CN103102398B - 一种利用纳米银浓缩分离Dps蛋白的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种利用纳米银浓缩分离Dps蛋白的方法,属于生物技术领域一种分离功能蛋白的技术。其特征在于采取如下步骤:(1)菌体培养和破碎,获得可溶性菌体蛋白溶液;(2)在菌体可溶性蛋白溶液中加纳米银;(3)将溶液进行高速离心,收集沉淀,Dps与纳米银结合后被离心到沉淀中,用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测Dps。本发明所提供的方法通过纳米银的结合将Dps从菌体可溶性蛋白中离心沉淀出来、进行富集浓缩,使得Dps蛋白的分离更为高效,而且本方法成本较低,简便易行。
Description
技术领域
本发明涉及一种利用纳米银浓缩分离Dps蛋白的方法,属于生物技术领域一种分离功能蛋白的技术。
背景技术
蛋白是细菌和古细菌编码的一种高度保守的蛋白,大肠杆菌的Dps于1992年首先被发现,目前在例如无害李斯特氏菌(Listeria innocua)、乳酸乳球菌( Lactococcus lactis)、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)、根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)、耻垢分支杆菌(Mycobacterium smegmati s)等几乎所有被检测的细菌中均已发现Dps家族蛋白,超过一千种Dps类蛋白已经被确定 (http://www.uniprot.org)。它们当中接近97% 在细菌中发现,剩余的 3%在古细菌中,但不存在于动物和人中。
Dps蛋白的结构信息也不断增加(http://www.rcsb.org), 揭示了整个蛋白家族的高度保守型。大肠杆菌Dps单体由167个氨基酸构成,分子量接近20KD,形成5个α-螺旋二级结构;活性结构为十二聚体,由12个单体形成了一个直径9nm、内腔直径4.5nm、近似球形中空的六面体结构颗粒(Nat Struct,Biol, 5:294-303,1998)。Dps蛋白每2个单体形成一个二聚体,一个二聚体形成一个面,形成二聚体的两个单体作用界面处含有两个铁氧化酶活性位点,共计12个铁结合位点。Fe(II)离子经氧化后转移到球体中空内腔,每个十二聚体的活性Dps能够结合约450-500个铁,形成Dps结合铁,当细菌需要铁时再以Fe(II)离子形式释放到细胞质溶液中供细菌利用。
在逆境胁迫条件如恶劣的生存环境、营养缺乏或药物作用时,Dps蛋白大量表达,十二聚体的Dps将通过生物晶体化(biocrystallization)方式聚集,能够在菌体内结合Fe(II)离子防止其通过芬东反应氧化产生自由基;能催化Fe(II)和Fe(III)的转化,防止Fe(III)因沉淀导致的毒性;与DNA非特异结合并保护DNA分子,防止DNA分子的氧化损伤。除此之外,Dps一类的蛋白展示出除抗氧化保护作用和DNA结合功能能之外的多种活性,Dps家族的成员可以作为毒力因子保护细胞抵抗冷激热激、金属胁迫,甚至与炎症过程有关(Rendiconti Lincei,19:261-270,2008)。鉴于Dps蛋白的结构和功能特点,其在生物技术和纳米技术领域将有广泛的应用前景。
纳米材料是指在三维空间上至少有一维尺度小于100nm的材料。纳米材料由于尺寸很小,结构特殊,具有与传统材料不同的理化特性,如小尺寸效应,量子效应,巨大表面比效应,量子隧道效应等。这些特性使纳米材料被广泛应用到药物载体,杀菌,食品保鲜,化妆品,涂料、服装制造等众多领域,这使人们有更多的机会直接接触到纳米材料。纳米银是由银制备的纳米材料,纳米银颗粒与生物大分子存在作用,特别是它巨大的表面比特性能吸附大量的蛋白质(Adv. Colloid Interface Sci. 167:134–135,2007),而这种吸附又是造成蛋白活性改变,影响生理机能的重要机制。纳米银具有杀菌、抑菌作用,其机制可能是通过细菌DNA损伤、活性氧自由基的氧化损伤、脱氢酶失活、菌体内溶物泄漏和中断细胞信号转导等机制发挥的作用(食品科学,17:420-424,2010),但还缺乏深入的实验证据支持。
目前有关纳米银与Dps蛋白之间的相互作用尚未见有报道。但是对Dps蛋白的应用已有研究,国内相关专利有“用于疫苗和诊断学的Dps蛋白(专利申请号201080060432.1)”,提供了一种新型Dps融合蛋白,其包含与Dps蛋白融合的蛋白或肽,可应用于疫苗、诊断试剂等领域。
发明内容
本项发明专利的意义在于通过纳米银与Dps结合从菌体大量可溶性菌体蛋白成分中浓缩分离Dps蛋白,整个方法简便快捷。
一种利用纳米银浓缩分离Dps蛋白的方法,其特征在于采取如下步骤:(1)菌体培养和破碎,获得可溶性菌体蛋白溶液,(2)在菌体可溶性蛋白溶液中加纳米银,(3)将溶液进行高速离心,收集沉淀,Dps与纳米银结合后被离心到沉淀中。
步骤(1)中,将菌体在液体培养基中培养至静止期,然后将菌体进行超声波破碎或反复冻融破碎,10 000rpm 离心10-20分钟,取上清,此为菌体可溶性蛋白溶液。
步骤(2)中,在菌体可溶性蛋白溶液中加入纳米银,至纳米银浓度为5-500ppm。25-37℃条件下震荡30分钟。
步骤(3)中,将溶液10 000 rpm,离心10-20分钟,收集沉淀。
本发明所述菌体为细菌或古细菌。
本发明所述DPS若是基因工程改造后的工程菌分泌表达,则步骤(2)在培养液中加纳米银。
目前常用的Dps蛋白的分离纯化方法一般是将菌体破碎后获得菌体可溶性蛋白溶液,用硫酸铵沉淀方法分离Dps蛋白,或者用柱层析的方法分离纯化蛋白,因为菌体中可溶性蛋白种类比较多且Dps蛋白含量较低,从中分离Dps蛋白比较困难。本专利所提供的方法首次发现并利用纳米银与Dps蛋白的结合作用分离Dps,通过纳米银的结合将Dps从菌体可溶性蛋白中离心沉淀出来、进行富集浓缩,使得Dps蛋白的分离更为高效,而且本方法成本较低,简便易行。
附图说明
图1.在大肠杆菌菌体可溶性蛋白中加入10ppm和50ppm纳米银,SDS-PAGE电泳检测图。M.低分子量标准指示蛋白;1.大肠杆菌全菌可溶性蛋白;2.加入10ppm纳米银,离心后的上清组分;3.加入10ppm纳米银,离心后的沉淀组分;4.加入50ppm纳米银,离心后的上清组分;5.加入50ppm纳米银,离心后的沉淀组分。
图2.在大肠杆菌菌体可溶性蛋白加入200ppm纳米银,SDS-PAGE电泳图。M.低分子量标准指示蛋白;1.加入200ppm纳米银,离心后的上清组分;2.加入200ppm纳米银,离心后的沉淀组分。
具体实施方式
实施例1 用10ppm和50ppm纳米银从大肠杆菌菌体可溶性蛋白中分离Dps蛋白。
(1)在50ml LB液体培养基中按1%接种量接种接种大肠杆菌(Escherichia coli),37℃震荡培养14小时到稳定期,8000rpm离心10 min,收集菌体,沉淀用10ml 20mmol/L PBS(pH7.4)缓冲液悬起,菌悬液在冰浴中进行超声波破碎,频率20kHz,功率150W,每破碎15秒,间隔15秒,15个循环。4℃,10 000rpm离心10分钟取上清,此为菌体可溶性蛋白溶液。
(2)分别取1ml菌体可溶性蛋白溶液加入容器1和容器2,然后加入纳米银至终浓度为10ppm和50ppm。37℃震荡孵育3小时。
(3)10 000rpm离心10分钟,分别取上清和沉淀,十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测。电泳检测过程为:制备SDS-PAGE凝胶,上层胶的浓度4%,下层胶的浓度10%;取全菌可溶性蛋白和上清各0.5ml、沉淀用0.5ml蒸馏水悬浮,然后分别加入等量加样缓冲液,沸水浴5min,制成电泳样品;将全菌可溶性蛋白样品、上清样品和沉淀样品分别加样10ul,同时在另一加样孔加低分子量标准蛋白样品5ul,200V 恒压电泳1.5小时;电泳后的胶板进行考马斯亮蓝R-250染色3小时,然后在脱色液中脱色至出现清晰条带。
电泳胶染色结果见图1。沉淀样品中在与大肠杆菌Dps蛋白分子量相符的18.7KD位置处有清晰的条带,将该蛋白切胶纯化后,用MALDI-TOF-MS(基质辅助激光解析电离飞行时间质谱)技术测定蛋白氨基酸序列,确定为大肠杆菌Dps蛋白。经凝胶成像分析系统中Gel-pro软件分析,加入纳米银终浓度为10ppm和50ppm的两组,Dps在样品沉淀中的含量可达37%和27%。
以上结果显示菌体破碎后的可溶性蛋白溶液中含有Dps蛋白,而加入纳米银离心后Dps蛋白大量出现在沉淀组分中,上清组分中没有发现Dps蛋白,因此利用纳米银可以从可溶性菌体蛋白中分离Dps蛋白。
实施例2 用200ppm纳米银从大肠杆菌菌体可溶性蛋白中分离Dps蛋白。
(1)在10ml LB液体培养基中按1%接种量接种将大肠杆菌,37℃震荡培养14小时,8000rpm离心10 min,收集菌体,沉淀用2 ml 20mmol/L PBS(pH7.4)缓冲液悬起;将菌悬液在-80℃冰冻、室温融解,反复冻融5次。10 000转/分离心20分钟取上清,此为菌体可溶性蛋白溶液。
(2)菌体可溶性蛋白溶液中加入纳米银,终浓度浓度为200ppm。37℃震荡孵育3小时。
(3)10 000 rpm离心20分钟,收集沉淀,加入蒸馏水洗两次。
(4)经十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测,Dps蛋白出现在沉淀中,经凝胶成像分析系统中Gel-pro软件分析,在样品沉淀中的含量可达25%。
Claims (6)
1.一种利用纳米银浓缩分离Dps蛋白的方法,其特征在于采取如下步骤:(1)菌体培养和破碎,获得可溶性菌体蛋白溶液,(2)在菌体可溶性蛋白溶液中加纳米银,(3)将溶液进行高速离心,收集沉淀,Dps与纳米银结合后被离心到沉淀中,用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测Dps。
2.根据权利要求1所述的一种利用纳米银浓缩分离Dps蛋白的方法,其特征在于步骤(1)中,将菌体在液体培养基中培养至静止期,8000rpm离心10 min收集菌体,用20mmol/L、pH7.4的PBS缓冲液悬浮菌体,将菌悬液超声波破碎或反复冻融破碎,4 ℃、10 000rpm 离心10-20分钟,取上清,此为菌体可溶性蛋白溶液。
3.根据权利要求1所述的一种利用纳米银浓缩分离Dps蛋白的方法,其特征在于步骤(2)中,在菌体可溶性蛋白溶液中加入纳米银,纳米银浓度为5-500ppm,25-37℃条件下震荡孵育30分钟。
4.根据权利要求1所述的一种利用纳米银浓缩分离Dps蛋白的方法,其特征在于步骤(3)中,将溶液在4℃、10 000 rpm条件下,离心10-20分钟,收集沉淀,用浓缩胶为4%、分离胶为10%的十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测Dps。
5.根据权利要求1所述的一种利用纳米银分离Dps蛋白的方法,其所述菌体为细菌或古细菌。
6.权利要求1所述的一种利用纳米银分离Dps蛋白的方法,其中所述Dps若是基因工程改造后的工程菌分泌表达,则步骤(2)在培养液中加纳米银。
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