CN103045738B

CN103045738B - 荧光定量pcr检测豇豆i型和ii型耐旱性的方法以及诊断性基因和引物

Info

Publication number: CN103045738B
Application number: CN201210559678.4A
Authority: CN
Inventors: 徐沛; 李国景; 吴晓花; 汪宝根; 鲁忠富; 罗洁; 王莎; 刘永华
Original assignee: Zhejiang Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Zhejiang Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2012-12-20
Filing date: 2012-12-20
Publication date: 2014-04-02
Anticipated expiration: 2032-12-20
Also published as: CN103045738A

Abstract

本发明涉及荧光定量PCR检测豇豆I型和II型耐旱性的方法以及诊断性基因和引物。荧光定量PCR检测豇豆I型和II型耐旱性的方法，该方法被检测的诊断基因的序列如SEQIDNO:1所示；所述的荧光定量PCR引物具有以下的序列：上游引物：5'-TGGATTGTGGTGGACATAC-3'；下游引物：5'-GGTTCCTTCTGAGCATTGA-3'。本发明的优点：所鉴定的在豇豆I型和II型耐旱性材料中呈显著差异表达的基因为特异区分豇豆品种不同类型的耐旱性提供了的诊断性基因工具，另外针对I型和II型耐旱性诊断性基因的引物序列为利用实时荧光定量PCR快捷、简便的检测不同育种亲本材料的耐旱类型提供了直接技术支持。

Description

荧光定量PCR检测豇豆I型和II型耐旱性的方法以及诊断性基因和引物

技术领域

本发明涉及植物生物技术领域，尤其涉及荧光定量PCR检测豇豆I型和II型耐旱性的方法以及诊断性基因和引物。

背景技术

豇豆（Vigna unguiculata L. Walp）起源于非洲干旱地区，是世界范围内重要的粮食豆类和亚洲国家重要蔬菜作物之一。据2006年统计年鉴，我国豇豆年产量达800万吨以上，而由于干旱造成的产量损失估计达20%左右。豇豆的耐旱性在不同基因型之间存在显著差异。前人研究表明豇豆自然资源中存在着两种不同类型的耐旱反应，即I型和II型耐旱响应（Watanabe et al., 1997; Muchero et al., 2008; Agbicodo et al., 2009）。在I型耐旱响应中，植物在水分胁迫下各组织迅速关闭气孔、停止生长并保持各组织水分含量大致相当，并在复水后才恢复生长；与此相反，II型耐旱品种的老叶快速干枯死亡，并且将其中水分运送至新叶并保持新叶气孔开张和继续生长，直到土壤水分继续下降至相当低的临界值（图1）。由于这两类耐旱机制的显著不同，在豇豆耐旱育种中需要事先明确将要利用的育种亲本材料的耐旱类型，然后有针对性的设计育种方案和制定育种计划。

基因表达的调节对生物性状的形成和变化具有至关重要的作用。在干旱胁迫下，大批植物基因如转录因子、脱水素蛋白、水通道蛋白、ABA合成相关因子基因等都会发生表达水平的上调或下调。模式植物中的大量研究表明，有些基因在干旱胁迫的表达调控模式在不同耐旱类型材料中特异地表现出差异，从而可以作为区分各种耐旱类型的诊断性基因。目前，豇豆中尚未报道或开发过可用于特异检测I型和II型耐旱性的诊断性基因及其引物。

检测基因表达的常用方法传统的有Northern杂交法，较新的有实时荧光定量PCR法、表达谱芯片法等。表达谱芯片是一种高通量检测方法，一次可对上万条基因的表达水平进行检测，适于从大量基因中筛选出与植物生长发育、环境胁迫、抗病虫害等相关的目标基因。实时荧光定量PCR通常一次检测一个基因，但简便、经济，一般实验室均可操作。

发明内容

为了解决上述的技术问题，本发明的第一个目的是提供一种荧光定量PCR检测豇豆I型和II型耐旱性的方法，通过简单的荧光定量PCR即可区分豇豆品种的不同耐旱类型，分析过程在1-2日内即可完成，大大提高了效率，有利于有针对性的利用不同耐旱类型的育种亲本，促进豇豆耐旱育种。本发明的第二个目的是一种特异区分豇豆I型和II型耐旱性的诊断性基因。本发明的第三个目的是一种特异区分豇豆I型和II型耐旱性的诊断性基因的荧光定量PCR引物。

为了实现上述的第一个目的，本发明采用了以下的技术方案：

荧光定量PCR检测豇豆I型和II型耐旱性的方法，该方法被检测的诊断基因的序列如SEQ ID NO:1所示；所述的荧光定量PCR引物具有以下的序列：

上游引物：5'-TGGATTGTGGTGGACATAC-3'；

下游引物：5'-GGTTCCTTCTGAGCATTGA-3'。

作为优选，该方法包括以下的步骤：

1）材料准备：挑选饱满的1份I型耐旱豇豆品种和1份II型耐旱豇豆品种种子播于营养钵，基质为蛭石：营养土=3：1；待子叶平展时浇透水后停止灌水，于处理后14天用常规Trizol法提取正常生长和受胁迫条件下的叶部RNA；或者拔出植株根部，迅速用水洗净后用常规Trizol法提取正常生长和受胁迫条件下的根部RNA；

2）RAN提取和反转录：取叶片或根组织组织0.1g加液氮研磨成粉末，参照试剂盒说明书提取总RNA；将提取的RNA用DEPC处理过的水稀释至0.1 g/L，在8μL DEPC处理过的水中依次加入2μL 锚定引物AP、RNA 2μL；将上述混合物置于70℃温浴5 min后置于冰上；在RNA-AP混合物中依次加入5×第一链缓冲液4μL、0.25mmol/L dNTP 2.5μL、0.1 mol/L DTT 2.5μL、200 u/μL 的SUPERSCRIPTⅡ反转录酶0.4μL；25℃ 5 min，42℃ 15 min，70℃ 10 min，4℃保持；反转录产物于-20℃保存；cDNA稀释10倍备用；

所述的第一链缓冲液包括：250 mmol/L Tris-HCl、pH8.3、375 mmol/L KCl、15 mmol/L MgCl₂；

3）荧光实时定量PCR反应：采用八连PCR管为单位进行荧光实时定量PCR；PCR体系包括：10μL2×Mix，5.4μL ddH₂O，2μL 50×ROX，0.6μL 引物和2μL cDNA，为20μL体系； PCR程序为：①酶激活95℃ 15min，扩增循环②95℃ 15s，③55℃ 30s，④72℃ 32s，②-④共40个循环；溶解曲线分析为：95℃ 15s，60℃ 1min；每组PCR均做3次重复，取平均值进行计算；内参基因的序列如SEQ ID NO:4所示；数据分析采用2^-ΔΔC _T法；结果表明利用荧光实时定量PCR反应获得了与芯片表达谱相一致的SEQ ID NO:1基因差异表达模式，从而能够将I型和II型耐旱性材料明确区分出来。

为了实现上述的第二个目的，本发明采用了以下的技术方案：

特异区分豇豆I型和II型耐旱性的诊断性基因，该基因的序列如SEQ ID NO:1所示。

为了实现上述的第三个目的，本发明采用了以下的技术方案：

用于诊断上述的特异区分豇豆I型和II型耐旱性的诊断性基因的荧光定量PCR引物，其特征在于该引物具有以下的序列：

上游引物：5'-TGGATTGTGGTGGACATAC-3'；

下游引物：5'-GGTTCCTTCTGAGCATTGA-3'。

本发明由于采用了上述的技术方案，通过简单的荧光定量PCR即可区分豇豆品种的不同耐旱类型，分析过程在1-2日内即可完成，大大提高了效率，有利于有针对性的利用不同耐旱类型的育种亲本，促进豇豆耐旱育种。

本发明的有益效果是：

1. 本发明所鉴定的在豇豆I型和II型耐旱性材料中呈显著差异表达的基因为特异区分豇豆品种不同类型的耐旱性提供了的诊断性基因工具。

2. 本发明获得的针对I型和II型耐旱性诊断性基因的引物序列为利用实时荧光定量PCR快捷、简便的检测不同育种亲本材料的耐旱类型提供了直接技术支持。

附图说明

图1为豇豆I型和II型耐旱性的特征。左图为I型耐旱材料，植株所有三出复叶均微黄且萎蔫程度相当；右图为II型耐旱材料，植株表现为最下方的三出复叶完全枯死，上部叶片组织则持绿良好。

图2为利用基因芯片比较和鉴定I型和II型耐旱豇豆叶片在正常生长和干旱胁迫下基因表达谱聚类图。1xp，2xp，3xp：I型耐旱豇豆品种“花豆角”在正常生长条件下的叶片；7xp，8xp，9xp：“花豆角”在干旱胁迫条件下的叶片；13xp，14xp，15xp：II型耐旱豇豆品种“饭豆”在正常生长条件下的叶片；19xp，20xp，21xp：“饭豆”在干旱胁迫条件下的叶片。每个编号代表一个生物学重复。

图3为荧光实时定量PCR在2个不同豇豆品种“花豆角”和“饭豆”中扩增诊断性基因CETS1的结果及与基因芯片的比较。

具体实施方式

实施例1

特异区分豇豆I型和II型耐旱性的诊断性基因的筛选和引物的设计方法，该方法包括以下的步骤：

（1）豇豆无冗余基因序列的下载和预处理：从HarvEST豇豆DNA数据库UP12 (http://www.harvest-web.org/hweb/bin/wc.dll?hwebProcess~hmain~&versid=68)批量下载豇豆unigene序列，共29,728条。运行VecScreen程序（ http://www.ncbi.nlm.nih.gov/VecScreen/VecScreen.html ），扫描并去除下载序列上包含的载体和接头序列。

（2）豇豆基因芯片设计：对UP12数据库中全部29,728条unigene序列进行扫描后，针对每条序列在其不同碱基位置分别设计4条寡核苷酸DNA序列作为探针，这4条序列在芯片杂交中信号值的加权平均值将定义一个基因的信号值。设计时技术标准为：转录组GC含量在35-60%之间，探针设计倾向于ORF开放阅读框3’末端，探针长度为60-mer。除去189条序列没有设计出合适的探针，有62组成对序列和3组3对序列由于同源性太高，设计的探针相同，最终设计出探针总数为117,746条，代表了29728-189-62x1-3x2=29,471条unigene。

（3）芯片杂交和差异表达谱分析：将步骤（2）设计的所有探针序列交由Nimblegen公司点制成12 X 135k规格的表达谱芯片。将点制好的芯片交由北京博奥生物有限公司分别对正常灌溉和干旱处理条件下生长的1个I型耐旱豇豆品种“花豆角”和1个II型耐旱豇豆品种"饭豆"的叶片cDNA进行杂交分析。杂交方法按常规表达谱芯片的标准程序进行。杂交完毕后用Roche-NimbleGen MS200 扫描仪扫描芯片。通过 LuxScan 4.0 图像分析软件分析把图像信号转化为数字信号。根据cy5和cy3总体信号的全局平均值对各芯片进行片间线性校正，使得各张芯片的全局平均值相同。采用RMA 方法（Irizarry et al., 2003）进行归一化。用SAM软件进行统计显著性测验并结合文献分析，挑选出11个在两类耐旱性材料中的表达调控模式呈显著差异的候选基因（表1）。

表1 芯片表达谱分析获得的11个候选差异表达基因

UP12数据库基因代号	基因功能注释
		UP12_7902	Non-specific lipid-transfer protein
UP12_7163	CETS1
		UP12_14620	Fructose-bisphosphate aldolase
UP12_15394	Putative uncharacterized protein
		UP12_17989	Arabidopsis thaliana gl1 homolog
UP12_22675	Seed maturation protein PM39
		UP12_312	Glycine max ethylene-responsive transcription factor ERF017
UP12_4697	Vicilin protein
		UP12_6246	Gibberellin-regulated protein 1 precursor
UP12_7188	RING-H2 finger protein ATL5H precursor
		UP12_20518	Chromosome chr5 scaffold_2

（4）诊断性基因的确定和荧光实时定量PCR引物设计：根据11个候选差异基因在I型和II型耐旱材料中被干旱所诱导程度的差异程度，选择差异程度最大的UP12_6246作为用于区分I型和II型耐旱材料的诊断性基因，并根据其功能注释重命名为VuCETS1。VuCETS1基因在I型耐旱品种的叶片中受干旱上调的幅度是II型耐旱品种100倍以上（图3）。用Primer Premier 6软件设计针对VuCETS1基因的荧光实时定量PCR引物，设计条件为:Tm为55±5℃，目标扩增条带长度为100-200bp，引物长度为20-25bp，GC％为40-60％。VuCETS1基因的序列来自UP12数据库。设计的引物序列为：VuCETS1F引物 5'-TGGATTGTGGTGGACATAC-3'和VuCETS1R引物5'-GGTTCCTTCTGAGCATTGA-3'。

实施例2

利用荧光实时定量PCR分析叶片组织中诊断性基因VuCETS1的差异表达信息鉴别I型和II型耐旱性材料。

（1）材料准备：挑选饱满的1份I型耐旱豇豆品种和1份II型耐旱豇豆品种种子播于营养钵，基质为蛭石：营养土=3：1。待子叶平展时浇透水后停止灌水，于处理后14天用常规Trizol法提取正常生长和受胁迫条件下的叶部RNA。

（2）RAN提取和反转录：取叶片组织0.1g加液氮研磨成粉末，参照试剂盒说明书提取总RNA。将提取的RNA用DEPC处理过的水稀释至0.1 g/L，在8μL DEPC处理过的水中依次加入2μL 锚定引物（AP）、RNA 2μL；将上述混合物置于70℃温浴5 min后置于冰上；在RNA-AP混合物中依次加入5×第一链缓冲液（250 mmol/L Tris-HCl、pH8.3、375 mmol/L KCl、15 mmol/L MgCl₂）4μL、0.25mmol/L dNTP 2.5μL、0.1 mol/L DTT 2.5μL、200 u/μL 的SUPERSCRIPTⅡ反转录酶0.4μL；25℃ 5 min，42℃ 15 min，70℃ 10 min，4℃保持。反转录产物于-20℃保存。cDNA稀释10倍备用。

（3）荧光实时定量PCR反应：采用八连PCR管为单位进行荧光实时定量PCR。PCR体系包括：10μL2×Mix，5.4μL ddH₂O，2μL 50×ROX，0.6μL 引物和2μL cDNA，为20μL体系。PCR程序为①酶激活95℃ 15min，扩增循环②95℃ 15s，③55℃ 30s，④72℃ 32s，②-④共40个循环；溶解曲线分析为：95℃ 15s，60℃ 1min。每组PCR均做3次重复，取平均值进行计算。用UBC9基因作为内参基因，内参基因的序列如SEQ ID NO:4所示。数据分析采用2^-ΔΔC _T法。结果表明利用荧光实时定量PCR反应获得了与芯片表达谱相一致的VuCETS1基因差异表达模式（图3），从而能够将I型和II型耐旱性材料明确区分出来。

实施例3

利用荧光实时定量PCR分析根组织中诊断性基因VuCETS1的差异表达信息鉴别I型和II型耐旱性材料。

（1）材料准备：挑选饱满的1份I型耐旱豇豆品种和1份II型耐旱豇豆品种种子播于营养钵，基质为蛭石：营养土=3：1。待子叶平展时浇透水后停止灌水，处理后14天小心拔出植株根部，迅速用水洗净后用常规Trizol法提取正常生长和受胁迫条件下的根部RNA。

（2）RAN提取和反转录：取根组织0.1g加液氮研磨成粉末，参照试剂盒说明书提取总RNA。将提取的RNA用DEPC处理过的水稀释至0.1 g/L，在8μL DEPC处理过的水中依次加入2μL 锚定引物（AP）、RNA 2μL；将上述混合物置于70℃温浴5 min后置于冰上；在RNA-AP混合物中依次加入5×第一链缓冲液（250 mmol/L Tris-HCl、pH8.3、375 mmol/L KCl、15 mmol/L MgCl₂）4μL、0.25mmol/L dNTP 2.5μL、0.1 mol/L DTT 2.5μL、200 u/μL 的SUPERSCRIPTⅡ反转录酶0.4μL；25℃ 5 min，42℃ 15 min，70℃ 10 min，4℃保持。反转录产物于-20℃保存。cDNA稀释10倍备用。

（3）荧光实时定量PCR反应：采用八连PCR管为单位进行荧光实时定量PCR。PCR体系包括：10μL2×Mix，5.4μL ddH₂O，2μL 50×ROX，0.6μL 引物和2μL cDNA，为20μL体系。PCR程序为①酶激活95℃ 15min，扩增循环②95℃ 15s，③55℃ 30s，④72℃ 32s，②-④共40个循环；溶解曲线分析为：95℃ 15s，60℃ 1min。每组PCR均做3次重复，取平均值进行计算。用UBC9基因作为内参基因，内参基因的序列如SEQ ID NO:4所示。数据分析采用2^-ΔΔC _T法。结果表明利用荧光实时定量PCR反应获得了比芯片表达谱更好的VuCETS1基因差异表达模式，即能够更清楚的揭示2材料间VuCETS1基因的上调倍数差异（图3），从而清晰地将I型和II型耐旱性材料明确区分出来。

序列表

<110>浙江省农业科学院

<120>荧光定量PCR检测豇豆I型和II型耐旱性的方法以及诊断性基因和引物

<160>4

<210>1

<211>1032

<212>DNA

<213>豇豆

<400>1

1 AGTTGTTGAT TCTCTTCATT CCTTGGGAAT TGCAGTAGAA CAGATACACG GTGAAGCTGG 61 AAAAGGTCAA TTTGAGGTGG TTTTGAAGTA TACCATTTGC ACCAAAGCAG CAGACAACTT 121 AATTTTCACC CGTGAAGTTG TTAGGGCAAT TGCAAGAAAG CATGGCTTGC TAGCAACTTT 181 TATTCCAAAG TACGCATTAG ATGATTTGGG TTCTGGGTCG CATGTTCATC TTAGCTTGTG 241 GAGGAATGGC CAAAATGTAT TTATGGGATC TGGTACATCA TCTAAGAATG GAATATCAAC 301 TTTGGGAAGA GAATTTATGG CAGGAATTCT ACAACATCTT CCTTCAATCT TGGCATTTAT 361 AGCACCACTC CCTAACAGTT ATGATCGATT GCAACCTAAT ACATGGAGTG GTGCGTACCT 421 CTTCTGGGGA AACGAAAATA AGGAGGCTCC ATTGCGAGCT TCATCTCCAC CTGGAACTCT 481 CGACGGTCTA GTCACCAACT TTGAGATGAA ATCATTTGAT GGTTCTGCCA ATCCATACTT 541 GGGCTTAGCT GCCATACTTG CTGCTGGCAT TGATGGCCTT CGAAGGCATC TTCCTCTTCC 601 TGAGCCTGTT GATACAAATC CAAATCCGGA AACCCTTCAG AGATTGCCAG CATCCCTTTC 661 TGAATCTTTG GATGCTCTCC ATAAAGACGA CTTCCTTAAG GAATTTATCA GCGAGAAGTT 721 GCTAACTGCC ATAAAAGCAA TTCGAAAGGC TGAAATTGAG CATTACACCA AGCACAAGGA 781 TGCATACAAG GAACTCATTC ACCGTTACTG AGTACTCTTT AGCTTATGGT TCAGAGACGG 841 TTATTGCCGT ATCTGTTTTA GAGTCTGTCT TTAACTATTA TATGTATCTT ATACTATCTA 901 TTGTATGTAC CTTGTATTCT CCTAGTAAGA TGTATGAACT AATTTATCCT CAGACTGTTG 961 TTCAACTTCA TCTTCAATGT ACTAATTTGT CCAATGCCCT TGACATAAAT TCATTTTAAA

1021 AAAAAAAAAA AA

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

TGGATTGTGG TGGACATAC 19

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

GGTTCCTTCT GAGCATTGA 19

<210> 4

<211> 945

<212> DNA

<213> 豇豆

<400> 4

1 ATTGGCGTGT GAGAGAGAGA AGGGTTTCAG AGAGAGAGAG AGAGAGGGTT TGGGATTGGG 61 AAGGCGAGGG ATTGACGCTG CGTCTCTTCC TCTTCCATTT TGATCTGTCC CTCATTCCTG 121 ATCATCCAAC CACCTCAGCC TCACACCAAC ACCATATCTG AACGTGTATC GTCCCACCCA

181 TGGCTTCCAA GCGCATCCTC AAGGAGCTCA AGGACTTGCA GAAAGACCCA CCAACTTCTT 241 GCAGCGCTGG TCCAGTAGCT GAGGACATGT TCCATTGGCA AGCAACAATT ATGGGTCCTG 301 CGGATAGTCC TTATGCTGGA GGTGTATTCC TAGTCACTAT CCATTTTCCT CCGGATTATC 361 CTTTCAAGCC CCCTAAGGTT GCATTTAGGA CCAAGGTCTT TCACCCGAAC ATCAATAGTA 421 ATGGTAGCAT TTGTCTTGAT ATCCTGAAAG AGCAGTGGAG TCCCGCACTC ACTATCTCCA 481 AGGTACTGCT TTCTATATGC TCATTGCTGA CTGATCCAAA TCCTGATGAC CCACTTGTTC 541 CGGAAATTGC TCATATGTAC AAAACTGACC GGGCCAAGTA TGAGGCCACT GCTCGCAGCT 601 GGACCCAGAA GTATGCCATG GGCTGATTTG TGTTTAGATA TTGTATATTG AAGAATGGCT 661 GGCATCTATC AATACTTTTG TGGGTTTGCT TTTCTCTTCC TGTTTTCCGG GGTGAGATTA 721 TGTTTCTGTT ATGAGGGATA GGGAAGGGCG GTGTCTTAAT TTGATAAAAA AAAATAACTA 781 TGATGTTTTA TCATGATGCA AACGCATGAA CAGGATGTTA TTTGTGTCAT GGTTGTGTTG 841 TAACTTTCTC TATCCAGTAA TGTAGAAATA GTGATATGTG GCACAAAAAA AAAAAAAAAA

901 AAAAACCGTT TTCAACTAAA CATGTTTTGA AAAAAAAAAA AAAAA

Claims

1.荧光定量PCR检测豇豆I型和II型耐旱性的方法，其特征在于该方法被检测的诊断基因的序列如SEQ ID NO:1所示；荧光定量PCR引物的序列如下：

上游引物：5'-TGGATTGTGGTGGACATAC-3'；

下游引物：5'-GGTTCCTTCTGAGCATTGA-3'。

2.根据权利要求1所述的荧光定量PCR检测豇豆I型和II型耐旱性的方法，其特征在于该方法包括以下的步骤：

2）RNA提取和反转录：取叶片或根组织组织0.1g加液氮研磨成粉末，参照试剂盒说明书提取总RNA；将提取的RNA用DEPC处理过的水稀释至0.1 g/L，在8μL DEPC处理过的水中依次加入2μL 锚定引物AP、RNA 2μL；将上述混合物置于70℃温浴5 min后置于冰上；在RNA-AP混合物中依次加入5×第一链缓冲液4μL、0.25mmol/L dNTP 2.5μL、0.1 mol/L DTT 2.5μL、200 u/μL 的SUPERSCRIPTⅡ反转录酶0.4μL；25℃ 5 min，42℃ 15 min，70℃ 10 min，4℃保持；反转录产物于-20℃保存；cDNA稀释10倍备用；

3）荧光实时定量PCR反应：采用八连PCR管为单位进行荧光实时定量PCR；PCR体系包括：10μL2×Mix，5.4μL ddH₂O，2μL 50×ROX，0.6μL 引物和2μL cDNA，为20μL体系； PCR程序为：①酶激活95℃ 15min，扩增循环②95℃ 15s，③55℃ 30s，④72℃ 32s，②-④共40个循环；

溶解曲线分析为：95℃ 15s，60℃ 1min；

每组PCR均做3次重复，取平均值进行计算；内参基因的序列如SEQ ID NO:4所示；数据分析采用2-ΔΔCT法；结果表明利用荧光实时定量PCR反应获得了与芯片表达谱相一致的SEQ ID NO:1基因差异表达模式，从而能够将I型和II型耐旱性材料明确区分出来。

3.特异区分豇豆I型和II型耐旱性的诊断性基因，其特征在于该基因的序列如SEQ ID NO:1所示。

4.用于诊断权利要求3所述的特异区分豇豆I型和II型耐旱性的诊断性基因的荧光定量PCR引物，其特征在于该引物的序列如下：

上游引物：5'-TGGATTGTGGTGGACATAC-3'；

下游引物：5'-GGTTCCTTCTGAGCATTGA-3'。