CN103889431A

CN103889431A - 开联番木鳖苷酸、包含其的药物组合物及其用途

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Publication number: CN103889431A
Application number: CN201180072835.2A
Authority: CN
Inventors: 石建功; 张铁军; 孟红; 韩丰年; 马旭伟; 李竹兰
Original assignee: Gansu Puyuan Pharmaceutical Technology Co ltd
Current assignee: Gansu Puyuan Pharmaceutical Technology Co ltd
Priority date: 2011-08-12
Filing date: 2011-08-12
Publication date: 2014-06-25
Anticipated expiration: 2031-08-12
Also published as: WO2013023339A1; CN103889431B

Abstract

一种用作细菌所引起疾病的预防剂和/或治疗剂的开联番木鳖苷酸；它可抗多种多重抗生素耐药菌，包括多重耐药的革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌；它可以用于制备预防和/或治疗细菌、特别是多重抗生素耐药菌所造成疾病的药物。包含开联番木鳖苷酸的药物组合物。预防和/或治疗细菌所引起疾病的方法，包括给有此需要的患者施用治疗有效量的开联番木鳖苷酸和/或其药物组合物。

Description

开联番木鳖苷酸、包含其的药物组合物及其用途技术领域

本发明属于制药技术领域。具体而言，本发明涉及从中药金银花或其基源植物忍冬或同属植物中提取、精制得到的植物提取物在制备抗菌药物中的用途。背景技术

"金银花"一名出自《本草纲目》，为中药材和植物的统称。植物金银花又名忍冬，为忍冬科多年生、半常绿缠绕木质藤本植物。由于忍冬花初开为白色，后转为黄色，因此得名金银花。药材金银花即为忍冬科忍冬属植物忍冬及同属植物干燥花蕾或初开的花。

金银花自古被誉为清热解毒的良药，是我国传统医学常用的清热解毒药物之一，几千年以来，在临床上发挥着突出疗效，深受医患人群的喜爱。它性甘寒、气芳香，甘寒清热而不伤胃，芳香透达又可祛邪。金银花既能宣散风热，还善清解血毒，用于各种热性病，如身热、发疹、发斑、热毒疮痈、咽喉肿痛等证，均效果显著。近代研究对金银花清热解毒的机制作了初步探讨。例如，金银花有明显的解热和抗炎作用，腹腔注射金银花提取液 0.25g / kg, 能抑制大鼠角叉菜胶性脚肿；注射 30-40g / kg 能减轻蛋清性脚肿程度；注射 8g / kg、 2次 /天，对大鼠巴豆油性肉芽嚢也有明显抗渗出和抗增生的作用。另外认为金银花对机体免疫系统有重要的调节作用，金银花煎剂促进白细胞的吞噬功能；腹腔注射金银花注射液，也有明显促进炎性细胞吞噬功能的作用。

对金银花化学成分的研究表明，金银花中含有有机酸类、三萜皂苷类、黄酮及其苷类、环烯醚萜苷类、挥发油等。虽然从金银花中已经分离得到并鉴定了多种成分，但目前认为金银花中主要有效成分为绿原酸类化合物；此外，还有挥发性成分芳樟醇等。因此，通常以绿原酸的含量高低来评价金银花质量的优劣，金银花的提取、精制工艺多以绿原酸类化合物为考察指标，少部分以挥发性成分为考察指标。绿原酸虽具有解热和广谱的抗菌、抗病毒作用，但其并非是金银花中唯一解热、抑菌和抗病毒成分，且绿原酸在体内能被蛋白质灭活，其抗菌和抗病毒作用并不强。而且，绿原酸类化合物具有致敏作用亦为逾来逾多的研究者所共识。因此，对金银花解热、镇痛、消炎、抗菌、抗病毒的有效成分和作用机理尚不完全清楚。

专利号为 ZL200610083556.7, 发明名称为"金银花提取物，其制备方法和应用 "的发明专利公开了一种从中药金银花 (Lonicera japonica Thunb.)或其基源植物忍冬或同属其他植物中制备植物提取物的方法，以及由该方法制备的金银花提取物和含有该提取物的药物组合物。该发明公开了所制得的金银花提取物中的有效成分为开联番木鳖苷酸及其衍生物类化合物，并发现该金银花提取物具有解热、镇痛、消炎、抗菌和抗病毒的活性。但是，该发明对于制得的金银花提取物的抗菌作用并无明确的研究内容及结果。发明内容

本发明的一个目的在于提供一种用作细菌所引起疾病的预防剂和 /或治疗剂的开联番木鳖苷酸。该开联番木鳖苷酸从金银花或其基源植物忍冬或同属其他植物制备得到。

本发明的另一个目的是提供包含所述开联番木鳖苷酸的药物组合物。本发明的又一个目的是提供所述开联番木鳖苷酸或药物组合物在制备用于预防和 /或治疗细菌所引起疾病的药物中的用途。

本发明的还一个目的是提供一种预防和 /或治疗细菌所引起疾病的方法。上述技术方案通过以下实现：

一方面，本发明提供了一种用作细菌所引起疾病的预防剂和 /或治疗剂的开联番木鳖苷酸。

其中，所述开联番木鳖苷酸具述结构式 (I):

可以根据专利 ZL200610083556.7公开的方法制备本文所述金银花提取物，该专利的公开内容以引用的方式全部并入本文。根据本发明的具体实施方式，所述开联番木鳖苷酸制备自中药金银花或其基源植物忍冬或同属植物。具体而言，本发明的开联番木鳖苷酸通过包括以下步骤的方法制备：

( 1 )将植物金银花或其基源植物忍冬或同属其他植物粉碎，然后用水和 /或含量不大于 95体积％的 C_rC₆烷醇水溶液进行提取，得到提取液；

( 2 )将步骤（ 1 )得到的提取液经常压或减压浓缩干燥得到浸膏，或经喷雾干燥得到粉末，再用水溶解后，用含量不大于 95体积％的 C_rC₆烷醇水溶液进行沉淀或沉降，得到沉淀物或溶解液浓缩物；

( 3 )将经步骤（ 2 )得到的沉淀物或溶解液浓缩物用色谱方法分离纯化，收集含有环烯醚萜类化合物的洗脱液，其中所述的色谱方法选自大孔吸附树脂柱色谱法、正相硅胶色谱法和反相硅胶色谱法中的一种或多种；

优选地，所述开联番木鳖苷酸的制备方法包括以下步骤：

( 1 )将金银花药材粉碎，以 50% (体积 /体积）乙醇水溶液提取，从而得到提取液；

( 2 )将步骤（1 )得到的提取液减压浓缩得到浸膏，加水溶解，过滤，溶液浓缩至干，加 95% (体积 /体积）乙醇水溶液溶解，同时加入蒸馏水使溶液含乙醇 75% (体积 /体积），静置后过滤，滤液回收乙醇的流浸膏；

( 3 )向将步骤（2 )得到的流浸膏加水溶解并过滤，滤液通过苯乙烯大孔吸附树脂色语柱，然后依次用水、 20% (体积 /体积）乙醇水溶液洗脱，回收 20% (体积 /体积 ) 乙醇水溶液洗脱液中的乙醇；

更优选地，所述制备方法进一步包括将步骤（3 )获得的含有环烯醚萜类化合物的洗脱液通过凝胶色谱纯化；

最优选地，所述制备方法进一步包括将步骤（3 )获得的含有环烯醚萜类化合物的洗脱液通过 Sephadex LH-20凝胶色谱柱纯化，收集水洗脱液。

本发明的开联番木鳖苷酸可以用于制备预防和 /或治疗细菌所引起疾病的药物，所述细菌为抗生素耐药菌，优选为多重抗生素耐药菌；具体地，所述抗生素选自氨苄西林、青霉烷砜、哌拉西林、他唑巴坦、阿莫西林、克拉维酸、头孢唑林、头孢呋辛、头孢曲松、头孢呋新钠、舒普深、左旋氧氟、头孢噻肟、头孢他啶、亚胺培南、头孢吡肟、头孢西丁、庆大霉素、阿米卡星、环丙沙星、氯霉素、复方新诺明、四环素、呋喃妥因、氨曲南、环丙沙星、诺氟沙星、氨卡、舒巴坦、替卡西林、棒酸、妥布霉素、特治星、亚胺培南、米诺环素、美罗培南、青霉素、苯唑西林、红霉素、万古霉素、利福平和克林霉素中的一种或多种。优选地，所述细菌可以为多重抗生素耐药的革兰氏阴性菌；进一步优选地，所述多重抗生素耐药的革兰氏阴性菌选自大肠杆菌、铜绿假单胞菌、克雷伯氏杆菌、鲍曼不动杆菌、变形杆菌、肠科杆菌属、流感嗜血杆菌、肺炎杆菌和卡他菌属中的一种或多种；更优选地，所述多重抗生素耐药的革兰氏阴性菌为大肠杆菌、铜绿假单胞菌和 /或克雷伯氏杆菌。

或者，所述细菌为多重抗生素耐药的革兰氏阳性菌；进一步优选地，所述多重抗生素耐药的革兰氏阳性菌选自金黄色葡萄球菌、耐曱氧西林金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌 A组、肺炎链球菌、枯草芽孢杆菌和表皮葡萄球菌中的一种或多种；更优选地，所述多重抗生素耐药的革兰氏阳性菌为耐曱氧西林金黄色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和 /或表皮葡萄球菌。

此外，所述细菌所引起疾病为细菌引起的感染类疾病，特別是抗生素耐药菌引起的感染类疾病，例如消化系统感染，血液系统感染，呼吸系统感染，尿路感染，中枢神经系统感染，骨关节感染，耳、乳突和 /或鼻窦感染以及皮肤软组织感染中的一种或多种；优选地，所述细菌所引起疾病为由抗生素耐药细菌引起的呼吸系统感染。

其中，所述细菌所引起疾病可以为多重抗生素耐药的革兰氏阴性菌引起的呼吸系统感染；优选地，所述细菌所引起疾病为多重抗生素耐药的革兰氏阴性菌引起的感染性肺炎；进一步优选地，所述细菌所引起疾病为多重抗生素耐药的革兰氏阴性菌引起的院内感染性肺炎；更优选地，所述细菌所引起疾病为多重抗生素耐药的克雷伯氏杆菌引起的院内感染性肺炎。

或者，所述细菌所引起疾病为多重抗生素耐药的革兰氏阳性菌引起的呼吸系统感染；优选地，所述细菌所引起疾病为多重抗生素耐药的革兰氏阳性菌引起的肺炎；进一步优选地，所述细菌所引起疾病为耐曱氧西林金黄色葡萄球菌引起的肺炎。

另一方面，本发明还提供一种药物组合物，所述药物组合物包含上述开联番木鳖苷酸；优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体和 /或赋形剂。

又一方面，本发明提供上述开联番木鳖苷酸或上述药物组合物在制备用于预防和 /或治疗细菌所引起疾病的药物中的用途。

其中，所述细菌为抗生素耐药菌，优选为多重抗生素耐药菌。

优选地，所述细菌为多重抗生素耐药的革兰氏阴性菌；进一步优选地，所述多重抗生素耐药的革兰氏阴性菌选自大肠杆菌、铜绿假单胞菌、克雷伯氏杆菌、鲍曼不动杆菌、变形杆菌、肠科杆菌属、流感嗜血杆菌、肺炎杆菌和卡他菌属中的一种或多种；更优选地，所述多重抗生素耐药的革兰氏阴性菌为大肠杆菌、铜绿假单胞菌和 /或克雷伯氏杆菌。

或者，所述细菌为多重抗生素耐药的革兰氏阳性菌；进一步优选地，所述多重抗生素耐药的革兰氏阳性菌选自金黄色葡萄球菌、耐曱氧西林金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌 A组、肺炎链球菌、枯草芽孢杆菌和表皮葡萄球菌中的一种或多种；更优选地，所述多重抗生素耐药的革兰氏阳性菌为耐曱氧西林金黄色葡萄球菌和 /或金黄色葡萄球菌。

此外，所述细菌所引起疾病为细菌引起的感染类疾病，特別是抗生素耐药菌引起的感染类疾病，例如消化系统感染，血液系统感染，呼吸系统感染，尿路感染，中枢神经系统感染，骨关节感染，耳、乳突和 /或鼻窦感染以及皮肤软组织感染中的一种或多种；优选地，所述细菌所引起疾病为由所述抗生素耐药细菌引起的呼吸系统感染。

优选地，所述细菌所引起疾病为多重抗生素耐药的革兰氏阴性菌引起的呼吸系统感染；进一步优选地，所述细菌所引起疾病为多重抗生素耐药的革兰氏阴性菌引起的感染性肺炎；更优选地，所述细菌所引起疾病为多重抗生素耐药的革兰氏阴性菌引起的院内感染性肺炎；再优选地，所述细菌所引起疾病为多重抗生素耐药的克雷伯氏杆菌引起的院内感染性肺炎。

再一方面，本发明提供一种预防和 /或治疗细菌所引起疾病的方法，所述方法包括给有此需要的患者施用治疗有效量的上述开联番木鳖苷酸和 /或上述药物组合物。

或者，所述细菌所引起疾病为多重抗生素耐药的革兰氏阳性菌引起的呼吸系统感染；优选地，所述细菌所引起疾病为多重抗生素耐药的革兰氏阳性菌引起的肺炎；进一步优选地，所述细菌所引起疾病为耐曱氧西林金黄色葡萄球菌引起的肺炎。在绿原酸及其衍生物被认为具有抗菌、抗病毒活性之后，金银花清热解毒的物质基石出研究掀起了一个高潮，多家研究机构或实验室都致力于金银花有效成分的分离和提取。

本发明人经过大量实验，发现开联番木鳖苷酸在体外、体内都具有抑制和 /或杀灭细菌，特別是抗生素耐药菌的作用，包括具有显著的中和细菌内毒素的作用和退热作用。所述细菌包括革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌，且对革兰氏阴性菌效果较革兰氏阳性菌效果更为突出。开联番木鳖苷酸对部分革兰氏阴性菌、例如肺炎克雷伯氏杆菌、大肠埃希氏杆菌、铜绿假单胞菌的半数抑菌浓度均在 lmg/ml左右，对革兰氏阳性菌、例如芽孢杆菌的半数抑菌浓度也达到 0.92mg/ml。这些都表明开联番木鳖苷酸对多重耐药菌具有较强的抗菌作用。

此外，实验发现含较高含量的开联番木鳖苷酸的金银花提取物表现出体外抗菌及体内治疗肺炎的突出疗效，含量与提取物作用效果呈明显正相关，进一步表明了开联番木鳖苷酸的作用效果。附图说明以下，结合附图来详细说明本发明的实施例：

图 1为本发明实施例 1中制备的金银花提取物 N4的 HPLC色谱图，经测定其含有 52.6% (重量比 ) 的开联番木鳖苷酸。

图 2为本发明实施例 1中制备的金银花提取物 N3的 HPLC色谱图，经测定其含有 79.3% (重量比）的开联番木鳖苷酸。

图 3为本发明实施例 1中制备的金银花提取物 N2的 HPLC色谱图，经测定其含有 84.7% (重量比）的开联番木鳖苷酸。

图 4为本发明实施例 1中制备的金银花提取物 N1的 HPLC色谱图，经测定其含有 90.67% (重量比）的开联番木鳖苷酸。

图 5为本发明实施例中采用的开联番木鳖苷酸标准品的 HPLC色谱图，纯度为 98.03% (重量比）。实施发明的最佳方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的药材原料、试剂材料等，如无特殊说明，均可自常规生化试剂商店或药品经营企业购买得到。其中：

实施例中采用的金银花药材购自北京同仁堂连锁药店，产地为河南，由毫州市京皖中药饮片厂加工，批号 200502014 , 经中国医学科学院药物研究所鉴定为忍冬科植物忍冬 Lonicera japonica Thunb.的干燥花蕾。

实施例中采用的开联番木鳖苷酸，其用作提取物含量测定的标准品以及用作药理实验的药物（本文筒称为 NO ), 由中国医学科学院药物研究所天然药物化学研究室按照专利 ZL200610083556.7公开的方法自制，经测定含量为 98.03% (色谱图见图 5 )。

实施例中对于金银花提取物中的开联番木鳖苷酸的含量测定方法采用 HPLC外标法，具体采用下述仪器和条件：

( 1 )仪器 Agilent 1100液相色谱仪，包括四元泵、自动进样器、 DAD 检测器和 Chemstation色语工作站；

( 2 ) 色谱条件和系统适用性试验：色谱柱为 Prevail C₁₈ 5μ(250ηιηιΧ4.6ηιηι) [Alltech, 美国]; 乙腈 -1%冰醋酸水溶液 (13 : 87)为流动相，梯度洗脱；流速 0.9 ml/min, 停止时间 40分钟，平衡时间 10分钟，检测波长为 242 nm。理论板数按 JYH峰计算应不低于 1000。

( 3 )试剂：色谱用乙腈；纯净水；分析纯乙酸。实施例中采用的菌种大肠杆菌 ( Escherichia coli )、铜绿假单胞菌 ( Pseudomona aeruginosa ), 克雷 4白氏干菌 ( Klebsiella pneumoniae ), 金黄色葡萄球菌（ Staphylococcus aureus )、表皮葡萄球菌均为临床分离株，为多重耐药菌，由山东省济南市市立四院检验科提供，其耐药情况见下表 1、 2、 3、 4、 5。枯草芽孢杆菌由中国科学院微生物学研究所提供。

表 1 : 克雷伯氏杆菌实验菌株背景材料

表 1和表 2的备注:

R: 耐药； S: 敏感； I：中介度（中度耐药）。

AMP: 氨苄西林； PIP: 哌拉西林； TZP: 哌拉西林 /他唑巴坦； AMC: 阿莫西林 /克拉维酸； CZO: 头孢唑啉； CXM: 头孢呋辛； CTX: 头孢噻肟； CAZ: 头孢他啶； CRO: 头孢曲松； IPM: 亚胺培南； FEP: 头孢吡肟； FOX: 头孢西丁； GEN: 庆大霉素； AMK: 阿米卡星； CIP: 环丙沙星； CHL: 氯霉素； SXT: 复方新诺明； TCY: 四环素； NIT: 呋喃妥因。

表 3铜绿假单胞菌背景资料

备注： R: 耐药； S: 敏感； I: 中介度。

AK: 阿米卡星； ATM: 氨曲南； AMP: 氨苄西林； CRO: 头孢曲松； CLS: 舒普深； CXM: 头孢呋新钠； CAZ: 头孢他啶； CTX: 头孢噻肟； CFP: 头孢哌酮； CIP: 环丙沙星； CN: 庆大； FEP: 头孢吡肟； LEV: 左旋氧氟； NOR: 诺氟杀星； PIP: 哌拉西林； SAM: 氨卡 /舒巴坦； TIM: 替卡西林 / 棒酸； TOB: 妥布； TZP: 特治星； IPM: 亚胺培南； MH: 米诺环素； MEM: 美洛培南。

表 4金黄色葡萄球菌背景资料

表 4和表 5的备注:

R: 耐药； S: 敏感； I：中介度。

PEN: 青霉素； OXA: 苯唑西林； SAM: 氨苄西林 /青霉烷砜； FOX: 头孢西丁； GEN: 庆大霉素； AMK: 阿米卡星； CIP: 环丙沙星； ERY: 红霉素； VAN: 万古霉素； RIF: 利福平； SXT: 复方新诺明； TCY: 四环素； CLI: 克林霉素； NIT: 呋喃妥因。

实施例中采用的组织切片操作根据《病理学技术》，人民卫生出版社，第 1版， 39-41 页；苏木精 -伊红染色操作根据《病理学技术》，人民卫生出版社，第 1版， 41-43页。

实施例中采用的设备：

恒温培养箱：上海跃进医疗器械一厂产品。

净化工作台：济南隆宏公司产品。

分光光度计：华东电子管厂生产。

酶标仪：芬兰雷勃公司产品。

722分光光度计：上海精密科学仪器有限公司产品。

-20°C冰箱：中国青岛得贝公司产品。

-80°C冰箱：美国 FOMAS公司产品。离心机：贺立氏台式氐温离心机：贺立氏公司产品。

此外，实施例中进行实验的实验室为 BSL-2实验室和 ABSL-2实验室。实施例 1 金银花提取物的制备

取金银花药材（500g ), 粗粉碎，用重量为金银花药材干重 13倍的 50% (体积 /体积）乙醇水溶液提取 2次，每次提取 1小时。合并提取液，减压浓缩至稠浸膏，加入 450毫升蒸馏水加热溶解，冷却至室温，静置 24小时，过滤，得澄清溶液。

将该澄清溶液减压浓缩至干，加 1600毫升 95% (体积 /体积）乙醇水溶液，充分搅拌溶解，同时緩慢加入蒸馏水使溶液含乙醇 75% (体积 /体积），静置 24小时，过滤，收集滤液，再减压回收乙醇至流浸膏状。

将该流浸膏加水 500毫升，溶解并过滤，滤液通过经预处理的苯乙烯 SP-825型大孔吸附树脂色语柱，依次用 5倍量树脂柱体积的水洗脱，然后再用 6倍量树脂柱体积的 20% (体积 /体积）乙醇水溶液洗脱，减压回收乙醇至无醇味，冷冻干燥，得到金银花提取物 4.31克（金银花提取物 N4 )。

以开联番木鳖苷酸为参照物，用 HPLC外标法测定该金银花提取物 N4 中含开联番木鳖苷酸 52% (色谱图见图 1 )。

将金银花提取物 N4采用 Sephadex LH-20凝胶色谱柱进一步纯化，包括用水洗脱，收集样品液，减压回收，冷冻干燥，得到的产物可经该凝胶色谱柱几次纯化，从而分別得到金银花提取物 N3、 N2和 Nl。以开联番木鳖苷酸为参照物，用 HPLC外标法测定该金银花提取物 N3中含开联番木鳖苷酸 79.3% (色谱图见图 2 ); N2中含开联番木鳖苷酸 84.7% (色谱图见图 3 ); N1中含开联番木鳖苷酸 90.67% (色谱图见图 4 )。实施例 2 金银花提取物和开联番木鳖苷酸对临床耐药菌株的体外抑制作用

本实施例测定了实施例 1制备的金银花提取物 Nl、 N2、 N3、 N4以及开联番木鳖苷酸（NO )对临床耐药菌株大肠杆菌、铜绿假单胞菌、克雷伯氏杆菌、金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌以及枯草芽孢杆菌的体外抑制作用。

1、活化菌种及菌液制备

将冻干保存的上述 6个菌种接种于营养肉汤液体培养基。取约 4ml肉汤培养基，加入 lml的液体菌种， 37°C培养 20小时，肉目艮观察到大肠杆菌、克雷伯氏杆菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌；枯草芽胞杆菌、铜绿假单胞菌呈表面生长，形成菌膜。重复接种培养，获得活化菌种。

2、抑菌试验

将受试样品金银花提取物 Nl、 N2、 N3、 N4和开联番木鳖苷酸（NO ) 用 PBS稀释成 40mg/ml浓度，然后做 2倍比系列稀释（1 : 2、 1 : 4、 1 : 8、 1 ： 16、 1 ： 32、 1 ： 64、 1 ： 128 )。

将活化的菌悬液稀释成浓度相当于 0.5 麦氏比浊标准，经肉汤培养基 1： 10稀释后，向每孔中加 ΙΟΟμΙ菌液。将原液及倍比稀释后不同浓度的抗菌药物溶液分別加到灭菌的 96孔板中，第 1至第 8孔加药液，每孔 ΙΟΟμΙ, 此时，第 1孔至第 8孔药物浓度分別为 20、 10、 5、 2.5、 1.25、 0.625、 0.3125、 0.15625mg/mL

同时设菌液对照，即菌液加等容量培养液；

37°C培养 20h, 酶标仪于 630nm检测，用公式②计算细菌抑制率，并将获得的数据代入公式①计算比距，比距与低于 50%的病变率病毒稀释度指数相加，获得半数抑菌浓度 ( Reed-Muench方法）。

比距 =(高于 50%抑制率 -50% )/(高于 50%抑制率 -低于 50%抑制率 ) 公式①

细菌抑制率 = (抑菌试验 OD值 -药物对照 OD值） / (菌液对照 OD值 -空白对照 OD值） ......公式②

结果详见表 6、 7。

体外抑菌（革兰氏阳性菌）试验结果

Nl l . lmg/ml 1.7mg/ml 1.4mg/ml

N2 2.6mg/ml 9.6mg/ml 1.9mg/ml

N3 5.2mg/ml 5.4mg/ml 4.9mg/ml

N4 25mg/ml 24mg/m 9.8mg/ml

从上述结果可以看出，具有一定含量的开联番木鳖苷酸的金银花提取物和开联番木鳖苷酸纯品对上述临床耐药细菌和芽孢菌都有一定的体外抑制作用，且对革兰氏阴性菌效果较革兰氏阳性菌效果突出。其中开联番木鳖苷酸对克雷伯氏杆菌、大肠埃希氏杆菌、铜绿假单胞菌的半数抑菌浓度均在 1 mg/ml左右，对革兰氏阳性芽孢杆菌半数抑菌浓度也达到 0.92mg/ml。

并且从上述结果来看，随着金银花提取物中含有的开联番木鳖苷酸含量的上升，其抑菌效果也更加明显，而开联番木鳖苷酸纯品的抑菌效果最佳，含量与提取物作用效果呈明显正相关，这进一步说明了开联番木鳖苷酸的抗菌作用。

值得重视的是，本研究特別采用了多重耐药菌，提示开联番木鳖苷酸对多重耐药菌的较强抗菌作用，具有重要的临床意义。实施例 3 金银花提取物对小鼠-克雷伯氏杆菌肺炎模型的疗效观察本实施例观察了实施例 1制备的金银花提取物 N1对小鼠-克雷伯氏杆菌肺炎模型的体内疗效。

本实施例采用的细菌试验株为表 1的克雷伯氏杆菌，具体分离自济南市第四人民医院临床肺炎患者痰液标本，耐药情况见表 1。

受试药物：金银花提取物 N 1 , 乳白色结晶状粉末。

硫酸庆大霉素注射液（规格： 2ml 8万单位；购自天津药业焦作有限公司，生产批号 09082732 )

注射用头孢他啶（规格： lg; 购自山东威奇达药业股份有限公司，生产批号 20081204 )

实验动物：昆明种鼠，雄性， 16~18g, 购自山东大学动物中心。

1、动物分组

将昆明鼠随机分为正常对照组，模型对照组，金银花提取物 N1疗效模型组大、中、小剂量组，抗药对照组（庆大霉素）和敏感药物对照组（头孢他啶）。每组 10只，共 70只动物。

2、模型制备

在乙醚麻醉下，将接种物緩緩滴入动物鼻腔，并将鼠体位直立，使接种液体进入气管支气管。其中正常对照组接种细菌培养基 50μΙ, 其余组的动物接种克雷伯氏杆菌菌液 5(^L (新鲜扩增的菌液稀释至 1.5xl0⁸CFU/ml )。

3、干预治疗

抗药对照组（庆大霉素组）每日肌肉注射庆大霉素 400单位 /只（ 200μ ), 每日 1次；

敏感药物对照组（头孢他啶 )每日注射 30mg/只（ 200μ )，每日 1次；金银花提取物 N1 疗效模型组每日注射金银花提取物 N1 ( 200μ∑ ) , 每日 1次，剂量见表 8;

正常对照组和模型对照组每 T日注射生理盐水 200μΙ^，每日 1次；连续干预治疗 6天。

表 8 金银花 II提 o取物 N1给药剂量

o

O

1

各实验组（除抗药对照组外）第 1-4 日采用尾静 II脉 o注射给药，第 5-6 曰 o

采用腹腔注射给药。

4、动物观察结果

T τ

与正常对照组比较，所有动物饮食减少，皮毛凌乱，模型组、受试药物 'J、剂量组和抗药对照组尤为显著。 II II

O O

第 5天，模型组死亡 2只，抗药对照组死亡 2只，受试药物小剂量组死卜亡 1只。死亡动物立刻做称重、解剖，肺脏组织用福尔马林固定，备做病。理学检查。

5、体重检测和剖检

在第 6天末次给药 2h后，将动物在乙醚麻醉下牵颈臼处死，称重并做剖检。

1 )体重分析

结果见下表 9。

表 9 体重分析结果

正常组与各组模型组与各组药物组与各组组别均数 ( X ) 标准差（ S )

比较比较比较正常组 21.5439 0.79959

模型组 18.5274 2.21512 大剂量 20.0214 1.81394

中剂量 20.3523 0.89170 2→4： p=0.032 3→4: ρ=0.614 小剂量 20.2090 1.77033 3→5 : ρ=0.827 抗药组 20.2331 1.34141 1→6： p=0.020 2→6: ρ=0.090 3→6: ρ=0.790 敏感组 20.0686 0.88956 2→10: ρ=0.064 3→10: ρ=0.943

2 )剖检

正常对照组动物可见肺组织呈乳白色，光泽；

模型对照组动物肺组织外观呈血红色，有紫红色斑点或斑块，有时可见整个肺叶呈实变（置福尔马林中 T T沉底）或个別肺叶的肺不张（肺叶萎缩成小

1

团）； O

金银花提取物 N1疗效模型组大 II II

II剂 II o o量组有 2只动物肺组织呈红色，也可 o o O O

见紫红色斑点，其余 8只动物肺组织肉 o眼 o卜观察与正常对照组动物相近，偶见表面分布有红色斑点；

(

N1中剂量组动物有 4只动物可见肺组织呈 T τ红n i色，并分布有紫红色斑点，其余 6只动物肺组织外观与大剂量组类似；

II II

剂量组动物肺组织多成红色，分布有紫红色 O

N1 小 O斑点，与模型组动物类似；

抗药对照组（庆大霉素）动物肺组织与模型组动物类似；

敏感药物对照组（头孢他啶）动物肺组织呈白色，偶见红色斑点。

6、动物肺组织病理学检查

将石蜡包埋 HE (苏木精-伊红）染色组织切片做显微镜检测。按照如下组织病例学评分系统进行评分，结果见表 10。

病理学评分系统（参考文献： [l]Martin RJ,Chu HW,Honour JM,Airway inflammation and bronchial hypersponsiveness after mycoplasma pneumoniaw infection in a murine model J Am J Reapir Cell Mol Biol.2001.24:577; [2] 晓红，辛得莉，侯安存等，小鼠肺炎支原体肺炎模型的建立及病理组织学评分方法的应用，重庆医学 2004: vol 33(9): 1338-1340 ):

A. 细支管、支气管周围浸润（部位的百分率）：

0 =无； 1 =少许 ( <25 % ); 2 =许多（ 25 % ~ 75 % ); 3 =所有 ( >75 % )。

B. 细支气管、支气管浸润的定性：

0 =无：偶见轻微的浸润，或支气管周围淋巴样细胞团块见于正常动物； 1 =轻：不正常，常常伴有间断的环； 2 =中度：完整的环或新月形的环，伴有<5个细胞的厚度； 3 =严重：完全的环，伴有 >5 ~ 10个细胞厚度。 C. 细支气管 /支气管腔渗出：

0 =无； 1=轻度： ≤25%月空闭合； 2 =重度： ≥25%月空闭合。

D. 血管周围浸润，（部位的百分率）：

0 =无； 1 =少（<10% ); 2 =许多（10% ~50% ); 3 =大多数 (>50% )

E. 实质性肺炎：

0 =无； 1=轻度：斑状实质性浸润； 2 =重度：斑和融合的实质性浸润。分数的计算 = A+3(B+C)+D+E=0-26分。

各实验组的病理学检测结果见表 10。表 10 动物病理学检测评分结果

( ±s, n=10)

从上表结果可以看出，金银花提取物 N1具有显著的体内抗肺炎克雷伯氏杆菌 -小鼠肺炎的效果，且呈一定的量效关系，进一步说明了其活性成分开联番木鳖苷酸的抗菌作用。

Claims

1、用作细菌所引起疾病的预防剂和 /或治疗剂的开联番木鳖苷酸。

2、根据权利要求 1所述的开联番木鳖苷酸，其特征在于，所述开联番木鳖苷酸提取自金银花或其基源植物忍冬或同属其他植物。

3、根据权利要求 1所述的开联番木鳖苷酸，其特征在于，所述开联番木鳖苷酸通过包括以下步骤的方法制备：

( 2 )将经步骤（ 1 )得到的提取液经常压或减压浓缩干燥得到浸膏，或经喷雾干燥得到粉末，再用水溶解后，用含量不大于 95体积％的 C_rC₆烷醇水溶液进行沉淀或沉降，得到沉淀物或溶解液浓缩物；

( 3 )将经步骤（ 2 )得到的沉淀物或溶解液浓缩物用色谱方法分离纯化，收集含有环烯醚萜类化合物的洗脱液，其中所述的色谱方法选自大孔吸附树脂柱色谱法、正相硅胶色谱法和反相硅胶色谱法中的一种或多种。

4、根据权利要求 3所述的开联番木鳖苷酸，其特征在于，所述方法包括：

5、根据权利要求 1 所述的开联番木鳖苷酸，其特征在于，所述细菌为抗生素耐药菌，优选为多重抗生素耐药菌；

其中，所述抗生素选自氨苄西林、青霉烷砜、哌拉西林、他唑巴坦、阿莫西林、克拉维酸、头孢唑林、头孢呋辛、头孢曲松、头孢呋新钠、舒普深、左旋氧氟、头孢噻肟、头孢他啶、亚胺培南、头孢吡肟、头孢西丁、庆大霉素、阿米卡星、环丙沙星、氯霉素、复方新诺明、四环素、呋喃妥因、氨曲南、环丙沙星、诺氟沙星、氨卡、舒巴坦、替卡西林、棒酸、妥布霉素、特治星、亚胺培南、米诺环素、美罗培南、青霉素、苯唑西林、红霉素、万古霉素、利福平和克林霉素中的一种或多种。

6、根据权利要求 5所述的开联番木鳖苷酸，其特征在于，所述细菌为多重抗生素耐药的革兰氏阴性菌；

优选地，所述多重抗生素耐药的革兰氏阴性菌选自大肠杆菌、铜绿假单胞菌、克雷伯氏杆菌、鲍曼不动杆菌、变形杆菌、肠科杆菌属、流感嗜血杆菌、肺炎杆菌和卡他菌属中的一种或多种；

进一步优选地，所述多重抗生素耐药的革兰氏阴性菌为大肠杆菌、铜绿假单胞菌和 /或克雷伯氏杆菌。

7、根据权利要求 5所述的开联番木鳖苷酸，其特征在于，所述细菌为多重抗生素耐药的革兰氏阳性菌；

优选地，所述多重抗生素耐药的革兰氏阳性菌选自金黄色葡萄球菌、耐曱氧西林金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌 A组、肺炎链球菌、枯草芽孢杆菌和表皮葡萄球菌中的一种或多种；

进一步优选地，所述多重抗生素耐药的革兰氏阳性菌为耐曱氧西林金黄色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和 /或表皮葡萄球菌。

8、根据权利要求 1 所述的开联番木鳖苷酸，其特征在于，所述细菌所引起疾病为细菌引起的感染类疾病，特別是抗生素耐药菌引起的感染类疾病，例如消化系统感染，血液系统感染，呼吸系统感染，尿路感染，中枢神经系统感染，骨关节感染，耳、乳突和 /或鼻窦感染以及皮肤软组织感染中的一种或多种；

优选地，所述细菌所引起疾病为由抗生素耐药细菌引起的呼吸系统感染。

9、根据权利要求 8所述的开联番木鳖苷酸，其特征在于，所述细菌所引起疾病为多重抗生素耐药的革兰氏阴性菌引起的呼吸系统感染；

进一步优选地，所述细菌所引起疾病为多重抗生素耐药的革兰氏阴性菌引起的感染性肺炎；

更优选地，所述细菌所引起疾病为多重抗生素耐药的革兰氏阴性菌引起的院内感染性肺炎；

再优选地，所述细菌所引起疾病为多重抗生素耐药的克雷伯氏杆菌引起的院内感染性肺炎。

10、根据权利要求 8所述的开联番木鳖苷酸，其特征在于，所述细菌所引起疾病为多重抗生素耐药的革兰氏阳性菌引起的呼吸系统感染；

优选地，所述细菌所引起疾病为多重抗生素耐药的革兰氏阳性菌引起的肺炎；

进一步优选地，所述细菌所引起疾病为耐曱氧西林金黄色葡萄球菌引起的肺炎。

11、一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含根据权利要求 1至 10中任一项所述的开联番木鳖苷酸；

优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体和 /或赋形剂。

12、根据权利要求 1至 10中任一项所述的开联番木鳖苷酸或根据权利要求 11所述的药物组合物在制备用于预防和 /或治疗细菌所引起疾病的药物中的用途。

13、根据权利要求 12所述的用途，其特征在于，所述细菌为抗生素耐药菌，优选为多重抗生素耐药菌。

14、根据权利要求 13所述的用途，其特征在于，所述细菌为多重抗生素耐药的革兰氏阴性菌；

15、根据权利要求 13所述的用途，其特征在于，所述细菌为多重抗生素耐药的革兰氏阳性菌；

进一步优选地，所述多重抗生素耐药的革兰氏阳性菌为耐曱氧西林金黄色葡萄球菌和 /或金黄色葡萄球菌。

16、根据权利要求 12所述的用途，其特征在于，所述细菌所引起疾病为细菌引起的感染类疾病，特別是抗生素耐药菌引起的感染类疾病，例如消化系统感染，血液系统感染，呼吸系统感染，尿路感染，中枢神经系统感染，骨关节感染，耳、乳突和 /或鼻窦感染以及皮肤软组织感染中的一种或多种；优选地，所述细菌所引起疾病为由所述抗生素耐药细菌引起的呼吸系统感染。

17、根据权利要求至 16所述的用途，其特征在于，所述细菌所引起疾病为多重抗生素耐药的革兰氏阴性菌引起的呼吸系统感染；

18、根据权利要求 16所述的用途，其特征在于，所述细菌所引起疾病为多重抗生素耐药的革兰氏阳性菌引起的呼吸系统感染；

19、一种预防和 /或治疗细菌所引起疾病的方法，其特征在于，所述方法包括给有此需要的患者施用治疗有效量的根据权利要求 1至 10中任一项所述的开联番木鳖苷酸和 /或根据权利要求 11所述的药物组合物。

20、根据权利要求 19所述的方法，其特征在于，所述细菌为抗生素耐药菌，优选为多重抗生素耐药菌。

21、根据权利要求 20所述的方法，其特征在于，所述细菌为多重抗生素耐药的革兰氏阴性菌；

22、根据权利要求 20所述的方法，其特征在于，所述细菌为多重抗生素耐药的革兰氏阳性菌；

优选地，所述多重抗生素耐药的革兰氏阳性菌选自金黄色葡萄球菌、耐曱氧西林金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌 A组、肺炎链球菌、枯草芽孢杆菌和表皮葡萄球菌中的一种或多种；进一步优选地，所述多重抗生素耐药的革兰氏阳性菌为耐曱氧西林金黄色葡萄球菌和 /或金黄色葡萄球菌。

23、根据权利要求 19所述的方法，其特征在于，所述细菌所引起疾病为细菌引起的感染类疾病，特別是抗生素耐药菌引起的感染类疾病，例如消化系统感染，血液系统感染，呼吸系统感染，尿路感染，中枢神经系统感染，骨关节感染，耳、乳突和 /或鼻窦感染以及皮肤软组织感染中的一种或多种；优选地，所述细菌所引起疾病为由所述抗生素耐药细菌引起的呼吸系统感染。

24、根据权利要求至 23所述的方法，其特征在于，所述细菌所引起疾病为多重抗生素耐药的革兰氏阴性菌引起的呼吸系统感染；

25、根据权利要求 23所述的方法，其特征在于，所述细菌所引起疾病为多重抗生素耐药的革兰氏阳性菌引起的呼吸系统感染；