CN102226200A

CN102226200A - 牛Nramp1巨噬细胞特异性表达载体及其构建方法和应用

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Publication number: CN102226200A
Application number: CN 201110109953
Authority: CN
Inventors: 王爱华; 李倩; 靳亚平; 张涌; 徐晓彬; 胡林勇
Original assignee: Northwest A&F University
Current assignee: Northwest A&F University
Priority date: 2011-04-29
Filing date: 2011-04-29
Publication date: 2011-10-26

Abstract

本发明涉及了一种牛Nramp1巨噬细胞特异性表达载体及其构建方法和应用。该方法以质粒pIRES2-EGFP为骨架载体，在多克隆位点Sal I与BamH I之间插入牛Nramp1开放阅读框序列，并用Nramp1基因表达调控序列替换掉骨架载体上巨细胞病毒(CMV)启动子序列，从而实现Nramp1基因在吞噬细胞内的特异性表达。本载体可以作为一种转基因载体应用在转基因抗病动物培育中。本发明还指出秦川牛Nramp1开放阅读框序列与GenBank中相应序列(GenBank序列号U12862.1)相似率为99.88％，存在两个碱基差异。

Description

牛Nramp1巨噬细胞特异性表达载体及其构建方法和应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及一种真核表达载体的构建，特别是牛天然免疫力相关巨噬细胞蛋白1(Nrampl)的吞噬细胞特异性表达载体及其构建方法和应用。本载体可以作为一种转基因载体应用在转基因抗病动物培育中。

背景技术

研究动物机体抵抗牛结核分支杆菌(M.bovis)、鼠麻风分支杆菌(M.lepraemurium)、布鲁氏菌(Brucella)、沙门菌(S.typhimurium)及利什曼原虫(Leishmania spp)等胞内寄生病原微生物的侵染机制，是寻求高效的防治药物与疫苗和进行家畜抗病育种的前提。机体抵御胞内寄生微生物侵染主要依赖于细胞免疫，即巨噬细胞吞噬病原体、处理并递呈抗原至T淋巴细胞，T淋巴细胞识别抗原后增殖分化，释放细胞因子，巨噬细胞活化清除病原微生物。巨噬细胞作为抗原递呈细胞与最后的效应细胞在细胞免疫过程中发挥巨大的作用。然而，胞内寄生微生物拥有一套抵御巨噬细胞杀伤的机制来阻遏机体对其的清除作用，并在巨噬细胞内生长繁殖，给胞内寄生菌疾病的防治工作带来很大的困扰。1981年，Gros等指出机体对结核分支杆菌的易感性是受遗传因素控制的，针对与机体天然免疫相关蛋白功能的研究遂成为胞内寄生菌疾病防治研究领域的热点之一。Paixáo(2006)通过SSCA法比较荷斯坦奶牛及瘤牛基因组指出，不同基因型对布鲁氏菌的抗性和敏感性差异显著，这种差异源自荷斯坦牛及瘤牛天然免疫力相关巨噬细胞蛋白1(Nramp1)基因3’UTR区序列的遗传变异。牛Nramp1基因是一个较为保守的基因，位于第二号染色体上，全长约10926bp，含有15个外显子，编码的磷酸糖蛋白位于吞噬细胞吞噬溶酶体膜上，含有12个推定的跨膜区(Feng et al.，1996)，在有吞噬能力的细胞(如巨噬细胞，噬中性粒细胞)内特异性表达，具有二价金属阳离子转运的功能。Nramp1可通过外运吞噬体内病原微生物满足自身营养代谢或合成防御体系所必须的金属离子(如Fe²⁺、Mn²⁺)而减弱其对吞噬体内环境的抵御能力，同时，Nramp1的离子转运效应可活化巨噬细胞，引起“多向性效应”(包括NO产生、抗原递呈、蛋白激酶C产生等功能的上调)，增强巨噬细胞对病原微生物的杀伤性，从而影响动物对疾病的天然抵抗力。2006年，Pereira-Suárez从感染牛结核分枝杆菌牛群取样检测Nramp1表达量发现病畜较健康牛Nramp1表达量显著升高；且对比健康人群，患病儿童Nramp1表达的减弱增加了机体对结核病的易感性。提示，机体对胞内寄生菌的抵抗力强弱与Nramp1的表达存在量依赖关系。

发明内容

本发明目在于针对现有技术的不足提供一种牛Nramp1巨噬细胞特异性表达载体及其构建方法和应用，该载体含有牛Nramp1基因及其调控序列，可以通过特异性的增强Nramp1的表达量，从而提高转基因动物的抗病能力。

牛Nramp1巨噬细胞特异性表达载体构建方法，包括以下步骤：

A1：血液基因组提取：

A2：Nramp1调控区序列的扩增，具体包括以下操作，A21：引物设计：从牛Nramp1全基因序列结合其核心启动子区序列设计含Vsp I和Xho I酶切位点的引物：

F：5’-CCATTAATCCCTCTACCCCTGCCTCTCC-3’

R：5’-CCTCTCGAGGCGGTGGCGATTGTGC-3’；

下划线序列为酶切位点；A22：PCR反应：以荷斯坦奶牛外周血基因组为模板，按照TaKaRa公司TaKaRa TaqTM使用说明书进行PCR反应，反应程序如下：94℃3min；94℃30s，60.8℃30s，72℃2min 20s，30个循环；72℃10min；4℃10min；用1％琼脂糖凝胶电泳分离待回收的PCR产物，切胶回收；回收产物与pMD 18-T simple载体连接，转化DH5α感受态细菌进行蓝白斑筛选；挑取阳性菌落，提取质粒后用Vsp I及XhoI进行双酶切鉴定；酶切正确的质粒送样测序序列正确者命名为pMD18-P；

A3：吞噬细胞特异性表达载体pIRES2-P的构建与鉴定：

pMD18-P与pIRES2-EGFP载体分别用Vsp I及Xho I进行双酶切，胶回收获得的目的基因片段与相应载体片段用T4DNA连接酶16℃连接过夜，连接产物转化DH5α感受态细菌，选取阳性菌落增菌获得的重组质粒进行酶切鉴定，命名为pIRES2-P；

A4：牛Nramp1吞噬细胞特异性表达载体pIRES2-PN的构建与鉴定

pIRES2-P与pMD18-N4载体分别用BamH I和Sal I进行双酶切，胶回收获得的目的基因片段与相应载体片段用T4DNA连接酶16℃连接过夜，连接产物转化DH5a感受态细菌，选取阳性菌落增菌获得的重组质粒进行酶切鉴定，命名为pIRES2-PN。

所述的构建方法，所属步骤A1具体操作如下：

(1)取荷斯坦奶牛外周血血液样本200uL，加入20uL的蛋白酶K溶液，混匀；再次加入200uL的缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10min，溶液变清亮后瞬时离心去除管盖内壁的水珠；

(2)加入200uL无水乙醇，充分振荡15s，瞬时离心；

(3)将上一步所得的溶液和絮状沉淀都加入吸附柱CB3中，13400×g离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中；

(4)向吸附柱CB3中加入500uL缓冲液GD，13400×g离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中；

(5)向吸附柱CB3中加入700uL漂洗液PW，13400×g离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中；

(6)向吸附柱CB3中加入500uL漂洗液PW，13400×g离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中；

(7)13400×g离心2min，倒掉废液，将吸附柱CB3室温放置10min，以彻底晾干吸附材料中残留的漂洗液；

(8)将吸附柱转入一个干净的离心管中，向吸附膜中间部位悬空滴加100uL洗脱缓冲液TE，室温放置5min，13400×g离心2min；

(9)重复步骤8；

(10)获得的外周血基因组溶液，5uL上样，0.8％琼脂糖凝胶电泳分析。

根据上述的构建方法获得的重组载体pIRES2-PN。

所述的重组载体pIRES2-PN在转基因抗病动物培育中的应用。

本发明选择质粒pIRES2-EGFP为骨架载体，该载体所含IRES序列不仅可以实现目的基因与标记基因(绿色荧光蛋白)的独立表达，而且两者的表达量存在比例关系：一方面减少了绿色荧光蛋白对目的蛋白功能的影响，另一方面更有利于检测目的蛋白的表达水平。

本发明在质粒pIRES2-EGFP多克隆位点Sal I与BamH I之间插入牛Nramp1开放阅读框序列，并用Nramp1基因表达调控序列替换掉骨架载体上巨细胞病毒(CMV)启动子序列(命名为pIRES2-PN)，从而实现Nramp1基因在吞噬细胞内的特异性表达。一方面，该载体可以提高Nramp1基因的表达量；另一方面，该载体启动子的特异性限制了Nramp1的表达范围，最大程度的减少人工加入基因表达对转基因动物机体生命活动的不利影响。

本发明将重组质粒pIRES2-PN分别转染至成纤维细胞与鼠单核巨噬细胞系RAW264.7中验证重组质粒功能：转染后的RAW264.7出现绿色荧光，而转染后的成纤维细胞并没有绿色荧光出现；以转染后的成纤维细胞基因组为模板进行Nramp1的开放阅读框序列扩增，有目的条带出现。说明质粒pIRES2-PN中Nramp1的表达具有特异性。

附图说明

图1为外周血总RNA琼脂糖凝胶电泳；

图2为Nramp1基因PCR扩增；

图3重组质粒pMD18-N酶切鉴定；

图4重组质粒pIRES2-N酶切鉴定；

图5牛外周血基因组琼脂糖凝胶电泳；

图6牛Nramp1基因调控区序列PCR扩增；

图7重组质粒pMD18-P酶切鉴定；

图8重组质粒pIRES2-P酶切鉴定；1：Vsp I和Xho I双酶切后的pIRES2-P；2：pIRES2-P；

图9重组质粒pIRES2-PN的鉴定；1：Sal I单酶切后的pIRES2-PN 2：BamH I和Sal I双酶切；3：Vsp I和Xho I双酶切；

图10质粒载体pIRES2-EGFP、pIRES2-N、pIRES2-PN转染小鼠单核巨噬细胞株RAW264.7；

图11重组质粒pIRES2-N、pIRES2-PN转染牛成纤维细胞；

图12重组质粒pIRES2-PN转染牛成纤维细胞单克隆基因组PCR；

图13重组质粒pIRES2-PN示意图。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。

实施例1Nramp1基因片段的分离，扩增与测序

1.1总RNA的提取

无菌采取秦川牛(陕西杨凌科元生物工程有限公司)颈静脉血，加入红细胞裂解液(Triis-NH₄Cl)，混匀4℃作用4～5min(其间反复轻柔颠倒混匀)除去红细胞，待红细胞完全破碎，1000r/min离心5min，得到白细胞沉淀，PBS清洗2～3次，离心沉淀。加入适量TRIzol试剂，室温静置5min，加入1/5TRIzol试剂量的氯仿震荡混匀室温静置5min，12000r/min 4℃离心10min，吸取上清移至新的离心管中，加入等量体积的异丙醇，室温静置10min，12000r/min 4℃离心10min加入75％乙醇清洗2次，离心、沉淀干燥后溶解于适量的DEPC处理水中，1％琼脂糖电泳检测(图1)。

1.2引物设计

从牛Nramp1基因(GenBank序列号U12862.1)的完整阅读框架序列的两端设计含Sal I和BamH I酶切位点的引物：

下划线序列为酶切位点，预计扩增片段约为1660bp。

1.3反转录反应

1.3.1引物处理：干粉状的引物在稀释之前，12000r/min离心30s，然后慢慢地半打开管盖，加入适量的双蒸去离子水，制成引物贮存液，分装后于-20℃保存备用。

1.3.2如下配制微量离心管中混合液：

1.3.3在PCR仪上进行变性、退火反应。65℃，5min后4℃离心数秒。

1.3.4如下配制微量离心管中反转录反应液：

1.3.5在PCR仪上按下列条件进行反转录反应

30℃10min；45℃30min；95℃5min；4℃10min。

1.4PCR反应

按下表制备50uLPCR反应：

反应程序如下：94℃4min；94℃30s，62.8℃30s，72℃2min 45s，30个循环；72℃10min；4℃10min。用1％琼脂糖凝胶电泳分离待回收的PCR产物(图2)，切胶回收。回收产物与pMD18-T simple载体连接，转化DH5α感受态细菌进行蓝白斑筛选。挑取阳性菌落，提取质粒后用BamH I及Sal I进行双酶切鉴定(图3)。酶切正确的质粒送样测序，将所获序列用Blast程序与已发表的牛Nramp1 cDNA序列相比较，序列正确者命名为pMD18-N4。将所获序列用Blast程序与已发表的牛Nramp1 cDNA序列相比较，结果显示RT-PCR扩增秦川牛cDNA区段有2个碱基与已发表的牛Nramp1 cDNA碱基差异：第1个碱基差异使第49位氨基酸由苏氨酸(ACA)变异为丙氨酸(GCA)，第2个碱基差异未引起该基因编码的氨基酸变化，第53位氨基酸为精氨酸(AGG→CGG)，该片段碱基序列如SEQ ID NO：3。

实施例2Nramp1真核表达载体重组质粒pIRES2-N的构建及鉴定

pMD18-N4和pIRES2-EGFP载体分别用BamH I及Sal I进行双酶切，胶回收获得的目的基因片段与相应载体片段用T4DNA连接酶16℃连接过夜，连接产物转化DH5a感受态细菌，16h后挑取单克隆振摇、扩增，提取重组质粒进行酶切鉴定，鉴定正确的重组质粒命名为pIRES2-N(图4)。

实施例3吞噬细胞特异性表达载体pIRES2-PN的构建与鉴定

3.1血液基因组提取

(1)取荷斯坦奶牛外周血血液样本(陕西杨凌科元生物工程有限公司)200uL，加入20uL的蛋白酶K溶液，混匀。再次加入200uL的缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10min，溶液变清亮后瞬时离心去除管盖内壁的水珠。

(2)加入200uL无水乙醇，充分振荡15s，瞬时离心。

(3)将上一步所得的溶液和絮状沉淀都加入吸附柱CB3中，13400×g离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。

(4)向吸附柱CB3中加入500uL缓冲液GD，13400×g离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。

(5)向吸附柱CB3中加入700uL漂洗液PW，13400×g离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。

(6)向吸附柱CB3中加入500uL漂洗液PW，13400×g离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。

(7)13400×g离心2min，倒掉废液，将吸附柱CB3室温放置10min，以彻底晾干吸附材料中残留的漂洗液。

(8)将吸附柱转入一个干净的离心管中，向吸附膜中间部位悬空滴加100uL洗脱缓冲液TE，室温放置5min，13400×g离心2min。

(9)重复步骤8。

(10)获得的外周血基因组溶液，5uL上样，0.8％琼脂糖凝胶电泳分析(图5)。

3.2Nramp1调控区序列的扩增

3.2.1引物设计

从牛Nramp1全基因序列(GenBank序列号gi：194719396)结合其核心启动子区序列(GenBank序列号AY438096.1)设计含Vsp I和Xho I酶切位点的引物：

下划线序列为酶切位点，预计扩增片段约为1600bp。

3.2.2PCR反应

以荷斯坦奶牛外周血基因组为模板，按照TaKaRa公司TaKaRa TaqTM使用说明书进行PCR反应，反应程序如下：94℃3min；94℃30s，60.8℃30s，72℃2min 20s，30个循环；72℃10min 4℃10min。用1％琼脂糖凝胶电泳分离待回收的PCR产物(图6)，切胶回收。回收产物与pMD18-T simple载体连接，转化DH5α感受态细菌进行蓝白斑筛选。挑取阳性菌落，提取质粒后用Vsp I及Xho I进行双酶切鉴定(图7)。酶切正确的质粒送样测序(序列正确者命名为pMD18-P)，将所获序列用Blast程序与已发表的牛Nramp1启动子区序列相比较，碱基序列完全一致。序列正确者命名为pMD18-P。

3.3吞噬细胞特异性表达载体pIRES2-P的构建与鉴定

pMD18-P与pIRES2-EGFP载体分别用Vsp I及Xho I进行双酶切，胶回收获得的目的基因片段与相应载体片段用T4DNA连接酶16℃连接过夜，连接产物转化DH5α感受态细菌，选取阳性菌落增菌获得的重组质粒进行酶切鉴定，命名为pIRES2-P(图8)。

3.4牛Nramp1吞噬细胞特异性表达载体pIRES2-PN的构建与鉴定

pIRES2-P与pMD18-N4载体分别用BamH I和Sal I进行双酶切，胶回收获得的目的基因片段与相应载体片段用T4DNA连接酶16℃连接过夜，连接产物转化DH5α感受态细菌，选取阳性菌落增菌获得的重组质粒进行酶切鉴定，命名为pIRES2-PN(图9)。

实施例4牛Nramp1吞噬细胞特异性表达载体pIRES2-PN功能验证

4.1质粒载体pIRES2-EGFP、pIRES2-N、pIRES2-PN转染小鼠单核巨噬细胞株RAW264.7

4.1.1转染前细胞培养

(1)转染前24h通过胰酶消化收集细胞，用完全培养基(高糖DMEM，10％胎牛血清)以

5×10⁵个/mL的细胞密度接种于12孔板上，静置于含5％CO₂的37℃培养箱中培养20～24h。转染前1h换液，待转。

(2)本实验采用质粒∶转染试剂(FuGENE HD Transfection Reagent，Roche)＝2∶4(质量∶体积)的比率进行转染。12孔板每孔添加4μL的转染试剂与1μg的质粒载体，使用无血清的DMEM培养液添加至50μL，吹打混匀。将混合液加入待转细胞中，12孔板每孔50μL，震荡混匀，静置于培养箱中培养。本实验分为4组：质粒pIRES2-EGFP转染组、质粒pIRES2-N转染组、质粒pIRES2-PN转染组及阴性对照组(PBS、转染试剂混合液)，每组3个重复。

(3)细胞转染后48h观察荧光(图10)，质粒pIRES2-EGFP转染组、质粒pIRES2-N转染组、质粒pIRES2-PN转染组均出现弱荧光，说明这3个质粒均可在小鼠单核巨噬细胞中表达。

4.2重组质粒pIRES2-N、pIRES2-PN转染牛成纤维细胞

(1)转染前24h通过胰酶消化收集细胞，用完全培养基(高糖DMEM，10％胎牛血清)以5×10⁵个/mL的细胞密度接种于12孔板上，静置于含5％CO₂的37℃培养箱中培养20～24h。转染前1h换液，待转。

(2)本实验采用质粒∶转染试剂(FuGENE HD Transfection Reagent，Roche)＝2∶4(质量∶体积)的比率进行转染。12孔板每孔添加4μL的转染试剂与1μg的质粒载体，使用无血清的DMEM培养液添加至50μL，吹打混匀。将混合液加入待转细胞中，12孔板每孔50μL，震荡混匀，静置于培养箱中培养。本实验分为3组：质粒pIRES2-N转染组、质粒pIRES2-PN转染组及阴性对照组(PBS、转染试剂混合液)，每组3个重复。

(3)细胞转然后48h观察荧光(图11)，质粒pIRES2-N转染组出现弱荧光，质粒pIRES2-PN转染组未出现荧光，说明pIRES2-PN质粒并不能在牛成纤维细胞中表达，即该载体的表达具有特异性。

4.3重组质粒pIRES2-PN转染牛成纤维细胞单克隆基因组PCR检测

4.3.1重组质粒pIRES2-PN转染牛成纤维细胞筛选

重组质粒pIRES2-PN转染牛成纤维细胞48h后通过胰酶消化收集细胞，接种于60cm皿中，12h后进行第一次换液，用含有600μg/mL的G418、添加了10％的胎牛血清的高糖DMEM培养基进行培养，以后2d换液1次，9d后将G418浓度降低至300μg/ml继续培养，直至出现具G418抗性的成纤维细胞克隆。

4.3.2重组质粒pIRES2-PN转染牛成纤维细胞单克隆PCR

(1)重组质粒pIRES2-PN转染牛成纤维细胞单克隆基因组提取

挑取具G418抗性的成纤维细胞单克隆，提取细胞基因组。

(2)引物

(3)PCR反应

以重组质粒pIRES2-PN转染牛成纤维细胞单克隆基因组为模板，按照TaKaRa公司TaKaRa TaqTM使用说明书进行Nramp1开放阅读框的扩增。反应程序如下：94℃4min；94℃30s，62.8℃30s，72℃2min 45s，30个循环；72℃10min；4℃10min。1％琼脂糖凝胶电泳检PCR产物(图12)，在2250bp与1500bp Marker之间出现特异性条带，与预期大小一致，说明质粒pIRES2-PN已经整合进牛成纤维细胞单克隆中。

应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims

1.牛Nramp1巨噬细胞特异性表达载体构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

A1：血液基因组提取：

F：5’-CCATTAATCCCTCTACCCCTGCCTCTCC-3’

R：5’-CCTCTCGAGGCGGTGGCGATTGTGC-3’；

下划线序列为酶切位点；A22：PCR反应：以荷斯坦奶牛外周血基因组为模板，按照TaKaRa公司TaKaRa TaqTM使用说明书进行PCR反应，反应程序如下：94℃3min；94℃30s，60.8℃30s，72℃2min 20s，30个循环；72℃10min；4℃10min；用1％琼脂糖凝胶电泳分离待回收的PCR产物，切胶回收；回收产物与pMD18-T simple载体连接，转化DH5α感受态细菌进行蓝白斑筛选；挑取阳性菌落，提取质粒后用Vsp I及XhoI进行双酶切鉴定；酶切正确的质粒送样测序序列正确者命名为pMD18-P；

A3：吞噬细胞特异性表达载体pIRES2-P的构建与鉴定：

A4：牛Nramp1吞噬细胞特异性表达载体pIRES2-PN的构建与鉴定

pIRES2-P与pMD18-N4载体分别用BamH I和Sal I进行双酶切，胶回收获得的目的基因片段与相应载体片段用T4DNA连接酶16℃连接过夜，连接产物转化DH5α感受态细菌，选取阳性菌落增菌获得的重组质粒进行酶切鉴定，命名为pIRES2-PN。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所属步骤A1具体操作如下：

(2)加入200uL无水乙醇，充分振荡15s，瞬时离心；

(9)重复步骤8；

3.根据权利要求1或2所述的构建方法获得的重组载体pIRES2-PN。

4.根据权利要求3所述的重组载体在转基因抗病动物培育中的应用。