CN101085795A - 金银花提取物,其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及从中药金银花(Lonicera japonica Thunb.)或其基源植物忍冬或同属其他植物中制备植物提取物的方法，以及由该方法制备的金银花提取物，和含有该提取物的药物组合物，所述组合物的有效成分为开联番木鳖苷酸及其衍生物类化合物。该方法包括水或醇提取，提取物经沉淀和色谱方法精制，如果需要还可用凝胶柱色谱进一步纯化，得到的提取物中开联番木鳖苷酸及其衍生物的含量在50％以上，优选70％以上。用本发明的制备方法得到的金银花提取物具有解热、镇痛、消炎、抗菌和抗病毒的活性，可用于治疗高热症、疼痛和感染性疾病，尤其是病毒性肺炎、病毒性感冒和艾滋病等疾病。
Description
技术领域
本发明属于天然药物技术领域，具体地，本发明涉及从中药金银花或其基源植物忍冬或同属植物中提取、精制得到的植物提取物及其提取方法，以及含有该提取物的药物组合物。用本发明方法得到的提取物主要含有开联番木鳖苷酸(裂环马钱子苷酸，secologanic acid)及其衍生物，即环烯醚萜苷类化合物，或称为总环烯醚萜苷。所述的植物提取物具有解热、镇痛、抗炎、抗菌和抗病毒作用，该提取物和含有该提取物的药物组合物可用于制备治疗高热症、疼痛、感染性疾病，特别是用于治疗病毒性肺炎、病毒性感冒和艾滋病等疾病的药物和保健品。并且，所述的开联番木鳖苷酸及其衍生物还可作为中药金银花的质量控制指标。
背景技术
金银花首载于梁·陶弘景《名医别录》，名忍冬。《中国药典》(1963年版)将忍冬作为金银花首载于梁·陶弘景《名医别录》，名忍冬。《中国药典》(1963年版)将忍冬作为金银花的唯一来源，1977年后各版《中国药典》根据临床疗效、地区习惯用药等综合考虑，选定忍冬科的4种植物忍冬Lonicera japonica Thunb.、红腺忍冬Lonicera hypoglauca Miq.、山银花Lonicera confusa DC.或毛花柱忍冬Lonicera dasystyla Rehd.的干燥花蕾或带初开的花为金银花。其中正品为忍冬的干燥花蕾，我国大部分地区均产，以山东产量最大，河南产的质量较佳。事实上，全国各地所用者远不止于此。全世界忍冬属植物约200种，我国有98种，广布于全国各省区，而以西南部种类最多，其中可供药用的品种达47种。由于金银花的药用品种相对混乱，因此为了保证其质量和药效的稳定性，2005版《中国药典》规定金银花为忍冬科的植物忍冬Lonicera japonica Thunb.的干燥花蕾或带初开的花；同时，将红腺忍冬Lonicera hypoglauca Miq.、山银花Lonicera confusa DC.和毛花柱忍冬Lonicera dasystyla Rehd.的干燥花蕾或带初开的花为金银花单独列为“山银花”(参见国家药典委员会编，《中华人民共和国药典》一部，2000年版，北京，化学工业出版社，p.177；和国家药典委员会编，《中华人民共和国药典》一部，2005年版，北京，化学工业出版社，pp.152～153)。金银花和山银花具有清热解毒，凉散风热等功效。用于痈肿疔疮，喉痹，丹毒，热毒血痢，风热感冒，温病发热。临床上用于治疗风热犯肺，上呼吸道感染所致发热、咽痛等症。近年来，以金银花原料相继开发了许多单方和复方制剂。尽管金银花具有较好的临床疗效，但其有效成分及现行的质量控制指标仍然有必要进行深入研究和探讨。
化学成分研究表明金银花中含有有机酸类、三萜皂苷类、黄酮及其苷类、环烯醚萜苷类、挥发油等。实验研究表明金银花的药理活性多种多样，主要有抑菌、抗病毒、解热、抗炎、保肝、止血、抗氧化、免疫调节等作用。虽然从金银花中已经分离得到并鉴定了多种成分，但目前认为金银花中主要有效成分为绿原酸类化合物；此外，还有挥发性成分芳樟醇等。因此，通常以绿原酸的含量高低来评价金银花质量的优劣，金银花的提取、精制工艺多以绿原酸类化合物为考察指标，少部分以挥发性成分为考察指标。绿原酸虽具有解热和广谱的抗菌、抗病毒作用，但其并非是金银花中唯一解热、抑菌和抗病毒成分，且绿原酸在体内能被蛋白质灭活，其抗菌和抗病毒作用并不强。因此，对金银花解热、镇痛、消炎、抗菌、抗病毒的有效成分和作用机理尚不完全清楚。有关金银花资源和其中成分的研究可参见上海医药工业研究院中药分析室，上海中药制药一厂，金银花有效成分的初步研究，医药工业，1975，7，24；石钺，石任兵和陆蕴如，我国药用金银花资源、化学成分及药理研究进展，中国药学杂志，1999，34(11)，724-727；娄红祥等人，金银花中水溶性化合物的分离与结构确定，中草药，1996，27(4)，195-197；Son KunHo等人，Triterpenoid saponins from the aerial parts of Lonicera japonica，Phytochemistry，1994，35(4)，1005-1008；Hideaki Kawai等人，Studies on thesaponins of Lonicera japonica Thunb，Chem.Pharm.Bull，1988，36(12)：4769-4773；中冲太七郎，金银花の成分に就いて，药学杂志，1949，69，320；中冲太七郎，金银花の成分に就いて，药学杂志，1961，81，558；高玉敏等，金银花化学成分的研究，中草药，1995，26(11)：568；黄丽瑛等人，中药金银花化学成分的研究，中草药，1996，27(11)，645；和SonKun Ho等人，Flavonoids from the aerial parts of Lonicera japonica，Arch.Pharmacal Res.，1992，15(4)，365。以上文献引入本文作为参考。
本发明人研究发现金银花中具有解热、抗炎、抗菌、抗病毒作用的有效部位主要以环烯醚萜苷类化合物为主，尤其是以开联番木鳖苷酸为主(含量大于10％)，而其中绿原酸类化合物的总含量小于5％。在药理活性评价中，该有效部位和其中的主要化合物均表现出显著的解热、抗炎、抗菌和抗病毒作用。然而，现有金银花提取物的制备方法不但忽略了环烯醚萜苷类化合物，同时，以绿原酸类化合物为考察指标的质量控制标准也无法反映其中环烯醚萜苷类化合物的含量情况。
环烯醚萜类化合物普遍存在于植物界，文献报道金银花的基源植物忍冬Lonicera japonica Thunb.中含有以下结构的5个环烯醚萜类化合物，分别为：secologanin dimethylacetal[开联番木鳖苷二甲基缩醛]、loganin(番木鳖苷，或马钱子苷)、vogeloside、epi-vogeloside和开联番木鳖苷酸(或裂环马钱子苷酸，secologanic acid)，参见Kim Youngleem，KimYoungmi，Kim Jinwoong等人，Isolation of flavonoids from herbs ofLudwigia prostrate and flowers of Lonicera jiaponica.Soul TaehakkyoYakhak Nonmunjip，1997，22，43。
文献中已经报道了通过反复多次的正相和反相硅胶柱色谱分离纯化，从金银花及其基源植物忍冬或忍冬属其他植物中得到包括开联番木鳖苷酸和其他环烯醚萜衍生物类单体化合物的方法，例如可参见HideakiKawai，Masanori Kuroyanagi，Akira Ueno.Iridoid Glucosides from Lonicerajaponica Thunb，Chem.Pharm.Bull.，1988，36(9)，p3664；王国亮等，豫北平原栽培金银花精油化学成分分析，中国中药杂志，1992，17(5)，p268；张玲等，山东金银花鲜花挥发油的化学成分的研究，中国现代应用药学，1998，15(1)，p18；姚育法等，超临界CO2流体萃取金银花产物的化学成分研究，中药材，2000，23(9)，p545；王天志和李永梅，细毡毛忍冬花蕾挥发油成分研究，中药材，1999，22(11)，p574；郭艳文等，黄褐毛忍冬与金银花的比较研究，药物分析杂志，1990，10(1)，p2；Sim KylSoon等，sterols and sterol glycosides from Lonicerae flos.Soul TaehakkyoYakhak Nonmunjip，1997，4，p79；Kunitomo Junichi等，On the constituentsof Lonicerae Folium.Shoyakugaku Zasshi，1983，37(3)，p294；张重义和李萍，金银花药材的综合研究.现代中药研究与实践，2003，17(3)。p58-62；邢俊波等，金银花质量与生态系统的相关性研究，中医药学刊，2003，21(8)，p1237-1238；和林丹等，中药金银花药用成分的提取及抑菌实验研究，天然产物研究与开发，2003，15(5)，p 436-437。以上文献被引入本文作为参考。
但是，由于金银花及其基源植物忍冬或同属其他植物中环烯醚萜类化合物的极性较大水溶性很大，利用常规分离技术富集高含量环烯醚萜类(总含量大于50％)，尤其是高含量的开联番木鳖苷酸有较大难度；同时，由于开联番木鳖苷酸的结构特殊，鉴定存在相当难度，因此，到目前为止尚未有过由上述植物中提取适于药用的有效部位的报道，更没有文献报道从上述植物中得到开联番木鳖苷酸及其衍生物具有解热、镇痛、消炎、抗菌、抗病毒等作用，可用于治疗高热症、疼痛和感染性疾病，尤其是病毒性肺炎、病毒性感冒和艾滋病等疾病。另外，现有技术的有关报道中，开联番木鳖苷酸及其衍生物的制备也难以实现工业化生产。
本发明人经过深入的研究，发现了从金银花或其基源植物忍冬或同属其他植物中制备得到了具有解热、镇痛、消炎、抗菌和抗病毒作用的植物提取物，该植物提取物是适于药用的有效部位；并且，该提取物的制备方法适用于工业化生产。
发明内容
本发明的一个目的是提供了从金银花或其基源植物忍冬或同属其他植物制备得到具有解热、镇痛、消炎、抗菌和抗病毒作用的植物提取物的方法，以及由该方法获得的植物提取物，该提取物中的有效成分是以开联番木鳖苷酸(裂环马钱子苷酸，secologanic acid)为主要成分的环烯醚萜类化合物，以提取物的总重量计，该提取物中以开联番木鳖苷酸及其衍生物为主要成分的环烯醚萜类有效成分群的含量大于50％，优选大于70％，最优选70-98％；在所述的环烯醚萜类化合物中，以提取物的总重量计，开联番木鳖苷酸单一成分的含量大于25％，优选大于50％，最优选大于70％，特别优选70～95％。
本文中上述植物提取物被简称为“金银花提取物”。
本发明所述环烯醚萜类化合物或开联番木鳖苷酸及其衍生物包括如下结构式的化合物：
其中，
X1和X2各自独立地表示O、N或S，其中优选O；
R、R1或R2各自独立地表示氢、C1-6低级烷基或C2-6低级链烯基。
本文中所使用的术语“C1-6低级烷基”是指具有1-6和碳原子的，直链或支链的饱和烃基，例如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、正戊基、异戊基、正己基等。
本文中所使用的术语“C2-6低级链烯基”是指具有2-6个碳原子，以及具有一或二个不饱和双键的直链或支链烃基，例如乙烯基、丙烯基、异丁烯基、异戊烯基等。
优选的，上述R、R1或R2基团各自独立的是氢、甲基、乙基或异戊烯基。
最优选其中的式(1)化合物，特别是其中X1和X2为O，R为H的化合物，即开联番木鳖苷酸。
本发明还提供了从金银花或忍冬属植物原料中制备金银花提取物的方法，应用该制备方法得到的提取物中以开联番木鳖苷酸及其衍生物为主要成分的环烯醚萜类有效成分群，该有效成分群即是所述植物的有效部位。
本发明所述金银花提取物的制备方法包括以下步骤：
1、提取：
将植物金银花或其基源植物忍冬或同属其他植物粉碎，然后用水和/或C1-C6烷醇含量不大于95％的水溶液作为溶剂进行提取，得到提取液；
2、后处理：
(1)将提取液经常压或减压浓缩干燥得到浸膏，或经喷雾干燥得到粉末；
(2)将上一步骤得到的产物用溶剂溶解后，用极性相反的其他溶剂进行沉淀或沉降，用常规方法进行处理得到含有环烯醚萜类化合物的金银花提取物，为沉淀物或溶解液浓缩物；
3、色谱分离纯化：
将上述后处理得到的沉淀物或溶解液浓缩物，用色谱方法分离纯化，用洗脱溶剂洗脱，收集含有环烯醚萜类化合物的流份，得到含有环烯醚萜类化合物的金银花提取物。
其中，所述的色谱方法为大孔吸附树脂柱色谱、正相硅胶和/或反相硅胶色谱，或者它们的组合；
经过上述色谱方法纯化的金银花提取物中，开联番木鳖苷酸及其衍生物类化合物，即总环烯醚萜苷含量大于50％。
如果需要，可将上述方法得到的产物用凝胶色谱法进一步纯化，收集含有环烯醚萜类化合物的馏分，浓缩，干燥，得到含有环烯醚萜类化合物的植物提取物。其中所述的凝胶色谱的填料优选为Sephadex LH-20；以及洗脱所用的溶剂为选自乙醇、甲醇和水中的一种，或数种溶剂组合的混合溶剂。
具体的，本发明所述金银花提取物的制备方法包括以下步骤：
1、提取
将植物金银花或其基源植物忍冬或同属其他植物粉碎，然后用水和/或C1-C6烷醇含量不大于95％的水溶液作为溶剂在室温至加热回流的温度下提取，得到提取液；
其中，所述C1-C6烷醇选自甲醇、乙醇、异丙醇和正丁醇，或其中的二种或多种组成的混合溶剂，优选乙醇或甲醇，更优选乙醇；
2、后处理
(1)将上述提取液经常压或减压浓缩干燥得到浸膏，或经喷雾干燥得到粉末；
(2)将上一步骤得到的产物用溶剂溶解后，用极性相反的其他溶剂进行沉淀或沉降，过滤收集沉淀物直接干燥，或收集溶液后，再经浓缩和干燥，得到含有环烯醚萜类化合物的金银花提取物；
其中，所述用于溶解提取物的溶剂为水或选自甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、正丁醇和异丁醇的醇溶剂，或它们的组合，优选水、甲醇或乙醇，更优选水或乙醇；所述用于沉淀的极性相反的其它溶剂是水或醇溶剂，所述醇溶剂选自甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、正丁醇和异丁醇，或它们的组合，优选水、甲醇或乙醇，更优选水或乙醇；
3、色谱纯化
将经过后处理得到的产物用色谱方法分离纯化，用洗脱溶剂洗脱，收集含有环烯醚萜类化合物的馏分，浓缩，干燥，得到含有环烯醚萜类化合物的金银花提取物，其中所述的色谱方法为大孔吸附树脂柱色谱、正相硅胶或反相硅胶色谱，或者它们的组合；
经过此处理得到的提取物中环烯醚萜类化合物含量大于50％；
4、凝胶色谱纯化
将上述色谱精制得到的提取物用凝胶色谱纯化，用水或醇溶剂洗脱，收集含有环烯醚萜类化合物的馏分，浓缩，干燥，得到含有环烯醚萜类化合物的植物提取物，其中总环烯醚萜苷含量大于70％。
在上述步骤1中，特别是在工业化生产中，提取步骤所使用的乙醇可以是工业乙醇，工业乙醇中的乙醇含量通常是大约60％-95％。
在上述步骤2中，所用的处理方法是中药制药领域常规的沉淀法，例如使用水提醇沉，或使用醇提水沉，或分别使用不同浓度的醇溶剂进行提取和沉淀等，以达到提纯的目的。
在所述步骤3的色谱纯化中，所述的色谱法为大孔吸附树脂柱色谱、正相硅胶和反相硅胶柱色谱，或者它们的组合。其中所述的大孔吸附树脂可使用苯乙烯型大孔吸附树脂，例如HP-20、D101、SP-70、SP-700、SP-825、RH等型号的树脂；所述的正相硅胶色谱，其填料例如是硅胶；所述的反相硅胶色谱，其填料例如是C-18。在色谱方法中，优选使用大孔吸附树脂柱色谱的方法，该方法分离效果好，且成本低廉。
所述色谱法的洗脱溶剂为水；C1-C6烷醇，如：甲醇、乙醇、异丙醇或正丁醇等；卤代烃，如：二氯甲烷、氯仿等；醚类溶剂，如：乙醚、甲基叔丁醚等；酮类溶剂，如：丙酮、2-丁酮等；酯类溶剂，如：乙酸乙酯、甲酸乙酯等；以及由上述二种或多种溶剂组成的混合溶剂。其中，优选的洗脱溶剂为氯仿、乙酸乙酯、乙醇、甲醇和水以及其中的二种或数种混合的溶剂。在所述色谱方法中，当用苯乙烯型大孔吸附树脂柱进行分离纯化时，洗脱溶剂优选水和10-50％的乙醇或甲醇水溶液；当用反相硅胶色谱精制时，洗脱溶剂优选水和10-50％的乙醇或甲醇水溶液；当用正相硅胶精制时，洗脱溶剂为三氯甲烷或乙酸乙酯和90-100％乙醇水溶液或甲醇组成的混合溶剂，它们的比例为10∶1-1∶1。
本发明所述的色谱法也可以将经后处理步骤得到的产物混合于硅胶或硅藻土中，晾干后用洗脱溶剂逐步洗脱或回流洗脱的方法，所用的洗脱溶剂与使用硅胶或苯乙烯型大孔吸附树脂柱时类似。
经过色谱方法处理得到的提取物中环烯醚萜类化合物含量大于50％，开联番木鳖苷酸的含量通常可大于25％，优选大于50％。
关于步骤4的凝胶色谱纯化，其中所述的凝胶色谱填料优选为Sephadex LH-20；洗脱所用的溶剂为选自乙醇、甲醇和水中的一种，或其中数种组成的混合溶剂。
以提取物的总重量计，凝胶色谱处理后得到的金银花提取物中环烯醚萜类化合物的含量大于70％，优选大于90％，开联番木鳖苷酸的含量大于60％，优选大于70％。
如果希望所得到的提取物含有更高含量的环烯醚萜类化合物，可进行多次凝胶色谱处理。
实验证明，用以上提取和精制方法从金银花或忍冬属植物中制备提取物，采用大孔吸附树脂、反相硅胶或正相硅胶进行植物提取物精制，植物提取物的收率和有效成分群总环烯醚萜苷类化合物以及主要有效成分开联番木鳖苷酸的含量差别不十分显著。
从上述任一步骤得到的产物，包括提取物、浸膏、沉淀物等均可用作含有开联番木鳖苷酸及其衍生物的金银花提取物使用。
其中，开联番木鳖苷酸及其衍生物类化合物，即总环烯醚萜苷含量的测定方法是：以开联番木鳖苷酸或其衍生物或其他可替代的环烯醚萜苷类化合物为参照物质，按分光光度法比色测定；或，按反相HPLC(外标法、内标法或归一化法等)方法测定。
本发明的另一目的是提供了含有所述金银花提取物的药物组合物及其制备方法，该组合物含有治疗有效量的本发明的金银花提取物，以及任选的含有药用载体。其中所述的药用载体的药学领域常用的药用载体；所述组合物的制备方法是药学领域常规的药物制备方法。
本发明的药物组合物中还可以含有其它的植物提取物或其它的药物化合物，制成复合制剂。
本发明的另一目的是提供了由含有所述金银花提取物的药物组合物制备的各种药用制剂。
利用本发明方法得到的植物提取物可以与药物上可接受的载体一起制成各种药物制剂，其中所述的药物制剂可以是药学领域常用的剂型，例如注射剂或口服制剂，所述的注射剂例如是溶液、悬浮液、乳液或冻干粉针制剂等，所述的口服制剂例如是片剂、胶囊、口服液或滴丸等。利用本发明的金银花提取物制备所需各种剂型时，可以按照药学领域的常规生产方法制备。
与常规的中药制剂方法相比，应用本发明的金银花提取物制备各种制剂时，因其中的有效成分高，以及其含量可以得到有效地控制，因此可获得高效的、质量均一的药品，有利于中药制剂的标准化。
因此，本发明的另一目的是提供了本发明金银花提取物在制药和保健品领域中的应用，特别是本发明金银花提取物在制备用于解热、镇痛、消炎、抗菌和抗病毒的药物中的应用，本发明的金银花提取物可用于制备治疗高热症、疼痛、感染性疾病，特别是病毒性肺炎、病毒性感冒和艾滋病等疾病的药物和保健品。
在将本发明的金银花提取物或本发明的组合物用于治疗上述疾病时，其用药量可参照使用金银花进行治疗时的用量；在将本发明的金银花提取物或本发明的组合物用作保健品，或将其加入保健品时，其用量应少于通常的治疗量。
本发明人进行了大量的药物实验，证明了本发明的金银花提取物具有解热、镇痛、消炎、抗菌和抗病毒的作用，对高热症、疼痛、感染性疾病，特别是病毒性肺炎、病毒性感冒和艾滋病等疾病具有良好的治疗作用，并可用作或加入保健品，有利于改善身体状况，提高免疫力。
根据文献报道，目前中药领域认为金银花中的主要有效成分为绿原酸类化合物，另外还有挥发性成分芳樟醇等。因此，通常以绿原酸的含量高低来评价金银花质量的优劣，金银花的提取、精制工艺多以绿原酸类化合物为考察指标，少部分以挥发性成分为考察指标。
本发明人的研究发现金银花中具有解热、抗炎、抗菌、抗病毒作用的有效部位主要是以环烯醚萜苷类化合物为主，而不是绿原酸类化合物。在金银花提取物中，开联番木鳖苷酸的含量(大约10％)远高于绿原酸类化合物的含量(大约5％)，大约是绿原酸类化合物的二倍。因此，在药理活性评价中，该有效部位和其中的主要化合物开联番木鳖苷酸所表现出的解热、抗炎、抗菌、抗病毒作用显然大于绿原酸的作用。以绿原酸类化合物为考察指标的质量控制标准无法真实地反映金银花提取物的内在质量。
因此，另一方面，本发明还提供了中药金银花的质量控制标准，所述的质量控制标准是以从中药金银花中提取的具有解热、抗炎、抗菌和抗病毒的有效部位，即以环烯醚萜苷类化合物为有效成分群，以开联番木鳖苷酸为主要有效成分或质量控制的指标成份；以开联番木鳖苷酸或其他可替代的环烯醚萜苷类化合物为参照物质，按分光光度法比色测定有效部位中开联番木鳖苷酸及其衍生物(总环烯醚萜苷)类化合物的总含量；按HPLC方法测定开联番木鳖苷酸单一成分的含量。
本发明新的质量控制标准改变了通常以绿原酸的含量高低来评价金银花质量优劣的标准，能够更真实准确的反映所述中药的内在质量。
以上质量控制标准可用于金银花或忍冬属植物原料、提取物及其单独制备的制剂、复合制剂中间品和终产品的质量控制。
具体实施方式
下面的实施例可进一步说明本发明，但不以任何方式限制本发明。
实施例1：
(1)提取：取金银花药材(500g)，粗粉碎，加水浸泡提取3次，每次用水量为金银花药材干重的12倍，每次浸泡24小时。合并提取液，减压浓缩至稠浸膏，加入500毫升蒸馏水，加热溶解，冷却至室温，静置24小时，过滤，得澄清滤液。
(2)醇沉精制：金银花水提取浓缩液，在充分搅拌下，加乙醇(95％)，使溶液含醇量为70％，静置24小时，过滤，收集滤液，再减压回收乙醇至流浸膏状。
(3)大孔吸附树脂色谱精制：将(2)中的流浸膏加水500毫升，溶解并过滤，滤液，通过经预处理的苯乙烯型大孔吸附树脂HP-20，依次用6倍量树脂柱体积的水洗脱，然后再用6倍量树脂柱体积的20％乙醇洗脱，减压回收20％乙醇洗脱液至浓缩液，冷冻干燥，得到提取物5.81g。
(4)以开联番木鳖苷酸为参照物，用紫外分光光度法测定提取物中开联番木鳖苷酸及其衍生物类化合物，以上述提取物总量计，开联番木鳖苷酸及其衍生物类化合物，即总环烯醚萜苷含量为75.6％；用HPLC外标法测定开联番木鳖苷酸含量为33.4％。
实施例2：
(1)提取：取金银花药材(500g)，粗粉碎，加水煎煮二次，每次用水量为金银花药材干重的12倍，煎煮温度为98℃，每次煎煮时间为1小时；合并水提取液，过滤，滤液减压浓缩至1g生药/mL。
(2)醇沉精制：金银花水提取浓缩液，在充分搅拌下，加乙醇(95％)，使溶液含醇量为75％，静置16小时，过滤，收集滤液，再减压回收乙醇至流浸膏状。
(3)大孔吸附树脂色谱精制：将(2)中的流浸膏加水500毫升，溶解并过滤，滤液，通过经预处理的苯乙烯型大孔吸附树脂D-101，依次用5倍量树脂柱体积的水洗脱，然后再用6倍量树脂柱体积的15％乙醇洗脱，减压回收15％乙醇洗脱液至干，得到提取物4.94g。
(4)以开联番木鳖苷酸为参照物，用紫外分光光度法测定提取物中开联番木鳖苷酸及其衍生物类化合物，以上述提取物总量计，总环烯醚萜苷含量为75.5％；用HPLC外标法测定开联番木鳖苷酸含量为27.6％。
实施例3：
(1)提取：取金银花药材(500g)，粗粉碎，加水浸泡提取2次，每次用水量为金银花药材干重的12倍，每次浸泡18小时。合并提取液，减压浓缩至稠浸膏，加入500毫升蒸馏水加热溶解，冷却至室温，静置18小时，过滤，得澄清滤液。
(2)水沉精制：金银花水提取浓缩液，减压浓缩至干，加1500毫升乙醇(95％)，在充分搅拌溶解，同时缓慢加入蒸馏水使溶液含醇量为75％，静置24小时，过滤，收集滤液，再减压回收乙醇至流浸膏状。
(3)大孔吸附树脂色谱精制：将(2)中的流浸膏加水500毫升，溶解并过滤，滤液通过经预处理的苯乙烯RH型大孔吸附树脂色谱柱，依次用4倍量树脂柱体积的水洗脱，然后再用5倍量树脂柱体积的15％乙醇洗脱，减压回收15％乙醇洗脱液至无醇味，冷冻干燥，得到提取物4.28g。
(4)以开联番木鳖苷酸为参照物，用紫外分光光度法测定提取物中开联番木鳖苷酸及其衍生物类化合物，以上述提取物总量计，总环烯醚萜苷含量为51.4％；用HPLC外标法测定开联番木鳖苷酸含量为25.8％。
实施例4：
(1)提取：取金银花药材(500g)，粗粉碎，加水煎煮二次，每次用水量为金银花药材干重的12倍，每次煎煮时间为1.5小时；合并水提取液，过滤，滤液减压浓缩至1g生药/ml。
(2)醇沉精制：金银花水提取浓缩液，在充分搅拌下，加乙醇(95％)，使溶液含醇量为80％，静置24小时，过滤，收集滤液，再减压回收乙醇至流浸膏状。
(3)大孔吸附树脂色谱精制：将(2)中的流浸膏加水400毫升，溶解并过滤，滤液，通过经预处理的苯乙烯SP-700型大孔吸附树脂色谱柱，用6倍量树脂柱体积的水洗脱，然后再用6倍量树脂柱体积的18％乙醇洗脱，减压回收18％乙醇洗脱液至干，得到提取物4.68g。
(4)以开联番木鳖苷酸为参照物，用紫外分光光度法测定提取物中开联番木鳖苷酸及其衍生物类化合物，以上述提取物总量计，总环烯醚萜苷含量为76.6％；用HPLC外标法测定开联番木鳖苷酸含量为56.8％。
实施例5：
(1)提取：取金银花药材(500g)，粗粉碎，加50％乙醇回流提取2次，每次用50％乙醇量为金银花药材干重的13倍，每次提取1小时。合并提取液，减压浓缩至稠浸膏，加入450毫升蒸馏水加热溶解，冷却至室温，静置24小时，过滤，得澄清滤液。
(2)水沉精制：金银花50％乙醇提取浓缩液，减压浓缩至干，加1600毫升乙醇(95％)，在充分搅拌溶解，同时缓慢加入蒸馏水使溶液含醇量为75％，静置24小时，过滤，收集滤液，再减压回收乙醇至流浸膏状。
(3)大孔吸附树脂色谱精制：将(2)中的流浸膏加水500毫升，溶解并过滤，滤液通过经预处理的苯乙烯SP-825型大孔吸附树脂色谱柱，依次用5倍量树脂柱体积的水洗脱，然后再用6倍量树脂柱体积的20％乙醇洗脱，减压回收20％乙醇洗脱液至无醇味，冷冻干燥，得到提取物4.31g。
(4)以开联番木鳖苷酸为参照物，用紫外分光光度法测定提取物中开联番木鳖苷酸及其衍生物类化合物，以上述提取物总量计，总环烯醚萜苷含量为69.6％；用HPLC外标法测定开联番木鳖苷酸含量为52.6％。
实施例6：
(1)提取：取金银花药材(500g)，粗粉碎，加50％乙醇浸泡提取3次，每次用50％乙醇量为金银花药材干重的15倍，每次提取24小时。合并提取液，减压浓缩至稠浸膏，加入500毫升蒸馏水加热溶解，冷却至室温，静置24小时，过滤，得澄清滤液。
(2)醇沉精制：金银花50％乙醇提取浓缩液，在充分搅拌溶解，加乙醇(95％)至溶液含醇量为85％，静置24小时，过滤，收集滤液，再减压回收乙醇至流浸膏状。
(3)大孔吸附树脂色谱精制：将(2)中的流浸膏加水500毫升，溶解并过滤，滤液通过经预处理的苯乙烯SP-70型大孔吸附树脂色谱柱，依次用4倍量树脂柱体积的水洗脱，然后再用8倍量树脂柱体积的15％乙醇洗脱，减压回收15％乙醇洗脱液至无醇味，冷冻干燥，得到提取物6.22g。
(4)以开联番木鳖苷酸为参照物，用紫外分光光度法测定提取物中开联番木鳖苷酸及其衍生物类化合物，以上述提取物总量计，总环烯醚萜苷含量为66.3％；用HPLC外标法测定开联番木鳖苷酸含量为38.1％。
实施例7：
(1)提取：取金银花药材(500g)，粗粉碎，加95％乙醇回流提取3次，每次用95％乙醇量为金银花药材干重的12倍，每次回流提取时间为1.5小时；合并提取液，过滤，滤液减压浓缩至无醇味，再加蒸馏水至1g生药/ml。
(2)醇沉精制：金银花95％乙醇提取浓缩液，在充分搅拌下，加乙醇(95％)，使溶液含醇量为60％，静置24小时，过滤，收集滤液，再减压回收乙醇至流浸膏状。
(3)大孔吸附树脂色谱精制：将(2)中的流浸膏加水500毫升，溶解并过滤，滤液，通过经预处理的苯乙烯SP-700型大孔吸附树脂色谱柱，用6倍量树脂柱体积的水洗脱，然后再用8倍量树脂柱体积的12％乙醇洗脱，减压回收12％乙醇洗脱液至干，得到提取物3.60g。
(4)以开联番木鳖苷酸为参照物，用紫外分光光度法测定提取物中开联番木鳖苷酸及其衍生物类化合物，以上述提取物总量计，总环烯醚萜苷含量为78.5％；用HPLC外标法测定开联番木鳖苷酸含量为54.9％。
实施例8：
(1)提取：取金银花药材(500g)，粗粉碎，加95％乙醇浸泡提取3次，每次用95％乙醇量为金银花药材干重的12倍，每次浸泡提取时间为24小时；合并提取液，过滤，滤液减压浓缩至无醇味，再加蒸馏水至1g生药/ml。
(2)醇沉精制：金银花95％乙醇提取浓缩液，在充分搅拌下，加乙醇(95％)，使溶液含醇量为60％，静置24小时，过滤，收集滤液，再减压回收乙醇至流浸膏状。
(3)反相硅胶(C-18)柱色谱精制：将(2)中的流浸膏加水500毫升，溶解并过滤，滤液，通过中压反相硅胶(C-18)色谱柱，用4倍量柱体积的水洗脱，然后再用4倍量柱体积10％乙醇洗脱，再用8配量柱体积的20％乙醇洗脱，减压回收20％乙醇洗脱液至干，得到提取物2.63g。
(4)以开联番木鳖苷酸为参照物，用紫外分光光度法测定提取物中开联番木鳖苷酸及其衍生物类化合物，以上述提取物总量计，总环烯醚萜苷含量为78.3％；用HPLC外标法测定开联番木鳖苷酸含量为65.6％。
实施例9：
(1)提取：取山银花药材(500g)，粗粉碎，加水煮提2次，每次用水量为山银花药材干重的13倍，每次煮提时间为1小时；合并提取液，过滤，滤液减压浓缩至1g生药/ml。
(2)醇沉精制：山银花水提取浓缩液，在充分搅拌下，加乙醇(95％)，使溶液含醇量为70％，静置24小时，过滤，收集滤液，再减压回收乙醇至流浸膏状。
(3)大孔吸附树脂色谱精制：将(2)中的流浸膏加水500毫升，溶解并过滤，滤液，通过经预处理的苯乙烯SP-700型大孔吸附树脂色谱柱，用6倍量树脂柱体积的水洗脱，然后再用8倍量树脂柱体积的18％乙醇洗脱，减压回收18％乙醇洗脱液至干，得到提取物6.26g。
(4)以开联番木鳖苷酸为参照物，用紫外分光光度法测定提取物中开联番木鳖苷酸及其衍生物类化合物，以上述提取物总量计，总环烯醚萜苷含量为76.7％；用HPLC外标法测定开联番木鳖苷酸含量为53.8％。
实施例10：
(1)提取：取忍冬(茎和枝)药材(500g)，粗粉碎，加水煮提3次，每次用水量为药材干重的8倍，每次煮提时间为1.5小时；合并提取液，过滤，滤液减压浓缩至1g生药/ml。
(2)醇沉精制：忍冬(茎和枝)水提取浓缩液，在充分搅拌下，加乙醇(95％)，使溶液含醇量为75％，静置24小时，过滤，收集滤液，再减压回收乙醇至流浸膏状。
(3)大孔吸附树脂色谱精制：将(2)中的流浸膏加水350毫升，溶解并过滤，滤液，通过经预处理的苯乙烯SP-700型大孔吸附树脂色谱柱，用6倍量树脂柱体积的水洗脱，然后再用8倍量树脂柱体积的15％乙醇洗脱，减压回收15％乙醇洗脱液至干，得到提取物5.58g。
(4)以开联番木鳖苷酸为参照物，用紫外分光光度法测定提取物中开联番木鳖苷酸及其衍生物类化合物，以上述提取物总量计，总环烯醚萜苷含量为74.3％；用HPLC外标法测定开联番木鳖苷酸含量为56.1％。
实施例11：
(1)提取：取金银花药材(500g)，粗粉碎，加95％乙醇浸泡提取3次，每次用95％乙醇量为金银花药材干重的12倍，每次浸泡提取时间为24小时；合并提取液，过滤，滤液减压浓缩至无醇味，再加蒸馏水至1g生药/ml。
(2)醇沉精制：金银花95％乙醇提取浓缩液，在充分搅拌下，加乙醇(95％)，使溶液含醇量为65％，静置24小时，过滤，收集滤液，再减压回收乙醇至流浸膏状。
(3)反相硅胶(C-18)柱色谱精制：将(2)中的流浸膏加水500毫升，溶解并过滤，滤液，通过中压反相硅胶(C-18)色谱柱，用4倍量柱体积的水洗脱，然后再用4倍量柱体积10％乙醇洗脱，再用8配量柱体积的18％乙醇洗脱，减压回收18％乙醇洗脱液至干，得到提取物2.63g。
(4)以开联番木鳖苷酸为参照物，用紫外分光光度法测定提取物中开联番木鳖苷酸及其衍生物类化合物，以上述提取物总量计，总环烯醚萜苷含量为78.3％；用HPLC外标法测定开联番木鳖苷酸含量为65.6％。
实施例12：
(1)提取：取忍冬药材(茎和枝)(500g)，粗粉碎，加95％乙醇回流提取3次，每次用95％乙醇量为金银花药材干重的10倍，每次提取时间为2.5小时；合并提取液，过滤，滤液减压浓缩至无醇味，再加蒸馏水至1g生药/ml。
(2)醇沉精制：忍冬药材(茎和枝)95％乙醇提取浓缩液，在充分搅拌下，加乙醇(95％)，使溶液含醇量为75％，静置36小时，过滤，收集滤液，再减压回收乙醇至流浸膏状。
(3)正相硅胶柱色谱精制：将(2)中的流浸膏加乙醇200毫升，充分加热溶解，拌入350g色谱用硅胶(100目)，室温放置72小时至干燥，将拌有样品的硅胶置正相硅胶(1000g)色谱柱上，然后用氯仿-甲醇(50∶1-1∶1)进行梯度洗脱，每个梯度洗脱用溶剂量为4～5个柱床体积，收集氯仿-甲醇(5∶1-3∶1)洗脱部位，减压回收溶剂至干，得到提取物5.99g。
(4)以开联番木鳖苷酸为参照物，用紫外分光光度法测定提取物中开联番木鳖苷酸及其衍生物类化合物，以上述提取物总量计，总环烯醚萜苷含量为78.8％；用HPLC外标法测定开联番木鳖苷酸含量为64.0％。
实施例13：
(1)提取：取山银花药材(500g)，粗粉碎，加95％乙醇回流提取3次，每次用95％乙醇量为金银花药材干重的12倍，每次提取时间为2.5小时；合并提取液，过滤，滤液减压浓缩至无醇味，再加蒸馏水至1g生药/ml。
(2)醇沉精制：山银花水提取浓缩液，在充分搅拌下，加乙醇(95％)，使溶液含醇量为75％，静置32小时，过滤，收集滤液，再减压回收乙醇至流浸膏状。
(3)正相硅胶柱色谱富集：将(2)中的流浸膏加乙醇200毫升，充分加热溶解，拌入250g色谱用硅胶(100目)，室温放置72小时至干燥，将拌有样品的硅胶置正相硅胶(1000g)色谱柱上，然后用乙酸乙酯-乙醇(50∶1-1∶1)进行梯度洗脱，每个梯度洗脱用溶剂量为5～7个柱床体积，收集乙酸乙酯-乙醇(10∶1-5∶1)洗脱部位，减压回收溶剂至干，得到提取物3.86g。
(4)以开联番木鳖苷酸为参照物，用紫外分光光度法测定提取物中开联番木鳖苷酸及其衍生物类化合物，以上述提取物总量计，总环烯醚萜苷含量为81.2％；用HPLC外标法测定开联番木鳖苷酸含量为70.8％。
实施例14有效部位的凝胶色谱纯化
将上述实施例7中得到的金银花植物提取物有效部位3.60g，用50毫升蒸馏水溶解后，通过Sephadex LH-20凝胶色谱柱纯化，用H2O洗脱，收集样品液，减压回收，冷冻干燥，得到进一步纯化的有效部位2.18g。
进一步纯化的有效部位的定量分析：以开联番木鳖苷酸为参照物，用紫外分光光度法测定，经过凝胶柱色谱进一步纯化的有效部位中开联番木鳖苷酸及其衍生物类化合物，即总环烯醚萜苷含量为94.6％；用HPLC外标法测定开联番木鳖苷酸含量为78.9％。
纯化后的有效部位定性分析：经液相色谱-质谱联用(HPLC-MS)检测分析，初步确定进一步纯化的有效部位中含有的环烯醚萜苷类化合物包括：番木鳖苷(M＝390)，开联番木鳖苷(M＝388)，开联番木鳖苷二甲基缩醛(M＝434)，獐牙菜苷(sweroside) (M＝358)，四乙酰开联番木鳖苷(secologanoside)7-甲基酯(M＝404)，金银花甙(kingiside)(M＝404)，莫罗忍冬甙(morroniside)(M＝406)，8-表-番木鳖甙(loganin)(M＝390)，vogeloside(M＝388)，epi-vogeloside(M＝388)，loniceracetalides A(M＝460)，loniceracetalides B(M＝460)和开联番木鳖苷酸(M＝374)。具体结构如下：
实施例15有效部位中主要环烯醚萜苷类化合物的分离纯化和结构鉴定
上述实施例14中得到的进一步纯化的金银花植物提取物有效部位2.18g，用20毫升蒸馏水溶解后，注入中压反相硅胶(C-18)柱色谱，用H2O-甲醇(1∶0-0∶1)梯度洗脱，根据薄层色谱检查，合并组成成分相似的洗脱液。减压回收溶剂至干燥，按极性大小得到5个分离部位F1(0.18g)、F2(0.44g)、F3(0.62g)、F4(0.20g)和F5(0.31g)。
取F2部位(0.44g)用纯净水溶解后，经过反相(C-18)制备型HPLC分离纯化得到一个单体化合物F2-1(305.8mg)。该化合物经过HPLC归一化法测定，含量为99.7％；经过紫外光谱，红外光谱，低分辨和高分辨电喷雾质谱，一维核磁共振氢谱、碳和DEPT谱，二维核磁共振同核化学位移相关(COSY)谱、异核单量子相干(HSQC)谱和异核多键化学位移相关(HMBC)谱测定，以及化学衍生化后得到的衍生物的紫外光谱，红外光谱，一维核磁共振氢谱、碳和DEPT谱，二维核磁共振COSY谱、HSQC谱和HMBC谱测定，确定为开联番木鳖苷酸。
取F3部位(0.25g)用纯净水溶解后，经过反相(C-18)制备型HPLC分离纯化得到三个单体化合物F3-1(96.1mg)、F3-2(83.8mg)和F3-3(46.2mg)。经HPLC归一化法测定，得到的三个化合物的纯度分别为98.6％，97.4％和95.6％；经过分别测定三个化合物的紫外光谱，红外光谱，一维核磁共振氢谱、碳和DEPT谱，以及电喷雾质谱测定，确定F3-1与F2-1为同一化合物；F3-2和F3-3分别鉴定为开联番木鳖苷(甙)(或裂环马钱子苷secologanin)和开联氧化番木鳖苷(或裂环氧化马钱子苷，secoxyloganin)。
实施例16对二甲苯所致小鼠耳肿胀模型的影响
通过药理实验观察从金银花中分离鉴定的主要成分开联番木鳖苷酸和以环烯醚萜苷类为主要成分的金银花提取物的抗炎活性。
(1)受试药物
①开联番木鳖苷酸：来源为实施例16分离鉴定单一化合物。
②金银花提取物：来源为前述实施例2得到的金银花提取物，以开联番木鳖苷酸(裂环马钱子苷酸，secologanic acid)为参照物，用紫外分光光度法测定其中环烯醚萜苷类化合物总含量为75.5％，用HPLC外标法测定开联番木鳖苷酸含量为27.6％。
③阳性对照药物：阿司匹林片：陕西白鹿制药厂生产，规格：0.3g/片，100片/瓶。生产批号：020527。人日最大用量为1.8g.
受试药物的配制方法：临用时加适量蒸馏水或注射用水稀释至所需浓度的药液。
(2)实验动物：ICR小鼠，雄性，体重18-20g，购自北京维通利华试验动物技术有限公司提供。动物许可证编号：SCXK(京)2002-0003。
(3)实验方法：
ICR小鼠，18-20g，雄性，随机分为8组，即空白对照组、阳性药组(阿司匹林)、受试药物高剂量组、中剂量组和低剂量组，每组10只。小鼠灌胃给药，每天给药1次，连续3d，给药体积均为25mL/Kg，对照组给予同体积蒸馏水。于末次给药后1h，将二甲苯涂于各组小鼠右耳，每只50μL，30min后处死动物，用直径9mm的打孔器将双耳同部位的等面积打下，精密天平称重，以左右耳片重之差值为肿胀度，计算肿胀抑制率，比较组间差异。
(4)实验结果：结果见表1。
表1开联番木鳖苷酸和金银花提取物对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响(X±SD；n＝10)
| 组别 | 剂量(mg/kg) | 肿胀度(mg) | 抑制率(％) | |
| 空白对照组 | 18.8±3.3 | |||
| 阿司匹林组 | 3 | 12.0±5.7** | 36.3 | |
| 开联番木鳖苷酸(裂环马钱子苷酸，secologanic acid) | 高剂量组中剂量组低剂量组 | 10.05.02.5 | 11.7±4.5**13.0±5.1**13.5±5.7* | 37.630.828.0 |
| 金银花提取物 | 高剂量组中剂量组低剂量组 | 25.012.56.25 | 12.0±6.6**14.2±5.2*15.6±6.1 | 35.623.816.5 |
注：与对照组比较*p＜0.05；**p＜0.01。
(5)结论：本次试验结果显示，开联番木鳖苷酸和金银花提取物能够明显抑制二甲苯所致小鼠的耳肿胀，同模型对照组比较有显著性差异(p＜0.05)，提示它们均具有较明显的抗炎作用，作用效果开联番木鳖苷酸＞金银花提取物。
实施例17对角叉菜胶所致小鼠足跖肿胀模型的影响
通过药理实验观察从金银花中分离鉴定的主要成分开联番木鳖苷酸和以环烯醚萜苷类为主要成分的金银花提取物的抗炎活性。
此试验的受试药物与实施例16相同。
(1)动物：ICR小鼠，雌雄性各半，体重18-20g，购自北京维通利华试验动物技术有限公司提供。动物许可证编号：SCXK(京)2002-0003。
(2)实验方法：ICR小鼠，18-20g，雌雄性各半，禁食过夜，随机分为8组，即空白对照组、阳性药组(阿司匹林)、受试药物高剂量组、中剂量组和低剂量组，每组12只。小鼠灌胃给药，每天给药1次，连续3d，给药体积均为25mL/Kg，对照组给予同体积蒸馏水。于末次给药后45分钟，小鼠右后足跖部皮下注射1％角叉菜胶0.03mL致炎，4小时后处死小鼠，在关节处剪下双后足，以右后足与左后足重之差为肿胀程度的指标。
(3)实验结果：结果见表2。
表2开联番木鳖苷酸和金银花提取物对角叉菜胶致小鼠足跖肿胀的影响(X±SD；n＝12)
| 组别 | 剂量(mg/kg) | 肿胀度(mg) | |
| 空白对照组 | 99.2±20.3 | ||
| 阿司匹林组 | 3.0 | 36.5±5.5** | |
| 开联番木鳖苷酸 | 高剂量组中剂量组低剂量组 | 10.05.02.5 | 39.7±11.5**42.0±12.1**63.4±16.3* |
| 金银花提取物 | 高剂量组中剂量组低剂量组 | 25.012.56.25 | 55.8±15.6**73.3±18.6*82.9±16.7 |
注：与对照组比较*p＜0.05；**p＜0.01。
(4)结论：本次试验结果显示，开联番木鳖苷酸和金银花提取物能够明显抑制角叉菜胶致小鼠足跖肿胀，同模型对照组比较有显著性差异(p＜0.05)，提示它们均具有较明显的抗炎作用，作用效果开联番木鳖苷酸＞金银花提取物。
实施例18对酵母菌悬液所致大鼠体温的影响
通过药理实验观察从金银花中分离鉴定的主要成分开联番木鳖苷酸和以环烯醚萜苷类为主要成分的金银花提取物的解热作用。
此试验的受试药物与实施例16相同。
(1)动物：大鼠：SD种，雌雄各半，体重160-180g，购自北京维通利华试验动物技术有限公司，动物许可证编号：SCXK(京)2002-0003。
(2)试验方法：在实验当天和前一天早上测量大鼠肛温，以每只动物的两天的平均体温作为实验前的基础体温。除正常对照组外，其余大鼠1ml/100g体重皮下注射20％的酵母菌悬液，注射4h后测量大鼠的肛温，按体温增高值将大鼠均匀分为9组。试验分别设：①正常对照组；②模型对照组；③开联番木鳖苷酸大剂量组；④开联番木鳖苷酸中剂量组；⑤开联番木鳖苷酸小剂量组；⑥金银花提取物大剂量组；⑦金银花提取物中剂量组；⑧金银花提取物小剂量组；和⑨阳性对照药阿司匹林(0.3g/kg)组；每组10只，各给药组分别灌胃给药1次，给药体积为10mL/Kg体重，正常对照和模型组均灌胃等体积的蒸馏水。各组分别在药后的0.5h、1h、2h和4h测量大鼠的肛温。以每只大鼠各不同时间点的体温与致热前的基础体温的差值作为体温的增加值。
(3)数据处理和统计分析方法：实验数据经SPSS统计软件处理，实验数据均以均数±标准差表示，组间比较采用t检验。
(4)试验结果：实验结果见下表。
表3开联番木鳖苷酸和金银花提取物对酵母菌悬液致大鼠发热体温的影响(X±SD；n＝10)
| 组别 | 剂量(mg/Kg) | 基础体温 | 给药后不同时间体体温增加值 | ||||
| 0.0h | 0.5h | 1.0h | 2.0h | 4.0h | |||
| 正常对照模型阿司匹林金银花提取物开联番木鳖苷酸 | 3.06.03.01.53.01.50.75 | 36.59±0.2836.76±0.2736.50±0.1536.61±0.2636.52±0.2436.96±0.4436.53±0.3336.64±0.2636.57±0.33 | 0.001±0.541.06±0.54**0.87±0.330.91±0.760.84±0.520.91±0.680.89±0.560.88±0.761.07±0.60 | 0.001±0.362.19±0.56**1.08±0.28**1.35±0.55**2.13±0.601.81±0.541.15±0.30**1.65±0.60*2.00±0.59 | 0.09±0.312.27±0.35**0.55±0.47**1.28±0.62**1.98±0.561.75±0.500.84±0.46**1.49±0.66**1.94±0.53 | 0.03±0.332.05±0.57**0.73±0.56**1.33±0.43**1.63±0.651.64±0.560.80±0.49**1.37±0.89*1.94±0.38 | 0.105±0.322.05±0.35**1.49±0.67*1.41±0.58*1.81±0.901.86±0.391.12±0.66**1.50±0.882.00±0.33 |
注：*表示同对照组比较P＜0.05；**表示同对照组比较P＜0.01。
(5)结论：金银花提取物和开联番木鳖苷酸对酵母所致大鼠发热模型具有明显的抑制作用，提示它们均具有一定的解热作用。作用效果开联番木鳖苷酸＞金银花提取物。
实施例19对内毒素致家兔发热模型的影响
通过药理实验观察从金银花中分离鉴定的主要成分开联番木鳖苷酸和以环烯醚萜苷类为主要成分的金银花提取物的对内毒素引起发热的解热活性。
此试验的受试药物与实施例16相同。
(1)动物：实验用家兔，体重1.8-2.5Kg，购自北京维通利华试验动物技术有限公司提供。
(2)实验方法：健康家兔，每日次量体温3次，连续测3天，在第4天，测量正常体温3次，每次间隔30分钟，三次体温波动不超过0.3℃的动物用于实验，耳缘静脉注射250ng/mL大肠杆菌内毒素1mL/Kg，注射后测量体温，30分钟测量一次，体温升高0.6℃以上的动物分为8组，即模型对照组、阳性对照组(阿司匹林，口服给药)、药物低剂量组、中剂量组和高剂量组，每组5只。各给药组分别耳缘静脉注射给药1次，模型对照给生理盐水和阳性对照灌胃给药。各组动物分别在药后的1h、2h、3h、4h和5h测量家兔体温。以每只家兔各不同时间点的体温与致热后的基础体温的差值作为体温的变化。
(3)数据处理和统计分析方法：实验数据经SPSS统计软件处理，实验数据均以均数±标准差表示，组间比较采用t检验。
(4)实验结果：实验结果见下表。
表4开联番木鳖苷酸和金银花提取物对内毒素致家兔发热体温的影响(X±SD；n＝5)
| 组别 | 剂量(mg/Kg) | 给药后不同时间体温变化 | ||||
| 1h | 2h | 3h | 4h | 5h | ||
| 模型对照阿司匹林金银花提取物开联番木鳖苷酸 | 5.06.03.01.53.01.50.75 | 0.23±0.230.33±0.220.26±0.380.00±0.790.32±0.680.10±0.560.20±0.731.01±0.40 | 0.23±0.320.10±0.410.38±0.43-0.05±0.790.35±0.341.15±0.301.05±0.62*0.89±0.68 | 0.33±0.44-0.25±0.440.04±0.23-0.28±0.570.21±0.28-0.82±0.56*-0.49±0.36*-0.18±0.57 | 0.00±0.56-0.80±0.44*-0.74±0.46*-0.83±0.44*-0.04±0.36-0.91±0.58**-0.88±0.79*-0.54±0.51* | -0.43±0.66-1.18±0.46*-1.01±0.40*-1.18±0.46**-0.56±0.49-1.22±0.86**-0.95±0.28**-0.57±0.33 |
注：*表示同对照组比较P＜0.05；**表示同对照组比较P＜0.01。
(5)结论：本次试验结果显示，开联番木鳖苷酸和金银花提取物能够明显抑制大肠杆菌内毒素致家兔发热，给药3-4小时后，同模型对照组比较有显著性差异(p＜0.05)，提示它们均具有较明显的抗内毒素致热作用，作用效果开联番木鳖苷酸＞金银花提取物。
实施例20对醋酸所致小鼠疼痛扭体模型的影响
通过药理实验观察从金银花中分离鉴定的主要成分开联番木鳖苷酸和以环烯醚萜苷类为主要成分的金银花提取物的镇痛活性。
此试验的受试药物与实施例16相同。
(1)动物：ICR小鼠，雄性，体重18-20g，购自北京维通利华试验动物技术有限公司提供。动物许可证编号：SCXK(京)2002-0003。
(2)实验方法：ICR小鼠，18-20g，雌雄兼有，随机分为8组，即生理盐水对照组、阳性药(阿司匹林)组、试验药物低剂量组、中剂量组和高剂量组，每组12只。各组小鼠灌胃给药30分钟后，各鼠均腹腔注射0.5％醋酸0.2mL/只。观察10分钟内各组小鼠出现扭体反应小鼠只数，计算各药物镇痛百分率。
镇痛百分率(％)＝(对照组扭体反应小鼠数-给药组扭体反应小鼠数)/对照组扭体反应小鼠数×100％
(3)实验结果：结果见下表。
表5.开联番木鳖苷酸和金银花提取物醋酸致小鼠疼痛扭体的影响(X±SD；n＝12)
| 组别 | 剂量(mg/kg) | 镇痛百分率(％) | |
| 生理盐水对照组 | 0 | ||
| 阿司匹林组 | 2.5 | 68** | |
| 开联番木鳖苷酸 | 高剂量组中剂量组低剂量组 | 10.05.02.5 | 57**51**20 |
| 金银花提取物 | 高剂量组中剂量组低剂量组 | 25.012.56.25 | 61**49**26 |
注：与对照组比较*p＜0.05；**p＜0.01。
(4)结论：本次试验结果显示，开联番木鳖苷酸和金银花提取物能够明显抑制醋酸致小鼠疼痛扭体作用，同模型对照组比较有显著性差异(p＜0.05)，提示它们均具有较明显的镇痛作用，作用效果金银花提取物＞开联番木鳖苷酸。
实施例21体外抗病毒实验
通过药理实验观察从金银花中分离鉴定的主要成分开联番木鳖苷酸和以环烯醚萜苷类为主要成分的金银花提取物的抗病毒活性。
此试验的受试药物与实施例16相同。
(1)病毒株和细胞：呼吸道合胞病毒(RSV，Long株)，Hela细胞。
(2)实验方法：
①病毒毒力测定
将经Hela细胞活化扩增的呼吸道合胞病毒进行10倍系列稀释，稀释度10-1～10-9。将各稀释度的病毒液分别接种2孔生长良好的Hela细胞，每孔接种0.1mL RSV液，37℃吸附1小时后，弃病毒液，每孔细胞加入培养液1mL，于37℃继续培养，于24小时和48小时观察细胞病变情况。结果表明，培养48小时呼吸道合胞病毒的滴毒为10-7(见下表)。
表6呼吸道合胞病毒(RSV，Long株)致Hela细胞病变
| 时间(h) | 病毒稀释度 | ||||||||
| 10-1 | 10-2 | 10-3 | 10-4 | 10-5 | 10-6 | 10-7 | 10-8 | 10-9 | |
| 24 | ++ | ++ | + | + | - | - | - | - | - |
| 48 | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ | + | + | - | - |
②开联番木鳖苷酸、金银花提取物和阳性对照药物病毒唑的细胞毒性
称取受试样品各500mg，分别用10mL蒸馏水溶解后，煮沸15分钟，分别取1.5mL，加入培养液0.5mL，用5mol/L的NaOH调节pH至7.2。将上述药液用培养液进行2倍系列稀释，稀释度1∶2～1∶4096。将各稀释度药液加入到24孔Hela细胞培养板内，每孔1mL，每个稀释度接种2个复孔，37℃培养48小时。结果显示，开联番木鳖苷酸和金银花提取物在稀释度为1∶2～1∶8的情况下，细胞坏死、脱落，均表现出有明显的细胞毒性；在稀释度为1∶16时，均无明显细胞毒性，在稀释度为1∶32～1∶4096的药液中，细胞生长良好，与对照组培养细胞无明显差异。阳性对照药物病毒唑，在稀释度为1∶2～1∶64的情况下，细胞坏死、脱落，表现出明显的细胞毒性；在1∶128～1∶4096稀释度的病毒唑药液中，细胞均生长良好，与正常培养细胞对照组无明显差别。
③药物抗病毒作用测试
将RSV病毒液进行10倍系列稀释，稀释度为10-5。将病毒液接种于24孔生长良好的Hela细胞，每孔接种0.1mL RSV液，37℃吸附1小时后，弃去病毒液，并加入如下待测药液和阳性药物药液。将开联番木鳖苷酸、金银花提取物和阳性对照药物病毒唑分别进行2倍系列稀释，稀释度为1∶128～1∶4096(开联番木鳖苷酸和金银花提取物的浓度分别为293、146、73、18、9μg/mL；病毒唑的浓度为781、391、195、98、49和24μg/mL)。将各稀释度的药液分别加入经病毒液(10-5)吸附过的单层培养Hela细胞孔中，每一稀释度平行加入2孔。然后在37℃培养48小时。
(3)实验结果：结果见表7。
表7开联番木鳖苷酸、金银花提取物和阳性对照药物病毒唑对呼吸道合胞病毒(RSV)的致Hela细胞病变的抑制作用
| 病毒稀释度 | 1∶128 | 1∶256 | 1∶512 | 1∶1024 | 1∶2048 | 1∶4096 |
| 开联番木鳖苷酸金银花提取物病毒唑 | --- | --- | --++ | --++ | ±±+++ | ±++++++ |
(4)结论：本次试验结果显示，开联番木鳖苷酸和金银花提取物均能够明显抑制呼吸道合胞病毒(RSV)致体外培养Hela细胞的病变作用，提示它们均具有较明显体外抗病毒作用，作用效果开联番木鳖苷酸＞金银花提取物。
实施例22体内抗病毒实验
通过药理实验观察从金银花中分离鉴定的主要成分开联番木鳖苷酸和以环烯醚萜苷类为主要成分的金银花提取物的体内抗病毒活性。
此试验的受试药物与实施例16相同。
(1)动物：ICR小鼠，雌雄各半，体重14-16g，购自北京维通利华试验动物技术有限公司提供。动物许可证编号：SCXK(京)2002-0003。
(2)试验方法：ICR小鼠，随机分为8组，即空白对照组、阳性药组(病毒唑)、受试药物高剂量组、中剂量组和低剂量组，每组12只。各组小鼠腹腔注射给药，每天给药1次，连续3天，给药体积均为25mL/Kg，对照组给予同体积生理盐水。于末次给药2h后，除正常对照组小鼠外，其余各组动物用乙醚浅度麻醉后，用10个LD50流感病毒肺适应株(FM1)病毒液，滴鼻感染，每鼠0.05mL，动物自然苏醒后，继续给药，连续4天(共给药7天)。每天观察动物自主活动情况，并记录动物死亡情况，死亡动物立即称重后解剖，取肺并称湿重；第4天给药后，禁食8小时后，称重，并解剖取肺，称肺湿重；计算肺指数，求肺指数抑制率。
肺指数＝肺湿重(g)/体重×100％
肺指数越大表示肺病变越严重。
(3)试验结果：实验结果见下表。
表8开联番木鳖苷酸和金银花提取物对流感病毒肺适应株(FM1)感染小鼠肺指数的抑制作用(X±SD；n＝12)
| 组别 | 剂量(mg/Kg) | 肺指数(％) | 抑制率(％) | 死亡动物数 | ||||
| 1d | 2d | 3d | 4d | |||||
| 正常对照模型对照组病毒唑组金银花提取物组开联番木鳖苷酸组 | 生理盐水生理盐水20.010.05.02.55.02.51.25 | 0.934±0.1.324±0.0.993±0.1.018±0.1.027±0.1.126±0.0.948±0.0.997±0.1.009±0. | 25.0**23.11*22.43*14.95*28.40*24.70*23.79* | 000000000 | 000000000 | 000000000 | 051101001 | 041.678.338.3308.33008.33 |
注：*表示同对照组比较P＜0.05；**表示同对照组比较P＜0.01。
(4)结论：金银花提取物和开联番木鳖苷酸对流感病毒肺适应株(FM1)感染小鼠的肺指数有抑制作用，提示它们均具有体内抗流感病毒的作用。作用效果开联番木鳖苷酸＞金银花提取物。
实施例23溶血性试验
通过实验观察从金银花中分离鉴定的主要成分开联番木鳖苷酸和以环烯醚萜苷类为主要成分的金银花提取物的溶血作用，以判断其在制剂中作为注射用药的可行性。
此试验的受试药物与实施例16相同。
(1)动物：家兔1只，雄性，体重1.65Kg。
(2)实验方法：自家兔心脏取血20mL，只三角瓶中，去纤维蛋白后，均分转移至8支10mL刻度离心管内，每管加入生理盐水2.5mL，混匀后离心，去除上清液，再分别加5mL生理盐水，混匀离心，反复处理3次，至上清液无色。将得到的红细胞按体积用生理盐水稀释称2％的红细胞混悬液。取试管14支，编号并按下表加入药液。并判断结果。其中，开联番木鳖苷酸和金银花提取物药液均为生理盐水配制，浓度分别为10和20mg/mL。
(3)实验结果：结果见下表。
表9开联番木鳖苷酸和金银花提取物的溶血性试验结果
| 空白管 | 阳性管 | 开联番木鳖苷酸试验管 | 金银花提取物试验管 | |||||||||
| 试管编号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 |
| 药液量(mL) | -- | -- | 0.1 | 0.2 | 0.3 | 0.4 | 0.5 | 0.1 | 0.2 | 0.3 | 0.4 | 0.5 |
| 生理盐水量(mL) | 2.5 | 2.5(蒸馏水) | 2.4 | 2.3 | 2.2 | 2.1 | 2.0 | 2.4 | 2.3 | 2.2 | 2.1 | 2.0 |
| 红细胞悬液量(mL) | 2.5 | 2.5 | 2.5 | 2.5 | 2.5 | 2.5 | 2.5 | 2.5 | 2.5 | 2.5 | 2.5 | 2.5 |
| 结果 | - | + | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
“+”表示有溶血现象；“-”表示无溶血现象。
(4)结论：本次试验结果显示，开联番木鳖苷酸和金银花提取物无溶血性。
实施例24刺激性试验
通过实验观察从金银花中分离鉴定的主要成分开联番木鳖苷酸和以环烯醚萜苷类为主要成分的金银花提取物的血管刺激性，以判断其在制剂中作为注射用药的可行性。
此试验的受试药物与实施例16相同。
(1)动物：家兔3只，雄性1只，雌性2只，体重1.60-1.80Kg。
(2)实验方法：按照8.33mg/Kg体重，右侧耳缘静脉滴注给予药液(浓度0.5mg/mL)，每天1次，连续给药3天，末次给药后24小时，处死动物，剪下双耳，左侧耳作为对照，进行组织病理学检查。
(3)实验结果：三只家兔，其左侧和右侧耳均无明显组织病理学差别。
(4)结论：本次试验结果显示，开联番木鳖苷酸和金银花提取物，浓度分别为0.5mg/mL，家兔耳缘静脉给药无明显血管刺激性。
实施例25急性毒性实验
通过实验观察以环烯醚萜苷类为主要成分的金银花提取物的急性毒性和半数致死量(LD50)。
此试验的受试药物与实施例16相同。
(1)动物：ICR小鼠，雌雄各半，体重18-22g，购自北京维通利华试验动物技术有限公司提供。动物许可证编号：SCXK(京)2002-0003。
(2)实验方法：ICR小鼠，18-20g，雌雄性各半，随机分为4组，每组10只。分别通过尾静脉注射给不同剂量的金银花提取物药液，各组动物的给药剂量分别为每公斤体重2.70g、2.43 g、2.19g和1.97g。给药后观察并记录各组小鼠出现的中毒症状和死亡情况。观察7日。死亡率按Bliss法计算LD50和95％可信限，并注意死亡率与性别的关系。
(3)实验结果：金银花提取物静脉注射后，较大剂量组多数小鼠立即出现跳跃、挣扎惊厥，然后俯卧或仰卧，翻正反射消失，耳廓苍白，呼吸停止而死亡。尸检未见各脏器组织明显异常。部分小鼠上述症状出现数秒钟后逐渐消失。小剂量组小鼠注射给药后呼吸减慢、俯卧，持续近1分钟后恢复正常。观察7日，按Bliss法计算LD50和95％可信限，结果见下表。
表10金银花提取物小鼠静脉注射给药的的急性毒性和半数致死量测定(LD50)(Bliss法)
| 剂量(g/Kg) | 对数剂量(x) | 动物数(只)(雄/雌) | 死亡动物数(只)(雄/雌) | 死亡率(％) | 机率单位(Y) | LD50(95％可信限)g/Kg |
| 2.702.432.191.97 | 0.43140.38560.34040.2945 | 5/55/55/55/5 | 3/52/51/30/2 | 80704020 | 5.845.524.754.16 | 2.28(2.14-2.42) |
(4)结论：本次试验结果显示，金银花提取物小鼠静脉注射给药LD50为2.28g/Kg体重；95％可信限为2.14～2.42g/Kg体重。
以上已经详细描述了本发明的实施方案，对本领域技术人员来说很明显可以做很多改进和变化而不会背离本发明的基本精神。所有这些变化和改进都在本发明的范围之内，所附权利要求的技术特征由上述说明书确定。
Claims (10)
1.一种具有解热、镇痛、消炎、抗菌和抗病毒作用的金银花提取物，该提取物是从金银花或其基源植物忍冬或同属其他植物中提取制备的，其中的有效成分是以开联番木鳖苷酸为主要成分的环烯醚萜类化合物，其中所述环烯醚萜类化合物的结构式如下：
其中
X1和X2各自独立地表示O、N或S；
R、R1或R2各自独立地表示氢、C1-6低级烷基或C2-6低级链烯基；其中以提取物的总重量计，所述环烯醚萜类化合物的含量大于50％。
2.按照权利要求1所述的金银花提取物，其中所述基团X1和X2各自独立地表示O。
3.按照权利要求1所述的金银花提取物，其中所述的R、R1或R2基团各自独立的是氢、甲基、乙基或异戊烯基。
4.按照权利要求3的所述的金银花提取物，其中所述的化合物是开联番木鳖苷酸。
5.按照权利要求1所述的金银花提取物，其中环烯醚萜类化合物的含量大于70％，优选70％-98％。
6.按照权利要求1所述的金银花提取物，其中开联番木鳖苷酸单一成分的含量大于25％，优选大于50％，更优选大于70％，最优选70％-98％。
7.按照权利要求1-5任意一项所述的金银花提取物的制备方法，该方法包括以下步骤：
(1)提取：
将植物金银花或其基源植物忍冬或同属其他植物粉碎，然后用水和/或C1-C6烷醇含量不大于95％的水溶液作为溶剂进行提取，得到提取液；
(2)后处理：
A.将该提取液经常压或减压浓缩干燥得到浸膏，或经喷雾干燥得到粉末；
B.将上一步骤得到的产物用溶剂溶解后，用极性相反的其他溶剂进行沉淀或沉降，用常规方法进行处理得到含有环烯醚萜类化合物的金银花提取物，得到沉淀物或溶解液浓缩物；
(3)色谱分离纯化：
将上述后处理得到的产物用色谱方法分离纯化，收集含有环烯醚萜类化合物的洗脱液馏分，得到含有环烯醚萜类化合物的金银花提取物；
其中所述的色谱方法为大孔吸附树脂柱色谱、正相硅胶或反相硅胶色谱，或者它们的组合；
由此得到的金银花提取物中环烯醚萜类化合物含量大于50％。
8.按照权利要求7所述金银花提取物的制备方法，该方法还包括将上述方法获得的产物用凝胶色谱进一步纯化的步骤，得到环烯醚萜类化合物含量大于70％的金银花提取物。
9.一种用于治疗高热症、疼痛和感染性疾病的药物组合物，其中含有治疗有效量的权利要求1-5任意一项所述的金银花提取物，以及药学上可接受的载体。
10.权利要求1-6任意一项所述的金银花提取物和权利要求8的药物组合物中在制备治疗高热症、疼痛和感染性疾病，尤其是病毒性肺炎、病毒性感冒和艾滋病的药物中的应用。
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