CN103102398B - 一种利用纳米银浓缩分离Dps蛋白的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种利用纳米银浓缩分离Dps蛋白的方法，属于生物技术领域一种分离功能蛋白的技术。其特征在于采取如下步骤：（1）菌体培养和破碎，获得可溶性菌体蛋白溶液；（2）在菌体可溶性蛋白溶液中加纳米银；（3）将溶液进行高速离心，收集沉淀，Dps与纳米银结合后被离心到沉淀中，用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测Dps。本发明所提供的方法通过纳米银的结合将Dps从菌体可溶性蛋白中离心沉淀出来、进行富集浓缩，使得Dps蛋白的分离更为高效，而且本方法成本较低，简便易行。

Description

一种利用纳米银浓缩分离Dps蛋白的方法

技术领域

本发明涉及一种利用纳米银浓缩分离Dps蛋白的方法，属于生物技术领域一种分离功能蛋白的技术。

背景技术

蛋白是细菌和古细菌编码的一种高度保守的蛋白，大肠杆菌的Dps于1992年首先被发现，目前在例如无害李斯特氏菌（Listeria innocua）、乳酸乳球菌（ Lactococcus lactis）、幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）、根癌土壤杆菌（Agrobacterium tumefaciens）、耻垢分支杆菌（Mycobacterium smegmati s）等几乎所有被检测的细菌中均已发现Dps家族蛋白，超过一千种Dps类蛋白已经被确定 (http://www.uniprot.org)。它们当中接近97% 在细菌中发现，剩余的 3%在古细菌中，但不存在于动物和人中。

Dps蛋白的结构信息也不断增加(http://www.rcsb.org), 揭示了整个蛋白家族的高度保守型。大肠杆菌Dps单体由167个氨基酸构成，分子量接近20KD，形成5个α-螺旋二级结构；活性结构为十二聚体，由12个单体形成了一个直径9nm、内腔直径4.5nm、近似球形中空的六面体结构颗粒（Nat Struct,Biol, 5:294-303,1998）。Dps蛋白每2个单体形成一个二聚体，一个二聚体形成一个面，形成二聚体的两个单体作用界面处含有两个铁氧化酶活性位点，共计12个铁结合位点。Fe(II)离子经氧化后转移到球体中空内腔，每个十二聚体的活性Dps能够结合约450-500个铁，形成Dps结合铁,当细菌需要铁时再以Fe(II)离子形式释放到细胞质溶液中供细菌利用。

在逆境胁迫条件如恶劣的生存环境、营养缺乏或药物作用时，Dps蛋白大量表达，十二聚体的Dps将通过生物晶体化（biocrystallization）方式聚集，能够在菌体内结合Fe(II)离子防止其通过芬东反应氧化产生自由基；能催化Fe(II)和Fe(III)的转化，防止Fe(III)因沉淀导致的毒性；与DNA非特异结合并保护DNA分子，防止DNA分子的氧化损伤。除此之外，Dps一类的蛋白展示出除抗氧化保护作用和DNA结合功能能之外的多种活性，Dps家族的成员可以作为毒力因子保护细胞抵抗冷激热激、金属胁迫，甚至与炎症过程有关（Rendiconti Lincei,19:261-270,2008)。鉴于Dps蛋白的结构和功能特点，其在生物技术和纳米技术领域将有广泛的应用前景。

纳米材料是指在三维空间上至少有一维尺度小于100nm的材料。纳米材料由于尺寸很小，结构特殊，具有与传统材料不同的理化特性，如小尺寸效应，量子效应，巨大表面比效应，量子隧道效应等。这些特性使纳米材料被广泛应用到药物载体，杀菌，食品保鲜，化妆品，涂料、服装制造等众多领域，这使人们有更多的机会直接接触到纳米材料。纳米银是由银制备的纳米材料，纳米银颗粒与生物大分子存在作用，特别是它巨大的表面比特性能吸附大量的蛋白质（Adv. Colloid Interface Sci. 167:134–135，2007），而这种吸附又是造成蛋白活性改变，影响生理机能的重要机制。纳米银具有杀菌、抑菌作用，其机制可能是通过细菌DNA损伤、活性氧自由基的氧化损伤、脱氢酶失活、菌体内溶物泄漏和中断细胞信号转导等机制发挥的作用（食品科学,17:420-424,2010），但还缺乏深入的实验证据支持。

目前有关纳米银与Dps蛋白之间的相互作用尚未见有报道。但是对Dps蛋白的应用已有研究，国内相关专利有“用于疫苗和诊断学的Dps蛋白（专利申请号201080060432.1）”，提供了一种新型Dps融合蛋白，其包含与Dps蛋白融合的蛋白或肽，可应用于疫苗、诊断试剂等领域。

发明内容

本项发明专利的意义在于通过纳米银与Dps结合从菌体大量可溶性菌体蛋白成分中浓缩分离Dps蛋白，整个方法简便快捷。

一种利用纳米银浓缩分离Dps蛋白的方法，其特征在于采取如下步骤：（1）菌体培养和破碎，获得可溶性菌体蛋白溶液，（2）在菌体可溶性蛋白溶液中加纳米银，（3）将溶液进行高速离心，收集沉淀，Dps与纳米银结合后被离心到沉淀中。

步骤（1）中，将菌体在液体培养基中培养至静止期，然后将菌体进行超声波破碎或反复冻融破碎，10 000rpm 离心10-20分钟，取上清，此为菌体可溶性蛋白溶液。

步骤（2）中，在菌体可溶性蛋白溶液中加入纳米银，至纳米银浓度为5-500ppm。25-37℃条件下震荡30分钟。

步骤（3）中，将溶液10 000 rpm，离心10-20分钟，收集沉淀。 

本发明所述菌体为细菌或古细菌。

本发明所述DPS若是基因工程改造后的工程菌分泌表达，则步骤（2）在培养液中加纳米银。

目前常用的Dps蛋白的分离纯化方法一般是将菌体破碎后获得菌体可溶性蛋白溶液，用硫酸铵沉淀方法分离Dps蛋白，或者用柱层析的方法分离纯化蛋白，因为菌体中可溶性蛋白种类比较多且Dps蛋白含量较低，从中分离Dps蛋白比较困难。本专利所提供的方法首次发现并利用纳米银与Dps蛋白的结合作用分离Dps，通过纳米银的结合将Dps从菌体可溶性蛋白中离心沉淀出来、进行富集浓缩，使得Dps蛋白的分离更为高效，而且本方法成本较低，简便易行。

附图说明

图1.在大肠杆菌菌体可溶性蛋白中加入10ppm和50ppm纳米银，SDS-PAGE电泳检测图。M.低分子量标准指示蛋白；1.大肠杆菌全菌可溶性蛋白；2.加入10ppm纳米银，离心后的上清组分；3.加入10ppm纳米银，离心后的沉淀组分；4.加入50ppm纳米银，离心后的上清组分；5.加入50ppm纳米银，离心后的沉淀组分。

图2.在大肠杆菌菌体可溶性蛋白加入200ppm纳米银，SDS-PAGE电泳图。M.低分子量标准指示蛋白；1.加入200ppm纳米银，离心后的上清组分；2.加入200ppm纳米银，离心后的沉淀组分。 

具体实施方式

实施例1 用10ppm和50ppm纳米银从大肠杆菌菌体可溶性蛋白中分离Dps蛋白。

（1）在50ml LB液体培养基中按1%接种量接种接种大肠杆菌（Escherichia coli），37℃震荡培养14小时到稳定期，8000rpm离心10 min，收集菌体，沉淀用10ml 20mmol/L PBS（pH7.4)缓冲液悬起，菌悬液在冰浴中进行超声波破碎，频率20kHz，功率150W，每破碎15秒，间隔15秒，15个循环。4℃，10 000rpm离心10分钟取上清，此为菌体可溶性蛋白溶液。

（2）分别取1ml菌体可溶性蛋白溶液加入容器1和容器2，然后加入纳米银至终浓度为10ppm和50ppm。37℃震荡孵育3小时。

（3）10 000rpm离心10分钟，分别取上清和沉淀，十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）检测。电泳检测过程为：制备SDS-PAGE凝胶，上层胶的浓度4%，下层胶的浓度10%；取全菌可溶性蛋白和上清各0.5ml、沉淀用0.5ml蒸馏水悬浮，然后分别加入等量加样缓冲液，沸水浴5min，制成电泳样品；将全菌可溶性蛋白样品、上清样品和沉淀样品分别加样10ul，同时在另一加样孔加低分子量标准蛋白样品5ul，200V 恒压电泳1.5小时；电泳后的胶板进行考马斯亮蓝R-250染色3小时，然后在脱色液中脱色至出现清晰条带。

电泳胶染色结果见图1。沉淀样品中在与大肠杆菌Dps蛋白分子量相符的18.7KD位置处有清晰的条带，将该蛋白切胶纯化后，用MALDI-TOF-MS(基质辅助激光解析电离飞行时间质谱)技术测定蛋白氨基酸序列，确定为大肠杆菌Dps蛋白。经凝胶成像分析系统中Gel-pro软件分析，加入纳米银终浓度为10ppm和50ppm的两组，Dps在样品沉淀中的含量可达37%和27%。

以上结果显示菌体破碎后的可溶性蛋白溶液中含有Dps蛋白，而加入纳米银离心后Dps蛋白大量出现在沉淀组分中，上清组分中没有发现Dps蛋白，因此利用纳米银可以从可溶性菌体蛋白中分离Dps蛋白。

实施例2 用200ppm纳米银从大肠杆菌菌体可溶性蛋白中分离Dps蛋白。

（1）在10ml LB液体培养基中按1%接种量接种将大肠杆菌，37℃震荡培养14小时，8000rpm离心10 min，收集菌体，沉淀用2 ml 20mmol/L PBS（pH7.4)缓冲液悬起；将菌悬液在-80℃冰冻、室温融解，反复冻融5次。10 000转/分离心20分钟取上清，此为菌体可溶性蛋白溶液。

（2）菌体可溶性蛋白溶液中加入纳米银，终浓度浓度为200ppm。37℃震荡孵育3小时。

（3）10 000 rpm离心20分钟，收集沉淀，加入蒸馏水洗两次。

（4）经十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）检测，Dps蛋白出现在沉淀中，经凝胶成像分析系统中Gel-pro软件分析，在样品沉淀中的含量可达25%。

Claims (6)

1.一种利用纳米银浓缩分离Dps蛋白的方法，其特征在于采取如下步骤：（1）菌体培养和破碎，获得可溶性菌体蛋白溶液，（2）在菌体可溶性蛋白溶液中加纳米银，（3）将溶液进行高速离心，收集沉淀，Dps与纳米银结合后被离心到沉淀中，用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测Dps。

2.根据权利要求1所述的一种利用纳米银浓缩分离Dps蛋白的方法，其特征在于步骤（1）中，将菌体在液体培养基中培养至静止期，8000rpm离心10 min收集菌体，用20mmol/L、pH7.4的PBS缓冲液悬浮菌体，将菌悬液超声波破碎或反复冻融破碎，4 ℃、10 000rpm 离心10-20分钟，取上清，此为菌体可溶性蛋白溶液。

3.根据权利要求1所述的一种利用纳米银浓缩分离Dps蛋白的方法，其特征在于步骤（2）中，在菌体可溶性蛋白溶液中加入纳米银，纳米银浓度为5-500ppm，25-37℃条件下震荡孵育30分钟。

4.根据权利要求1所述的一种利用纳米银浓缩分离Dps蛋白的方法，其特征在于步骤（3）中，将溶液在4℃、10 000 rpm条件下，离心10-20分钟，收集沉淀，用浓缩胶为4%、分离胶为10%的十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测Dps。

5.根据权利要求1所述的一种利用纳米银分离Dps蛋白的方法，其所述菌体为细菌或古细菌。

6.权利要求1所述的一种利用纳米银分离Dps蛋白的方法，其中所述Dps若是基因工程改造后的工程菌分泌表达，则步骤（2）在培养液中加纳米银。