CN103031336A - 牛质粒型腺病毒载体pAd-ZBED6及其构建方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明牛质粒型腺病毒载体pAd-ZBED6及其构建方法和用途，属于基因工程技术领域。牛质粒型腺病毒载体pAd-ZBED6的构建方法包括：(1)将秦川牛ZBED6基因插入pAdTrack-CMV腺病毒穿梭质粒的CMV启动子之下，构建重组穿梭质粒pAdTrack-CMV-ZBED6；(2)Pme I线性化后转化含有pAdEasy-l质粒的E.coli BJ5183感受态细胞，利用E.coli BJ5183内Cre重组酶高效的同源重组系统，在细菌中完成pAdTrack-CMV-ZBED6和pAdEasy-1的同源重组，将正确的重组腺病毒质粒命名为pAd-ZBED6；(3)pAd-ZBED6经Pac I酶切线性化后，脂质体转染293A细胞和秦川牛原代肌肉细胞，产生并获得重组病毒颗粒。本发明可应用于秦川牛ZBED6基因功能研究、鉴定和对种子细胞进行改造，调控肌肉生长发育相关基因的代谢。

Description

牛质粒型腺病毒载体pAd-ZBED6及其构建方法和用途

技术领域

本发明涉及一种含有ZBED6基因的质粒型腺病毒载体，该质粒型腺病毒载体腺病毒载体的构建以及在改造种子细胞和牛ZBED6功能鉴定的应用。

背景技术

AdEasyTM系统是由T.C.He等(1998)构建的用来代替传统腺病毒重组系统的一个快捷系统。在这个系统中，只需二步即可产生重组腺病毒：先将表达盒装入转移载体，然后再通过同源重组插入腺病毒基因组。将外源基因插入腺病毒的最有效途径是通过同源重组，原因是：1)腺病毒DNA是大型的线性分子，含有几乎所有的内切酶切位点；2)基因组过大(36kb)，难于操作。

在AdEasyTM载体系统中，含有大部分腺病毒基因组的载体为超螺旋质粒，而不是线性DNA，同源重组则在大肠杆菌进行。相对于传统系统而言，这两点改进使病毒DNA操作更容易，同时由于利用了大肠杆菌的高效率同源重组特性而使重组载体的筛选更为简单。在本系统中，首先将基因cDNA插入一个转移载体，将得到的质粒用PmeI线性化，然后在大肠杆菌BJ5183中与病毒DNA质粒pAdEasy-1进行同源重组。pAdEasy-1缺失了E1和E3区，其E1区功能将在293A细胞中得到互补。重组子通过卡那霉素筛选，用内切酶进行鉴定分析。最后将得到的重组腺病毒用PacI线性化，暴露其反向末端重复序列(ITR，IavertedTermined Repeats)，转染293A细胞后产生重组病毒颗粒。

同源重组在线性化的转移载体和完整的超螺旋腺病毒质粒之间进行。应用完整的腺病毒质粒而不用内切酶进行线性化，对于产生重组腺病毒至关重要。转移载体中的卡那霉素抗性基因则可用来筛选重组子。由于线性化的转移载体产生卡那霉素抗性克隆的背景较低，因此该同源重组系统有较高的信噪比。大肠杆菌BJ5183有recA活性，但同时缺失介导细菌重组的其它酶，具有高效的转化和重组能力。一旦重组子经确定，则可转入普通的无recA、endA活性的细菌株如DH5α等进行扩增。由于缺乏recA活性，DH5α不能用于腺病毒的同源重组。

与传统系统相比，AdEasyTM系统中筛选和纯化腺病毒所需的时间大大缩短了。克隆和筛选约需1～3周，重组后需验证重组病毒质粒是否含有目的基因。重组子在DH5α中扩增后转入哺乳动物细胞293A，最后将293A细胞中产生的重组病毒颗粒进行纯化和滴定。最终得到的重组腺病毒只能在提供E1区功能的293A细胞中进行增殖。

一般来说，用传统方法产生重组腺病毒并不需要大量工作，每天只需1小时进行细胞传代和观察空斑形成。但由于病毒空斑形成速度慢，整个过程就需要很长时间。而AdEasyTM载体系统用大肠杆菌产生重组病毒，大大缩短了所需时间。

锌指蛋白是一类具有手指状结构域的转录因子，对基因调控起重要的作用。根据其保守结构域的不同，可将锌指蛋白主要分为C2H：型、C。型和C6型。锌指通过与靶分子DNA、RNA、DNA-RNA的序列特异性结合，以及与自身或其他锌指蛋白的结合，在转录和翻译水平上调控基因的表达。

锌指蛋白ZBED基因家族共发现有5个成员；其功能如下：ZBED1基因：参与调节一些能够促进细胞的增殖的基因；ZBED2基因：参与胚胎发育；ZBED3基因：参与正调控Wnt/β-catenin信号通路。ZBED4基因：作用于视网膜的形成。ZBED5基因：与乳腺癌有关。ZBED6基因：主要影响着发育、细胞增殖和肌肉生长。

ZBED6基因是失去转座功能的转座子，在所有哺乳动物中位于ZC3H11A基因第一内含子中；该基因在小鼠、大鼠、人、猩猩、狗、马、家猪中高度保守。实时定量PCR分析显示，小鼠ZBED6的mRNA在脑、心脏、肾脏、肝脏、肺、肌肉、卵巢、脾、尾和睾丸组织有不同程度地表达。

ZBED6蛋白含有2个BED结构域和1个hATC二聚结构域；第61~80位和第231~248位氨基酸残基是2个细胞核定位信号(富Lys-Arg区段)。该蛋白在哺乳动物中高度保守，尤其是DNA结合BED结构域，在26个物种中(包括家猪)显示出100%相似性。

Markljung等(2009)用siRNA将小鼠C2C12成肌细胞中的ZBED6基因沉默后的实验结果表明，ZBED6蛋白作为抑制因子是通过与位于胰岛素样生长因子2(insuLin-like growth factor 2，IGF2)基因第3内含子中的QTN(Quantitative traitnucleotide)位点结合来抑制IGF2基因的表达。当ZBED6基因沉默后，IGF2基因的表达量升高、细胞增殖(肌管形成)加快、创伤愈合加快。

Markljung等(2009)采用ChIP-Seq技术对小鼠C2C12成肌细胞进行分析，研究ZBED6蛋白作用靶点(IGF2基因及其下游基因)，在IGF2基因内含子中的QTN位点是ZBED6蛋白在基因组上的主要结合位点。家猪IGF2基因第三内含子单碱基G→A的替换，导致抑制因子ZBED6在该基因上结合位点的丧失，从而使IGF2在骨骼肌中上调表达(表达量是正常情况的3倍)，这一突变主要影响肌肉生长(提高了骨骼肌的数量，因此猪肉产量提高了3%~4%)、心脏增大和脂肪沉积。GO注释分析发现，ZBED6蛋白的1200个作用靶点起着发育、转录调控、细胞分化等作用。其中，262个靶基因编码转录因子，36个含有Homeobox结构域，26个属于bHLH(basic helix-loop-helix)家族，10个属于FOX家族，8个细胞核受体，7个属于SOX家族。

综上所述，在哺乳动物中，ZBED6是一个重要的转录因子，影响着发育、细胞增殖和肌肉生长。通过秦川牛ZBED6基因腺病毒载体的构建能够为秦川牛肉质性能、生长性能的标记辅助选择和新的优良品种的育种提供重要的研究资料，最终为转基因动物的研究及秦川牛生长发育和牛肉品质的改善提供理论依据。

发明内容

本发明的目的在于公开了一种质粒型腺病毒载体pAd-ZBED6。

本发明的第二个目的在于公开了质粒型腺病毒载体pAd-ZBED6的制备方法。

本发明的第三个目的在于公开了质粒型腺病毒载体pAd-ZBED6的应用。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种质粒型腺病毒载体pAd-ZBED6，其中，所述质粒型腺病毒载体pAd-ZBED6含有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的秦川牛ZBED6基因。

上述技术方案所述的质粒型腺病毒载体pAd-ZBED6，其中，所述质粒型腺病毒载体pAd-ZBED6是由AdEasyTM系统构建完成。

上述技术方案所述的质粒型腺病毒载体pAd-ZBED6，其中，所述质粒型腺病毒载体pAd-ZBED6中的ZBED6基因连接于穿梭质粒CMV启动子之下。

上述技术方案所述的质粒型腺病毒载体pAd-ZBED6，其中，所述质粒型腺病毒载体pAd-ZBED6中的ZBED6基因起始密码子前含有Kozak序列；其中Kozak序列为GCCCACC。

上述技术方案所述的质粒型腺病毒载体pAd-ZBED6，其中，所述质粒型腺病毒载体pAd-ZBED6中的ZBED6基因起始密码子后含有6个His标签序列。

构建上述技术方案中任一技术方案所述的质粒型腺病毒载体pAd-ZBED6的方法，所述方法包括如下步骤：

(1)、将PCR扩增的ZBED6基因片段连接到pGM-T载体，重组质粒pGM-T-ZBED6；将重组质粒pGM-T-ZBED6和穿梭质粒pAdTrack-CMV经KpnI和XbaI双酶切，将ZBED6基因片段和pAdTrack-CMV载体片段利用T4DNALigase进行酶连反应，酶连产物转化E.coli DH5α感受态细菌，得到pAdTrackCMV-ZBED6重组质粒；

(2)、限制性内切酶Pme I线性化pAdTrack-CMV-ZBED6重组穿梭质粒，用线性化pAdTrack-CMV-ZBED6重组穿梭质粒转化含有pAdEasy-1质粒E.coliBJ5183感受态细菌，利用E.coli BJ5183内Cre重组酶高效的同源重组系统，在细菌中完成pAdTrack-CMV-ZBED6和pAdEasy-1的同源重组，获得携带ZBED6基因的重组腺病毒质粒pAd-ZBED6。

上述技术方案所述的方法，其中，所述方法还包括将重组腺病毒质粒pAd-ZBED6用脂质体LIPOFECTAMINE 2000转染后，在293A细胞中进行病毒包装。

上述技术方案中任一技术方案所述的质粒型腺病毒载体pAd-ZBED6，作为秦川牛ZBED6基因功能鉴定的应用。

上述技术方案中任一技术方案所述的质粒型腺病毒载体pAd-ZBED6，作为细胞改造的应用。

上述技术方案中任一技术方案所述的质粒型腺病毒载体pAd-ZBED6，作为肌肉生长发育调控的应用。

具体的：

本发明是通过以下技术方案来实现：

PCR扩增ZBED6后和pAdTrack-CMV穿梭质粒经KpnI和XbaI双酶切，凝胶回收试剂盒回收ZBED6基因片段和pAdTrack-CMV载体片段，回收的载体片段和目的基因片段T4DNA Ligase进行酶连反应。酶连产物转化E.coli DH5α感受态细胞，纯化试剂盒抽提pAdTrack-CMV-ZBED6重组穿梭质粒，KpnI和XbaI双酶切鉴定证明获得正确的pAdTrackCMV-ZBED6重组质粒。

限制性内切酶PmeI线性化pAdTrack-CMV-ZBED6重组穿梭质粒，凝胶回收试剂盒回收线性化pAdTrack-CMV-ZBED6重组穿梭质粒，转化含有pAdEasy-1质粒E.coli BJ5183感受态细胞，利用E.coli BJ5183内Cre重组酶高效的同源重组系统，在细菌中pAdTrack-CMV-ZBED6和pAdEasy-1同源重组获得携带ZBED6基因的重组腺病毒质粒，将同源重组成功的重组腺病毒质粒命名为pAd-ZBED6。试剂盒抽提同源重组质粒，0.7%琼脂糖凝胶电泳，选择比pAdEasy-l大的重组腺病毒质粒，Pac Ⅰ酶切。酶切产物通过0.7%琼脂糖凝胶电泳鉴定，琼脂糖凝胶电泳结果与理论上同源重组质粒多克隆位点图谱吻合。pAd-ZBED6重组腺病毒质粒转化E.coli DH5α感受态细胞，大量抽提质粒备用。pAd-ZBED6重组腺病毒质粒用PacI线性化暴露反向的末端重复序列，采用脂质体转染包装细胞(293A cells)进行病毒包装。转染24h后荧光显微镜直接观察，可见穿梭质粒带有的绿色荧光蛋白(GFP)基因表达。重组病毒上清液感染293A细胞扩增重组腺病毒，荧光显微镜观察绿色荧光蛋白基因的表达。

将重组腺病毒质粒pAd-ZBED6感染牛原代肌肉细胞，利用实时定量PCR和Western bloting技术检测过表达ZBED6基因对牛肌肉细胞增殖分化和肌肉发育相关基因的表达模式的影响，是本发明重组腺病毒质粒pAd-ZBED6作为秦川牛ZBED6基因功能鉴定方面的应用。

本发明的重组腺病毒质粒pAd-ZBED6，可用于感染牛肌肉细胞，牛脂肪细胞，293细胞，C2C12细胞，3T3L细胞等细胞系，检测其对相应细胞结构和功能的影响，是本发明重组腺病毒质粒pAd-ZBED6作为细胞改造的应用。

将重组腺病毒质粒pAd-ZBED6感染鼠C2C12细胞系，利用实时定量PCR和Western bloting技术检测过表达ZBED6基因对肌肉细胞增殖分化和肌肉发育标志基因（MyoD、MyoG、MEF-2D、Pax7、MHC）在肌肉细胞中的差异表达情况，是本发明重组腺病毒质粒pAd-ZBED6作为肌肉生长发育调控的应用。

本发明具有以下有益效果：

本发明构建了能够表达秦川牛ZBED6基因的重组腺病毒载体，本发明所构建的载体，转染原代培养的秦川牛肌肉细胞后，可获得ZBED6mRNA的高效表达，为ZBED6基因功能鉴定和改造细胞，调控代谢和生长发育奠定了基础。

附图说明：

1、图1为PCR扩增的秦川牛ZBED6基因；

2、图2为pAdTrack-CMV-ZBED6重组质粒双酶切鉴定；

3、图3为pAd-ZBED6重组腺病毒质粒PacI酶切鉴定；

4、图4为pAd-ZBED6质粒转染293A细胞5d；

5、图5为pAd-ZBED6质粒转染293A细胞10d；

6、图6为pAd-ZBED6质粒转染秦川牛原代肌肉细胞4d。

具体实施方式：

为使本发明的技术方案便于理解，以下结合具体试验例对鬼子红在制备治疗胃溃疡药物中的应用作进一步的说明。

本发明利用质粒的体外酶切及连接技术，应用pAdEasy-1系统，将线性化的穿梭质粒转化含有pAdEasy-1质粒的E.coli BJ5183感受态细胞进行同源重组，所得重组腺病毒质粒可以通过卡那霉素筛选出，并通过质粒大小和限制性内切酶分析鉴定。最后，PacI酶切后的重组腺病毒质粒转染293A细胞包装产生重组腺病毒。

实施例1：pAd-ZBED6重组腺病毒质粒的构建

1、材料和方法：

1.1、仪器：

超净工作台、生化培养箱、基因扩增仪、PTC-200单槽梯度基因扩增仪、Heraeus冷冻高速离心机(德国)、Bio-Rad凝胶成像分析仪(USA)、CO₂培养箱、HZS-H水浴振荡器(哈尔滨)、Eppendorf移液器、DYY-Ⅲ型稳压稳流电泳仪(北京六一)、DYY-Ⅲ31A和DYY-Ⅲ28D电泳槽(北京六一)、制冰仪、MDF-382E超低温冰箱(日本三洋)、Eppendorf台式高速离心机、Sartorious电子天平(德国)、常规冰箱等。

1.2、主要生化试剂和试剂盒：

Long Taq聚合酶、PrimeSTAR DNA聚合酶、DNA限制性内切酶(XbaI、PacI、PmeI、KpnI和XbaI等)、胶原蛋白、胰蛋白酶、DNA Marker、DNA连接酶、Trizol、反转录试剂盒、表达载体(pAdTrack-CMV、pAdEasy-1)、质粒提取试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒、胎牛血清、细胞培养基等。

1.3、培养基和抗性：

LB培养基：胰蛋白胨，酵母粉，NaCl，琼脂粉；

抗性：氨苄青霉素，卡纳霉素等。

1.4、普通试剂：

肝素钠，Tris，EDTA，NaCl，NaOH，无水乙醇，醋酸钠，十二烷基磺酸钠(SDS)，抗生素，溴化乙锭(EB)，溴酚蓝，二甲基苯菁FF，乙酸，蔗糖，去离子甲酰胺，硝酸，盐酸，硝酸银，无水碳酸钠，硫代硫酸钠，甲醛，硼酸，琼脂糖，KCl，Na₂HPO₄，KH₂PO₄，Tris饱和酚(pH＝8.0)，氯仿，异戊醇，甘油，石蜡油。

1.5、秦川牛ZBED6基因PCR引物的设计(引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成)：

参照GenBank公布的ZBED6mRNA序列(NC 007314.4)设计引物：

上游引物:5’>CGGggtaccGCCCACCATGcaccaccaccaccaccacAGTGTATGTACCTTAAGTGTACC<3’；

下游引物:5’>CCCaagcttTTAAGGTAATATTTCTTT TTCATTGC<3’，

其中KpnI，XbaI分别为上下游的酶切位点。

1.6、PCR扩增秦川牛的ZBED6基因片段：

(1)、PCR总反应体系为50μL，见表1：

表1本发明的PCR反应体系

(2)、PCR反应程序，见表2：

表2本发明的PCR反应程序

1.7、携带ZBED6基因的pGM-T-ZBED6重组质粒的构建：

由于使用高保真酶PrimeSTAR扩增的PCR产物不带A尾巴，无法进行TA克隆，所以扩增产物需做加A处理,才可以连到pGM-T载体上,反应体系见表3：

表3本发明的加A反应体系

注：反应条件为72度（建议水浴），10分钟。

将PCR扩增的ZBED6基因片段经加A反应后，与pGM-T载体经过T4Ligase16℃过夜连接，得到pGM-T-ZBED6重组质粒，后者转化E.coli DH5α感受态细胞，挑选菌落扩增，质粒回收后KpnI和XbaI双酶切鉴定。

KpnI和XbaI酶切反应体系20μL，见表4：

表4本发明的KpnI和XbaⅠ酶切反应体系

注：酶切消化条件为37℃，3～10h。

1.8、携带ZBED6基因的pAd-TrackCMV-ZBED6重组质粒的构建：

KpnI和XbaI双酶切携带ZBED6基因的pGM-T-ZBED6重组质粒和pAdTrack-CMV质粒，胶回收后T4Ligase 16℃过夜连接，得到pAdTrack-CMV-ZBED6重组质粒。后者转化E.coli DH5α感受态细胞，挑选菌落扩增，质粒回收后KpnI和XbaI双酶切鉴定。

连接体系25μL，见表5：

表5本发明的连接反应体系

注：条件为16℃，10～12h。

1.9、携带ZBED6基因的pAd-ZBED6重组腺病毒质粒的构建：

限制性内切酶PmeI线性化pAdTrack-CMV-ZBED6重组穿梭质粒，凝胶回收试剂盒回收线性化pAdTrack-CMV-ZBED6重组穿梭质粒，转化包含有pAdEasy-1质粒的E.coli BJ5183感受态细胞，利用E.coli BJ5183内Cre重组酶高效的同源重组系统，在细菌中完成pAdTrack-CMV-ZBED6和pAdEasy-1同源重组，获得同源重组成功的携带ZBED6基因的重组腺病毒质粒pAd-ZBED6，试剂盒抽提同源重组质粒，0.7%琼脂糖凝胶电泳，选择比pAdEasy-l大的重组腺病毒质粒，PacI酶切。酶切产物通过0.7%琼脂糖凝胶电泳鉴定，琼脂糖凝胶电泳结果与理论上同源重组质粒多克隆位点图谱吻合；具体步骤如下：

(1)、将2管含有pAdEasy-1的BJ5183感受态细胞置于冰上，1管加入6μLPmeI线性化的pAdTrack-CMV-ZBED6轻弹混匀，另一管做空对照，冰浴30min；

(2)、42℃水浴90秒，迅速置于冰中静置3min；

(3)、每管加入37℃预热的LB培养基1000μL，37℃震荡培养60min；

(4)、将转化物铺3~5块LB/Kan(50μg/mL)培养板，37℃培养24h。分别铺100、300和600μL，以提高得到可分离菌落的机率，约得到40~100个菌落；

(5)、挑出24个最好的克隆，转入2mL LB/Kan(50μg/mL)培养液中培养10~15h。因可能产生非目的重组子，应尽快抽提重组质粒；

(6)、用传统碱裂解法小量制备质粒，取一半进行0.7%琼脂糖凝胶电泳检测质粒的大小。重组质粒大小约40kb，由于它是低拷贝质粒，所以小量制备时应相应调整具体操作；

(7)、20%以上的菌落含有大质粒(约40kb)，这些是侯选重组子。与对照培养板生长的菌落进行对照即可估计线性化穿梭质粒再连接所致的背景强弱；

(8)、重组质粒的筛选和扩增

将侯选重组子进行酶切分析，验证其结构。PacI酶切后通常得到约30kb的片段和一个3.0或4.5kb的小片段，小片段的大小因重组位置在左臂还是复制子而不同。

挑选最佳阳性重组子转入E.coli DH5α中进行扩增，这一步对于扩增时保持重组质粒的结构是必需的。因为重组质粒在BJ5183中是不稳定的，而在DH5α中能很容易地获得大量重组质粒。

1.10、含pAd-ZBED6重组质粒的脂质体LIPOFECTAMINE 2000转染293A细胞(即在293A细胞中进行病毒包装)：

(1)、转染前一天，以合适的细胞密度接种到6孔培养板上；转染时，细胞要达到90%～95%的融合；

(2)、溶液1：240μL无血清培养基+10μL LIPOFECTAMINE 2000(温育5min)；

(3)、溶液2：X μL无血清培养基+4μg质粒(总体积250μL)；

(4)、将溶液1与溶液2混合，室温下置20min；

(5)、与此同时，将6孔板中的细胞用无血清培养基冲洗细胞两遍后，加入2mL无血清培养基；

(6)、将溶液1与溶液2的混合液逐滴加入孔中，摇动培养板，轻轻混匀。在37℃，5％的CO₂中保温5～6h；

(7)、6h后，更换含有血清的全培养基，在37℃，5％的CO₂中24～72h检测转染水平。

1.11、携带秦川牛ZBED6基因的重组腺病毒的鉴定：

取重组腺病毒上清500μL，加入至90%融合的293A细胞中，37℃，5%的CO₂中培养。镜下观察到95%～100%细胞出现病变后，离心收集上清。并将细胞于-80℃和37℃之间反复冻融3次，以3000r/min离心收集上清，对腺病毒上清进行离心纯化。取5μL病毒上清加入10μL蛋白酶K，55℃孵育1h，再煮沸5min，离心后取2μL做PCR。

1.12、携带秦川牛ZBED6基因的重组腺病毒pAd-ZBED6的滴度测定：

(1)、细胞准备:96孔板中接种100μL293A细胞,每孔细胞数约10⁴个,以2%DMEM培养；

(2)、稀释病毒液准备：以2%DMEM将病毒液稀释成8个较高浓度(如10^-3～10^-10)，每个浓度重复10个，每孔加入病毒稀释液100μL。另留两排不加病毒液作为阴性对照。37℃下，孵箱培养10天；

(3)、10d后观察细胞，记数每排出现CPE的孔数，计算细胞病变率(如某一浓度各孔细胞全部病变，比率为1，如无细胞病变，则比率为0)；

(4)、计算T=10×10^1+d(S-0.5)/mL

d=Log₁₀稀释度(如为10倍稀释度，d=1)

S=各浓度细胞病变比率之和。

2、结果：

2.1、ZBED6基因PCR扩增结果：

以秦川牛基因组为模板，参考NCBI上公布的牛ZBED6基因序列（登录号：NC 007314.4）设计引物。利用PrimeSTAR DNA聚合酶，成功扩增出ZBED6，结果如图1所示，图1为PCR扩增的秦川牛ZBED6基因：其中M为D15000Marker，条带分别为250，1000，2500，5000，7500，10000，15000bp；1为ZBED6基因片段，大小为2943bp。

2.2、pAdTrack-CMV-ZBED6重组质粒酶切鉴定结果：

经过连接和扩繁，以KpnI和XbaI双酶切pAdTrack-CMV-ZBED6重组质粒，琼脂糖检测有2943bp片段，证明成功获得pAdTrack-CMV-ZBED6阳性重组质粒，结果如图2所示，图2为pAdTrack-CMV-ZBED6重组质粒双酶切鉴定：M为D15000Marker，条带分别为250，1000，2500，5000，7500，10000，15000bp；1为KpnI和XbaI双酶切。

2.3、携带ZBED6基因的pAd-ZBED6质粒的构建结果：

如图3所示，携带ZBED6基因的pAd-ZBED6重组质粒构建成功。后经PacI酶切鉴定，进一步证实携带ZBED6基因的pAd-ZBED6重组质粒构建成功，结果如图3所示，图3为pAd-ZBED6重组腺病毒质粒PacI酶切鉴定：1为PacI酶切产生一个3.0kb的小片度；M为D15000Marker，条带分别为250，1000，2500，5000，7500，10000，15000bp。

2.4、携带ZBED6基因的pAd-ZBED6重组质粒脂质体LIPOFECTAMINE2000转染293A细胞效果：

5d和10d转染效果见图4和图5，图4为pAd-ZBED6质粒转染293A细胞5d，图5为pAd-ZBED6质粒转染293A细胞10d，证明转染成功。

2.5、携带ZBED6基因的pAd-ZBED6重组质粒脂质体LIPOFECTAMINE 2000转染秦川牛原代肌肉细胞细胞效果：

4d转染效果见图6，图6为pAd-ZBED6质粒转染秦川牛原代肌肉细胞4d，证明转染成功。

2.6、携带秦川牛ZBED6基因的重组腺病毒的滴度测定：

重组腺病毒经繁殖、扩增后，计算出病毒滴度为1.96×10¹⁰pfu/mL，说明病毒滴度较高，能够满足转染细胞及其他应用。

实施例2：携带秦川牛ZBED6基因的重组腺病毒转染原代培养的秦川牛肌肉细胞：

本实施例的目的在于将重组腺病毒质粒pAd-ZBED6感染牛原代肌肉细胞，经过实时定量PCR和Western bloting技术检测过表达ZBED6基因对肌肉细胞增殖分化和肌肉发育标志基因（MyoD、MyoG、MEF-2D、Pax7、MHC）在牛肌肉细胞中的差异表达情况。

1、秦川牛肌肉细胞的原代培养：

(1)、将新鲜组织置于培养皿中，于无菌操作台中用Hank’s液洗涤三次，并剔除脂肪、血液等杂物；

(2)、用手术剪将肌肉剪成小块(1mm³)，再用Hank’s液洗三次，转移至小青霉素瓶中；

(3)、视组织块量加入5～6倍的0.25%胰酶液，37℃中消化20～40min，每隔5min振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离；

(4)、加入3～5mL培养液以终止胰酶消化作用(或加入胰酶抑制剂)；

(5)、静置5～10min，使未分散的组织块下沉，取悬液加入到离心管中；

(6)、1000r/min，离心10min，弃上清液；

(7)、加入Hank’s液5mL，冲散细胞，再离心一次，弃上清液；

(8)、加入培养液l～2mL(视细胞量)，血球计数板计数；

(9)、将细胞调整到5×10⁵/mL左右，转移至75mL 2方瓶中37℃培养。

2、ZBED6重组腺病毒转染原代细胞后的RT-PCR检测：

当培养的秦川牛原代肌肉细胞密度达到60%，加入适量病毒上清感染细胞。细胞感染病毒(MOI=200)72h时，RT-PCR检测证明，与阴性对照相比(阴性对照为空pAdTrack-CMV与pAdEasy-1重组产生的重组腺病毒质粒，没有携带ZBED6基因)，ZBED6基因mRNA的表达量明显增加。同时90%的肌肉细胞表达绿色荧光，且肌肉细胞形态良好。

实施例3：E.coli DH5α感受态细胞的制备：

本发明实施例中感受态细胞E.coli DH5α的制备步骤：

1、步骤：

(1)、在15mL离心管中普通4mLLB培养液摇菌过夜；

(2)、次日1：100接种扩大培养于200mLRichLB(见表6)培养液中(37°C)至OD₆₀₀=0.6～0.7；

(3)、置于冰上10min，摇动使其冷却，分装到50mL离心管，每管42mL；

(4)、4°C，2000r/min，15min，收集细胞(去尽上清)；

(5)、1/6体积的CCMB80Buffer(见表7)重悬，置冰上20min；

(6)、4°C，2000r/min，15min，收集细胞(去尽上清)；

(7)、用1/24体积CCMB80Buffer重悬，每100μL于一个离心管，-80°C冻存。

表6Rich LB的组分

表7CCMB80Buffer的配方

CCMB80中各种试剂的应称量精确，先用一定量的ddH₂O溶解各化合物，再加入甘油，搅拌均匀，最后用ddH₂O定容到所需体积。CCMB80不可高压灭菌，将pH调至6.4后，先用滤纸过滤，然后用0.22μm滤膜过滤，保存于4°C。以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上和实质上的限制，凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用以上所揭示的技术内容，而作出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对以上实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

Claims (10)

1.一种质粒型腺病毒载体pAd-ZBED6，其特征在于：所述质粒型腺病毒载体pAd-ZBED6含有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的秦川牛ZBED6基因。

2.如权利要求1所述的质粒型腺病毒载体pAd-ZBED6，其特征在于：所述质粒型腺病毒载体pAd-ZBED6是由AdEasyTM系统构建完成。

3.如权利要求1所述的质粒型腺病毒载体pAd-ZBED6，其特征在于：所述质粒型腺病毒载体pAd-ZBED6中的ZBED6基因连接于穿梭质粒CMV启动子之下。

4.如权利要求1所述的质粒型腺病毒载体pAd-ZBED6，其特征在于：所述质粒型腺病毒载体pAd-ZBED6中的ZBED6基因起始密码子前含有Kozak序列。

5.如权利要求1所述的质粒型腺病毒载体pAd-ZBED6，其特征在于：所述质粒型腺病毒载体pAd-ZBED6中的ZBED6基因起始密码子后含有6个His标签序列。

6.一种构建权利要求1至6中任一权利要求所述质粒型腺病毒载体pAd-ZBED6的方法，所述方法包括如下步骤：

(1)、将PCR扩增的ZBED6基因片段连接到pGM-T载体，重组质粒pGM-T-ZBED6；将重组质粒pGM-T-ZBED6和穿梭质粒pAdTrack-CMV经KpnI和XbaI双酶切，将ZBED6基因片段和pAdTrack-CMV载体片段利用T4DNALigase进行酶连反应，酶连产物转化E.coli DH5α感受态细菌，得到pAdTrackCMV-ZBED6重组质粒；

(2)、限制性内切酶Pme I线性化pAdTrack-CMV-ZBED6重组穿梭质粒，用线性化pAdTrack-CMV-ZBED6重组穿梭质粒转化含有pAdEasy-1质粒E.coliBJ5183感受态细菌，利用E.coli BJ5183内Cre重组酶高效的同源重组系统，在细菌中完成pAdTrack-CMV-ZBED6和pAdEasy-1的同源重组，获得携带ZBED6基因的重组腺病毒质粒pAd-ZBED6。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述方法还包括将重组腺病毒质粒pAd-ZBED6用脂质体LIPOFECTAMINE 2000转染后，在293A细胞中进行病毒包装。

8.权利要求1至5中任一权利要求所述的质粒型腺病毒载体，作为秦川牛ZBED6基因功能鉴定的应用。

9.权利要求1至5中任一权利要求所述的质粒型腺病毒载体，作为细胞改造的应用。

10.权利要求1至5中任一权利要求所述的质粒型腺病毒载体，作为肌肉生长发育调控的应用。

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