CN103070004B

CN103070004B - 一种盐水灌溉转基因番茄的方法

Info

Publication number: CN103070004B
Application number: CN201310051687.7A
Authority: CN
Inventors: 李银心; 陈显扬; 贺希格; 台方
Original assignee: Institute of Botany of CAS
Current assignee: Institute of Botany of CAS
Priority date: 2013-02-17
Filing date: 2013-02-17
Publication date: 2014-12-03
Anticipated expiration: 2033-02-17
Also published as: CN103070004A

Abstract

本发明公开了一种盐水灌溉转基因番茄的方法。该方法是在以下两种时期中的任一种或两种用番茄正常生长需水量的盐水对所述转基因番茄进行灌溉，在其他生育期用番茄正常生长需水量的淡水对所述转基因番茄进行灌溉：（a）第一穗果实膨大期，第一穗果实直径达2cm至第二穗果实直径达2cm；（b）第二穗果实膨大期，果实直径达2cm至第一个果实采收；所述转基因番茄为向目的番茄中导入耐盐基因后得到的表达所述耐盐基因的番茄；所述盐水为200mM的NaCl水溶液。本发明将遗传转化结合灌溉措施，结果显示在果实膨大一期或二期进行200mM NaCl灌溉，转基因番茄与正常生长番茄相比无显著减产，这在番茄生产中具重要使用价值。

Description

一种盐水灌溉转基因番茄的方法

技术领域

本发明涉及一种盐水灌溉转基因番茄的方法。

背景技术

番茄是世界上重要的农业经济作物，在全世界广泛种植，近年来有不断增长的趋势。对于番茄的盐水灌溉已经被科学家广泛的研究。研究报道，用电导率为1.7，2.3，3.4and5.0dS m^-1（相当于17，24，35和51mM NaCl）的盐水进行灌溉，可以减产0、10、25和50%[Cerda A,Fernandez FG，Caro M.1977.Effect of sodium-chloride inirrigation water on tomato yield and quality.Agrochimica,21:295-304]。Cuartero andFernandez-Munoz[Cuartero J and Fernandez-Munoz R.1999.Tomato and salinity.SciHortic,78:83-125]研究表明，当番茄灌溉大于2.5dS m^-1电导率的盐水时，就会发生明显的减产；若电导率增加到3.0dS m^-1以上，番茄产量将显著减少。而且，研究发现用添加盐分使得电导率（2，4，6和8dS m^-1）不同的营养液并对三个发育时期的番茄进行滴灌，结果显示，盐施加的越晚，番茄耐受盐胁迫能力越强；在换盆16天后施加4dS m^-1的盐水，最终番茄果实产量并没有明显降低[Dalla VF,Barbato R,La RN.et al.2001.Responses to bleaching herbicides by leaf chloroplasts of maize plants grown atdifferent temperatures.J Exp Bot，52:811-820]。在中国北方进行的研究表明，在番茄换盆后30天进行盐水灌溉（1.1–4.9dS m^-1），对番茄最终果实重量毫无影响[Wan SQ,KangYH,Wang D.et al.2007.Effect of drip irrigation with saline water on tomato(lycopersiconesculentum mill)yield and water use in semi-humid area.Agr Water Manage,90:63-74]。尽管如此，至今对番茄盐敏感的发育时期，还没有准确的界定。同时，几乎没有研究对番茄进行电导率高于5dS m^-1（相当于51mM NaCl）盐水灌溉的产量评价。在淡水缺乏的地区，特别是利用海水或者高盐度地下水的地区，提高番茄盐水灌溉的利用率，对番茄生产具有特殊的意义。对番茄品种“丽春”，进行“开花坐果期”、“果实膨大I期”、“果实膨大II期”和“采收期”不同盐浓度的灌溉，结果表明，对于34mM NaCl的盐浓度在全时期内浇灌都不会引起番茄减产；对于85mM NaCl盐浓度在除了开花坐果期浇灌，都不会引起番茄减产；对于171mM NaCl的盐浓度浇灌，只有在采收期浇灌才不会引起番茄减产[Bao HXGDL,Li YX.2010.Effect of stage-specific salineirrigation on greenhouse tomato production.Irrigation Sci，28:421-430]。仅在采收期进行中高盐浓度浇灌，才能使番茄保持不减产，这就成为了番茄生产中盐水灌溉的瓶颈。随着生物技术，特别是转基因技术的发展，通过遗传转化来提高植株的耐盐性成为广泛被接受的方法。研究表明，通过质膜或者液泡膜上Na⁺/H⁺逆向转运蛋白的转化，能显著提高番茄的耐盐性；同时，科学家也将许多转录因子导入番茄，提高番茄的耐盐性；另外，实验也证明，对番茄转化抗氧化酶基因，也可以显著提番茄的耐盐性。成功将BADH基因转化番茄，证明转基因番茄的耐盐性明显提高，可以在1%的NaCl盐浓度下，完成生活周期[Jia GX,Zhu ZQ,Chang FQ.et al.2002.Transformation oftomato with the BADH gene from atriplex improves salt tolerance.Plant Cell Rep,21:141-146]。同时，对BADH后代的分析也表明，在1%和1.5%的盐水灌溉条件下，转基因番茄耐盐性显著高于野生型番茄[Zhou S,Chen X,Zhang X.et al.2008.Improvedsalt tolerance in tobacco plants by co-transformation of a betaine synthesis gene BADH anda vacuolar Na⁺/H⁺antiporter gene SeNHX1.Biotechnol Lett，30:369-376]。

迄今为止，所有的转基因番茄耐盐性，都是呈现在某一发育阶段耐盐性的提高，并没有将番茄耐盐性的提高与最终的果实产量进行联系比较；同时，研究证明转基因番茄耐盐性高于野生型番茄，但与正常条件相比，番茄产量上还是有显著的差异，这也反映出转基因番茄在实际应用中还具有很大的局限性。

发明内容

本发明的目的是提供一种盐水灌溉转基因番茄的方法。

本发明所提供的盐水灌溉转基因番茄的方法，是在以下两种时期中的任一种或两种用番茄正常生长需水量的盐水对所述转基因番茄进行灌溉，在除所述两种时期中的任一种或两种外的生育期用番茄正常生长需水量的淡水对所述转基因番茄进行灌溉：

（a）第一穗果实膨大期；

（b）第二穗果实膨大期；

所述第一穗果实膨大期为第一穗果实直径达2cm至第二穗果实直径达2cm；所述第二穗果实膨大期为第二穗果实直径达2cm至第一个果实采收；

所述转基因番茄为向目的番茄中导入耐盐基因后得到的表达所述耐盐基因的番茄；

所述盐水为200mM的NaCl水溶液。

在上述方法中，所述耐盐基因可为SeNHX1基因或BADH基因。

所述SeNHX1基因为离子区隔化基因，即编码盐角草（Salicornia europaea L.）液泡膜上钠氢逆向转运蛋白（Na⁺/H⁺ exchanger 1）的基因；所述BADH基因为渗透调节物质合成酶基因，即编码榆钱菠菜（Atriplex hortensis）甜菜碱醛脱氢酶（betaine aldehydedehydrogenase）基因。

在本发明中，所述SeNHX1基因编码的蛋白的氨基酸序列具体如序列表中序列1所示；所述BADH基因编码的蛋白的氨基酸序列具体如序列表中序列3所示。

进一步，所述SeNHX1基因的核苷酸序列具体如序列表中序列2所示；所述BADH基因的核苷酸序列具体如序列表中序列4所示。

其中，序列1由560个氨基酸组成；序列2由1683个核苷酸组成，编码序列表中序列1所示的蛋白质；序列3由500个氨基酸组成；序列4由1503个核苷酸组成，编码序列表中序列3所示的蛋白质。

在本发明中，所述目的番茄具体为番茄“百丽春”。

所述盐水灌溉转基因番茄的方法在种植所述转基因番茄中的应用也属于本发明的保护范围。

实验证明，外源SeNHX1基因和BADH基因的导入，将转基因番茄对盐的耐受性从第IV阶段，提高到第III阶段。即只要在第III阶段之后对番茄进行200mM NaCl处理，转基因番茄都可以表现出与对照番茄（利用淡水进行浇灌）相似的果数和果实总重。这说明未来提高番茄耐盐性的工作，应该主要集中在提高番茄在花芽分化期和开花座果期对盐的耐受性上。当遗传转化结合灌溉措施，发现在果实膨大一期或二期进行200mM NaCl灌溉，转基因番茄与正常生长番茄相比无显著减产，该结果在番茄生产中具有重要的使用价值。

附图说明

图1为番茄外植体转化后的分化与再生。其中，（a）为经过4周分化筛选，成功转化的外植体；（b）为生根完毕的番茄组培苗；（c）为培养生根过程中的番茄组培苗。

图2为T0代转SeNHX1基因番茄的分子检测结果。其中，（a）为PCR检测结果，泳道mark为全式金公司提供的Trans2K plus DNA MARKER，从电泳孔往下依次是：5000bp，3000bp，2000bp，1000bp，750bp和500bp；泳道positive为阳性对照（以pEASY-Se作为模板）；（b）为RT-PCR检测结果。

图3为T1代转基因番茄real-time PCR分析SeNHX1基因表达量。图中每组数值为3个重复平均数，标准误差线上不同字母为LSD检验在P≤0.05水平上差异显著。

图4为转基因番茄在不同发育时期盐处理后茎粗的变化。S1-200，表示仅在第I阶段进行200mM的NaCl处理，S2/3/4/5-200也同理。Control表示以淡水灌溉的番茄。图中每组数值为6个重复的平均值。

图5为转基因番茄在不同发育时期盐处理后株高的变化。S1-200，表示仅在第I阶段进行200mM的NaCl处理，S2/3-200也同理。Control表示以淡水灌溉的番茄。图中每组数值为6个重复平均数。

图6为转基因番茄在不同发育时期盐处理后光合速率测定。S1-200，表示仅在第I阶段进行200mM的NaCl处理，S2/3/4/5-200也同理。Control表示以淡水灌溉的番茄。图中每组数值为6个重复平均数。

图7为转基因番茄在不同发育时期盐处理后呼吸速率测定。S1-200，表示仅在第I阶段进行200mM的NaCl处理，S2/3/4/5-200也同理。Control表示以淡水灌溉的番茄。图中每组数值为6个重复平均数。

图8为转基因番茄在不同发育阶段盐处理后光系统II活性测定。S1-200，表示仅在第I阶段进行200mM的NaCl处理，S2/3/4/5-200也同理。Control表示以淡水灌溉的番茄。图中每组数值为6个重复平均数。

图9为转基因番茄在不同发育阶段200mM NaCl处理后最终产量，果数和果重的测定结果。其中，（a）为不同番茄单株果数采集图，标尺=5cm，对照表示进行淡水灌溉的野生型番茄。（b）为最终产量测定结果。（c）为最终平均果数测定结果。（d）为最终平均果重测定结果。图中每组数值为6个重复平均数，虚线以上的值为LSD检验在P≤0.05水平上无显著差异。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

野生型番茄（Lycopersicon esculentum L.）“百丽春”（tomato cultivar Bailichun）：记载在“Zhou S F,Chen X Y，Xue X N.et al.2007.Physiological and growth tomatoprogenies harboring the betaine alhyde dehydrogenase gene to salt stress.J Integr Plant Biol，(2007)49:628-637”一文中，公众可从中国科学院植物研究所获得。

T3代转BADH基因番茄T3-8和T3-9株系：为将渗透调节物质合成酶基因BADH转入野生型番茄“百丽春”后得到的表达所述BADH基因（核苷酸序列如序列表中序列4所示，编码序列表中序列3所示的蛋白）的T3代转基因番茄。记载在“Zhou S F,Chen X Y，Xue X N.et al.2007.Physiological and growth tomato progenies harboring thebetaine alhyde dehydrogenase gene to salt stress.J Integr Plant Biol，(2007)49:628-637”一文中，公众可从中国科学院植物研究所获得。

T4代转BADH基因番茄B4和B9株系：分别为T3代转BADH基因番茄T3-8和T3-9株系的自交后代。

pBI121-Se载体，在pBI121载体的酶切位点Xba I和Sma I之间插入了序列表中序列2（编码序列表中序列1所示的蛋白质）所示的SeNHX1基因编码序列的重组载体。pBI121-Se载体记载在“Zhou S,Chen X,Zhang X.et al.2008.Improved salt tolerancein tobacco plants by co-transformation of a betaine synthesis gene BADH and a vacuolarNa⁺/H⁺ antiporter gene SeNHX1.Biotechnol Lett，30:369-376”一文中，公众可从中国科学院植物研究所获得。

农杆菌LBA4404：记载在“Zhou S,Chen X,Zhang X.et al.2008.Improved salttolerance in tobacco plants by co-transformation of a betaine synthesis gene BADH and avacuolar Na⁺/H⁺ antiporter gene SeNHX1.Biotechnol Lett，30:369-376”一文中，公众可从中国科学院植物研究所获得。

实施例1、转SeNHX1基因番茄的获得

一、转SeNHX1基因番茄的获得及鉴定

1、转SeNHX1基因番茄的获得

（1）重组表达载体转化农杆菌

将pBI121-Se载体用热击的方式转入农杆菌LBA4404中。对转化后的重组农杆菌用引物1和引物2扩增SeNHX1基因。

引物1：5’-ATGTTGTCACAATTGAGCTCTCTAT-3’（序列2的第1-25位）

引物2：5’-CTATGTTCTGTCTAGCAAATTGTCG-3’（序列2的第1659-1683位的反向互补序列）

将经鉴定表明含有SeNHX1基因（序列表中序列2，目的条带大小为1683bp）的重组农杆菌命名为LBA/pBI121-SeNHX1。同时设置转入空载体pBI121的对照（空载体对照），所得重组农杆菌命名为LBA/pBI121。

（2）重组农杆菌转化番茄

a）取无菌培养7天的番茄“百丽春”的子叶作转化外植体。

b）将步骤（1）获得的重组农杆菌LBA/pBI121-SeNHX1或LBA/pBI121的菌液用MS液体培养基稀释至OD=0.8，用于转化。

c）将番茄外植体置于稀释过的农杆菌菌液中，感染8min。

d）取出外植体，置于无菌干燥Whatman滤纸上，吸干残留菌液。

e）将感染过的外植体置于MS₀培养基上，黑暗中共培养48h。

f）将材料转移至SIM培养基中于25±2℃，每天光照12h。每2周换一次培养基。3~4周后，成功转化的外植体就会出现绿色突起和叶状体，如图1中（a）所示，而未转化成功的外植体则无法在含有卡那霉素（Kana）的SIM培养基上生长。

g）待芽长到3~4cm时，将其切下移入SMS₀培养基中诱导生根，如图1中（c）所示，10天左右可看到幼根长出，如图1中（b）所示。

h）待植株根系较发达后，于室温将容器口敞开炼苗3~5天。之后取出植株，洗净琼脂，移栽于温室或大田土壤中，获得T0代转基因番茄苗。

以上所涉及的各种培养基的配方具体如表1所示。

表1重组农杆菌转化番茄过程中所涉及的培养基

2、转SeNHX1基因番茄的鉴定

（1）CTAB法提取植物基因组DNA，具体如下：

A.准备工作：

1)将玻璃瓶，药匙，镊子，研钵，滤纸，枪头，水浴锅准备好。

2)准备CTAB溶液

使用前加入终浓度为4μl/ml的巯基乙醇。

3）将水浴锅调到65度

4）事先准备好要用的氯仿：Tris饱和酚（体积比1︰1），异丙醇。无水乙醇放在－20℃的冰箱里保存。

B.提取方法：

1）称取0.5g新鲜待测的转SeNHX1基因番茄的叶片，置于研钵中，加入液氮迅速研磨成粉末，用小药匙迅速转移至1.5ml Eppendorf管中。

2）加入700μl 2×CTAB/巯基乙醇缓冲液，颠倒混匀。

3）将离心管置于65℃水浴中保温1h，中间不时颠倒混匀。

4）加入700μl氯仿（三氯甲烷）：Tris饱和酚（体积比1︰1），温和颠倒5min.

5）室温，12000g，离心10min。

6）取上清（约700μl）于一新的Eppendorf管中（切勿扰动界面），加入氯仿：异戊醇（体积比24︰1）700μl，轻轻颠倒混匀。

7）室温，12000g，离心10min。

8）取上清500μl，加入500μl于-20℃预冷的无水乙醇，混匀。-20℃放置30min.

9）室温，12000g离心10min。

10）弃上清，用70%乙醇将沉淀小心清洗两遍。

11）铺一块吸水纸于超净台中，将离心管开口向下置于滤纸上，室温下吹干10min左右。

12）溶于适量水或TE溶液中（约50μl）。

（2）转SeNHX1基因番茄的分子检测

A.PCR检测SeNHX1基因

以步骤（1）提取的基因组DNA为模板，以引物1和引物2进行PCR扩增，反应体系为50μl，退火56℃。同时设置以步骤一所得的重组克隆载体pEASY-SeNHX1作为模板的阳性对照。

引物1：5’-ATGTTGTCACAATTGAGCTCTCTAT-3’（序列2的第1-25位）

B.Real-time PCR检测SeNHX1基因

a.RNA提取（Trizol一步法）

1）取100mg待测的转SeNHX1基因番茄的叶片用液氮研碎。

2）加入1ml Trizol提取液混匀。

3）室温放置5min（可加入一步2~8℃离心，将杂质去除）。

4）加入0.2ml新鲜氯仿，剧烈振荡15s，室温放置2~3min。

5）于4℃ 12000g离心15min，弃沉淀，取上清约600μl至新试管中，加0.6ml异丙醇，室温放置20min。

6）于4℃ 12000g离心15min，弃上清，留沉淀。75%乙醇冲洗沉淀两遍，置超净台中吹5min。

7）溶于100μl DEPC处理过的双蒸水中，获得cDNA。

b.定量PCR检测SeNHX1基因的表达

以Actin为内参，定量PCR检测SeNHX1基因的表达，反应体系如表2所示。

表2 定量PCR的反应体系

组分	用量
		正向引物（20μM）	0.5μL
反向引物（20μM）	0.5μL
		cDNA模板	3μL
SYBR Green I	10μL
		ddH₂O	6μL

总体积

20μL

用于扩增SeNHX1基因的正向引物SeNHX1-F和反向引物SeNHX1-R，以及用于扩增内参基因Actin的正向引物Actin-F和反向引物Actin-R，这四条引物的序列如下：

SeNHX1-F：5’-GCCAGCACTGTATCAGATTTGGG-3’（序列2的第1366-1388位）

SeNHX1-R：5’-TCTGTCTAGCAAATTGTCGGTGTTC-3’（序列2的第1653-1677位的反向互补序列）

Actin-F：5’-GGAACACCCTGTTCTCCTGACTG-3’

Actin-R：5’-CAGAGAAAGCACAGCCTGGATAG-3’

反应程序：95℃ 4min；95℃ 10s，56℃ 20s，72℃ 30s，35个循环；72℃ 10min。

PCR反应的过程通过MxPro监测系统进行。结果也是通过MxPro analysissoftware分析，得到Ct值，与相应对照Actin的Ct值相减，得到△Ct，2^-△Ct即为基因相对于内标Actin的含量。

本发明的发明人对步骤1得到的T0代转SeNHX1基因番茄，按照以上方法进行PCR和RT-PCR检测（同时以未经转基因的野生型番茄“百丽春”作为对照，记作WT），得到T0代转SeNHX1基因阳性植株，分别记作S2，S9，S22和S23（图2）。收获转SeNHX1基因番茄S2，S9，S22和S23的种子，并用按照以上PCR方法检测转SeNHX1基因番茄4个株系后代（T1代）的阳性率。结果如表3所示，转SeNHX1基因番茄S2，S9，S22和S23的后代（T1代）阳性率为80%，65%，50%和35%。

表3 T1代转SeNHX1基因番茄的阳性率统计

株系	S2	S9	S22	S23
					T1代检测苗数目	20	20	20	20
T1代阳性苗数目	16	13	10	7
					阳性率	80%	65%	50%	35%

随机从转SeNHX1基因番茄S2，S9，S22和S23的后代（T1代）中各选取4株阳性苗，按照以上方法进行real-time PCR分析，同时以未经转基因的野生型番茄“百丽春”为对照（WT）。结果如图3所示，所选取的阳性苗SeNHX1基因表达量比野生型有明显的上升，其中转SeNHX1基因番茄S2的后代（T1代）X9、X10，转SeNHX1基因番茄S9的后代（T1代）B10和转SeNHX1基因番茄S22的后代（T1代）E8单株都表现50倍以上的上调表达。因此，选取T1代转SeNHX1基因番茄X10，B10和E8进行后续T2代阳性率分析（按照以上PCR方法检测）。结果如表4所示，发现T1代转SeNHX1基因番茄X10，B10和E8后代（T2代）阳性率高达100%，100%和86%。

表4 T2代转SeNHX1基因番茄的阳性率统计

株系	X10	B10	E8
				T2代检测苗数目	20	20	20
T2代阳性苗数目	20	20	17
				阳性率	100%	100%	85%

同样地，随机选取转SeNHX1基因番茄X10和B10的阳性后代（T2代）S2-X10和S9-B10，进行T3代转SeNHX1基因苗阳性率分析。结果如表5所示，S2-X10和S9-B10的后代（T3代）阳性率也为100%，因此，选择S2-X10和S9-B10的后代（T3代）X10和B10继续进行T4代分析。与预计相一致，这两个株系后代（T4代）的阳性率也均为100%（表6）。因此，选择T3代转SeNHX1基因番茄X10和B10的后代（T4代转SeNHX1基因番茄，其中两株记作XX10和BB10）来进行后续试验。

表5 T3代转SeNHX1基因番茄的阳性率统计

株系	S2-X10	S9-B10
			T3代检测苗数目	20	20
T3代阳性苗数目	20	20
			阳性率	100%	100%

表6 T4代转SeNHX1基因番茄的阳性率统计

株系	X10	B10
			T4代检测苗数目	20	20
T4代阳性苗数目	20	20
			阳性率	100%	100%

实施例2、转基因番茄的盐水灌溉

一、水盐调控试验

1、试验材料、试验环境条件

选取野生型番茄“百丽春”（WT）、实施例1获得的T4代转SeNHX1基因番茄XX10和BB10株系、T4代转BADH基因番茄B4和B9株系，进行实验。待幼苗长至两叶一心期，定植到直径20cm，高20cm的大花盆，生长在中国农科院花卉研究所试验温室内。实验时间从7月份持续到10月份，温室日间温度为25-30℃，夜间为18-20℃，相对湿度60%~80％，每天光照16h。基质为草炭土：蛭石=1：1。

2、试验及重复设计

将番茄的生长期划分为花芽分化期（第Ⅰ阶段，转移盆栽4周内）；开花坐果期（第Ⅱ阶段，第一朵花开放至第一穗果实直径达2cm）、第一穗果实膨大期（第Ⅲ阶段，第一穗果实直径达2cm至第二穗果实直径达2cm）、第二穗果实膨大期（第Ⅳ阶段，第二穗果实直径达2cm至第一个果实采收）、采收期（第Ⅴ阶段，第一个果实采收至采收结束）五个阶段。

盐水灌溉：盐水具体为浓度为200mM的NaCl水溶液。分别在番茄的第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ生育阶段用番茄正常生长需水量的盐水进行灌溉，除盐水灌溉外的其他生育期用番茄正常生长需水量的淡水（自来水）进行灌溉。浇灌频率为每5天进行一次。

空白对照（control）：整个生育期用番茄正常生长需水量的淡水（自来水）进行灌溉。浇灌频率为每5天进行一次。

每个处理6盆，随机区组排列，实验设三次重复。除灌溉不同外，其它管理均相同。第一穗果实膨大期每盆番茄根施1g尿素，七天后又叶面喷施0.2g/100ml的磷酸二氢钾。

期间，对如下番茄植株生长及生理指标进行检测：

株高、茎粗：每个时期最后一次灌溉处理后第6天测株高、茎粗。所述株高是从地上部分茎基部到茎顶端生长点的距离；所述茎粗是指番茄茎部最大的直径。

光合速率，呼吸速率和光系统II（Fv/Fm）：用美国LI-Cor公司生产的LI-6400便携式光合仪测量，光强用6400-02B红蓝光源控制在500μmol.m^-2.s^-1水平，每阶段第一次处理后第6天上午9点到11点进行测定，测定部位为从植株顶端向下数第五个叶片。

产量：涉及果实总重量、平均果数和平均果重三个指标，于采收期结束时进行。

3、番茄植株生长及生理指标测定结果及分析

（1）茎粗

结果如图4所示，对于第I至IV阶段的茎粗检测结果来说，在第I至IV任一阶段经盐处理后，转基因株系的茎粗都能表现比野生型（WT）更大。另外，对于转基因株系在第IV和V阶段的茎粗检测结果来说，在第IV或V阶段经盐处理后，其茎粗与利用淡水进行浇灌的转基因番茄（对照，control）相比，无差异。

（2）株高

因为在第III阶段（即果实膨大I期）后番茄进行了去顶，所以对于株高的检测只记录分析了前三个阶段的情况。结果如图5所示，对于第I至III阶段的株高检测结果来说，除了第III阶段外，其余阶段进行盐水浇灌后，转基因番茄都表现出比野生型（WT）更高的株高；但是，无论是在哪一个阶段进行盐水灌溉，转基因番茄株高都不如利用淡水进行浇灌的转基因番茄（对照，control）。

（3）光合速率

光合作用与植物的干物质积累，以及最后的果实重量有最直接的关系。对光合速率的测定结果如图6所示，无论在哪个阶段，对番茄进行200mM的NaCl处理，转基因番茄都比野生番茄（WT）具有更高的光合速率；特别地，在第V阶段进行盐处理，转基因番茄具有和利用淡水进行浇灌的转基因番茄（对照，control）相似的光合速率。另外，在第III阶段进行盐处理，转基因番茄比野生型（WT）表现出更强的恢复能力，如S3-200（第III阶段）转基因番茄光合速率平均为7个单位左右，而到S3-200（第IV阶段）的时候，转基因番茄光合速率为14个单位，几乎提高了一倍；尽管和利用淡水进行浇灌的转基因番茄（对照，control）还有一定的差距，但转基因番茄在第III阶段中，体现出较强的盐害恢复能力。

（4）呼吸速率

与光合速率变化趋势不同，盐胁迫导致呼吸速率显著下降；而且五个阶段呼吸速率对盐的响应是一致的。同时，随着恢复正常灌溉的时间延长，呼吸速率有所提高；但无论是野生型（WT）还是转基因番茄，在盐处理后，无论恢复多久，都无法表现与利用淡水进行浇灌的番茄（对照，control）一致的呼吸速率（图7）。

（5）光系统II（Fv/Fm）活性

结果如图8所示，无论转基因还是野生型番茄（WT），在第IV和第V阶段进行盐胁迫，并不会对光系统II活性造成伤害。然而，对于转基因番茄，在第III阶段进行盐胁迫，也能具有和对照番茄相似的光系统II活性。另外，无论在哪个阶段对转基因番茄进行进行盐胁迫，随着正常灌溉时间的延长，光系统II的活性总会恢复与对照番茄相似；但野生型番茄如果在第I或II阶段进行盐胁迫，其光系统II的活性就无法恢复到正常水平。

（6）产量

如图9所示，本发明的发明人对不同发育阶段的番茄进行盐处理后，测定了转基因和野生型番茄（WT）的最终果实总重。在第V阶段施加200mM NaCl，对番茄果实总重量没有影响，因为无论野生型（WT）还是转基因番茄都表现出与利用淡水进行浇灌的番茄（对照，control）相似的果实总重量。除了第V阶段外，转基因番茄在任何阶段盐水灌溉下都表现出比野生型（WT）更高的果实总重量。特别地，转基因番茄在第III或第IV阶段进行盐处理，其最终的果实总重量与利用淡水进行浇灌的转基因番茄（对照，control）相比，没有显著性降低。

特别地，本发明的发明人采集了转基因番茄和野生型番茄（WT），在不同的发育阶段盐处理后，最终收获表型图，具体如图9中（a）所示。从结果可以看出，在第III或IV这两个阶段进行盐水灌溉，转基因番茄的单株果实数量比野生型（WT）明显增多，同时与利用淡水进行浇灌的转基因番茄（见图9（c））（对照，control）果实数量相似。这也表明转基因番茄在发育的第III或IV阶段进行盐水灌溉，不会显著降低产量，有生产应用的价值。在第I或II阶段进行盐胁迫，尽管转基因番茄表现比野生型（WT）具有更多的单株果数，但与利用淡水进行浇灌的转基因番茄（对照，control）单株果数还是有明显的差别。

单独比较不同发育阶段进行盐水灌溉措施，转基因技术结合灌溉的方法表现出更高的盐水灌溉效率。如图9中（b）所示，单独比较遗传转化的策略，发现若是对转基因番茄不分阶段进行灌溉，比如在第I或II阶段进行盐水灌溉，转基因番茄也表现出显著的减产，并没有实用价值。而仅使用灌溉措施的野生型番茄（WT），发现除了在采收期进行200mM NaCl灌溉外，其余时期的处理都会显著地降低番茄产量。然而，当遗传转化结合灌溉措施，发现在果实膨大一期（第III阶段）或二期（第IV阶段）进行200mM NaCl灌溉，转基因番茄与利用淡水进行浇灌的转基因番茄（对照，control）相比无显著减产，该结果在番茄生产中具有重要的使用价值。

另外，本发明的发明人还考察了不同阶段盐胁迫，对番茄的果实数目和平均果重的影响。果实数目检测结果如图9中（c）所示，与果实产量相似地，在第V阶段进行盐处理，无论野生型（WT）还是转基因番茄都表现出与利用淡水进行浇灌的番茄（对照，control）相似的果实数量。同时，在第III阶段之后进行盐胁迫，不会减少转基因番茄的果实数量。在第I或II阶段进行盐胁迫，尽管转基因番茄比野生型（WT）具有更多的单株果数，但是与利用淡水进行浇灌的转基因番茄（对照，control）相比，还是有显著的降低。平均果重检测结果如图9中（d）所示，在第III阶段之后进行盐胁迫，与利用淡水进行浇灌的番茄（对照，control）相比较，无论是野生型还是转基因番茄，都不会减少平均果实鲜重。尽管在第I或II阶段，转基因番茄比野生型（WT）在盐胁迫下具有更高的平均果实鲜重，但是与利用淡水进行浇灌的转基因番茄（对照，control）相比，还是有显著的差别。

综合本实施例的结果，可以看出，在果实膨大一期（第III阶段）或/和二期（第IV阶段）对转基因番茄进行200mM NaCl灌溉，具有实际生产意义，不仅可以节约淡水资源，同时也保证了果实的产量，该技术方法可以在生产实践中推广应用。

Claims

1.一种盐水灌溉转基因番茄的方法，是在以下两种时期中的任一种或两种用番茄正常生长需水量的盐水对所述转基因番茄进行灌溉，在除所述两种时期中的任一种或两种外的生育期用番茄正常生长需水量的淡水对所述转基因番茄进行灌溉：

（a）第一穗果实膨大期；

（b）第二穗果实膨大期；

所述盐水为200mM的NaCl水溶液；

所述耐盐基因为SeNHX1基因，或BADH基因；所述SeNHX1基因编码的蛋白的氨基酸序列如序列表中序列1所示；所述BADH基因编码的蛋白的氨基酸序列如序列表中序列3所示；所述SeNHX1基因的编码序列如序列表中序列2所示；所述BADH基因的编码序列如序列表中序列4所示；所述目的番茄为番茄百丽春。

2.权利要求1所述的方法在种植转基因番茄中的应用；所述转基因番茄为向目的番茄中导入耐盐基因后得到的表达所述耐盐基因的番茄；所述耐盐基因为SeNHX1基因，或BADH基因；所述SeNHX1基因编码的蛋白的氨基酸序列如序列表中序列1所示；所述BADH基因编码的蛋白的氨基酸序列如序列表中序列3所示；所述SeNHX1基因的编码序列如序列表中序列2所示；所述BADH基因的编码序列如序列表中序列4所示；所述目的番茄为番茄百丽春。