CN103091443B

CN103091443B - 混合制剂中盐酸吗啉胍含量和乙酸铜含量的检测方法

Info

Publication number: CN103091443B
Application number: CN201310035297.0A
Authority: CN
Inventors: 曾显斌; 曾芸; 夏中梅; 黄秀辉; 侯勇; 朱培玲; 陈浩; 胡甦; 王兰英; 敬华英
Original assignee: Sichuan Lanyue Science & Technology Co ltd; SAAS BIOTECHNOLOGY AND NUCLEAR TECHNOLOGY RESEARCH INSTITUTE
Current assignee: Sichuan Lanyue Science & Technology Co ltd; SAAS BIOTECHNOLOGY AND NUCLEAR TECHNOLOGY RESEARCH INSTITUTE
Priority date: 2013-01-30
Filing date: 2013-01-30
Publication date: 2014-08-06
Anticipated expiration: 2033-01-30
Also published as: CN103091443A

Abstract

本发明提供了一种混合制剂中盐酸吗啉胍含量和乙酸铜含量的检测方法，包括：1）采用反相高效液相色谱法，其色谱条件如下：色谱柱：C₁₈，5μm，150×4.6mm(I.D)；流动相组成：按体积比甲醇：缓冲溶液=70～50:30～50，并以冰乙酸调节pH=3～5；缓冲溶液组成：按体积比乙酸钠-乙酸∶阴离子对试剂＝1～3∶1～3；流速：1.0ml/min；柱温：30℃；检测波长：237nm；进样体积：20.0μl；2）配制盐酸吗啉胍和乙酸铜标准溶液及样品溶液；3）用二极管阵列检测器在200～400nm之间进行连续扫描；4）制作标准曲线，测定峰面积，计算出样品主成分的含量。本发明方法在同柱同条件下同时测定盐酸吗啉胍和乙酸铜含量，简单快速、节约时间和检测成本。

Description

混合制剂中盐酸吗啉胍含量和乙酸铜含量的检测方法

技术领域：

本发明涉及一种测定盐酸吗啉胍·乙酸铜混合制剂中盐酸吗啉胍含量和乙酸铜含量的检测方法。

背景技术：

盐酸吗啉胍别名为病毒灵，吗啉胍，吗啉咪胍，盐酸吗啉双胍。乙酸铜又称醋酸铜，别名一水醋酸铜。是一种广谱、低毒病毒防治剂,是一种有机铜杀菌剂。

盐酸吗啉胍的结构式：

乙酸铜的结构式：

在农业上，盐酸吗啉胍作为防治植物病害的杀菌剂，主要用来防治番茄病毒病，对番茄、青椒、黄瓜、甘蓝、大白菜、烟草等多种作物发生的花叶病、蕨叶病、条斑病具有预防和治疗作用。乙酸铜杀菌机理主要是铜离子与病源细胞膜表面上的阳离子（H⁺、K⁺等）交换，导致病源细胞膜上的蛋白质凝固，从而杀死病菌；部分铜离子可渗透进入病源细胞膜内，与多种酶结合，影响代谢酶的活性，导致病源菌代谢机理失调，病菌因而衰竭死亡。作为铜离子杀菌剂对病源细菌、真菌、病毒都有良好的灭杀效果。广泛应用于葡萄、柑橘病菌的防治，也适用于黄瓜、西瓜、番茄、辣椒、茄子等蔬菜以及棉花、水稻等多种作物。以往对盐酸吗啉胍的检测方法有液相色谱法、气相色谱法、极谱法、紫外分光光度法等；对乙酸铜的检测方法常采用碘量法和络合滴定法；混合制剂中，对二者的检测，通常采用二次取样，用不同方法分别进行测定，这样既费时间，又浪费药品。

发明内容：

本发明的目的是为了克服现有技术中对混合制剂中盐酸吗啉胍和乙酸铜含量的检测必须采用二次取样，用不同方法分别进行定量检测的不足，提供一种在同柱同条件下同时测定盐酸吗啉胍和乙酸铜含量简单快速、节约时间和检测成本的混合制剂中盐酸吗啉胍含量和乙酸铜含量的检测方法。

本发明的目的是这样来实现的：

本发明混合制剂中盐酸吗啉胍含量和乙酸铜含量的检测方法包括以下步骤：

1）采用反相高效液相色谱法，其色谱条件如下：

色谱柱：C₁₈，5μm，150×4.6mm(I.D)；

流动相组成：按体积比（V／V）甲醇:缓冲溶液=70～50:30～50，并以冰乙酸调节pH=3～5；

缓冲溶液组成：按体积比（V/V）乙酸钠-乙酸:阴离子对试剂=1～3:～31；

流速：1.0ml/min；

柱温：30℃；

检测波长：237nm；

进样体积：20.0μl；

2）分别配制盐酸吗啉胍和乙酸铜标准溶液及样品溶液；

3）用二极管阵列检测器在200～400nm之间进行连续扫描；

4）制作标准曲线，测定峰面积，计算出样品主成分的含量。

上述的方法中按体积比甲醇:缓冲溶液=55:45，按体积比乙酸钠-乙酸:阴离子对试剂=3:1，pH=3.5。

上述的阴离子对试剂为甲烷基磺酸盐（如甲烷基磺酸钠、甲烷基磺酸钾等）、戊烷基磺酸盐（如戊烷基磺酸钠、戊烷基磺酸钾等）、己烷基磺酸盐（如己烷基磺酸钠、己烷基磺酸钾等）、庚烷基磺酸盐（如庚烷基磺酸钠、庚烷基磺酸钾等）、十二烷基磺酸盐（如十二烷基磺酸钠、十二烷基磺酸钾等）、樟脑磺酸盐（如樟脑磺酸钠、樟脑磺酸钾等）、辛烷基硫酸盐（如辛烷基硫酸钠、辛烷基硫酸钾等）、癸烷基硫酸盐（如癸烷基硫酸钠、癸烷基硫酸钾等）、十二烷基硫酸盐（如十二烷基硫酸钠、十二烷基硫酸钾等）中的一种。

上述的方法中将测定主要成分含量的进样样品用水溶解，样品浓度配制成10μg/ml～200μg/ml后，再测定盐酸吗啉胍和乙酸铜的含量。

上述的乙酸钠-乙酸的浓度为0.01mol/L～0.02mol/L，阴离子对试剂的浓度为0.01mol/L～0.02mol/L。

本发明所需的试剂与药品如下：

盐酸吗啉胍对照品（＞99.0%wt%）；

乙酸铜对照品（＞99.0%wt%）

甲醇：HPLC级

乙酸：分析纯

乙酸钠：分析纯

实验中流动相和溶液用水均为纯水。

本发明方法采用C₁₈反相色谱柱，在乙酸钠-乙酸溶液中，保证了缓冲体系中pH值的稳定性，在缓冲体系中加入阴离子对试剂，更有效地提高了盐酸吗啉胍和乙酸铜的分离效果，最后用冰乙酸来调节pH值，有效地减小了峰的拖尾，使峰型更加对称。

本发明方法为确保盐酸吗啉胍·乙酸铜混合制剂产品的质量控制提供了可靠的检测数据，方法简单快速，节约了检测时间和检测成本。

附图说明：

图1为两个待测物质的紫外光谱图。

图2为在未加入阴离子对试剂前样品在甲醇-水流动相中的分离效果图。

图3为70%甲醇和30%缓冲溶液作流动相的分离效果图。

图4为50%甲醇和50%缓冲溶液作流动相的分离效果图；

图5为55%甲醇和45%缓冲溶液作流动相的分离效果图。

图6为pH值=3时的分离效果图。

图7为pH值=4时的分离效果图。

图8为pH值=5时的分离效果图。

图9为pH值=3.5时的分离效果图。

图10为盐酸吗啉胍标准曲线图。

图11为乙酸铜标准曲线图。

图12为盐酸吗啉胍标准液相谱图。

图13为乙酸铜标准液相谱图。

图14为样品液相色谱图。

图15为样品液相另一色谱图。

图16为样品液相再一色谱图。

具体实施方式：

实施例1：

本实施例1混合剂中盐酸吗啉呱含量和乙酸铜含量的检测方法，包括以下步骤：

1，检测波长的选择：

用二极管阵列检测器在200～400nm之间进行连续扫描，即得到紫外吸收光谱图，参看图1。由图1可知，盐酸吗啉胍和乙酸铜在237nm有最大吸收，而甲醇在此区间无吸收波长，综合考虑基线、峰形、信号相应强弱等情况，选择检测波长为237nm。

2，样品浓度的选择：

测定主成分含量时，样品溶液浓度过大会导致主峰超出线性范围使其定量不准。经试验，本发明采用将进样样品用水溶解，样品浓度配制成10μg/ml～200μg/ml后，再测定盐酸吗啉胍和乙酸铜的含量。

3，流动相组成的选择：

1）阴离子对试剂：

混合制剂在甲醇-水流动相体系中，盐酸吗啉胍和乙酸铜得不到很好的分离，两个峰几乎重叠为一个峰，无法分开，结果如图2所示。所以尝试在流动相中加入阴离子对试剂，经过大量试验确定当选用十二烷基磺酸钠为阴离子对试剂，且在乙酸-乙酸钠存在下pH值相对稳定，使得盐酸吗啉胍和乙酸铜能完全分开，便于后面对这两个物质定量。

2）流动相配比

选用缓冲溶液体积比（V/V）乙酸钠-乙酸：阴离子对试剂=3:1，甲醇和缓冲溶液不同体积比组成流动相进行对比筛选试验，结果如图3～图5所示。图3～图5为不同体积比流动相组成的液相色谱图。部分试验结果见表1。

表1流动相对比筛选试验的比较

从上述表1结果可以看出：甲醇：缓冲溶液=55:45（V/V），取得了较好的分离效果，但乙酸铜的峰型有拖尾的现象。

3）pH值：

为进一步改善峰形，对分离条件继续进行优化，在甲醇：缓冲溶液=55:45（V/V）前提下，考察了pH值的范围，结果如图6～图9所示。部分试验结果见表2。图6～图9为55%甲醇和45%缓冲溶液配比下的不同pH值。

表2 pH值对比筛选试验的比较

从上述表2结果可以看出：，在甲醇：缓冲溶液=55:45（V/V）流动相中加入含阴离子对试剂的乙酸-乙酸钠缓冲液，且缓冲溶液体积比（V/V）乙酸钠-乙酸：阴离子对试剂=3：1，并用冰乙酸控制pH值为3.5时，能消除拖尾影响，提高组分的分离度和峰的对称性，获得较理想的分离效果。

从步骤1～3可知，本实施例1采用反相高效液相色谱法，其色谱条件如下：

色谱柱：C₁₈，5μm，150×4.6mm(I.D)；

流动相组成：按体积比（V／V）甲醇:缓冲溶液=55:45，并以冰乙酸调节pH=3.5；

缓冲溶液组成：按体积比（V/V）乙酸钠-乙酸: 十二烷基磺酸钠=3:1；

流速：1.0ml/min；

柱温：30℃；

检测波长：237nm；

进样体积：20.0μl；

4，标准溶液的配制：

分别称取含0.05g(准至0.0002g)盐酸吗啉胍和乙酸铜的标准对照品于两个100ml容量瓶中，用水超声溶解并定容、摇匀。各吸出5.0ml于两个25ml容量瓶中，再用水稀释至刻度，摇匀，配成两个浓度为100μg/ml的标准溶液。以15%盐酸吗啉胍·乙酸铜（质量比1:1，下同）混合制剂为例，称取样品0.12g（准至0.0002g）于100ml容量瓶中，用水稀释、定容、摇匀。

5，标准曲线制作：

准确移取上述所配制的盐酸吗啉胍标准溶液0.5、1.0、2.0、3.0、5.0、7.0、9.0ml于7个25ml容量瓶中，用水定容，分别取20.0μl进样，以峰面积对浓度作图，得盐酸吗啉胍的标准曲线图，具体参看图10。

从图10可知，盐酸吗啉胍标准品浓度与峰面积成线性关系，线性回归方程为：Y=39540X+194400，其中X为盐酸吗啉胍样品浓度，Y为盐酸吗啉胍的峰面积，相关系数r=0.999586。

准确移取上述所配制的乙酸铜标准溶液0.5、1.0、2.0、3.0、5.0、7.0、9.0ml于7个25ml容量瓶中，用水定容分别取20.0μl进样，以峰面积对浓度作图，得盐酸吗啉胍的标准曲线图，具体参看图6。

从图11可知，乙酸铜标准品浓度与峰面积成线性关系，线性回归方程为：Y=6778X+40730，其中X为乙酸铜样品浓度，Y为乙酸铜的峰面积，相关系数r=0.999871。

6，盐酸吗啉胍·乙酸铜样品含量的测定：

取上述方法配制的盐酸吗啉胍标准溶液、乙酸铜标准溶液和样品溶液在最佳试验条件，即甲醇：缓冲溶液=55:45（V/V）,并以冰乙酸调节pH=3.5下进行高效液相色谱分析，进样量为20.0μl，结果分别见图12、图13和图14。经计算，盐酸吗啉胍的含量为7.72%，乙酸铜的含量为7.63%。图14中1峰为盐酸吗啉胍，2峰为乙酸铜。

盐酸吗啉胍和乙酸铜的计算公式如下：

式中：X—待测组分即盐酸吗啉胍或乙酸铜的质量分数（%）；

m₁—盐酸吗啉胍对照品或乙酸铜对照品的质量（g）；

m₂—试样质量（g）；

p—盐酸吗啉胍对照品或乙酸铜对照品的质量分数（%）；

A₁—盐酸吗啉胍对照品或乙酸铜对照品的峰面积；

A₂—待测组分即盐酸吗啉胍或乙酸铜的峰面积；

n—稀释倍数。

实施例2：

本实施例2混合制剂中盐酸吗啉呱含量和乙酸铜含量的检测方法，包括以下步以取：

1，检测波长的选择：同实施例1，

2，样品波度的选择：同实施例1。

3，流动相组成的选择：

1）阴离子对试剂选用甲烷基磺酸钠。

2）流动相配比：

选用缓冲溶液体积比（V/V）乙酸钠-乙酸：阴离子对试剂=2:1，甲醇和缓冲溶液不同体积比组成流动相进行对比筛选试验，部分试验结果见表3。

表3流动相对比筛选试验的比较

流动相组成（V/V）	分离效果
		甲醇：缓冲溶液=40:60（V/V）	两峰相距太远
甲醇：缓冲溶液=50:50（V/V）	两峰相距仍比较远，乙酸铜信号不强
		甲醇：缓冲溶液=70:30（V/V）	分离效果好，但有拖尾现象

从上述表3结果可以看出：甲醇：缓冲溶液=70:30（V/V），取得了较好的分离效果，但乙酸铜的峰型有拖尾的现象。

3）pH值

为进一步改善峰形，对分离条件继续进行优化，在甲醇：缓冲溶液=70:30（V/V）前提下，考察了pH值的范围，部分试验结果见表4。

表4 pH值对比筛选试验的比较

pH值	分离效果
		3	两峰重叠
4	两峰未完全分开
		5	分离效果好，无拖尾现象

从上述表4结果可以看出：在甲醇：缓冲溶液=70:30（V/V）流动相中加入含阴离子对试剂的乙酸-乙酸钠缓冲液，且缓冲溶液体积比（V/V）乙酸钠-乙酸：阴离子对试剂=2:1，并用冰乙酸控制pH值为5时，能消除拖尾影响，提高组分的分离度和峰的对称性，获得较理想的分离效果。

本实施例2采用反相高效液相色谱法，其色谱条件如下：

色谱柱：C₁₈，5μm，150×4.6mm(I.D)；

流动相组成：按体积比（V／V）甲醇:缓冲溶液=70:30，并以冰乙酸调节pH=5；

缓冲溶液组成：按体积比（V/V）乙酸钠-乙酸: 甲烷基磺酸钠=2:1；

流速：1.0ml/min；

柱温：30℃；

检测波长：237nm；

进样体积：20.0μl；

4、标准溶液的配制见实施例1；

5、标准曲线制作见实施例1；

6、盐酸吗啉胍·乙酸铜样品含量的测定步骤见实施例1。

经计算，盐酸吗啉胍的含量为7.74%，乙酸铜的含量为7.60%。分离效果见图15，其中1峰为盐酸吗啉胍，2峰为乙酸铜。

实施例3：

本实施例3混合制剂中盐酸吗啉呱含量的检测方法，包括以下步骤：

1，检测波长的选择：同实施例1。

2，样品浓度的选择：同实施例1。

3，流动相组成的选择：

1）阴离子对试剂选用癸烷基硫酸钠；

2）流动相配比；

选用缓冲溶液体积比（V/V）乙酸钠-乙酸：阴离子对试剂=1:3，甲醇和缓冲溶液不同体积比组成流动相进行对比筛选试验，部分试验结果见表5。

表5流动相对比筛选试验的比较

流动相组成（V/V）	分离效果
		甲醇：缓冲溶液=60:40（V/V）	两峰重叠
甲醇：缓冲溶液=50:50（V/V）	分离效果好，但有拖尾现象
		甲醇：缓冲溶液=40:60（V/V）	两峰相距仍比较远，乙酸铜信号不强

从上述表5结果可以看出：甲醇：缓冲溶液=50:50（V/V），取得了较好的分离效果，但乙酸铜的峰型有拖尾的现象。

3）pH值

为进一步改善峰形，对分离条件继续进行优化，在甲醇：缓冲溶液=50:50（V/V）前提下，考察了pH值的范围，部分试验结果见表6。

表6 pH值对比筛选试验的比较

pH值	分离效果
		5	乙酸铜峰形变形
4	两峰相距太远
		3	分离效果好，无拖尾现象

从上述表4结果可以看出：在甲醇：缓冲溶液=50:50（V/V）流动相中加入含阴离子对试剂的乙酸-乙酸钠缓冲液，且缓冲溶液体积比（V/V）乙酸钠-乙酸：阴离子对试剂=1:3，并控制pH值为3时，能消除拖尾影响，提高组分的分离度和峰的对称性，获得较理想的分离效果。

本实施例3采用反相高效液相色谱法，其色谱条件如下：

色谱柱：C₁₈，5μm，150×4.6mm(I.D)；

流动相组成：按体积比（V／V）甲醇:缓冲溶液=50:50，并以冰乙酸调节pH=3；

缓冲溶液组成：按体积比（V/V）乙酸钠-乙酸: 癸烷基硫酸钠=1:3；

流速：1.0ml/min；

柱温：30℃；

检测波长：237nm；

进样体积：20.0μl；

4、标准溶液的配制见实施例1。

5、标准曲线制作见实施例1。

6、盐酸吗啉胍·乙酸铜样品含量的测定步骤见实施例1。

经计算，盐酸吗啉胍的含量为7.71%，乙酸铜的含量为7.66%。分离效果见图16，其中1峰为盐酸吗啉胍，2峰为乙酸铜。

上述实施例是对本发明的上述内容作进一步的说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于上述实施例。凡基于上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

Claims

1.混合制剂中盐酸吗啉胍含量和乙酸铜含量的检测方法，包括以下步骤：

1）采用反相高效液相色谱法，其色谱条件如下：

色谱柱：C₁₈，5μm，150×4.6mm；

流动相组成：按体积比甲醇:缓冲溶液=70～50:30～50，并以冰乙酸调节pH=3～5；

缓冲溶液组成：按体积比乙酸钠-乙酸:阴离子对试剂＝1～3:1～3；

流速：1.0ml/min；

柱温：30℃；

检测波长：237nm；

进样体积：20.0μl；

2）分别配制盐酸吗啉胍和乙酸铜标准溶液及样品溶液：将测定主要成分含量的进样样品用水溶解，样品浓度配制成10μg/ml～200μg/ml后，再测定盐酸吗啉胍和乙酸铜的含量；

3）用二极管阵列检测器在200～400nm之间进行连续扫描；

4）制作标准曲线，测定峰面积，计算出样品主成分的含量。

2.如权利要求1所述的混合制剂中盐酸吗啉胍含量和乙酸铜含量的检测方法，其特征在于按体积比甲醇:缓冲溶液=55:45，按体积比乙酸钠-乙酸:阴离子对试剂=3:1，pH=3.5。

3.如权利要求1或2所述的混合制剂中盐酸吗啉胍含量和乙酸铜含量的检测方法，其特征在于阴离子对试剂为甲烷基磺酸盐、戊烷基磺酸盐、己烷基磺酸盐、庚烷基磺酸盐、十二烷基磺酸盐、樟脑磺酸盐、辛烷基硫酸盐、癸烷基硫酸盐、十二烷基硫酸盐中的一种；

4.如权利要求1或2所述的混合制剂中盐酸吗啉胍含量和乙酸铜含量的检测方法，其特征在于乙酸钠-乙酸的浓度为0.01mol/L～0.02mol/L，阴离子对试剂的浓度为0.01mol/L～0.02mol/L。