CN103027953A - 一种含有番石榴二醛总杂源萜的提取物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种含有番石榴二醛总杂源萜的提取物及其制备方法和应用，包括以下步骤：（1）将番石榴叶除杂，剪碎，用乙醇回流提取1~4次；合并提取液，滤过，减压浓缩，制得番石榴叶浓缩液；（2）将浓缩液通过大孔吸附树脂层析柱，先用水洗脱；接着用体积浓度5~20%的低浓度乙醇洗脱；最后再用体积浓度40~100%的高浓度乙醇洗脱，收集高浓度乙醇洗脱液；（3）将收集的洗脱液经减压浓缩，干燥，即得含有番石榴二醛总杂源萜的提取物。本方法制备工艺简单，提取物含量可以达到30~80%，与直接用有机溶剂萃取相比较，收率和含量更高，也更加经济环保，可用于制备预防和治疗Ⅱ型糖尿病、抗肿瘤、抗病原微生物的药物和保健品。

Description

一种含有番石榴二醛总杂源萜的提取物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种用天然植物番石榴叶制备的含有番石榴二醛总杂源萜的提取物，和制备方法及其在医药、保健品方面的应用。

背景技术

番石榴(Psidium guajava L)俗称拔子、鸡矢果、芭乐、红心果、喇叭果等，为桃金娘科番石榴属植物，是常绿小乔木或灌木，原产热带美洲和东南亚，现广泛分布和种植于热带、亚热带地区。

Junyaprasert等发现番石榴叶提取物对Caco-2细胞上P糖蛋白介导的若丹明123（Rho-123）外流的抑制作用明显（Junyaprasert VB，et a1.Inhibitory effectof Thai plant extracts on P-glycprotein mediated efflux[J].Phytother Res，2006，20(1):79-8l）；Manosroi等研究17种药用植物对表皮癌细胞及鼠白血病细胞增殖的影响，发现番石榴叶挥发油成分对表皮癌细胞抗增活性最高，是长春碱的4.37倍(Manosroi J，et a1.Anti-proliferative activity of essential oil extracted fromThai medicinal plants on KB and P388 cell lines[J].Cancer Lett，2006，235(1):114-120)。Seo等的研究认为番石榴叶提取物抗肿瘤细胞的机制在于抑制了T调节细胞，并增强了Th1细胞的作用(Seo N，et a1.Anti-allergic Psidiumguajava extracts exert an antitumor effect by inhibition of Tregulatory cells andresultant augmentation of Th1 cells[J].Anticancer Res，2005，25(6A):3763-3770)。

Arima等证实番石榴叶提取物对肠炎沙门氏菌和蜡样芽胞杆菌有良好的抑制作用（Arima H，etal.Isolation of antimicrobial compounds from guava(Psidium guajava L.)and their structural elucidation[J].Biosci Biotech Bioch，2002，66(8):1727-1730）；程天印等通过琼脂平板抑菌实验表明番石榴叶提取物对大肠杆菌、痢疾杆菌、沙门氏杆菌、巴氏杆菌、嗜水气单胞、金葡萄球菌均有抑制作用(程天印等．番石榴叶止泻机制的初步研究[J].畜牧与兽医，2005；37(2)：13-15)。轮状病毒和诺瓦克样病毒是引起非细菌性腹泻的两个重要的病原体，张学森等进行番石榴叶和思密达对诺瓦克样病毒腹泻治疗的随机对照研究，表明番石榴叶组疗效明显优于思密达组，其具体的作用机制却不甚明了，推测可能与干预了病毒和受体的结合并抑制病毒的复制，调节机体免疫功能等有关（张学森，等．番石榴叶治疗小儿诺瓦克样病毒性腹泻的临床观察[J].成都中医药大学学报，2006；29(3)：20-2l）。陈国宝等通过复制轮状病毒(HRV)感染动物小鼠模型，比较番石榴叶与病毒唑的治疗作用，研究表明番石榴叶可以促进小肠对Na⁺和糖的吸收，促进小肠分泌SIgA，对小肠粘膜具有保护作用，能直接抑制病毒的复制（陈国宝，等．番石榴叶体内抗轮状病毒的实验研究[J].新中医，2003；35(12)：65-67）。

糖尿病的发病率逐年递增，已成为继心脑血管疾病、癌症之后严重威胁人类健康的第三大疾病。番石榴叶降糖机制主要有：保护胰岛功能、提高胰岛素的敏感性、抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶作用、促进肝糖元合成等。中国专利CN201110089195.8介绍了“具有降血糖作用的番石榴叶提取物及其制备方法”，该专利仅涉及从番石榴叶中获得的总三萜化合物，以其作为活性成分用于Ⅱ型糖尿病的防治。中国专利CN101899171A介绍了一种使用大孔吸附树脂结合有机溶剂反复萃取获得番石榴叶多糖的精制方法。中国专利CN101703577B介绍一种传统水提醇沉法建立番石榴叶提取物的制备方法。中国专利CN200610041855.4介绍了“番石榴叶的黄酮类化合物制取方法”，但该专利仅涉及番石榴叶总黄酮的制取方法，以及总黄酮治疗Ⅱ型糖尿病与有关并发症的作用。中国专利ZL018066328.4介绍了“α-淀粉酶活性抑制剂”，该专利仅涉及一种从番石榴叶中获得含有多酚类物质作为活性成分的α-淀粉酶活性抑制剂用于Ⅱ型糖尿病的治疗。

以上研究表明番石榴叶具有抗肿瘤、抗病原微生物、降血糖的药理学作用，但均未涉及到番石榴叶中番石榴二醛总杂源萜类化合物的制备方法及其用途，该内容尚未见文献报道。

发明内容

本发明的首要目的在于提供一种含有番石榴二醛总杂源萜的提取物的制备方法。

本发明的目的之二在于提供上述方法制备的含有番石榴二醛总杂源萜的提取物。

本发明的目的之三在于提供上述化合物在预防和治疗Ⅱ型糖尿病、抗肿瘤、抗病原微生物方面的应用。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

一种含有番石榴二醛总杂源萜的提取物的制备方法，包括以下步骤：

（1）将番石榴叶除杂，剪碎，用体积浓度50~100%的乙醇回流提取1~4次，每次1~3h；合并提取液，滤过，减压浓缩至无醇味，制得番石榴叶浓缩液；

（2）将步骤（1）中制备的番石榴叶浓缩液通过大孔吸附树脂层析柱，先用水洗脱，弃去水洗脱液；接着用体积浓度5~20%的低浓度乙醇洗脱，弃去低浓度乙醇洗脱液；最后再用体积浓度40~100%的高浓度乙醇洗脱，收集高浓度乙醇洗脱液；

（3）将所得的高浓度乙醇洗脱液在30~80℃经减压浓缩，再经减压干燥或冷冻干燥，即得含有番石榴二醛总杂源萜的提取物。

优选地，步骤（1）中乙醇的体积为5~20ml/g番石榴叶。

优选地，步骤（1）中回流用体积浓度70%的乙醇。

优选地，步骤（2）中所述低浓度乙醇的体积浓度为10~20%。

优选地，步骤（2）中所述高浓度乙醇的体积浓度为90~100%。

优选地，步骤（2）中所述大孔吸附树脂是非极性、弱极性、中极性树脂。

上述方法制备的含有番石榴二醛总杂源萜的提取物，该提取物主要含有多种活性成分的总杂源萜类（番石榴二醛骨架结构），其主要成分包括PsidialA、PsidialB、PsidialC、PsiguadialsA、PsiguadialsB、Guajadial、Diguajadial，结构式如下：

上述提取物具有防治Ⅱ型糖尿病以及抗肿瘤、抗病原微生物的作用，用于制备防治Ⅱ型糖尿病、抗肿瘤、抗病原微生物的药物、保健品或健康产品。

本发明与现有技术相比，具有如下优点：

（1）利用本发明方法可以得到番石榴二醛总杂源萜含量为30~80%的提取物，与直接用有机溶剂萃取相比较，收率和含量更高，也更加经济环保。

（2）本方法制备工艺简单，易于大规模生产。

（3）本发明获取的番石榴叶提取物有效部位可用于制备预防和治疗Ⅱ型糖尿病、抗肿瘤、抗病原微生物的药物和保健品。

附图说明

图1为总杂源萜成分Guajadial、Psidial A、Psiguadials A的UV图；

图2为不同洗脱物溶液的紫外扫描图谱；

图3为石油醚萃取物紫外扫描图。

具体实施方式

实施例1

取剪碎后的干燥番石榴叶500g，用体积浓度50%的乙醇5000ml加热回流提取2次，每次提取1h，合并两次提取液，减压浓缩，回收乙醇至无醇味，得到的浓缩液通过填充有AB-8的弱极性大孔吸附树脂柱，先用水洗脱糖类等杂质，再用5%乙醇洗脱其他杂质；之后再用70%乙醇洗脱，收集该段乙醇洗脱液，并在65℃经减压浓缩，减压干燥或冷冻干燥，采用紫外分光光度法对进行含量测定，得到番石榴二醛总杂源萜含量为32.3%的提取物（测定方法详见“番石榴二醛总杂源萜的含量测定”）。

实施例2

取剪碎后的干燥番石榴叶500g，用体积浓度60%的乙醇5000ml加热回流提取2次，每次提取1h，合并两次提取液，减压回收乙醇至无醇味，得到的浓缩液通过填充有HPD450中极性大孔吸附树脂柱，先用水洗脱糖类等杂质，再用10%乙醇洗脱其他杂质；之后再用90%乙醇洗脱，收集该段乙醇洗脱液，并在65℃经减压浓缩，减压干燥或冷冻干燥，采用紫外分光光度法对进行含量测定，得到番石榴二醛总杂源萜含量为42%的提取物。

实施例3

取剪碎后的干燥番石榴叶500g，用体积浓度70%的乙醇5000ml加热回流提取2次，每次提取1h，合并两次提取液，减压回收乙醇至无醇味，得到的浓缩液通过填充有HPD100非极性大孔吸附树脂柱，先用水洗脱糖类等杂质，再用15%乙醇洗脱其他杂质；然后再用95%乙醇洗脱，收集该段乙醇洗脱液，并在65℃经减压浓缩，减压干燥或冷冻干燥，采用紫外分光光度法对进行含量测定，得到番石榴二醛总杂源萜含量为61%的提取物。

实施例4

取剪碎后的干燥番石榴叶500g，用体积浓度70%的乙醇5000ml加热回流提取3次，每次提取1h，合并两次提取液，减压回收乙醇至无醇味，即得上柱液。将上柱液通过填充有D101非极性大孔吸附树脂柱，先用水洗脱糖类等杂质，再用20%乙醇洗脱其他杂质；然后再用95%乙醇洗脱，收集该段乙醇洗脱液，并在65℃经减压浓缩，减压干燥或冷冻干燥，得到提取物。采用紫外分光光度法对其所含番石榴叶总二醛杂源萜含量进行测定，测定结果为78%。

实施例5

番石榴二醛总杂源萜提取物胶囊剂的制备：把本发明制得的提取物100g和微粉硅胶200g充分混匀，过筛，加入适量的硬脂酸镁，混匀，装入胶囊，每粒装0.3g。

实施例6

番石榴二醛总杂源萜类提取物片剂的制备：把本发明制得的提取物95g和微粉硅胶15g、微晶纤维素60g混合混匀，加入5%PVP溶液20ml，混合，过20目筛制粒，干燥，加入硬脂酸镁1.5g，压制成500片。

实施例7

番石榴二醛总杂源萜类提取物滴丸的制备：把本发明制得的提取物120-140g加100g无水乙醇溶解后过滤，滤液浓缩至相对密度为1.25（75℃）的膏状物，自然冷却，加4倍于膏状物质量的无水乙醇，搅匀，静置24小时，过滤，滤液浓缩至稠膏状，减压干燥后粉碎，粉末过100目筛备用。取400g聚乙二醇-6000，加热至80℃，使其熔融，加入上述过筛备用的浸膏粉末120g，混合均匀后，在70℃保温条件下，滴入8℃的液体石蜡，滴速为30滴/分钟，滴距为4cm，滴制成滴丸。

番石榴二醛总杂源萜的含量测定

由于番石榴叶中的总杂源萜类化合物在紫外光区279nm处有特征吸收（见图1），因此可以用紫外分光光度法测定本发明方法所得的总杂源萜类的含量。

1.标准品的制备和标准曲线的绘制

取对准品Psiguadials A适量，精密称定，置于10ml量瓶中，用氯仿稀释并定容至刻度，制得浓度为22.7μg/ml的对准品储备液。分别吸取上述对准品储备液0.4、0.6、1.0、1.5、2.5ml置于5ml量瓶中，用氯仿稀释并定容至刻度，制得系列浓度的对照品溶液，在279nm下测其吸光度A，结果如表1所示（n=3）。以Psiguadials A的浓度（μg/ml）为横坐标x，吸光度A为纵坐标y，绘制标准曲线，得回归方程：y=0.0688x-0.016，r=0.9995。

表1不同浓度PsiguadialsA标准品的紫外分光光度法测定结果（n=3）

2.不同浓度乙醇洗脱物中总杂源萜的比较

（1）上柱溶液的准备

取除杂、剪碎的干燥番石榴叶40g，用体积浓度70%的乙醇400ml回流提取，减压回收乙醇至无醇味，即得上柱液。

（2）大孔吸附树脂分离

将上述制备好的上柱液加入已经预处理好的D101大孔吸附树脂柱。先用2-4BV水洗脱杂质，再用20%、40%、70%和95%的乙醇洗脱，收集不同浓度乙醇洗脱液，水浴减压浓缩，减压干燥或冷冻干燥，得番石榴叶不同浓度乙醇洗脱物。不同浓度乙醇洗脱物溶液的紫外扫描图谱如图2所示。由图2可见，水洗脱部位中在279nm处无特征吸收峰，表明水洗脱部位中不含有或含有极少的总杂源萜成分，此时，总杂源萜成分很好地吸附在树脂柱上；20%乙醇洗脱部位与水洗脱部位在200-260nm处有相似的紫外吸收，表明该部位含有一些与水洗脱部位相同的杂质成分，在279nm处虽有吸收峰出现，但含量测定结果显示此部位总杂源萜含量很低，40%、70%、95%乙醇洗脱部位在279nm处有特征吸收峰，表明这些部位以总杂源萜类成分为主，总杂源萜类成分得到了富集。

不同乙醇浓度洗脱部位所含番石榴二醛总杂源萜的含量测定结果见表2。由表2可知，番石榴二醛总杂源萜的含量与洗脱时所用乙醇的浓度密切相关，当乙醇浓度为95%时，洗脱力度最强，总杂源萜成分以Psiguadials A计（分子式C₃₀H₃₄O₅）含量最高。

表2不同乙醇浓度洗脱部位所含番石榴二醛总杂源萜的含量测定

3.大孔吸附树脂法与石油醚萃取法的对比实验

3.1石油醚萃取法

取剪碎后的干燥番石榴叶40g，用体积浓度为70%的乙醇400ml回流提取，减压回收乙醇至无醇味，再用石油醚萃取至石油醚层几乎无色，回收石油醚，水浴蒸干后，得到石油醚萃取物288.5mg。收率为0.72%。取石油醚萃取物，配成适宜浓度（2-11μg/ml，即在标准曲线范围内），在279nm下测定该样品中总杂源萜类的量（紫外扫描见图3），总杂源萜类成分以Psiguadials A计（分子式C₃₀H₃₄O₅）含量为27.4%。

3.2大孔吸附树脂法

取剪碎后的干燥番石榴叶40g，用体积浓度为70%的乙醇400ml回流提取，减压回收乙醇至无醇味，即得上柱液。将制备好的上柱液加入已经预处理好的D101树脂的层析柱。先用2-4BV水洗脱杂质，接着用20%乙醇继续洗脱杂质，再用95%乙醇洗脱，收集95%乙醇洗脱液，水浴减压浓缩，减压干燥或冷冻干燥，得到番石榴叶95%乙醇洗脱物重301.8mg，收率为0.75%。取95%乙醇洗脱物，配成适宜浓度（2-11μg/ml，即在标准曲线范围内），在279nm下测定该样品中总杂源萜的量，总杂源萜类成分以Psiguadials A计（分子式C₃₀H₃₄O₅）含量为68.7%。

可见用大孔吸附树脂法分离制备番石榴二醛总杂源萜成分的收率和含量均高于石油醚萃取方法。

药效学实施例1

1.本发明含番石榴二醛总杂源萜的提取物对Ⅱ型糖尿病小鼠的作用

（1）实验动物与试剂：小鼠100只，2月龄，体重19g～22g，购于南方医科大学实验动物中心；尿链佐菌素（STZ），临用时用pH4.5的柠檬酸钠-柠檬酸缓冲溶液稀释；盐酸二甲双胍购自Sigma公司；胰岛素放免分析试剂盒购于上海生物制品研究所；邻甲苯胺、柠檬酸、柠檬酸钠、葡萄糖均购自广州精科化玻仪器公司；

（2）采用高糖高脂（含37%蔗糖、10%猪油和53%基础饲料）结合STZ诱导Ⅱ型糖尿病小鼠的造模方法：小鼠100只，随机选取15只作为正常对照组，给以基础饲料，其余85只给以高热量饮食，并腹腔注射STZ（80mg/kg体质量），72h后相同剂量加强1次。注射一周后，内眦静脉丛取血约2ml，离心（3000r/min）10min，留取血清用邻甲苯胺法进行血糖测定，选择血糖浓度在14.0mmol/L-27.0mmol/L的小鼠作为糖尿病模型。

（3）动物分组及处理：将造模成功的75只糖尿病小鼠(筛选后，余者弃掉)随机分为5组：模型对照组、二甲双胍对照组、本发明提取物小剂量组、中剂量组、大剂量组，15只/组。正常对照组和模型对照组用生理盐水灌胃；二甲双胍对照组用盐酸二甲双胍悬液灌胃，剂量5mg/kg；按本发明实施例4所述方法制备提取物，并分为小、中、大3个剂量组，剂量分别为5、10、25mg/kg，治疗周期为10周。

（4）指标测定：治疗期满，各组小鼠禁食12h后乙醚麻醉，内眦静脉采血5mL，于4℃、3500r/min离心20min，邻甲苯胺法测定血糖。空腹血糖(FPG)用氧化酶法检测，空腹血清胰岛素(FINS)采用双抗体放射免疫法检测。ISI计算公式：空腹血清胰岛素与空腹血糖乘积的倒数，因数据为非正态分布，故进行对数转换。

（5）统计学分析：数据由SPSS11.0软件处理，所有结果均以

表示；组间比较用配对t检验。

2.结果

含番石榴二醛总杂源萜的提取物对Ⅱ型糖尿病小鼠FBG/F INS/ISI的影响（见表3）：与正常对照组比较，模型组FBG升高（p﹤0.01），血清FINS水平升高（p﹤0.01），ISI降低(p<0.01);与模型组比较，本发明提取物作用的各组小鼠FBG水平降低(p<0.05～0.01)，血清FINS水平下降(p<0.01)，ISI升高(p<0.01)，其中中剂量组数值有优于其他组的趋势，但三组比较无统计学意义(p>0.05)，各番石榴叶组指标与二甲双胍对照组比较无统计学意义(p>0.05)。

表3不同剂量的番石榴叶提取物对小鼠FBG、FINS、ISI的影响(

n=15)

注：与正常对照组比较^*p<0.01；与模型组比较^△p<0.05，^**p<0.01

药效学实施例2

1.含番石榴二醛总杂源萜的提取物体外抗肿瘤实验研究

（1）细胞株的准备和主要试剂：人肺癌细胞株（A549）、人结肠癌细胞株（HCT-116）、人肝癌细胞（HepG2）均由广东省医学实验动物中心细胞库提供。RPMI1640培养液（Gibco公司），胎牛血清(FCS，广州蕊特生物科技有限公司)，CO₂培养箱（德国Labotect公司，型号C200），酶联免疫仪（广州市深华生物技术有限公司，型号WM1000）、胰蛋白酶购于Sigma。

（2）样品处理：取本发明实施例4方法制备的番石榴二醛总杂源萜提取物1g，加2ml无水乙醇溶解，再用8％甘油配成生药浓度为100mg/ml，漏斗抽滤、除菌，置冰箱备用。实验有3个剂量组(生药剂量分别为100mg/ml，10mg/m1，1mg/m1)，和空白对照组(8％甘油+含相同细胞密度的培养液)。

(3)细胞培养:A549、HCT-116、HepG2细胞株培养于含有青霉素钠(100μg/m1)及20％FCS(60℃下灭活40min)的RPMI1640培养液（缓冲液调pH至7.1），在37℃饱和湿度、5%CO₂条件下的细胞培养箱中培养，每3-4天传代一次。胰蛋白酶消化对数生长期的贴壁细胞，将细胞分别接种于96孔板，与不同剂量受试物在37℃饱和湿度、5％CO₂条件下，培养24h。各设4个复孔。

(4）细胞存活量测定：细胞培养24h后，弃去96孔培养板内未贴壁细胞，每孔加0.2％结晶紫染液50μl，15min后弃去染液，流水轻冲多余染液，晾干后加50％乙醇裂解液裂解细胞，在酶标仪主波长为570nm，参比波长为600nm处测其OD值，比色以无细胞孔做空白调零，抑制率=（1-实验组4孔OD值平均值/对照组4孔OD值平均值）×100%）。

（5）统计处理：实验数据以

表示，采用SPSS13.0统计软件进行统计学处理。

2.结果

含番石榴二醛总杂源萜的提取物对各类型肿瘤细胞存活量的影响见表4：

表4不同剂量总杂源萜类提取物对肿瘤细胞的抑制情况(n=4)

不同剂量的提取物对肿瘤细胞生长具有一定的抑制作用，其中，中剂量和高剂量组肿瘤细胞生长具有较好的抑制作用，表明含番石榴二醛总杂源萜的提取物有较好的抗肿瘤效果。

药效学实施例3

1.含番石榴二醛总杂源萜的提取物体外抑制病原微生物的实验研究

(1)供试菌种和培养基来源：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、肺炎链球菌、牛肉膏蛋白胨固体培养基、牛肉膏蛋白胨液体培养基由广州微生物研究所提供；肉汤培养基（按常规方法自制）。

(2)菌液及含番石榴二醛总杂源萜的提取物药液的制备：将上述实验菌种用牛肉膏蛋白胨固体培养基斜面培养48h活化，接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中震荡培养15h制成菌液备用；将按照实施例4方法所制备的番石榴二醛总杂源萜的提取物0.1g，加1ml无水乙醇溶解，加无菌水配成10mg/m1的溶液，经高压灭菌后4℃冰箱保存。

(3)采用滤纸片扩散法测定抗菌作用：用打孔器将定性滤纸打成直径为8mm的圆形纸片，置于培养皿中，于120℃湿热灭菌20min，取出在烘箱中40℃烘干备用。然后将烘干后的无菌滤纸浸入10mg/m1含番石榴二醛总杂源萜的提取物药液中，10min后取出置无菌小瓶内，并在37℃烘箱中烘干3~4h后存冰箱备用。将牛肉膏蛋白胨固体培养基溶化制备成平板，待凝固后，将各种实验菌悬浊液各取0.5mL于培养皿中，均匀涂布，制成含菌平板，每种实验菌做2皿。用无菌镊子夹取含总杂源萜的滤纸片，贴在含菌平板上，每皿贴3片，同时贴1片不含总杂源萜的无菌滤纸片作空白对照。最后置于培养箱中，37℃恒温培养24h，测定滤纸片的抑菌直径，求出算术平均值，比较总杂源萜对各种致病菌的抗菌效果，结果见表5。

表5番石榴二醛总杂源萜（10mg/ml）对不同致病菌的抑菌圈直径比较

(4)最小抑菌浓度（MIC）的测定：将含番石榴二醛总杂源萜的提取液原液(10mg/mL)逐步降低浓度，和等量的双倍浓度的营养肉汤相混合，含番石榴二醛总杂源萜提取液的浓度为1:2，1:4，1:8，1:16，1:32等5个浓度，即含番石榴叶提取液浓度分别为5，2.5，1.25，0.625，0.3125mg/mL。每个浓度设3个平行管，并分别设不含番石榴二醛总杂源萜提取液的肉汤培养基为对照管。然后用0.1mL浓度为10⁶cfu/mL实验菌(金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、肺炎链球菌)接种各试管中，置35℃培养箱培养24h，再将每一浓度用接种环取一环划线接种于3等分的固体营养琼脂平板上，每个浓度做两个平行样品，于35℃、24～48h培养观察结果，以抑制细菌生长的最低浓度为MIC，结果见表6。对照组中未加番石榴叶提取液，有菌生长。

表6含番石榴二醛总杂源萜的提取物对4种不同致病菌的MIC测定结果

2.结果

由表5和表6可见，滤纸片扩散法的实验结果与最低抑菌浓度法测定结果基本一致，含番石榴二醛总杂源萜的提取物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、肺炎链球菌均有一定程度的抑制作用，其中对金黄色葡萄球菌的抑制作用最强。

本发明的实施方式不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种含有番石榴二醛总杂源萜的提取物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）将番石榴叶除杂，剪碎，用体积浓度50~100%的乙醇回流提取1~4次，每次1~3h；合并提取液，滤过，减压浓缩至无醇味，制得番石榴叶浓缩液；

（2）将步骤（1）中制备的番石榴叶浓缩液通过大孔吸附树脂层析柱，先用水洗脱，弃去水洗脱液；接着用体积浓度5~20%的低浓度乙醇洗脱，弃去低浓度乙醇洗脱液；最后再用体积浓度40~100%的高浓度乙醇洗脱，收集高浓度乙醇洗脱液；

（3）将所得的高浓度乙醇洗脱液在30~80℃经减压浓缩，再经减压干燥或冷冻干燥，即得含有番石榴二醛总杂源萜的提取物。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中乙醇的体积为5~20ml/g番石榴叶。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中回流用体积浓度70%的乙醇。

4.根据权利要求1或2或3所述的方法，其特征在于，步骤（2）中所述低浓度乙醇的体积浓度为10~20%。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤（2）中所述高浓度乙醇的体积浓度为90~100%。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤（2）中所述大孔吸附树脂是非极性、弱极性、中极性树脂。

7.权利要求1~6任意一项方法制备的含有番石榴二醛总杂源萜的提取物。

8.根据权利要求7所述的提取物，其特征在于，该提取物包括PsidialA、PsidialB、PsidialC、PsiguadialsA、PsiguadialsB、Guajadial和Diguajadial。

9.权利要求7或8所述含有番石榴二醛总杂源萜的提取物的应用，其特征在于，该提取物具有防治Ⅱ型糖尿病以及抗肿瘤、抗病原微生物的作用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，该提取物用于制备防治Ⅱ型糖尿病、抗肿瘤、抗病原微生物的药物、保健品或健康产品。

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