惰性CLL，侵袭性CLL中的miR-29a和miR-29b都下调，虽然在miR-29b的情况下，该差异不是统计学上显著的(图1B)。
有趣的是，在所有的样品中，miR-29a的表达水平都比miR-29b高20倍以上(图1A和图1B)。
由于miR-29a和miR-29b二者的表达水平在惰性CLL中显著高于正常CD19+B细胞，本发明人认为miR-29可能引起CLL的发病。
为了研究，本发明人制备了转基因小鼠，其中小鼠miR-29a/b簇的表达受到VH启动子-IgH-Eμ增强子，以及人源化海肾绿色荧光蛋白(hrGFP)和猿猴病毒40(SV40)多聚(A)位点的控制。
这种启动子/增强子的组合驱动miR-29a/b在非成熟和成熟B细胞中表达(图1C)。将miR-29a/b簇序列插入至该构建体的内含子内(图1C)。产生了FVB/N背景下的两个创始者(称作“F1”和“F2”)并繁殖以建立转基因系。使用分离自转基因动物的脾的RNA，通过Northern印迹分析检测miR-29a和miR-29b的表达。
图1D和图1E显示：相对于非转基因(WT)同胞仔，两个转基因系(F1和F2)中的miR-29a和miR-29b都过表达。为了确认转基因在B细胞中表达，本发明人使用CD19作为B细胞标志物进行了流式细胞术。
图1F显示：两个转基因系(F1和F2)中的所有CD19+细胞也表达GFP，而在WT同胞仔中，未检测到GFP的表达。
Eμ-miR-29转基因小鼠显示出CLL表型
使用流式细胞术测定来自miR-29转基因小鼠的脾淋巴细胞的免疫表型谱。在12-24月龄，流式细胞术分析揭示：40只miR-29转基因小鼠中有34只小鼠(85%)的脾中具有显著扩增的CD5+B细胞群体(CLL的特征)，这些转基因小鼠中约50%的B细胞是CD5+。图2A(左侧)显示了代表性的样品。虽然几乎所有来自该动物的脾B细胞都是CD5+CD19+IgM+，但是这些细胞仅代表25-30%的所有脾淋巴细胞。图2A(中间)显示了更深度的CLL病例。该动物的脾中几乎所有正常淋巴细胞被替换为恶性CD5+CD19+IgM+B细胞。在WT同胞仔的脾中几乎未检测到CD5+CD19+IgM+B细胞(图2A，右侧)。
在来自miR-29转基因小鼠的外周血和骨髓中也检测到了CD5+CD19+B细胞的扩增的群体，但是在WT同胞仔中未检测到(图2B和图2C)。
图2D-2F显示了在脾中具有增加的CD5+CD19+IgM+群体的动物的数目。虽然40只miR-29转基因小鼠中仅有7只(17%)显示出0-20%CD5+B细胞，但是40只中有16只(40%)显示出60%或更多的CD5+CD19+IgM+细胞。另外，miR-29转基因小鼠显示出随着年龄增长CD5+脾B细胞的百分率显著增加(图2F)。在小于15个月龄的动物中，CD5+B细胞仅代表约20%总B细胞；到15-20月龄时，该百分率增加至约40%(图2F)。
在20-26月龄时，平均而言，大于65%的所有B细胞是CD5+(图2F)。这些数据显示miR-29转基因小鼠中惰性CLL的逐渐进展。20只Eμ-miR-29小鼠长至24-26月龄。几乎所有这些动物都显示出显著增大的脾，20只中有4只(20%)产生frank白血病并死于该病。图2G显示了具有增大的脾和肝和深度淋巴结病的frank白血病的代表性病例。
慢性IgH基因重排在人CLL病例中是典型的。在CLL的Tcl1驱动的小鼠模型中也观察到了这些重排。为了确定来自Eμ-miR-29转基因小鼠的CD5+B细胞是否显示出克隆性(clonality)，使用分离自显示出至少50%CD5+CD19+IgM+B细胞的病例的脾淋巴细胞DNA进行了Southern印迹杂交。图2H显示了所分析的5个病例中的3个病例的IgH基因的克隆重排。这些结果进一步表明Ep-miR-29小鼠中CD5+B细胞的扩增类似于人CLL。
为了进一步确认Ep-miR-29小鼠产生了CLL样疾病，进行了组织学和免疫组织学分析。图3A-3C显示了来自Ep-miR-29转基因小鼠和WT对照的血液的代表性涂片。来自WT小鼠的涂片显示出极少的具有正常外观的淋巴单核细胞(图3A)。相反，来自具有低等级CLL的Eμ-miR-29小鼠的涂片显示出数目增多的非典型性淋巴样细胞(图3B，黑色箭头)，来自具有深度CLL的miR-29转基因小鼠的涂片显示出众多的恶性淋巴样细胞(图3C)，包括破碎细胞(smudge cell)，其为CLL典型性的(图3C，插图；箭头标示出了破碎细胞)。
图3D-3L显示了Ep-miR-29转基因小鼠和WT对照的代表性组织学照片。WT小鼠的脾显示出保持的结构和几个正常外观的淋巴样滤泡(图3D，绿色箭头)。相反，具有CLL的患病的miR-29转基因小鼠的脾显示出扭曲的结构(图3E)，具有深度CLL的miR-29小鼠的脾显示出正常结构被恶性淋巴样增殖完全抹消(图3F)。
相同切片的B220染色显示出具有正常B细胞布置的WT小鼠的淋巴样滤泡(图3G)。相反，转基因小鼠的脾显示出混乱的淋巴样滤泡，这是由于低等级的恶性淋巴样增殖(图3H)或具有弥散性分布的B细胞恶性群体的CLL(图3I)。
图3J-3L显示出WT脾中的周期蛋白D1的低表达(图3J)和低等级CLL(图3K)和深度CLL(图3L)中的周期蛋白D1的中等至高表达。因此，组织学和免疫组织检查确认了Ep-miR-29小鼠产生了CLL样疾病。
如上所述，仅有20%的Ep-miR-29转基因小鼠产生了深度白血病并死于该病。图7A-7L显示了侵袭了肝和肾的代表性深度CLL病例。组织学检查显示正常的脾结构完全被高表达的B220、周期蛋白D1和Ki67抹消(图7A-7D)。
这些B220+恶性B细胞侵袭了肝(图7E-7H)和肾(图7I-7L)。
CLL淋巴细胞累积不仅可以由延长的存活引起，而且可以由产生于骨髓、淋巴结或脾的增殖性CD5+B220+细胞引起。因此，为了测定来自Ep-miR-29小鼠的CLL细胞是否增殖，本发明人使用了基于BrdU掺入的细胞周期分析。本发明人测定了B220+CD5+以及B220+CD5-转基因脾淋巴细胞的增殖能力，与WT B220+脾淋巴细胞对比。图4A-4J显示了来自Eμ-miR-29小鼠的B220+CD5+B细胞增殖，而对于B220+WT淋巴细胞未检查到增殖(对于转基因B细胞有2.7%和5.6%细胞处于S期；而对于WT B细胞，有0.3%和0.5%(图4I-4J，相对于图4C-4D)。有趣的是，即使是B220+CD5-转基因淋巴细胞，相对于B220+WT B细胞也显示出增加的增殖，处于S期的细胞是1.0%和0.95%，相对于WTB细胞的0.3%和0.5%(图4G-4H，相对于图4C-4D)。
这些数据显示：miR-29过表达促进B细胞增殖，甚至是在CD5-细胞中。人CLL的特征在于免疫失能和进行性严重性低丙球蛋白血症(在几乎所有患者中最终都会出现)。因此，为了测定Eμ-miR-29小鼠是否产生低丙球蛋白血症，本发明人比较了转基因小鼠和WT同胞仔在约18月龄时的血清Ig水平。
图4K显示：相对于WT对照，Eμ-miR-29转基因小鼠中的IgG1、IgG2a和IgG2b的水平降低2-4倍。为了测定Eμ-miR-29小鼠是否显示出破坏的免疫应答，本发明人比较了注射了SRBC的miR-29转基因小鼠和WT同胞仔的抗绵羊-RBC(SRBC)抗体的水平。图4L显示：相对于年龄匹配的WT小鼠，miR-29转基因小鼠的血清中的抗-SRBC抗体血清水平降低约4倍。这些数据清楚地表明：如在人CLL中一样，Eμ-miR-29小鼠中的CLL样疾病也具有低丙球蛋白血症和免疫失能的特征。
在本文描述的小鼠模型中，TCL1 ORF(无3'UTR)处于VH启动子-IgH-Eμ增强子的控制下。由于在转基因构建体中不存在3'UTR，所以miR-29不能抑制这些小鼠中的TCL1表达。Eμ-TCL1转基因小鼠产生侵袭性CLL，所有小鼠在12-15月龄死于该病。为了测定转基因miR-29表达是否能够加速ERTCL1转基因小鼠中的CLL，本发明人将Eμ-miR-29小鼠与Eμ-TCL1转基因小鼠杂交。在约8月龄时杀死Eμ-miR-29/Eμ-TCL1小鼠和它们的Eμ-TCL1同胞仔并进行分析。
图5A显示了这些基因型的脾淋巴细胞的代表性FACS分析。TCL1/miR-29双转基因小鼠显示出比Eμ-TCL1小鼠显著增加的CD5+CD19+和CD5+IgM+B细胞群体(93.9%和93.3%，相对于48.3%和50%)。平均而言，相对于Eμ-TCL1小鼠，Eμ-miR-29/Eμ-TCL1小鼠具有多40%的CD5+CD19+脾B细胞，脾的重量增加3倍(图5B-5C)。这些数据显示：miR-29可独立于Tcl1引起CLL的发病。
miR-29靶标的分析
为了测定小鼠B细胞中的miR-29过表达是否影响其靶标的表达，分析了从miR-29转基因小鼠和WT对照中分选的B220+B细胞中的miR-29的数个之前已经报道的靶标Cdk6、Mcl1和DNMT3A的表达水平。发现两个靶标Cdk6和DNMT3A在miR-29转基因小鼠中下调，而Mcl1和Pten则未检查到差异(图6A)[虽然Pten不是被证明的miR-29靶标，但是之前已经预测其是潜在靶标]。
由于Cdk6和DNMT3不是已知为肿瘤抑制子，所以使用Affymetrix基因表达阵列来测定贡献于其致癌活性的潜在miR-29靶标。使用微阵列分析，从来自miR-29转基因小鼠和WT对照的分选的B220+B细胞中比较了基因表达。然后，本发明人将具有已知的或潜在的肿瘤抑制功能的在miR-29转基因B细胞中下调的基因与Targetscan软件中获得的潜在miR-29靶标的列表进行交叉参考。鉴定了三个潜在靶标：peroxidasin(PXDN)，其为AML中下调的p53响应性基因；Bcl7A，其为T细胞淋巴瘤中下调的促细胞调亡基因；和ITIH5，其为乳腺癌中下调的间-α-胰蛋白酶抑制剂家族的成员。
图6B-6C显示了这3个基因在miR-29转基因小鼠的CD19+B细胞中相对于WT同胞仔的下调的表达，以及miR-29a和相应的3’UTR的比对。为了测定miR-29是否确实靶向PXDN、Bcl7A和ITIH5的表达，将这些cDNA的3T UTR片段(包括miR-29同源性区域)插入至pGL3载体中的萤光素酶ORF的下游。以miR-29a、miR-29b或混杂阴性对照和包含PXDN、Bcl7A和ITIH5 cDNA(包括同源于miR-29的区域)的片段的pGL3构建体共转染HEK293细胞，如所标示(图6D)。
miR-29a或miR-29b的表达显著(约3倍)降低了包含PXDN的3’UTR的构建体的萤光素酶的表达，对于Bcl7A和ITIH5未观察到显著效应(图6D)。因此，不希望被任何理论所限，本发明人相信PXDN的表达可能被miR-29靶向。为了确认，在巨细胞病毒哺乳动物表达载体中使用全长PXDN cDNA(包括5’和3’UTR)并研究了miR-29表达是否影响Pxdn蛋白表达水平。
将该构建体与miR-29a、miR-29b或PremiR阴性对照(混杂的)共转染进入HEK293细胞，如图6E所示。这些实验揭示：PXDN与miR-29a或miR-29b的共表达几乎完全抑制了Pxdn表达(图6E)。本发明人相信miR-29a和miR-29b在mRNA和蛋白水平靶向Pxdn表达。为了测定Pxdn是否在人CLL的发病中发挥作用，研究了25例人CLL样品和正常CD19+B细胞对照中的PXDN的表达。
图6F显示了这些样品的实时RT-PCR结果。相对于正常CD19B细胞，PXDN的表达在CLL样品中显著下调(50倍或更高)。这些结果显示miR-29在B细胞中的致癌作用可能至少部分依赖于靶向peroxidasin。
讨论
本发明显示：B细胞中miR-29的过表达引起CLL；相对于正常B细胞，miR-29在惰性CLL中过表达。
由于仅有20%的Eμ-miR-29转基因小鼠在老年时死于白血病，但几乎所有小鼠显示出扩增的CD5+CD19+B细胞群体，所以Eμ-miR-29的表型类似于惰性CLL的表型。因此，miR-29的上调起始惰性CLL或至少显著作用于其发病。另一方面，TCL1在惰性CLL中几乎不表达，可能在惰性CLL中不起重要作用。
不希望被理论所限，本发明人相信miR-29过表达不足以起始侵袭性CLL。相反，Tcl1的上调对于侵袭形式的CLL的发病是关键性事件。由于miR-29靶向TCL1，所以其在侵袭性CLL中的下调(相对于惰性形式)促成Tcl1的上调和侵袭性表型的产生。
虽然已经通过参考多个和优选实施方式描述了本发明，但是本领域技术人员应该理解，可以不脱离本发明的基本范围而对本发明进行多种改变和对其元件进行等同替换。另外，可以不脱离本发明的基本范围而对本发明的教导进行多种修饰以适应特定的情况或材料。
因此，本发明不应被限于本文公开的考虑用于实施本发明的特定实施方式，本发明应包括所有落在权利要求范围内的实施方式。
Figure IDA00002643068800011
Figure IDA00002643068800021

Claims (44)

1.转基因动物，其基因组包含核酸构建体，所述核酸构建体包含可操作地连接于编码miR-29的核酸序列的、能够指导在B细胞中表达的至少一种转录调节序列。
2.权利要求1的转基因动物，其中所述至少一种转录调节序列包括VH启动子。
3.权利要求2的转基因动物，其中所述至少一种转录调节序列还包括IgH-Eμ增强子。
4.权利要求1的转基因动物，其中所述编码miR-29的核酸序列包含编码人miR-29的DNA序列。
5.权利要求2的转基因动物，其中所述VH启动子源自小鼠。
6.权利要求3的转基因动物，其中所述IgH-Eμ增强子源自小鼠。
7.权利要求1的转基因动物，其中所述动物是小鼠。
8.权利要求1的转基因动物，其中所述动物显示出扩增的CD5+B细胞的群体。
9.权利要求1的转基因动物，其中所述动物显示出淋巴组织增生状况。
10.权利要求9的转基因动物，其中所述淋巴组织增生状况包括前白血病状态。
11.权利要求9的转基因动物，其中所述淋巴组织增生状况包括白血病。
12.权利要求11的转基因动物，其中所述白血病显示出人B-CLL的特征。
13.转基因小鼠，其基因组包含核酸构建体，所述核酸构建体包含编码miR-29的核酸序列，其中所述序列可操作地连接于VH启动子和IgH-Eμ增强子，其中miR-29在该动物的未成熟和成熟B细胞中表达。
14.产生具有淋巴组织增生病症的动物的方法，包括以下步骤：
a)从转基因动物获得白细胞，所述转基因动物的基因组包含核酸构建体，所述核酸构建体包含可操作地连接于编码miR-29的核酸序列的、能够指导在B细胞中表达的至少一种转录调节序列；
b)对细胞进行计数；和
c)将一定数目的细胞注射进入与所述转基因动物同基因的受体动物中，其中所注射的细胞的数目为在所述受体动物中有效产生淋巴组织增生病症。
15.测定一种治疗方式影响淋巴组织增生病症的能力的方法，包括以下步骤：
a)提供第一转基因动物，其基因组包含核酸构建体，所述核酸构建体包含可操作地连接于编码miR-29的核酸序列的、能够指导在B细胞中表达的至少一种转录调节序列；
b)将所述治疗方式施用于所述第一转基因动物；
c)在所述转基因动物中进行B细胞群体的分析；
d)提供对照动物，其中所述对照动物是第二转基因动物，其基因组包含核酸构建体，所述核酸构建体包含可操作地连接于编码miR-29的核酸序列的、能够指导在B细胞中表达的至少一种转录调节序列，其中所述对照动物不接受所述治疗方式；
e)在所述对照动物中进行B细胞群体的分析；和
f)将步骤c)的分析与步骤e)的分析进行比较，其中所述第一转基因动物和所述对照动物之间B细胞群体的差异证明所述治疗方式影响淋巴组织增生病症的能力。
16.权利要求15的方法，其中所述淋巴组织增生病症包括B细胞瘤。
17.权利要求16的方法，其中所述B细胞瘤是B-CLL。
18.权利要求15的方法，其中所述第一转基因动物和所述对照动物是小鼠。
19.权利要求18的方法，其中所述分析包括测定CD5+B细胞的数目和/或相对比例。
20.转基因小鼠，其基因组包括编码人B-CLL的核酸序列，其中所述序列可操作地连接于VH启动子和IgH-Eμ增强子，其中所述转基因小鼠相对于对照小鼠产生扩增的CD5+B细胞的群体。
21.权利要求20的转基因小鼠，其中所述VH启动子包括小鼠VH启动子。
22.权利要求20的转基因小鼠，其中所述IgH-Eμ增强子包括小鼠IgH-Eμ增强子。
23.权利要求20的转基因动物，其中所述小鼠产生显示出人B-CLL特征的淋巴细胞白血病。
24.转基因小鼠，其基因组包括编码人miR-29的核酸序列，其中所述序列可操作地连接于VH启动子和IgH-Eμ增强子，其中所述转基因小鼠产生显示出人B-CLL特征的淋巴细胞白血病。
25.权利要求24的转基因小鼠，其中所述VH启动子包括小鼠VH启动子。
26.权利要求24的转基因小鼠，其中所述IgH-Eμ增强子包括小鼠IgH-Eμ增强子。
27.在B细胞中过表达miR-29的转基因小鼠。
28.权利要求27的小鼠的用途。
29.转基因小鼠，其中小鼠miR-29a/b簇的表达由VH启动子-IgH-Eμ增强子以及人源化海肾绿色荧光蛋白(hrGFP)和猿猴病毒40(SV40)多聚(A)位点控制。
30.测定用于治疗慢性淋巴细胞白血病的治疗剂的功效的方法，包括测定miR-29a是否上调，其中miR-29的上调指示相对于侵袭性B-CLL和正常CD19+B细胞是惰性人B-CLL。
31.转基因小鼠，其基因组包含核酸构建体，所述核酸构建体包含能够指导在小鼠的B细胞中表达的至少一种转录调节序列，其中所述转录调节序列可操作地连接于编码miR-29基因产物的核酸，所述miR-29基因产物包含与miR-29具有至少90%序列同一性的核苷酸序列，其中所述小鼠显示出B细胞恶性肿瘤。
32.权利要求31的转基因小鼠，其中所述至少一种转录调节序列包括VH启动子。
33.权利要求31的转基因小鼠，其中所述至少一种转录调节序列包括IgH-Eμ增强子。
34.权利要求31的转基因小鼠，其中所述核酸编码包括SEQ IDNO:1的miR-29基因产物。
35.权利要求32的转基因小鼠，其中所述VH启动子源自小鼠。
36.权利要求33的转基因小鼠，其中所述IgH-Eμ增强子源自小鼠。
37.权利要求31的转基因小鼠，其中所述B细胞恶性肿瘤是白血病、淋巴瘤或肿瘤。
38.权利要求31的转基因小鼠，其中所述B细胞恶性肿瘤显示出人急性淋巴母细胞白血病、人淋巴母细胞淋巴瘤或其组合的特征。
39.测定试剂是否影响B细胞恶性肿瘤的方法，包括：
a)将所述试剂施用至转基因小鼠，所述转基因小鼠的基因组包含核酸构建体，所述核酸构建体包含可操作地连接于编码miR-29基因产物的核酸序列的能够指导在所述小鼠的B细胞中表达的至少一种转录调节序列，其中所述小鼠显示出B细胞恶性肿瘤；和
b)该试剂被施用至所述转基因小鼠后，将所述小鼠中B细胞恶性肿瘤的一种或多种症状和/或适应症与相同基因型的对照小鼠进行比较，其中对照小鼠未被施用该试剂，其中相对于对照小鼠，转基因小鼠中B细胞恶性肿瘤的一种或多种症状和/或适应症的可检测性和/或出现速率的差异指示该试剂影响所述B细胞恶性肿瘤。
40.测定试剂在治疗B细胞恶性肿瘤中的治疗功效的方法，包括：
a)将所述试剂施用至转基因小鼠，所述转基因小鼠的基因组包含核酸构建体，所述核酸构建体包含可操作地连接于编码miR-29基因产物的核酸的能够指导在所述小鼠的B细胞中表达的至少一种转录调节序列，其中所述小鼠显示出B细胞恶性肿瘤；和
b)该试剂被施用至所述转基因小鼠后，将所述小鼠中B细胞恶性肿瘤的一种或多种症状和/或适应症与相同基因型的对照小鼠进行比较，其中对照小鼠未被施用该试剂，其中相对于对照小鼠，如果所述试剂抑制、预防和/或减少转基因小鼠中B细胞恶性肿瘤的一种或多种症状和/或适应症，则该试剂被认为具有治疗或预防B细胞恶性肿瘤的治疗功效。
41.权利要求40或41的方法，其中所述至少一种转录调节序列包括VH启动子、IgH-Eμ增强子或其组合。
42.权利要求40或41的方法，其中所述转录调节序列源自小鼠。
43.权利要求40或41的方法，其中所述B细胞恶性肿瘤选自急性淋巴母细胞白血病、B细胞淋巴瘤、B细胞肿瘤及其组合。
44.权利要求41或42的方法，其中所述B细胞恶性肿瘤显示出人急性淋巴母细胞白血病、人淋巴母细胞淋巴瘤或其组合的特征。
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