CN111118008A - Mcl1基因的3’-UTR序列及其应用 - Google Patents

Mcl1基因的3’-UTR序列及其应用 Download PDF

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CN111118008A CN202010045790.0A CN202010045790A CN111118008A CN 111118008 A CN111118008 A CN 111118008A CN 202010045790 A CN202010045790 A CN 202010045790A CN 111118008 A CN111118008 A CN 111118008A
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Abstract

本发明涉及一种可调节细胞内基因表达的核酸元件，其为人或小鼠Mcl1的3’‑UTR序列；还涉及上述核酸元件在制备心脏重构治疗药物中的应用，还涉及上述核酸元件在调节离体细胞内的基因表达中的应用；本发明还提供了上述核酸构建体在制备基因治疗药物中的应用；还涉及包含上述核酸元件的核酸构建体及其应用。例如，可用AAV递送系统将上述核酸构建体递送至细胞内，或递送至病灶处，调节相关细胞或组织中相关基因例如Aggf1和Mcl1的表达，从而实现治疗的目的。将本发明的核酸元件与Mcl1基因可读框串接在一起导入到受损的心脏组织中可具有比仅仅导入可读框更好的疗效。

Description

Mcl1基因的3’-UTR序列及其应用
技术领域
本发明涉及新血管疾病和核酸药物领域，更特别地，涉及Aggf1基因的3’-UTR序列及其应用。
背景技术
高血压性心脏病是当前发病率和死亡率都较高的疾病。在该病的病程中，由心脏炎症和纤维化引起的高血压性心脏重构可导致左室肥厚、收缩和舒张功能障碍，甚至心力衰竭。然而，高血压性心脏病的分子机制尚不清楚，导致目前尚无有效的治疗方案。
MicroRNA(miRNA)介导的基因表达调控一种抑制靶蛋白mRNA翻译和/或促进其降解的主要方法。有报道称，一些3’端的非编码序列(3’-UTR)具有顺式元件的作用，可被识别并与miRNA结合，从而调控其所属的mRNA的稳定性及蛋白表达。
我们的前期研究发现，髓细胞白血病1(Mcl1)是一种抗凋亡的Bcl2家族蛋白，在心肌中高度表达，Mcl1在心肌的稳态和自噬中起着重要的作用，缺乏Mcl1会导致自噬功能受损、线粒体功能障碍和致命的心力衰竭。此外，AGGF1蛋白可以提高小鼠心肌梗死后的存活率。并且，在异丙肾上腺素诱导的心肌肥厚和腹主动脉缩窄诱导的心肌肥厚伴压力超载小鼠模型中，外源性AGGF1均可抑制心肌纤维化，防止心功能障碍和心肌重构的发生。在心衰和高血压患者中，AGGF1和Mcl1的表达均发生下调。在AngII处理的心肌细胞中也发现了该现象。
发明内容
在本研究中，我们发现，单独导入Mcl1基因3’-UTR后，小鼠新心肌细胞中显示出更高的Aggf1水平和Mcl1水平。
基于以上研究，本发明提供了一种可调节细胞内基因表达的核酸元件，其特征在于，为SEQ ID NO:1或2所示序列或其衍生序列。其中，SEQ ID NO:1为小鼠Mcl1基因的3’-UTR序列，SEQ ID NO:2为人Mcl1基因的3’-UTR序列。
此处所述的衍生序列是指，以SEQ ID NO:1或2所示序列中的重要位点为核心衍生出来的可作为3’-UTR的序列。例如，SEQ ID NO:1中，第424-429位和第877-882位影响其与miR-105相关的基因调控功能；第120-125位影响其与miR-101相关的基因调控功能；第340-344位和1668-1672位影响其与miR-93相关的基因调控功能。保留这几个位点中的一个或多个不变，其他位点可在本领域公知技术的范围内做适当的点突变、缺失、插入、倒位等，只要不影响该3’-UTR的调节功能即可。
本发明还提供了上述核酸元件在制备心脏重构治疗药物中的应用。
本发明还提供了上述核酸元件在调节离体细胞内的基因表达中的应用。
本发明还提供了一种核酸构建体，包括ORF和3’-UTR，所述3’-UTR为权利要求1或2所述的核酸元件，所述ORF与所述3’-UTR串接，并且所述3’-UTR位于所述ORF的3’端。
在一个具体实施方案中，所述ORF为编码Mcl1蛋白的核酸序列，并且所述3’-UTR串接在所述ORF的3’端。
在一个具体实施方案中，所述核酸构建体为双链DNA序列。
本发明还提供了上述核酸构建体在制备基因治疗药物中的应用。例如，可用AAV递送系统将上述核酸构建体递送至细胞内，或递送至病灶处，调节相关细胞或组织中相关基因例如Aggf1和Mcl1的表达，从而实现治疗的目的。将本发明的核酸元件与Mcl1基因可读框串接在一起导入到受损的心脏组织中可具有比仅仅导入可读框更好的疗效。
附图说明
图1为心脏重构小鼠模型心脏组织中的Mcl1和Aggf1基因表达水平统计图；
图2为不同的AAV处理后用AngII处理的小鼠新心肌细胞Mcl1和Aggf1蛋白的免疫印迹染色照片及蛋白质水平统计图(A)、Mcl1和Aggf1基因的mRNA水平统计图(B)和分泌的Aggf1蛋白的统计图(C)；
图3为用不同miRNA转染的小鼠新心肌细胞中Mcl1和Aggf1基因的mRNA水平统计图；
图4为AngII灌注小鼠的心脏组织中7种miRNA水平的统计图；
图5为AngII处理过的小鼠新心肌细胞中7种miRNA水平的统计图；
图6为三种miRNA单独或合并转染小鼠新心肌细胞后Aggf1和Mcl1的免疫印迹照片和mRNA统计图；
图7为分别用miR-105(A)、miR-101(B)和miR-93(C)转染含有不同荧光素酶质粒(缺失Mcl1基因3’-UTR的不同位置)的HEK293细胞后测量的荧光素酶活性的统计图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
1、组织与细胞中的Mcl1和Aggf1基因表达情况
我们从6个具有心脏重构症状的心脏移植患者和3个健康的志愿者采集心脏组织样品，通过RT-PCR检测Mcl1和Aggf1基因的表达情况，结果显示，具有心脏重构症状的患者的心脏组织中，Mcl1和Aggf1基因的表达水平均显著下调，免疫印迹实验亦得到了类似结果。可见，Mcl1和Aggf1基因的表达水平下调与心衰、高血压等心血管疾病有着明显的相关性。
2、心脏重构小鼠模型及其心脏组织中的基因表达
雄性C57BL/6小鼠，置于对照环境中，调节温度(22±1℃)和湿度(55％)，12:12小时暗光周期，不限制进食和饮水。所有动物研究均经中南大学动物保护与利用委员会批准，并按照国家卫生研究院指导原则进行。
将AngII(1mg/kg/day,Sigma)或生理盐水载剂(Veh)经皮渗透微泵(Alzet,Cupertino,CA)灌注6周，建立小鼠心脏重构模型。
采集小鼠心脏组织，检测其中Mcl1和Aggf1基因的表达，结果如图1所示，AngII灌注小鼠心脏组织中Mcl1和Aggf1基因的mRNA水平显著低于对照组小鼠。可见，AngII灌注可导致Mcl1和Aggf1基因表达水平下调。
3、AngII孵育对小鼠心肌细胞基因表达的影响
从1-3日的新生小鼠采集心脏，并立即消化，离心弃上清后，用含有10％血清的生长培养基重悬，培养24h后，加入新鲜的生长培养基，并培养48h。然后用AAV孵育12h。AAV孵育后的新心肌细胞用PBS洗涤，并使其处于饥饿状态过夜，然后用AngII处理24h。
我们设计了体外实验，使用分离的小鼠心肌细胞与AngII一起孵育，测定孵育后的小鼠心肌细胞中Mcl1和Aggf1基因的表达水平，结果显示，AngII孵育的小鼠心肌细胞中Mcl1和Aggf1基因的mRNA水平和蛋白水平均下调。
4、Mcl1基因的3’-UTR对Mcl1和Aggf1基因表达的影响
从cDNA扩增含有Mcl1的蛋白编码序列和3’-UTR的全长Mcl1基因、只含有Mcl1蛋白编码序列的Mcl1基因，以及3’-UTR序列(SEQ ID NO:1或2，其中SEQ ID NO:1为小鼠Mcl1基因的3’-UTR，SEQ ID NO:2为人Mcl1基因的3’-UTR)，分别插入AAV9质粒中，得到AAV-Mc-FL、AAV-Mc和AAV-Mc-U。通过三质粒共转染在HEK293中包装AAV9，并纯化得到的AAV9颗粒。
用AAV-Mc-U病毒颗粒处理小鼠新心肌细胞，使小鼠新心肌细胞中单独表达Mcl1的3’-UTR，结果显示Mcl1基因和Aggf1基因的mRNA水平和蛋白水平都提高，并且伴随着Aggf1蛋白的分泌量也升高(图2)。
将人Mcl1的3’-UTR插入到pLuc质粒中，形成pLuc-Mc-U质粒，在HEK293细胞中进行荧光素酶活性实验，结果显示，通过siRNA下调Aggf1基因可导致pLuc-Mc-U的荧光素酶活性下降。类似地，下调Mcl1基因可导致pLuc-Ag-U的荧光素酶活性下降。
以上实验说明，Mcl1基因的3’-UTR不仅可直接作为Mcl1基因的mRNA的顺式元件起作用，提高Aggf1基因和Mcl1基因的表达，还可以独立提高Aggf1基因和Mcl1基因的表达，从而对心脏组织和心脏细胞起保护作用。
5、鉴定与Aggf1基因和Mcl1基因的3’UTR相互作用的miRNA
我们通过研究分析，筛选出有可能与Aggf1基因与Mcl1基因的3’UTR相互作用的7种miRNA，包括miR-495、miR-101、miR-29、miR-105、miR-217、miR-93和miR-448。将这些miRNA分别转入小鼠新心肌细胞中，结果显示，miR-101、miR-105和miR-93降低Aggf1基因和Mcl1基因的mRNA水平(图3)和蛋白水平。
在AngII灌注小鼠的心脏组织中和用AngII处理过的小鼠新心肌细胞中，我们都检测到miR-101、miR-105和miR-93的上调表达(图4和5)。将miR-101、miR-105和miR-93单独或合并转染小鼠新心脏细胞，我们发现，无论单独或合并转染的细胞中，Aggf1基因和Mcl1基因表达水平均显著降低。并且，与分别转染相比，合并转染的细胞中Aggf1基因和Mcl1基因表达水平大幅降低(图6)，可见miR-101、miR-105和miR-93对于Aggf1基因和Mcl1基因表达水平的影响具有加和效应。
进一步的实验和研究发现，如图7所示，小鼠Mcl1基因3’-UTR的第424-429位(Mc-U105Δ1)和第877-882位(Mc-U105Δ2)影响其与miR-105相关的基因调控功能；第120-125位(Mc-U101Δ1)影响其与miR-101相关的基因调控功能；第340-344(Mc-U93Δ1)位和1668-1672位(Mc-U93Δ3)影响其与miR-93相关的基因调控功能。
由此可见，Mcl1基因的3’UTR调节Aggf1基因和Mcl1基因的一个途径是通过与相关的miRNA结合来实现的。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 南京医科大学
<120> Mcl1基因的3’-UTR序列及其应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2353
<212> DNA
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 1
ccttgtgagt gcaatagggg actcttaaag ctccagccac caaactacat gcatctgtga 60
aaacatgtgt atttatgaag gtggacttga agctgcccag gattttaaca gtccagttct 120
actgtagcaa catagcaaaa agaaagtggc tacaggattg tggctaacaa gaataaatac 180
atgggaaaag tgctccccct ggaagagtca ctgtctgaat gaagcaaagt tccctctcag 240
caaacactga gaggccatgg agaaggactt ctagaatgaa tgaaaggggt ggatggaaag 300
gtttgatttc ctatctagag atggaagagg ggccagtcat caggctagtc acaaagctca 360
ataaatatcc attactctgc tcagagtgtt gagagagaag ccctaattaa caacgttggt 420
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gctgtacagg aatgtgaagg gaggcctctg agcagtccag ggtgtgcttg acaaagtccc 540
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ataccctttt gaaatttgca gcttctctag ttagaaatgt atttcttaca gctttttaag 840
actttgtcat ccgttctagt gtatatgcag agcctgttgt gtgtgtggac tggttataga 900
tttataacta tgcagggtta attatccaat cttttttttt tgtatttaaa gatcacaggt 960
agatagatgt aagacatttg atcccctgtt gacttacaaa attgtaaatg gtaaagcagg 1020
ctagagtctt aaccatggtg ctattcactg ggtttacttg tttaacacaa gtttatacct 1080
ggtgtcaata aaacaaatat gtatttcttg tctactaagg attgccaagc tttgttttga 1140
atttctgtat tggtctctag gtgtagcctt tacttccttt actgttggcg tgttatgctc 1200
ccagttcccc tatagagtcg tctacacttc ctccctgtgc tcttcactgg ccattttagt 1260
tatctgcatt agaactctca ccccaacccc cccaaaactt tgaacctaaa taacccctcc 1320
cccatcctaa tcagagtcag cacagctttc ctgtcagagg ataggaacac ttgctctttg 1380
agccccgtga ccgacagtga ccagggattg gcattcttgg attggcatgc tttccattgt 1440
tactttgtct attttggtaa gaaaaacatc aaaggtcccc ttgggaattt caaaggttgg 1500
aaattatacg tttatacttt tattagtttg ctccaagtat gactgtgttc acttaagttt 1560
agagaaacac tgggttttgc taaactcggt taacaaaagc cactggtaac tgaaggtatt 1620
taagctaggg tcatttgaaa gcttcagcct cagaatgtga cctttagtca gggctgcaga 1680
taaaaatagg caggaatcaa atgactaaga atgtaatagg gaagaagtgc cctgcctgcc 1740
agcttgggag tgatttgtac ctgtgtattt atccttgatc atagtttgct tatttatgtt 1800
taactcttcg gacttcagag cactttatgt agttgaataa accctagagg ttgaggtgac 1860
taaaaggtta gcctctcata acccagccat ggaagttttg tttactagga gcctgacttc 1920
ccagctcaca aagggtgaaa tgaaagctga agtacagaca ggatcttagt aggtatttta 1980
ggtccagggc catgaagact tggagagcgc agtggctggg caaggggctg ctttggaggg 2040
aagaagcatg tggtctgagt gctgactaga tgaatagttg aggcacatcc ttcagagaag 2100
agggaggggc tgcttggaaa gatggctctc agcaaaatct gtttgtctta cacgtctctc 2160
agggaaaaaa catgcagtct tcaagcatct tccatgtaca ttctatctgg gtgaacacct 2220
tcattctggt agagcaccta acactttaac agctgttccc gaaagggtta ggaccaactg 2280
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<210> 2
<211> 2824
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 2
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gaaagtgtct atattggaac tagggtcatt tgaaagcttc agtctcggaa catgaccttt 2040
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ggtgggttta tagggggagg aggaggcagg tggtctaagt gctgactggc tacgtagttc 2520
gggcaaatcc tccaaaaggg aaagggagga tttgcttaga aggatggcgc tcccagtgac 2580
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gtttcatgta cattctgtgg ggggtgaaca ccttggttct ggttaaacag ctgtactttt 2700
gatagctgtg ccaggaaggg ttaggaccaa ctacaaatta atgttggttg tcaaatgtag 2760
tgtgtttccc taactttctg tttttcctga gaaaaaaaaa taaatctttt attcaaatac 2820
aggg 2824

Claims (7)

1.一种可调节细胞内基因表达的核酸元件，其特征在于，序列如SEQ ID NO:1或2所示，或为SEQ ID NO:1或2的衍生序列。
2.权利要求1和所述的核酸元件在制备心脏重构治疗药物中的应用。
3.权利要求1和所述的核酸元件在调节离体细胞内的基因表达中的应用。
4.一种核酸构建体，其特征在于，包括ORF和3’-UTR，所述3’-UTR为权利要求1或2所述的核酸元件，所述ORF与所述3’-UTR串接，并且所述3’-UTR位于所述ORF的3’端。
5.根据权利要求4所述的核酸构建体，其特征在于，所述ORF为编码Mcl1蛋白的核酸序列。
6.根据权利要求5中任一项所述的核酸构建体，其特征在于，所述核酸构建体为双链DNA序列。
7.权利要求5或6所述的核酸构建体在制备基因治疗药物中的应用。
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