CN110483540A - 含氮杂环混源萜类物质的制备及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种具有显著抗肿瘤活性的氮杂环混源萜类物质的制备及应用，该类物质是从真菌Clitocybe clavipes中分离得到，其特点在于七元氮杂环稠合苯并十元碳环，及其对血液瘤和实体瘤的细胞毒作用、诱导凋亡作用、影响细胞周期作用及其在肿瘤的临床预防和治疗中的应用。

Description

含氮杂环混源萜类物质的制备及应用
技术领域
本发明涉及一类含氮杂环混源萜类物质的提取制备及其在肿瘤的化学预防和治疗中的应用。
背景技术
苯并十元碳环混源萜类基本骨架是结构中香叶基片段与芳环片段通过两个碳碳键相连形成具有苯并十元碳环结构单元的一类化合物。该类化合物结构独特，自然界分布稀少，迄今为止，仅从植物界和真菌界中发现24个苯并十元碳环混源萜。然而该类化合物具有广泛而显著的生物活性包括抗细菌，抗真菌，抗肿瘤，心肌保护以及神经保护等，其中Clavilactone D具有很好的抑制生长因子受体(EGFR)酪氨酸激酶的活性(IC50＝5.5μM)和潜在的药物开发价值。基于该类物质的罕见结构和良好的药理活性，吸引了国内外有机合成学家的注意，从2006年至今，Barrett,Takao,Yoshimitsu,Li和Lindel五个团队在J.Am.Chem.Soc.,Angew.Chem.Int.Ed.,Org.Lett.以及J.Org.Chem.等权威杂志对该类化合物进行了全合成报道。
发明内容
本发明的目的是提供一类含氮杂环混源萜类物质的提取制备及其在肿瘤的化学预防和治疗中的应用。
根据本发明的一个方面，提供了具有抗肿瘤活性的氮杂环混源萜类化合物，其化学结构选自：
根据本发明的化合物，其可以为七元氮杂环稠合苯并十元碳环，或2，3位存在取代基的醌并十元碳环。该化合物还可以包括各位置存在取代基的系列衍生物质。
根据本发明的其它方面，上述化合物可以应用于肿瘤例如人宫颈癌、结肠癌、肝癌或肺癌的临床预防和/或治疗，例如制备成相应药物；也可以应用在保健品和/或食品中。
根据本发明的又一方面，还提供了上述化合物的制取方法，包括：
将真菌Clitocybe clavipes形成固体发酵物；
用乙酸乙酯萃取固体发酵物得到浸膏；
借助正相硅胶填料，用体积比为10:1的石油醚-乙酸乙酯洗脱浸膏得到洗脱馏分；以及
将所得洗脱馏分经反相高效液相制备色谱(仪)进一步分离纯化，分别得到化合物1、2和3。
本发明通过上述植物化学分离手段从真菌Clitocybe clavipes中同时分离出具有抗肿瘤活性的三个混源萜类化合物，制取方法简单、环保且成本低。发明人意外发现，仅能通过体积比为10:1的石油醚-乙酸乙酯来洗脱Clitocybe clavipes真菌浸膏才能分离得到化合物1、2和3，这或许与这三种化合物单体结构中存在不饱和内酯和杂原子所形成的极性有关。
具体实施方式
化合物1-3的制取
实施例
将真菌Clitocybe clavipes形成固体发酵物；用乙酸乙酯萃取固体发酵物得到浸膏；借助正相硅胶填料，用体积比为10:1的石油醚-乙酸乙酯洗脱浸膏得到洗脱馏分；最后将所得洗脱流分经反相高效液相制备色谱仪进一步分离纯化，分别得到化合物1、2和3。
化合物1结构确证：HR-ESIMS显示[M+Na]+为m/z 376.1153(计算值，376.1161)，结合核磁特征可得分子式为C20H19NO5，不饱和度为12。红外光谱表明该化合物含有氨基基团(3356cm-1)和羰基基团(1729cm-1)。核磁共振氢谱数据δH(ppm，CDCl3，600MHz)：H-6(6.08，s)，H-7(3.96，s)，H-9A(2.69，d，J＝12.0Hz)，H-9B(1.26，m)，H-10A(2.40，m)，H-10B(2.22，m)，H-11(5.30，t，J＝7.2Hz)，H-13A(3.85，d，J＝13.8)，H-13B(2.85，d，J＝13.8)，3H-15(1.52，s)，H-17(6.78，d，J＝12.0)，H-18(6.04，m)，H-18(2.62，m)，2H-19(2.62，m)，2H-20(3.55，m)，-NH-(6.46，s)；核磁共振碳谱数据δC(ppm，CDCl3，125Hz)：183.0(C，C-1)，110.6(C，C-2)，142.9(C，C-3)，182.2(C，C-4)，152.4(C，C-5)，72.1(CH，C-6)，62.9(CH，C-7)，60.8(C，C-8)，24.8(CH2，C-9)，22.9(C，C-10)，123.6(CH，C-11)，135.8(C，C-12)，27.6(CH2，C-13)，133.2(C，C-14)，23.2(CH3，C-15)，171.7(C，C-16)，122.8(CH，C-17)，131.7(CH，C-18)，33.4.(CH2，C-19)，45.2(CH2，C-20)。1D NMR谱和HSQC谱显示有20个碳信号，分别为一个甲基，五个亚甲基，五个次甲基(三个烯烃碳)以及九个季碳(分别为三个酮羰基，一个烯烃碳)。其中10个碳信号δC 110.6(C-2)，122.8(C-17)，123.6(C-11)，131.7(C-18)，133.2(C-14)，135.8(C-12)，142.9(C-3)，152.4(C-5)，182.2(C-4)和183.0(C-1)表明该化合物含有一个对苯二醌结构片段和两个双键。在COSY谱中，H-20与H-19和-NH-相关；H-19与H-20和H-18相关；H-17和H-18相关证明结构中-CH＝CH-(CH2)2-NH-片段的存在。H-11与H-10A和H-10B相关以及H-10A与H-9A和H-9B相关表明结构中＝CH-(CH2)2-片段的存在。在HMBC谱中，亚胺质子与C-4相关；H-17与C-1和C-19相关；H-18与C-2，C-19和C-20相关表明结构中存在一个七元杂环且氮取代在对苯二醌的C-3位。H-6与C-4，C-5，C-7，C-8和C-16相关；H-7与C-6和C-16相关以及H-13与C-1，C-11，C-12，C-14和C-15相关说明结构中α，β-环氧内酯单元与C-5相连，而-CH2C(CH3)＝CH-(CH2)2-单元与C-14相连。考虑结构有12个不饱和度，确定C-7与C-8相连形成结构中的苯并十元碳环。综合氢谱、碳谱、HMBC谱和NOESY谱，以及文献关于相关类型核磁数据，可基本确定该化合物结构如图所示，立体构型进一步通过ECD试验确定，理论值与实验值基本一致，化合物1的结构最终通过单晶衍射确定。
化合物2结构确证：HR-ESIMS显示[M+Na]+为m/z 376.1163(计算值,376.1161)，结合核磁特征可得分子式为C20H19NO5，不饱和度为12。核磁共振氢谱数据δH(ppm，CDCl3，600MHz)：H-6(6.29，s)，H-7(3.94，s)，H-9A(2.69，d，J＝13.2Hz)，H-9B(1.27，m)，H-10A(2.38，m)，H-10B(2.23，m)，H-11(5.31，t，J＝7.2Hz)，H-13A(3.58，d，J＝14.4Hz)，H-13B(2.91，d，J＝14.4Hz)，3H-15(1.51，s)，H-17(6.78，d，J＝11.4Hz)，H-18(6.05，m)，2H-19(2.63，m)，2H-20(3.49，3.58，m)，-NH-(6.43，s)；核磁共振碳谱数据δC(ppm，CDCl3，125Hz)：184.0(C，C-1)，143.3(C，C-2)，109.8(C，C-3)，182.2(C，C-4)，144.6(C，C-5)，72.7(CH，C-6)，63.1(CH，C-7)，60.8(C，C-8)，24.8(CH2，C-9)，22.9(C，C-10)，124.1(CH，C-11)，135.2(C，C-12)，26.6(CH2，C-13)，138.1(C，C-14)，23.0(CH3，C-15)，171.9(C，C-16)，121.9(CH，C-17)，131.9(CH，C-18)，33.4(CH2，C-19)，45.2(CH2，C-20)。通过比较化合物2与化合物1的1HNMR和13C APT，我们发现二者的结构十分相似，可能为同分异构体。HMBC谱中，亚胺质子δH6.43与C-1存在相关，确定化合物2中-NH-取代在C-2位，从而确定化合物2的平面结构。其立体构型通过ECD试验确定，理论值与实验值基本一致。
化合物3结构确证：HR-ESIMS显示[M+H]+为m/z 338.1184(计算值，338.1392)，结合核磁特征可得分子式为C20H19NO4，不饱和度为12。核磁共振氢谱数据δH(ppm，CDCl3，600MHz)：H-6(6.82，s)，H-7(6.73，s)，H-9A(2.83，m)，H-9B(2.27，m)，2H-10(1.89，m)，H-11(5.15，t，J＝7.2Hz)，H-13A(3.30，d，J＝13.8Hz)，H-13B(2.38，d，J＝13.8Hz)，3H-15(1.51，s)，H-17(6.80，d，J＝11.4Hz)，H-18(6.04，m)，2H-19(2.62，m)，2H-20(3.58，m)；核磁共振碳谱数据δC(ppm，CDCl3，125Hz)：184.2(C，C-1)，143.3(C，C-2)，109.5(C，C-3)，182.2(C，C-4)，143.4或143.3(C，C-5)，74.6(CH，C-6)，148.3(CH，C-7)，129.5(CH，C-8)，25.5(CH2，C-9)，24.7(C，C-10)，122.9(CH，C-11)，138.3(C，C-12)，25.3(CH2，C-13)，136.9(C，C-14)，23.3(CH3，C-15)，174.7(C，C-16)，122.0(CH，C-17)，131.6(CH，C-18)，33.4.(CH2，C-19)，45.2(CH2，C-20)。通过比较化合物3与化合物2的1H NMR和13C APT，我们发现二者的结构十分相似，唯一的不同时化合物3中多了两个烯碳信号(δC 148.3和δC129.5)，而化合物2中的两个环氧碳信号消失，表明化合物3中的双键代替了环氧部分。综合一维和二维谱图可基本确定该化合物结构。其立体构型进一步通过ECD试验确定，理论值与实验值基本一致。
对比例
其它同实施例1，不同之处在于分别用体积比为30:1、5:1和1:1的石油醚-乙酸乙酯以及体积比为20:1、10:1、5:1和1:1的二氯烷-甲醇替代体积比为10:1的石油醚-乙酸乙酯进行洗脱共得到7个对照馏分；之后经反相高效液相制备色谱仪进一步分离纯化，经验证所得均非上述化合物1、2或3。
细胞毒性实验
利用MTT比色法，对各化合物进行活性筛选。选取人宫颈癌细胞Hela，人结肠癌细胞HCT-8，人肝癌细胞HepG2、人肺癌细胞A549培养基稀释后，以6×104/ml的密度接种于96孔板，每孔100μl.培养箱中正常培养24小时后，加药。使药物的最终浓度分别为2.5μM(1组)，5μM(2组)，10μM(3组)，20Μm(四组)，40μM(5组)，顺铂(Cisplatin)做为阳性药。共设5个浓度，每个浓度3个复孔，并设空白组。培养48小时后，于每孔加MTT 10μl染色。继续培养四小时后，吸弃原培养液，每孔加入DMSO 100μl，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解，并于酶联免疫检测仪570nm波长处检测光密度值，结果如下表1。
表1化合物1-3的体外抗肿瘤活性筛选

Claims (7)

1.具有抗肿瘤活性的氮杂环混源萜类化合物，其化学结构选自：
2.根据权利要求1所述的化合物，其为七元氮杂环稠合苯并十元碳环，或2，3位存在取代基的醌并十元碳环。
3.根据权利要求2所述的化合物，包括各位置存在取代基的系列衍生物质。
4.根据权利要求1所述的化合物在肿瘤的临床预防和/或治疗中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其中肿瘤包括人宫颈癌、结肠癌、肝癌或肺癌。
6.根据权利要求1所述的化合物在保健品和/或食品中的应用。
7.根据权利要求1所述的化合物的制取方法，包括：
将真菌Clitocybe clavipes形成固体发酵物；
用乙酸乙酯萃取固体发酵物得到浸膏；
借助正相硅胶填料，用体积比为10:1的石油醚-乙酸乙酯洗脱浸膏得到洗脱馏分；
以及将所得洗脱馏分经反相高效液相制备色谱进一步分离纯化，分别得到化合物1、2和3。
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