CN103025785A - 异戊二烯低聚物、聚异戊二烯和它们的制造方法、橡胶组合物以及充气轮胎 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及下述式(1)所示的具有反式结构部、顺式结构部的异戊二烯低聚物,上述反式结构部中含有的原子或原子团的至少一个被其它的原子或原子团取代。此外,还涉及由该异戊二烯低聚物和异戊烯基二磷酸生物合成的聚异戊二烯。此外,还提供配合了该异戊二烯低聚物和/或该聚异戊二烯的橡胶组合物、以及将该橡胶组合物用于轮胎的各部件(例如,胎面、侧壁)的充气轮胎。[化1]式(1)中,n表示1~10的整数。m表示1~30的整数。Y表示羟基、甲酰基、羧基、酯基、羰基或下述式(2)所示的基团。[化2]
Description
技术领域
本发明涉及异戊二烯低聚物、聚异戊二烯和它们的制造方法、含有异戊二烯低聚物和/或聚异戊二烯的橡胶组合物、以及使用该橡胶组合物的充气轮胎。
背景技术
一直以来,橡胶产品中,以针对橡胶本来具有的特性赋予其新的特性为目的,根据其用途通过在橡胶组合物中引入各种材质和形状的填充剂等,使其体现所希望的特性。例如,汽车用的轮胎中,在作为有机物的橡胶相中引入二氧化硅、炭黑等填充剂,实现耐磨性、低发热性、湿抓地性能等特性的提高。
在这样的橡胶组合物中相对于橡胶相混合填充剂等时,以提高两者的亲和性、更好地提高低发热性和湿抓地性能等为目的,使用进行例如使具有含氮原子的基团且具有氯硫基的化合物与橡胶相中含有的橡胶分子反应的处理等,将相对于填充剂显示亲和性的官能团引入橡胶分子内的改性橡胶(改性二烯系聚合物)(例如,专利文献1、2)。
但是,已知通过在橡胶分子中引入规定的官能团的方法,难以在橡胶分子内的规定的位置上引入该官能团,结果,官能团特别是被引入到构成橡胶分子的主链的无规的位置上。这样,使用在主链上引入规定的官能团的橡胶分子时,橡胶分子和填充剂的结合状态是无规的,不仅难以获得希望的效果,而且在引入了该官能团的地方作为橡胶的特性下降,结果,存在作为橡胶整体的特性被损害的问题。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:日本专利特开2000-001573号公报
专利文献2:日本专利特开2000-001575号公报
发明内容
本发明的目的是解决上述课题,提供实质上只在分子的末端部分实施改性的异戊二烯低聚物、聚异戊二烯。此外还提供混合了该异戊二烯低聚物和/或该聚异戊二烯的橡胶组合物、以及在轮胎的各部件(例如,胎面、侧壁)使用该橡胶组合物的充气轮胎。
本发明涉及下述式(1)所示的具有反式结构部、顺式结构部的异戊二烯低聚物,上述反式结构部中含有的原子或原子团的至少一个被其它原子或原子团取代。
【化1】
(式(1)中,n表示1~10的整数。m表示1~30的整数。Y表示羟基、甲酰基、羧基、酯基、羰基或下述式(2)所示的基团。)
【化2】
优选下述式(1-1)中的II部分中含有的原子或原子团的至少一个被取代、下述式(1-1)中的III部分中含有的原子或原子团未被取代。
【化3】
上述反式结构部优选为下述式(a)~(s)中的任意一个。
【化4】
上述异戊二烯低聚物优选为由下述式(3)所示的、下述式(3)中的异戊二烯单元中含有的原子或原子团的至少一个被其它原子或原子团取代的烯丙基性二磷酸和异戊烯基二磷酸进行生物合成而得。
【化5】
(式(3)中,p表示1~10的整数。)
优选使用具有异戊二烯基转移酶活性的酶进行上述生物合成。
上述具有异戊二烯基转移酶活性的酶优选为以下[1]~[3]中任一项所记载的蛋白质。
[1]由序列号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22中的任意一个序列号所示的氨基酸序列构成的蛋白质。
[2]由序列号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22中的任意一个序列号所示的氨基酸序列中包含1或多个氨基酸的取代、缺失、插入或附加的序列构成、且具有催化下述式(3)所示的、下述式(3)中的异戊二烯单元中含有的原子或原子团的至少一个被其它的原子或原子团取代的烯丙基性二磷酸与异戊烯基二磷酸的反应的活性的蛋白质。
[3]由与序列号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22中的任意一个序列号所示的氨基酸序列具有45%以上的序列同一性的氨基酸序列构成、且具有催化下述式(3)所示的、下述式(3)中的异戊二烯单元中含有的原子或原子团的至少一个被其它的原子或原子团取代的烯丙基性二磷酸与异戊烯基二磷酸的反应的活性的蛋白质。
【化6】
(式(3)中,p表示1~10的整数。)
本发明还涉及由下述式(3)所示的、下述式(3)中的异戊二烯单元中含有的原子或原子团的至少一个被其它的原子或原子团取代的烯丙基性二磷酸与异戊烯基二磷酸进行生物合成而得的上述异戊二烯低聚物的制造方法。
【化7】
(式(3)中,p表示1~10的整数。)
优选使用具有异戊二烯基转移酶活性的酶进行上述生物合成。
本发明还涉及下述式(4)所示的具有反式结构部、顺式结构部的聚异戊二烯,其中上述反式结构部中含有的原子或原子团的至少一个被其它的原子或原子团取代。
【化8】
(式(4)中,n表示1~10的整数。q表示30~40000的整数。Y表示羟基、甲酰基、羧基、酯基、羰基或下述式(2)所示的基团。)
【化9】
优选下述式(4-1)中的VI部分中含有的原子或原子团的至少一个被取代、下述式(4-1)中的VII部分中含有的原子或原子团未被取代。
【化10】
上述聚异戊二烯优选由上述异戊二烯低聚物与异戊烯基二磷酸进行生物合成而得。
本发明还涉及由上述异戊二烯低聚物与异戊烯基二磷酸进行生物合成的上述聚异戊二烯的制造方法。
本发明还涉及含有上述异戊二烯低聚物和/或上述聚异戊二烯的橡胶组合物。
本发明还涉及使用上述橡胶组合物制备的充气轮胎。
本发明的异戊二烯低聚物是上述式(1)所示的具有反式结构部、顺式结构部的异戊二烯低聚物,其中上述反式结构部中含有的原子或原子团的至少一个被其它的原子或原子团取代。此外,本发明的聚异戊二烯是上述式(4)所示的具有反式结构部、顺式结构部的聚异戊二烯,其中,上述反式结构部中含有的原子或原子团的至少一个被其它的原子或原子团取代。因此,本发明的异戊二烯低聚物以及本发明的聚异戊二烯实质上只对分子(橡胶分子)的末端部分进行改性,没有妨碍分子(橡胶分子)本来具有的特性,与二氧化硅等的填充剂的亲和性优异。因此,通过将本发明的异戊二烯低聚物和/或本发明的聚异戊二烯混合在橡胶组合物中,可以得到橡胶分子和填充剂的复合比以往水平高的橡胶组合物,可以提供例如低发热性、湿抓地性能优异的橡胶组合物。此外通过在轮胎的各部件(例如,胎面、侧壁)中使用该橡胶组合物,还能提供例如低发热性、湿抓地性能优异的充气轮胎。
具体实施方式
已知人工生物合成橡胶分子(聚异戊二烯)的工序中,通过使法尼基(フアルネシル)二磷酸(FPP)等的起始基质和异戊烯基二磷酸等的单体的混合物与异戊二烯基转移酶等的酶作用,生成对于起始基质加聚8个左右异戊二烯单元的异戊二烯低聚物。然后,通过混合含有对该异戊二烯低聚物进一步加聚异戊烯基二磷酸的酶的乳胶成分,生成对于低聚物连接多个异戊烯基二磷酸的聚异戊二烯。
这样,使单体对于起始基质依次键合而成为橡胶分子的各过程中,采用天然酶的加聚不可缺。
因此,生物合成橡胶分子(聚异戊二烯)时,作为起始基质和单体,使用的酶需要是催化反应的酶,结果,作为橡胶分子(聚异戊二烯)的原料所使用的起始基质和单体的结构受到限制。由于为了生成低聚物的酶所引起的限制,特别是关于起始基质被限定为天然存在的二甲基烯丙基性二磷酸、香叶基二磷酸、法尼基二磷酸、香叶基香叶基二磷酸等。
结果,人工生物合成的橡胶分子(聚异戊二烯)中,其结构的自由度受限,为了赋予天然橡胶所不具有的功能性而进行的自由的分子设计较难。
因此,例如,想获得引入了官能团等的橡胶分子(聚异戊二烯)时,与作为原料使用合成橡胶时同样,对于暂时生物合成的橡胶分子(聚异戊二烯),进行例如使其与具有含氮原子的基团且具有氯代硫基的化合物反应的处理等,在橡胶分子内引入对填充剂显示亲和性的官能团。
针对此,本发明发现通过使用结构的一部分被改性的法尼基二磷酸等作为异戊二烯低聚物或聚异戊二烯时的起始基质,可以制造在末端部附加了功能性的异戊二烯低聚物和聚异戊二烯,并基于此发现完成了本发明。
特别地,本发明发现,通过对天然存在的起始基质法尼基二磷酸等维持下述式(I)的I部分的结构,即使在其它部分引入希望的结构时也能通过使用天然存在的低聚物生成酶异戊二烯基转移酶或其一部分突变了的酶而生成异戊二烯低聚物,并基于该发现完成了本发明。理由还不清楚,认为是由于,异戊二烯基转移酶在起始基质的下述式(I)的I部分的结构上产生吸附,在其它部分的结构上比较迟钝。
【化11】
基于该知识,可以提供具备具有希望的特性的末端部的异戊二烯低聚物和聚异戊二烯,可以提供不损害异戊二烯低聚物和聚异戊二烯自身的特性而附加了各功能的异戊二烯低聚物和聚异戊二烯。
(异戊二烯低聚物)
本发明的异戊二烯低聚物是下述式(1)所示的具有反式结构部、顺式结构部的异戊二烯低聚物,上述反式结构部中含有的原子或原子团的至少一个被其它的原子或原子团取代。反式结构部表示反式结构的异戊二烯单元的重复部分(下述式(1)中的A部分)。此外,顺式结构部表示顺式结构的异戊二烯单元的重复部分(下述式(1)中的()m部分(B部分))。此外,本说明书中,下述式(2)所示的基团具有与磷原子键合的3个羟基,但是在水溶液中,这些羟基的一部分或全部解离(例如,成为下述式(5)所示的基团)。本说明书中,下述式(2)所示的基团是包括这样的羟基的一部分或全部解离的基团的概念。
本说明书中,将分子(橡胶分子)的末端部分改性是指,在分子(橡胶分子)的末端存在的反式结构部的规定部分引入希望的官能团或在分子(橡胶分子)的末端存在的反式结构部的规定部分引入不同结构。
【化12】
(式(1)中,n表示1~10的整数。m表示1~30的整数。Y表示羟基、甲酰基、羧基、酯基、羰基或下述式(2)所示的基团。)
【化13】
【化14】
本发明的异戊二烯低聚物具有接近天然橡胶的结构,与橡胶分子的相溶性高。此外,本发明的异戊二烯低聚物实质上只对分子的末端部分进行改性。即,本发明的异戊二烯低聚物由于具有位于顺式结构部的末端的羟基、甲酰基、羧基、酯基、羰基或上述式(2)所示的基团,且反式结构部中含有的原子或原子团的至少一个被其它的原子或原子团取代,所以不损害异戊二烯低聚物本来具有的特性而与二氧化硅等填充剂的相互作用强。这样,由于本发明的异戊二烯低聚物与橡胶的相溶性高,且与二氧化硅等填充剂的相互作用强,所以通过混合在橡胶组合物中,可以得到以比以往高的水平复合了橡胶分子和填充剂的橡胶组合物,例如,可以提高橡胶组合物的低发热性、湿抓地性能、耐磨性。
本发明的异戊二烯低聚物只在顺式结构部的末端部分或与反式结构部的末端接近的部分存在极性基团等。因此,与主链部分具有极性基团等的情况和只在顺式结构部的末端部分具有极性基团等的情况相比,没有阻碍异戊二烯低聚物本来具有的特性而二氧化硅等填充剂的分散性高,例如,低发热性、湿抓地性能、耐磨性的提高效果高。
此外,本发明的异戊二烯低聚物显示优异的抗菌活性。推测这是由于,构成异戊二烯低聚物的反式结构部中含有的原子或原子团的至少一个被其它的原子或原子团取代,所以与自然界中存在的通常的异戊二烯低聚物结构不同,故而具有对菌所具有的酶或辅酶的阻碍、核酸合成的阻碍、细胞膜合成的阻碍、细胞质膜的合成的阻碍、细胞膜的破坏、细胞质膜的破坏等作用。
式(1)的n表示1~10(优选1~4,更优选1~3)的整数。
式(1)的m表示1~30(优选1~10,更优选1~8)的整数。
式(1)的Y表示羟基(-OH)、甲酰基(-CHO)、羧基(-COOH)、酯基(-COOR)、羰基(-COR)或上述式(2)所示的基团。
酯基(-COOR)、羰基(-COR)的R表示碳原子数1~30(优选碳原子数1~17)的烷基。碳原子数1~30的烷基可以举出例如,甲基、乙基、丙基、丁基、戊基等。
从显示优异的抗菌性和与二氧化硅等填充剂的相互作用强这些方面考虑,式(1)的Y优选羟基、羧基。
上述式(1)中的反式结构部中含有的原子或原子团的至少一个被其它的原子或原子团取代。
反式结构部中含有的原子或原子团(被取代前的原子或原子团)可以举出例如,氢原子、甲基、亚甲基、碳原子、次甲基等。
上述其它的原子可以举出例如,氮原子、氧原子、硫原子、硅原子、碳原子等。其中,出于氮原子具有强分子间力、产生与酶和细胞膜的强相互作用的理由,关于抗菌性优选氮原子。
上述其它的原子团可以举出例如,乙酰氧基、烷氧基(优选碳原子数1~3的烷氧基、更优选甲氧基)、羟基、芳基(优选苯基)、烷基(优选碳原子数1~5的烷基、更优选乙基、叔丁基)、乙酰基、N-烷基-乙酰氨基(烷基的碳原子数优选1~5)、叠氮基等。
其中,出于氮原子具有强分子间力、产生与酶和细胞膜的强相互作用的理由,关于抗菌性优选N-烷基-乙酰氨基(更优选N-甲基-乙酰氨基、N-丁基-乙酰氨基)、叠氮基。
上述反式结构部中含有的原子或原子团的至少一个被其它的原子或原子团取代,但该取代优选为,反式结构部的异戊二烯单元的重复部分中,下述式(1-1)中的II部分中含有的原子或原子团的至少一个被取代、下述式(1-1)中的III部分中含有的原子或原子团未被取代。这是基于本发明的以下发现:通过对天然存在的起始基质法尼基二磷酸等维持上述式(I)的I部分的结构,即使其它部分引入希望的结构时,通过使用天然存在的低聚物生成酶异戊二烯基转移酶或其一部分突变了的酶,也可以生成异戊二烯低聚物。
【化15】
(式(1-1)中的n、m、Y与式(1)中的n、m、Y一样。)
上述式(1)中的反式结构部的具体例可以举出例如,下述式(a)~(s)所示的结构。其中,出于低发热性、湿抓地性能、耐磨性的提高效果高的理由,优选下述式(c)、(d)、(e)、(f)、(k)、(l)、(r)。此外,出于抗菌性优异的理由,优选下述式(g)~(q)所示的结构,更优选下述式(k)、(l)或(q)所示的结构。
【化16】
(异戊二烯低聚物的制造方法)
本发明的异戊二烯低聚物的制造方法可以举出例如,由下述式(3)所示的、下述式(3)中的异戊二烯单元中含有的原子或原子团的至少一个被其它的原子或原子团取代的烯丙基性二磷酸(以下,也称为烯丙基性二磷酸衍生物)与异戊烯基二磷酸生物合成的方法。此外,本说明书中,烯丙基性二磷酸衍生物具有与磷原子键合的3个羟基,在水溶液中,这些羟基的一部分或全部解离(例如,成为上述式(5)所示的基团)。本说明书中,烯丙基性二磷酸衍生物这个概念也包括这样的羟基的一部分或全部解离的化合物。
【化17】
(式(3)中,p表示1~10的整数。)
式(3)的p表示1~10(优选1~4,更优选1~3)的整数。
本说明书中,式(3)中的异戊二烯单元中含有的原子或原子团(被取代前的原子或原子团)可以例举与上述式(1)中的反式结构部中含有的原子或原子团(被取代前的原子或原子团)同样的原子或原子团。
本说明书中,取代式(3)中的异戊二烯单元中含有的原子或原子团的其它的原子或原子团可以例举与针对上述式(1)说明的其它的原子或其它的原子团同样的原子或原子团。
如上所述,取代优选在维持上述式(I)的I部分的结构的条件下取代。即,优选下述式(3-1)中的IV部分中含有的原子或原子团的至少一个被取代、下述式(3-1)中的V部分中含有的原子或原子团未被取代。由此,通过使用天然存在的低聚物生成酶异戊二烯基转移酶或其一部分突变了的酶,可以适宜地制造异戊二烯低聚物。
【化18】
(式(3-1)中的p与式(3)中的p一样。)
烯丙基性二磷酸衍生物的具体例可以举出例如,下述式(A)~(S)所示的化合物。
【化19】
本说明书中,OPP具有与磷原子键合的3个羟基,在水溶液中,这些羟基的一部分或全部解离(例如,成为上述式(5)所示的基团)。本说明书中,OPP这个概念也包括这样的羟基的一部分或全部解离的基团。
本领域技术人员可以参考实施例记载的方法由例如二甲基烯丙基二磷酸、香叶基二磷酸、法尼基二磷酸、香叶基香叶基二磷酸、香叶醇、金合欢醇、香叶基香叶醇等制造上述式(A)~(S)等所示的烯丙基性二磷酸衍生物。
由烯丙基性二磷酸衍生物与异戊烯基二磷酸生物合成本发明的异戊二烯低聚物的方法可以举出例如,使用具有异戊二烯基转移酶活性的酶进行的方法。具体而言,使烯丙基性二磷酸衍生物与异戊烯基二磷酸在具有异戊二烯基转移酶活性的酶的存在下反应即可。
本说明书中,具有异戊二烯基转移酶活性的酶是指,通过催化烯丙基性基质(烯丙基性二磷酸)与异戊烯基二磷酸之间的缩合反应并合成增加了1单元异戊二烯单元的新的烯丙基性二磷酸,对在烯丙基性基质(烯丙基性二磷酸)上依序连接异戊烯基二磷酸为Z型(新增的异戊二烯单元为顺式结构)的反应具有催化活性的酶。例如,可以举出催化以下反应的酶。
【化20】
上述具有异戊二烯基转移酶活性的酶已知大量存在(例如,Z-九异戊二烯基二磷酸合成酶(Z一ノナプレニルニリン酸合成酵素)(Ishii,K.等,(1986)Biochem,J.,233,773.)、十一异戊二烯基二磷酸(UPP)合成酶(Takahashi,I.和Ogura,K.(1982)J.Biochem.,92,1527.;Keenman,M.V.and Allen,C.M.(1974)Arch.Biochem.Biophys.,161,375.)等)。能够生成的最大的异戊二烯单元的数(上述式(1)的m)由各酶决定,因此,根据目的异戊二烯单元数(上述式(1)的m)改变使用的酶即可。
具有上述具有异戊二烯基转移酶活性的酶的生物可以举出例如,藤黄微球菌B-P26(Micrococcus luteus B-P26)、大肠杆菌(Escherichia coli)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)、北五加皮(Periploca sepium)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bachillus Stearothermophilus)、嗜酸热硫化叶菌(Sulfolobus acidocaldarius)、ATCC49426)等。
通过使烯丙基性二磷酸衍生物与异戊烯基二磷酸在具有异戊二烯基转移酶活性的酶的存在下反应,可以得到本发明的异戊二烯低聚物。具有异戊二烯基转移酶活性的酶的存在下是指,上述生物的培养物、从该培养物中分离的生物体、该生物体的处理物、从该培养物或该生物体中纯化的酶,为了表达具有异戊二烯基转移酶活性的酶(该酶也包括后述的突变酶)而通过基因工程的手法转化后的生物体(转化体)的培养物、从该培养物中分离的生物体、该生物体的处理物、从该培养物或该生物体中纯化的酶等存在的情况。
为了表达具有异戊二烯基转移酶活性的酶而被转化得到的生物体是通过以往公知的基因工程的方法而制备的转化体,制备方法将在后面叙述。
为了获得上述生物的生物体,将该生物在适当的培养基中培养即可。此目的的培养基只要是能使该生物增殖即可,没有特别限定,含有通常的碳源、氮源、无机离子、以及根据需要添加的有机营养源的通常的培养基即可。
例如,作为碳源只要是上述生物能够利用的碳源则可以任意使用,具体而言,可以使用葡萄糖、果糖、麦芽糖、直链淀粉等的糖类,山梨糖醇、乙醇、甘油等的醇类、富马酸、柠檬酸、醋酸、丙酸等的有机酸类及它们的盐类、石蜡等的碳水化合物类或它们的混合物等。
作为氮源可以使用硫酸铵、氯化铵等的无机盐的铵盐、富马酸铵、柠檬酸铵等的有机酸的铵盐、硝酸钠、硝酸钾等的硝酸盐、胨、酵母提取物、肉提取物、玉米浆等的有机氮化合物或它们的混合物。
可以适当混合使用其它的无机盐类、微量金属盐、维生素类、激素等通常的在培养基中使用的营养源。
培养条件没有特别的限制,例如,在有氧条件下、pH5~8、温度20~60℃的范围内一边适当控制pH和温度一边进行12~480小时左右的培养即可。
上述生物的培养物可以举出例如,通过上述的培养条件培养的上述生物的培养液、通过过滤等从该培养液分离生物(生物体)的培养滤液(培养上清液)等。此外,从上述培养物中分离的生物体可以举出例如,通过过滤、离心分离等从培养液分离的生物体(生物)等。
上述生物体的处理物可以举出例如,将从上述培养物中分离的生物体均化处理后的生物体破碎物、超声波处理后的生物体破碎物等。
从上述培养物或上述生物体纯化的酶是例如,对上述培养物或上述生物体中存在的酶进行盐析、离子交换色谱、亲和色谱、凝胶过滤色谱等公知的纯化操作而得到的酶。纯化酶的纯度没有特别限定。
通过使烯丙基性二磷酸衍生物和异戊烯基二磷酸在具有异戊二烯基转移酶活性的酶的存在下反应从而得到本发明的异戊二烯低聚物,具体而言,例如,通过在含有烯丙基性二磷酸衍生物和异戊烯基二磷酸的溶液中添加上述生物体的培养物或纯化酶等进行反应即可。此外,反应温度例如20~60℃、反应时间例如1~16小时、pH例如5~8即可。此外,也可以根据需要添加氯化镁、表面活性剂、2-巯基乙醇等。
通过上述反应得到的本发明的异戊二烯低聚物,通常,上述式(1)的Y是上述式(2)所示的基团或羟基。所述羟基通过上述式(2)所示的基团水解而生成。
此外,上述式(1)的Y为甲酰基的异戊二烯低聚物可以通过例如,将上述式(1)的Y为上述式(2)所示的基团的异戊二烯低聚物氧化而得到。
此外,上述式(1)的Y为羧基的异戊二烯低聚物可以通过例如,将上述式(1)的Y为上述式(2)所示的基团的异戊二烯低聚物氧化而得到。
此外,上述式(1)的Y为酯基的异戊二烯低聚物可以通过例如,将上述式(1)的Y为上述式(2)所示的基团的异戊二烯低聚物氧化、酯化而得到。
此外,上述式(1)的Y为羰基的异戊二烯低聚物可以通过例如,将上述式(1)的Y为上述式(2)所示的基团的异戊二烯低聚物氧化、酯化而得到。
本发明的异戊二烯低聚物除了有机合成起始基质的烯丙基性二磷酸衍生物以外,是通过生物合成而得到的,因此可以顾及到石油资源的枯竭和环境问题。
(具有异戊二烯基转移酶活性的酶)
接着,对具有异戊二烯基转移酶活性的酶进行说明。
作为上述生物所具有的具有异戊二烯基转移酶活性的酶的一例,可将来自藤黄微球菌B-P26(Micrococcus luteus B-P26)(Dr.L.Jeffries,可购自Walton Oaks Experimental StationVitamins,Ltd.)的十一异戊二烯基二磷酸合成酶的碱基序列和氨基酸序列分别示于序列表序列号1、2。来自藤黄微球菌B-P26的十一异戊二烯基二磷酸合成酶的碱基序列和氨基酸序列是公知的,收录于数据库DDBJ(日本DNA数据库)中(accetion no.AB004319(碱基序列)、accetion no.BAA31993.1(氨基酸序列))。
上述生物具有的酶(具有异戊二烯基转移酶活性的酶)的本来的基质(起始基质)是烯丙基性二磷酸。而本发明中作为起始基质使用的上述烯丙基性二磷酸衍生物原本是作为上述生物产生的酶的阻碍剂而发挥功能的物质。因此,上述生物产生的酶中经常会对上述烯丙基性二磷酸衍生物(尤其是上述式(G)~(Q)所示的化合物)的酶活性低。因此,本发明中,优选使用使对上述烯丙基性二磷酸衍生物的酶活性提高的突变酶。
使用突变酶时,通过基因工程的方法制备被转化为表达突变酶的生物体(转化体)即可。
发明人成功制备了来自上述藤黄微球菌B-P26的十一异戊二烯基二磷酸合成酶的突变酶并提高了对上述烯丙基性二磷酸衍生物的酶活性。
来自藤黄微球菌B-P26的十一异戊二烯基二磷酸合成酶的立体结构已经公知(数据库PDB(RCSB蛋白质数据库)、ID:1f75)。因此,发明人基于该立体结构的信息进行对接模拟,对位于烯丙基性二磷酸的二磷酸的烃部分附近的氨基酸,进行突变以改变侧链的长度或改变电荷能够提高对上述烯丙基性二磷酸衍生物的酶活性,基于这样的设计构思,制备了突变酶。具体而言,优选进行以下的(1)~(4)的任一种突变。
(1)31位的天冬酰胺被取代为丙氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、天冬氨酸
(2)91位的亮氨酸被天冬酰胺、天冬氨酸、甘氨酸、赖氨酸取代
(3)77位的天冬酰胺被丙氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、天冬氨酸取代
(4)95位的苯丙氨酸被丙氨酸、色氨酸、甘氨酸、天冬氨酸、精氨酸取代
具体而言,制备以下的突变酶。
突变酶N31A:31位的天冬酰胺被丙氨酸取代(碱基序列和氨基酸序列分别表示为序列表序列号3,4)
突变酶N77A:77位的天冬酰胺被丙氨酸取代(碱基序列和氨基酸序列分别表示为序列表序列号5,6)
突变酶L91N:91位的亮氨酸被天冬酰胺取代(碱基序列和氨基酸序列分别表示为序列表序列号7,8)
突变酶L91D:91位的亮氨酸被天冬氨酸取代(碱基序列和氨基酸序列分别表示为序列表序列号9,10)
突变酶N31Q:31位的天冬酰胺被谷氨酰胺取代(碱基序列和氨基酸序列分别表示为序列表序列号11,12)
突变酶N77Q:77位的天冬酰胺被谷氨酰胺取代(碱基序列和氨基酸序列分别表示为序列表序列号13,14)
突变酶L91G:91位的亮氨酸被甘氨酸取代(碱基序列和氨基酸序列分别表示为序列表序列号15,16)
突变酶L91K:91位的亮氨酸被赖氨酸取代(碱基序列和氨基酸序列分别表示为序列表序列号17,18)
突变酶F95A:95位的苯丙氨酸被丙氨酸取代(碱基序列和氨基酸序列分别表示为序列表序列号19,20)
突变酶F95W:95位的苯丙氨酸被色氨酸取代(碱基序列和氨基酸序列分别表示为序列表序列号21,22)
其中,优选突变酶N77A、突变酶L91D、突变酶L91K。
这里,对使用来自藤黄微球菌B-P26的十一异戊二烯基二磷酸合成酶作为野生型的酶的情况进行了说明,对于使用其它的具有异戊二烯基转移酶活性的酶作为野生型的酶的情况也可以通过同样的方法制备突变酶。
具有异戊二烯基转移酶活性的酶的具体例可以例举下述[1]。
[1]由序列号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22中的任意一个序列号所示的氨基酸序列构成的蛋白质
此外,已知,当酶的原来的氨基酸序列中,含有1个或多个氨基酸取代、缺失、插入或附加时,有时也具有酶活性。因此,具有异戊二烯基转移酶活性的酶的具体例也可以例举下述[2]。
[2]由序列号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22中的任意一个序列号所示的氨基酸序列中包含1或多个氨基酸的取代、缺失、插入或附加的序列构成、且具有催化下述式(3)表示的、下述式(3)中的异戊二烯单元中含有的原子或原子团的至少一个被其它的原子或原子团取代的烯丙基性二磷酸(烯丙基性二磷酸衍生物)与异戊烯基二磷酸反应的活性的蛋白质
【化21】
(式(3)中,p表示1~10的整数。)
为了维持催化烯丙基性二磷酸衍生物与异戊烯基二磷酸的反应的活性,优选含有1或多个氨基酸取代、缺失、插入或附加的氨基酸序列,更优选1或100个氨基酸,进一步优选1或75个氨基酸,特别优选1或50个氨基酸,最优选1或25个氨基酸,最最优选1或12个氨基酸,进一步最优选1或5个氨基酸,特别最优选含有1或3个氨基酸取代、缺失、插入或附加的氨基酸序列。
此外,已知具有与具有异戊二烯基转移酶活性的酶的氨基酸序列的序列同一性高的氨基酸序列的蛋白质也具有同样的活性。因此,具有异戊二烯基转移酶活性的酶的具体例还可以例举下述[3]。
[3]由与序列号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22中的任意一个序列号所示的氨基酸序列具有45%以上的序列同一性的氨基酸序列构成、且具有催化烯丙基性二磷酸衍生物与异戊烯基二磷酸的反应的活性的蛋白质
为了维持催化烯丙基性二磷酸衍生物与异戊烯基二磷酸的反应的活性,与序列号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22中的任意一个序列号所示的氨基酸序列的序列同一性优选45%以上,更优选60%以上,进一步优选70%以上,特别优选80%以上,最优选90%以上,最最优选95%以上,进一步最优选98%以上,特别最优选99%以上。
氨基酸序列和碱基序列的序列同一性可以使用Karlin和Altschul的アルゴリズムBLAST[Pro.Natl.Acad.Sci.USA,90,5873(1993)]和FASTA[Methods Enzymol.,183,63(1990)]测定。
确认具有催化烯丙基性二磷酸衍生物与异戊烯基二磷酸的反应的活性的蛋白质的方法有:例如,通过目前公知的方法制备表达该蛋白质的转化体,使用该转化体制备该蛋白质。然后,使用该蛋白质,采用HPLC(高效液相色谱法)、TLC(薄层色谱法)等进行基质或生成物的定量、定性,从而确认是否催化烯丙基性二磷酸衍生物与异戊烯基二磷酸的反应。
(编码具有异戊二烯基转移酶活性的酶的DNA)
此外,编码具有异戊二烯基转移酶活性的酶的DNA可以例举下述[1]~[3]。
[1]编码上述[1]~[3]的蛋白质的DNA
[2]由序列号1,3,5,7,9,11,13,15,17,19,21中的任意一个序列号所示的碱基序列构成的DNA
[3]同由与序列号1,3,5,7,9,11,13,15,17,19,21中的任意一个序列号所示的碱基序列互补的碱基序列构成的DNA在严格条件下杂交、且编码具有催化烯丙基性二磷酸衍生物与异戊烯基二磷酸的反应的活性的蛋白质的DNA
这里所说的“杂交”是在具有特定的碱基序列的DNA或该DNA的一部分上杂交DNA的工序。因此,该具有特定的碱基序列的DNA或该DNA的一部分的碱基序列可以是作为Northern印迹杂交(Northern blot)或Southern印迹杂交(Southern blot)解析的探针有用的或、能够用作为PCR(聚合酶链反应)解析的低聚核苷酸引物的长度的DNA。用作为探针的DNA可以例举至少100碱基以上,优选200碱基以上,更优选500碱基以上的DNA,也可以是至少10碱基以上、优选15碱基以上的DNA。
DNA的杂交实验方法是熟知的,例如,除了分子克隆实验指南第2版、第3版(2001年)、一般及分子细菌学方法(Methods for General and Molecular Bacteriology),ASM出版社(1994)、免疫方法手册(Immunology methods manual),学术出版社(Academic press)(分子(Molecular))中的记载以外,可以根据多数其它的标准教科书确定杂交条件并进行实验。
上述的严格条件可以例举例如,将DNA固定化的过滤器和探针DNA在含有50%甲酰胺、5×SSC(750mM的氯化钠、75mM的柠檬酸钠)、50mM的磷酸钠(pH7.6)、5×Denhardt溶液、10%的硫酸葡聚糖和20μg/l的改性三文鱼精子DNA的溶液中于42℃培养一晚后,在例如约65℃的0.2×SSC溶液中清洗该过滤器的条件,也可以使用较低的严格条件。严格条件的改变可以通过甲酰胺的浓度调整(甲酰胺的浓度越降低越是低严格)、盐浓度和温度条件的改变来实现。低严格条件可以例举例如,在含有6×SSCE(20×SSCE是3mol/l的氯化钠、0.2mol/l的磷酸二氢钠、0.02mol/l的EDTA、pH7.4)、0.5%的SDS、30%的甲酰胺、100μg/l的改性后的三文鱼精子DNA的溶液中,37℃下培养一晚后,使用50℃的1×SSC、0.1%SDS溶液清洗的条件。此外,更低的严格条件可以例举,在上述的低严格条件中,使用高盐浓度(例如5×SSC)的溶液进行杂交后,清洗的条件。
上述各种条件可以通过添加或改变用于抑制杂交实验的背景的阻断试剂来设定。为了优化条件,上述阻断试剂的添加可以伴随着杂交条件的改变。
能够在上述严格条件下杂交的DNA可以例举例如,由使用BLAST和FASTA等的程序基于上述参数计算时与序列号1,3,5,7,9,11,13,15,17,19,21中的任意一个序列号所示的碱基序列具有至少80%以上、优选90%以上、更优选95%以上、进一步优选98%以上、特别优选99%以上的序列同一性的碱基序列构成的DNA。
与上述DNA在严格条件下杂交的DNA是编码具有催化烯丙基性二磷酸衍生物与异戊烯基二磷酸的反应的活性的蛋白质的DNA可以按照如下的方法确认,例如,通过目前公知的方法制备表达该DNA的重组DNA,将该重组DNA引入宿主细胞得到生物体,培养所述生物体,从得到的培养物纯化该蛋白质,然后,使用该蛋白质,通过HPLC、TLC等进行基质或生成物的定量、定性从而确认能否催化烯丙基性二磷酸衍生物与异戊烯基二磷酸的反应。
突变酶和编码该突变酶的DNA可以使用《分子克隆实验指南(Molecular Cloning)》,第二版,冷泉港实验室出版社(1989)、分子生物学现行协议(Current Protocols in MolecularBiology),John Wiley&Sons(1987-1997)、核酸研究(Nucleic Acids Research),10,6487(1982)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,79,6409(1982)、Gene,34,315(1985)、核酸研究,13,4431(1985)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82,488(1985)等记载的定点突变导入法,在例如序列号1所示的碱基序列(来自藤黄微球菌B-P26的十一异戊二烯基二磷酸合成酶的碱基序列)导入定点突变而获得。
(转化体)
接着,简单说明为了表达具有异戊二烯基转移酶活性的酶而被转化得到的生物体(转化体)的制备方法。这里,主要对为了表达上述突变酶而被转化得到的转化体的制备方法进行简单说明。这样的转化体,只要具有上述设计理念,可以通过目前公知的方法制备。
引入突变时,首先,为了在目标部位引入突变,设计引物。引物的碱基序列可以举出例如,实施例记载的碱基序列(参照序列表序列号23~42)等。接着,将例如具有序列号1所示的碱基序列(来自藤黄微球菌B-P26十一异戊二烯基二磷酸合成酶的碱基序列)的DNA作为模板DNA,使用上述引物通过PCR法等将引入突变的直链DNA扩增。然后,使用适当的限制酶等将得到的直链DNA插入到适当的表达载体的启动子的下游从而制备重组DNA。然后,通过将该重组DNA引入与该表达载体适合的宿主细胞从而可以得到转化体。
此外,例如,使用适当的限制酶等在适当的表达载体的启动子下游插入含有序列号1所示的碱基序列(来自藤黄微球菌B-P26的十一异戊二烯基二磷酸合成酶的碱基序列)的DNA,通过聚合酶使以该表达载体为模板DNA并使用上述引物通过PCR法等引入突变的DNA为环状从而制备重组DNA。然后,通过将该重组DNA引入到与该表达载体适合的宿主细胞从而可以得到转化体。
没有引入突变时,例如,使用适当的限制酶等在适当的表达载体的启动子的下游插入含有序列号1所示的碱基序列(来自藤黄微球菌B-P26十一异戊二烯基二磷酸合成酶的碱基序列)的DNA,从而制备重组DNA。然后,通过将该重组DNA引入到与该表达载体适合的宿主细胞从而可以得到转化体。
此外,上述说明中对含有已知的序列号1所示的碱基序列(来自藤黄微球菌B-P26十一异戊二烯基二磷酸合成酶的碱基序列)的DNA进行了说明,也可以使用编码来自上述生物的其它具有异戊二烯基转移酶活性的酶、或来自上述生物以外的生物的具有异戊二烯基转移酶活性的酶的DNA。此时,通过公知的方法,例如,将序列号1所示的碱基序列的一部分作为探针,通过筛选选定编码具有异戊二烯基转移酶活性的酶的DNA并分离即可。将DNA分子用作为探针分离目标DNA分子的方法在《分子克隆实验指南(MolecularCloning)》,第二版,冷泉港实验室出版社(1989)等中记载。
此外,也可以通过上述的纯化操作纯化来自上述生物的具有异戊二烯基转移酶活性的酶并确定该纯化酶的氨基酸序列,由此来确定编码该酶的DNA并进行分离。
宿主细胞可以使用微生物、酵母、动物细胞、昆虫细胞等、植物细胞等、只要能够表达目标基因即可。
表达载体可以使用能够在上述宿主细胞中自主复制或嵌入染色体中、在能够转录上述重组DNA的位置含有启动子的表达载体。
使用细菌等原核生物作为宿主细胞时,上述重组DNA优选在原核生物中能够自主复制,同时,由启动子、核糖体结合序列、编码具有异戊二烯基转移酶活性的酶的DNA、转录终止序列构成的重组DNA。此外,也可以含有控制启动子的基因。
表达载体可以例举pColdI(タカラバイオ社制)、pCDF-1b、pRSF-1b(均为ノバジエン社制)、pMAL-c2x(ニユ一イングランドバイオラブス社制)、pGEX-4T-1(ジ一イ一ヘルスケアバイオサイエンス社制)、pTrcHis(インビトロジエン社制)、pSE280(インビトロジエン社制)、pGEMEX-1(プロメガ社制)、pQE-30(キアゲン社制)、pET-3~pET-52(ノバジエン社制)、pKYP10(日本专利特开昭58-110600)、pKYP200[Agric.Biol.Chem.,48,669(1984)]、pLSA1[Agric.Biol.Chem.,53,277(1989)]、pGEL1[Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,82,4306(1985)]、pBluescriptII SK(+)、pBluescript IIKS(-)(ストラタジ一ン社制)、pTrS30[由大肠杆菌JM109/pTrS30(FERM BP-5407)配制]、pTrS32[由大肠杆菌JM109/pTrS32(FERM BP-5408)配制]、pPAC31(WO98/12343)、pUC19[Gene,33,103(1985)]、pSTV28(タカラバイオ社制)、pUC118(タカラバイオ社制)、pPA1(日本专利特开昭63-233798)等。
启动子只要是在大肠杆菌等的宿主细胞中发挥功能的启动子即可,可以是任何启动子。可以举出例如,trp启动子(Ptrp)、T7启动子、lac启动子(Plac)、PL启动子、PR启动子、PSE启动子等的、来自大肠杆菌和噬菌体等的启动子、SPO1启动子、SPO2启动子、penP启动子等。此外,也可以使用使两个Ptrp串联的启动子、tac启动子、lacT7启动子、let I启动子这样人为改变设计的启动子等。
此外,还可以使用用于在属于芽孢杆菌的微生物中表达的xylA启动子[Appl.Microbiol.Biotechnol.,35,594-599(1991)]和用于在属于棒杆菌(Corynebacterium)属的微生物中表达的P54-6启动子[Appl.Microbiol.Biotechnol.,53,674-679(2000)]等。
优选使用将作为核糖体结合序列的核糖体结合位点(Shine-Dalgamo)序列与起始密码子之间调节为适当距离(例如6~18碱基)的质粒。
原核生物可以例举属于埃希氏菌属、沙雷氏菌属(Serratia)、芽孢杆菌、短杆菌属(Brevibacterium)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、微杆菌属(Microbacterium)、假单胞菌属(Pseudomonas)、农杆菌属(Agrobacterium)、脂环酸杆菌属(Alicyclobacillus)、太湖念珠藻属(Anabena)、组囊蓝细菌属(Anacystis)、节杆菌属(Arthrobacter)、固氮菌属(Azotobacter)、着色菌属(Chromatium)、欧文氏菌属(Erwinia)、甲基杆菌属(Methylobacterium)、席蓝细菌属(Phormidium)、红细菌属(Rhodobacter)、红假单胞菌属(Rhodopseudomonas)、红螺菌属(Rhodospirillum)、栅列藻属(Scenedesmus)、链霉菌属(Streptomyces)、聚球菌属(Synechoccus)、发酵单胞菌属(Zymomonas)等的微生物,例如,大肠杆菌XL1-Blue、大肠杆菌XL2-Blue、大肠杆菌DH1、大肠杆菌DH5α、大肠杆菌MC1000、大肠杆菌KY3276、大肠杆菌W1485、大肠杆菌JM109、大肠杆菌HB101、大肠杆菌No.49、大肠杆菌W3110、大肠杆菌NY49、大肠杆菌MP347、大肠杆菌NM522、大肠杆菌BL21、枯草杆菌(Bacillus subtilis)ATCC33712、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、产氨短杆菌(Brevibacteriumammoniagenes)、马里奥短杆菌(Brevibacterium immariophilum)ATCC14068、解糖短杆菌(Brevibacterium saccharolyticum)ATCC 14066、黄色短杆菌(Brevibacteriumflavum)ATCC 14067、乳糖发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)ATCC 13869、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032、谷氨酸棒杆菌ATCC14297、嗜乙酰乙酸棒杆菌(Corynebacterium acetoacidophilum)ATCC13870、嗜氨微杆菌(Microbacterium ammoniaphilum)ATCC15354、无花果沙雷氏菌(Serratia ficaria)、居泉沙雷氏菌(Serratia fonticola)、液化沙雷氏菌(Serratia liquefaciens)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、假单胞菌(Pseudomonas sp.)D-0110、放射形土壤杆菌(Agrobacterium radiobacter)、发根土壤杆菌(Agrobacterium rhizogenes)、悬钩子癌肿病土壤杆菌(Agrobacterium rubi)、圆筒鱼腥蓝细菌(Anabaena cylindrica)、桶形鱼腥蓝细菌(Anabaena doliolum)、水花鱼腥蓝细菌(Anabaena flos-aquae)、金黄节杆菌(Arthrobacter aurescens)、柠檬节杆菌(Arthrobacter citreus)、格鲁伯福尼斯节杆菌(Arthrobacter globformis)、烃谷氨酸节杆菌(Arthrobacter hydrocarboglutamicus)、迈索尔节杆菌(Arthrobacter mysorens)、烟草节杆菌(Arthrobacter nicotianae)、石蜡节杆菌(Arthrobacter paraffineus)、原玻璃蝇短杆菌(Arthrobacter protophormiae)、玫瑰石蜡节杆菌(Arthrobacter roseoparaffinus)、硫磺节杆菌(Arthrobacter sulfureus)、产脲节杆菌(Arthrobacter ureafaciens)、巴氏着色菌(布氏红硫菌)(Chromatium buderi)、微温着色菌(Chromatium tepidum)、酒色着色菌(Chromatium vinosum)、沃氏着色菌(Chromatium warmingii)、河流相着色菌(Chromatium fluviatile)、噬夏孢欧文氏菌(Erwinia uredovora)、胡萝卜软腐杆菌(Erwinia carotovora)、凤梨软腐杆菌(Erwiniaananas)、草生假单胞菌(Erwinia herbicola)、斑点欧文氏菌(Erwinia punctata)、土曲霉欧文氏菌(Erwinia terreus)、罗得西亚甲基杆菌(Methylobacterium rhodesianum)、扭脱甲基杆菌(Methylobacterium extorquens)、席蓝细菌属(Phormidium sp.)ATCC29409、荚膜红细菌(Rhodobacter capsulatus)、类球红细菌(Rhodobactersphaeroides)、芽球红细菌(Rhodopseudomonas blastica)、马瑞那红假单胞菌(Rhodopseudomonas marina)、金红红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)、深红红螺菌(Rhodospirillum rubrum)、需盐红螺菌(Rhodospirillum salexigens)、盐渍红螺菌(Rhodospirillum salinarum)、产二素链霉菌(Streptomyces ambofaciens)、金霉素链霉菌(Streptomyces aureofaciens)、金色链霉菌(Streptomyces aureus)、杀真菌素链霉菌(Streptomyces fungicidicus)、灰产色链霉菌(Streptomyces griseochromogenes)、灰色链霉菌(Streptomyces griseus)、浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans、橄榄灰链霉菌(Streptomyces olivogriseus)、枝链霉菌(Streptomyces rameus)、田无链霉菌(Streptomyces tanashiensis)、酒红链霉菌(Streptomyces vinaceus)、运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)等。
重组DNA的引入方法只要是向上述宿主细胞引入DNA的方法则可以任意使用,可以例举,使用钙离子的方法[Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,69,2110(1972)]、原生质体法(日本专利特开昭63-248394)、电穿孔法[Nucleic Acids Res.,16,6127(1988)]、热休克法等。
将酵母菌株用作为宿主细胞时,表达载体可以使用例如,YEp13(ATCC37115)、YEp24(ATCC37051)、YCp50(ATCC37419)、pHS19、pHS15等。
作为启动子,只要是在酵母菌株中具有功能的启动子则可以使用任何启动子,例如,PHO5启动子、PGK启动子、GAP启动子、ADH启动子、gal 1启动子、gal 10启动子、热休克多肽启动子、MFα1启动子、CUP 1启动子等的启动子。
宿主细胞可以例举属于酵母菌属(Saccharomyces)、人体酵母菌属
(Schizosaccharomyces)、克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces)、孢子属(Trichosporon)、许旺酵母属(Schwanniomyces)、毕赤酵母属(Pichia)、或念珠菌属(Candida)等的酵母菌株,具体而言,可以例举酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、茁芽丝孢酵母(Trichosporon pullulans)、冲积许旺酵母(Schwanniomyces alluvius)、毕赤酵母(Pichiapastoris)、产朊假丝酵母(Candida utilis)等。
作为重组DNA的引入方法,只要是在酵母中引入DNA的方法则可以使用任意方法,例如,电穿孔法[Methods Enzymol.,194,182(1990)]、原生质体法[Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,81,4889(1984)]、醋酸锂法[J.Bacteriol.,153,163(1983)]等。
使用动物细胞作为宿主时,表达载体可以使用例如,pcDNAI、pcDM8(フナコシ社市售)、pAGE107(日本专利特开平3-22979)、pAS3-3(日本专利特开平2-227075)、pCDM8[Nature,329,840(1987)]、pcDNAI/Amp(インビトロジエン社制)、pREP4(インビトロジエン社制)、pAGE103[J.Biochem,101,1307(1987)]、pAGE210、pAMo、pAMoA等。
作为启动子,只要是在动物细胞中发挥功能的启动子即可,可以使用任何启动子,例如,巨细胞病毒(CMV)的IE(立早)基因的启动子、SV40的初期启动子或金属硫蛋白的启动子、反转录病毒的启动子、热休克启动子、SRα启动子等。此外,也可以将人CMV的IE基因的增强子与启动子一起使用。
宿主细胞可以例举小鼠多发性骨髓瘤细胞、大鼠多发性骨髓瘤细胞、小鼠杂交瘤细胞、人细胞淋巴瘤(ナマルバ;Namalwa)细胞或淋巴瘤(ナマルバ;Namalwa)KJM-1细胞、人胎儿肾脏细胞、人白血病细胞、非洲绿猴肾脏细胞、中国仓鼠的细胞CHO细胞、HBT5637(日本专利特开昭63-299)等。
小鼠多发性骨髓瘤细胞可以例举SP2/0、NSO等,大鼠多发性骨髓瘤细胞可以例举YB2/0等,人胎儿肾脏细胞可以例举HEK293(ATCC CRL-1573)、人白血病细胞可以例举BALL-1等,非洲绿猴肾脏细胞可以例举COS-1、COS-7等。
作为重组DNA的引入方法,只要是在动物细胞内引入DNA的方法则可以使用任何方法,例如,电穿孔法[Cytotechnology,3,133(1990)]、磷酸钙法(日本专利特开平2-227075)、脂质体转染法[Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,84,7413(1987)]、Virology,52,456(1973)中记载的方法等。
将昆虫细胞用作为宿主时,可以根据例如《杆状病毒表达载体(BaculovirusExpression Vectors)》,实验室手册,W.H.Freeman and Company,纽约(1992)、《分子生物学现行协议(カレント·プロトコ一ルズ·イン·モレキユラ一·バイオロジ一)》、分子生物学,实验室手册、生物/技术,6,47(1988)等中记载的方法,生产蛋白质。
即,可以将重组基因引入载体和杆状病毒共同引入昆虫细胞中、在昆虫细胞培养上清液中获得重组病毒后,再使昆虫细胞感染重组病毒,生产蛋白质。
该方法中使用的基因引入载体可以举出例如,pVL1392、pVL1393、pBlueBacIII(都是インビトロジエン社制)等。
杆状病毒可以使用例如,夜盗蛾科昆虫感染的病毒苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus)等。
昆虫细胞可以使用草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)的卵巢细胞、粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)的卵巢细胞、来自蚕卵巢的培养细胞等。
草地贪夜蛾的卵巢细胞可以例举Sf9、Sf21(杆状病毒·表达·载体·实验室·手册)等,粉纹夜蛾的卵巢细胞可以例举High 5、BTI-TN-5B1-4(インビトロジエン社制)等、来自蚕卵巢的培养细胞可以例举家蚕(Bombyx mori)N4等。
为了配制重组病毒的、向昆虫细胞共同引入上述重组基因引入载体和上述杆状病毒的方法可以举出例如,磷酸钙法(日本专利特开平2-227075)、脂质体转染法[Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,84,7413(1987)]等。
将植物细胞用作宿主细胞时,表达载体可以举出例如Ti质粒、烟草花叶病毒载体等。
作为启动子只要是在植物细胞中发挥功能的启动子则可以使用任何启动子,例如,花椰菜花叶病毒(CaMV)的35S启动子、水稻肌动蛋白1启动子等。
宿主细胞可以例举烟草、土豆、西红柿、胡萝卜、大豆、油菜、紫花苜蓿、水稻、小麦、大麦等的植物细胞等。
作为重组载体的引入方法,只要是在植物细胞中引入DNA的方法则可以使用任何方法,例如,使用农杆菌属(Agrobacterium)的方法(日本专利特开昭59-140885、日本专利特开昭60-70080、WO94/00977)、电穿孔法(日本专利特开昭60-251887)、使用粒子枪(基因枪)的方法(日本专利第2606856、日本专利第2517813)等。
宿主可以是微生物、酵母、动物细胞、昆虫细胞等、植物细胞等中的任何宿主,优选微生物,更优选属于埃希氏菌属的微生物,进一步优选属于大肠杆菌的微生物。
由酵母、动物细胞、昆虫细胞或植物细胞表达时,可以得到附加糖或糖链的蛋白质。
在培养基中培养得到的转化体,通过在培养物中生成蓄积具有异戊二烯基转移酶活性的酶,可以制造具有异戊二烯基转移酶活性的酶。此外,根据需要,也可以通过上述纯化操作纯化酶。
作为在培养基中培养上述转化体的方法,可以按照宿主的培养中常用的方法进行。例如,根据上述的培养基组成和培养条件进行培养即可。
(聚异戊二烯)
接着,对本发明的聚异戊二烯进行说明。本发明的聚异戊二烯是下述式(4)所示的由反式结构部、顺式结构部构成,上述反式结构部中含有的原子或原子团的至少一个被其它的原子或原子团取代。反式结构部表示反式结构的异戊二烯单元的重复部分(下述式(4)中的C部分)。此外,顺式结构部表示顺式结构的异戊二烯单元的重复部分(下述式(4)中的()q部分(D部分))。
【化22】
(式(4)中,n表示1~10的整数。q表示30~40000的整数。Y表示羟基、甲酰基、羧基、酯基、羰基或下述式(2)所示的基团。)
【化23】
本发明的聚异戊二烯具有接近天然橡胶的结构,与橡胶分子的相溶性高。此外,本发明的聚异戊二烯实质上只在分子的末端部分施加了改性。即,本发明的聚异戊二烯具有位于顺式结构部的末端的羟基、甲酰基、羧基、酯基、羰基或上述式(2)所示的基团,此外,由于反式结构部中含有的原子或原子团的至少一个被其它的原子或原子团取代,不阻碍聚异戊二烯本来具有的特性而与二氧化硅等填充剂的相互作用强。这样,由于本发明的聚异戊二烯与橡胶的相溶性高且与二氧化硅等填充剂的相互作用强,因此通过混合在橡胶组合物中,可以得到比以往水平高的橡胶分子与填充剂复合的橡胶组合物,例如,可以提高橡胶组合物的低发热性、湿抓地性能、耐磨性。
本发明的聚异戊二烯只在顺式结构部的末端部分、反式结构部的末端附近部分存在极性基团等。因此,与主链部分具有极性基团等或只在顺式结构部的末端部分具有极性基团等的情况相比,不阻碍聚异戊二烯本来具有的特性而与二氧化硅等填充剂的分散性高、例如,低发热性、湿抓地性能、耐磨性的提高效果高。
上述式(4)的n与上述式(1)的n相同。
上述式(4)的q表示30~40000(优选15000~30000,更优选15000~20000)的整数。
上述式(4)的Y与上述式(1)的Y相同。从与二氧化硅等填充剂的相互作用强考虑,Y优选羟基、羧基。
反式结构部中含有的原子或原子团(被取代前的原子或原子团)可以例举与上述式(1)中的反式结构部中含有的原子或原子团(被取代前的原子或原子团)相同的原子或原子团。
其它的原子或原子团可以例举与上述式(1)中对其它的原子或其它的原子团所说明的相同的原子或原子团。
上述反式结构部中含有的原子或原子团的至少一个被其它的原子或原子团取代,该取代与针对异戊二烯低聚物所说明的同样,优选下述式(4-1)中的VI部分中含有的原子或原子团的至少一个被取代、下述式(4-1)中的VII部分中含有的原子或原子团未被取代。
【化24】
(式(4-1)中的n、q、Y与式(4)中的n、q、Y一样。)
上述式(4)中的反式结构部的具体例可以举出例如,上述式(a)~(s)所示的结构。其中,出于与二氧化硅等填充剂的相互作用强、低发热性、湿抓地性能、耐磨性的提高效果高的理由,优选上述式(c)、(d)、(e)、(f)、(k)、(l)、(r)所示的结构。
(聚异戊二烯的制造方法)
本发明的聚异戊二烯的制造方法可以举出例如,由本发明的异戊二烯低聚物与异戊烯基二磷酸生物合成的方法。
本发明的聚异戊二烯,除了起始基质烯丙基性二磷酸衍生物为有机合成以外,是通过生物合成得到的,因此,顾及到了石油资源的枯竭和环境问题。
一直以来,已知天然胶乳中含有具有催化异戊二烯低聚物与异戊烯基二磷酸之间的缩合反应、依次将异戊烯基二磷酸与异戊二烯低聚物连接为Z型(新增的异戊二烯单元为顺式结构)、催化生成聚异戊二烯的以下反应的活性的酶和橡胶延长因子等。
【化25】
本发明中,可以使用该酶和橡胶延长因子等制造聚异戊二烯。
即,由本发明的异戊二烯低聚物和异戊烯基二磷酸生物合成本发明的聚异戊二烯的方法可以例举例如,使用天然胶乳中含有的酶和橡胶延长因子等的方法。此外,也可以使用由天然胶乳克隆的酶和橡胶延长因子等。
即,可以使本发明的异戊二烯低聚物和异戊烯基二磷酸在上述酶和/或上述橡胶延长因子的存在下反应。具体而言,例如,通过在含有本发明的异戊二烯低聚物与异戊烯基二磷酸的溶液中添加天然胶乳或从天然胶乳中分离的酶、橡胶延长因子等进行反应即可。此外,反应温度为例如20~40℃、反应时间为例如1~72小时、pH为例如6~8即可。此外,根据需要也可以添加氯化镁、表面活性剂、2-巯基乙醇等。
通过上述反应得到的本发明的聚异戊二烯中,通常,上述式(4)的Y为上述式(2)所示的基团或羟基。该羟基可以通过上述式(2)所示的基团水解生成。
此外,上述式(4)的Y为甲酰基的聚异戊二烯可以通过例如,将上述式(4)的Y为上述式(2)所示的基团的聚异戊二烯氧化得到。
此外,上述式(4)的Y为羧基的聚异戊二烯可以通过例如,将上述式(4)的Y为上述式(2)所示的基团的聚异戊二烯氧化得到。
此外,上述式(4)的Y为酯基的聚异戊二烯可以通过例如,将上述式(4)的Y为上述式(2)所示的基团的聚异戊二烯氧化、酯化得到。
此外,上述式(4)的Y为羰基的聚异戊二烯可以通过例如,将上述式(4)的Y为上述式(2)所示的基团的聚异戊二烯氧化、酯化得到。
上述天然胶乳的由来没有特别限定,可以举出例如,巴西橡胶树(Heveabrasiliensis)、印度橡胶树(Ficus elastica)、琴叶榕(Ficus lyrata)、垂叶榕(Ficusbenjamina)、菩提树(Ficus religiosa)、榕树(Ficus benghalensis)、鲑黄色乳菇(Lactariuschrysorrheus)等。其中,出于生产的橡胶的分子量大、乳胶中含有的橡胶分量多的理由,优选巴西橡胶树。
天然胶乳可以通过例如在巴西橡胶树的树干上用刀等划出槽状的伤口(割胶)、回收从被切断的乳管中流出的天然胶乳而得到。
从天然胶乳中分离的酶、橡胶延长因子可以举出例如,通过离心分离天然胶乳而分离的浆液(Serum)、底相(bottom fraction)和橡胶相(rubber fraction)等。浆液、底相和橡胶相中含有上述酶和上述橡胶延长因子等。
(橡胶组合物)
本发明的橡胶组合物中含有本发明的异戊二烯低聚物和/或本发明的聚异戊二烯。因此,本发明的橡胶组合物在低发热性、湿抓地性能、耐磨性方面优异。本发明的聚异戊二烯可以用作为橡胶成分。
本发明的聚异戊二烯的含量,在橡胶成分100质量%中,优选20质量%以上,更优选40质量%以上,进一步优选60质量%以上,也可以是100质量%。
本发明的聚异戊二烯以外可以使用的橡胶成分可以举出例如,异戊二烯橡胶(IR)、天然橡胶(NR)、丁二烯橡胶(BR)、丁苯橡胶(SBR)、苯乙烯异戊二烯丁二烯橡胶(SIBR)、氯丁橡胶(CR)、丙烯腈丁二烯橡胶(NBR)等的二烯系橡胶。橡胶成分可以单独使用也可以并用2种以上。其中,优选NR、BR。
在橡胶组合物中混合本发明的异戊二烯低聚物时,出于与异戊二烯低聚物的相溶性高的理由,橡胶成分优选使用NR。通过并用本发明的异戊二烯低聚物与NR,可以更好地获得混合本发明的异戊二烯低聚物的效果。
在橡胶组合物中混合本发明的异戊二烯低聚物时,橡胶成分100质量%中,NR的含量优选20质量%以上,更优选40质量%以上,进一步优选60质量%以上,也可以是100质量%。
本发明的异戊二烯低聚物的含量,相对于橡胶成分100质量份,优选1质量份以上,更优选2质量份以上。不足1质量份时,恐怕不能充分得到通过混合异戊二烯低聚物而得到的效果。此外,上述异戊二烯低聚物的含量优选20质量份以下,更优选15质量份以下。超过20质量份,存在强度下降且耐磨性也下降的担忧。
本发明中使用的填充剂可以举出例如,二氧化硅、炭黑、黏土、碳酸钙等。
本发明中优选使用二氧化硅作为填充剂。通过混合二氧化硅,可以充分得到由混合本发明的异戊二烯低聚物和/或本发明的聚异戊二烯而得到的效果。二氧化硅没有特别限定,可以例举例如,干法二氧化硅(无水硅酸)、湿法二氧化硅(含水硅酸)等,出于硅醇基多的理由,优选湿法二氧化硅。
此外,本发明中,也优选使用炭黑作为填充剂。此时也可以充分获得由混合本发明的异戊二烯低聚物和/或本发明的聚异戊二烯而得到的的效果。
本发明的橡胶组合物中除了上述成分以外还可以适当混合在橡胶组合物的制造中常用的配合剂,例如,硅烷偶联剂、氧化锌、硬脂酸、各种防老化剂、油等的软化剂、蜡、硫等的硫化剂、硫化促进剂等。
作为本发明的橡胶组合物的制造方法可以使用公知的方法,例如,通过使用开口辊、班伯里混练机等的橡胶混炼装置混炼上述各成分,然后硫化的方法等制造。
本发明的橡胶组合物可以适用于轮胎的各部件(例如,胎面、侧壁、胎面基部、帘布层、缓冲层、胎体)等。
(充气轮胎)
本发明的充气轮胎可以使用上述橡胶组合物按照通常的方法制造。即,在未硫化阶段将橡胶组合物挤压加工为对应于轮胎各部件(例如,胎面、侧壁)的形状,通过通常的方法用轮胎成形机成形,再与其它的轮胎部件贴合,从而形成未硫化轮胎。将该未硫化轮胎在硫化机中加热加压从而制造轮胎。
【实施例】
基于实施例具体说明本发明,但本发明并不局限于这些实施例。
(起始基质的配制)
(制造例1)
(10-乙酰基-3,7-二甲基-十二碳-(2E,6E)-二烯基二磷酸酯(上述式(S)所示的化合物)的合成)
以金合欢醇为起始物质合成。在无水二氯甲烷中用咪唑、叔丁基二苯基氯硅烷(TBDPS)保护金合欢醇的羟基,得到TBDPS保护体(下述(ai)所示的化合物)(收率92%)。在无水二氯甲烷中,用间氯苯甲酸氧化10位的烯烃,得到环氧体(下述(aii)所示的化合物)(收率9%)。接着,在无水四氢呋喃中用原高碘酸氧化环氧体得到醛体(下述(aiii)所示的化合物)(收率28%)。接着,在无水甲醇中用镁和溴代丁烷制作格氏试剂,在格氏试剂中加入醛体,得到仲醇体(下述(aiv)所示的化合物)(收率68%)。在无水二氯甲烷溶剂中,二甲基氨基吡啶存在下,通过无水醋酸得到仲羟基由乙酰基保护的酯体(下述(av)所示的化合物)(收率81%)。在无水四氢呋喃中用正四丁基铵水合物使TBDPS保护基脱保护,得到伯醇体(下述(avi)所示的化合物)(收率82%)。接着,在-40℃以下、无水二氯甲烷溶剂中,用N-氯代琥珀酸酰亚胺与二甲硫醚对伯羟基进行氯取代,得到氯化物(下述(avii)所示的化合物)(收率82%)。接着,在无水乙腈中用三(四正丁基铵)氢化磷酸盐(トリス—テトラnブチルアンモニウム水素化リン酸塩)进行二磷酸化,得到目标物质即下述(aviii)所示的化合物(上述式(S)所示的化合物)(收率42%)。
各合成阶段的中间体和最终产物的确认使用TLC和仪器分析(IR、NMR)进行。
【化26】
-Ac=-C(=O)-CH3
(制造例2)
(8-甲氧基-3,7-二甲基-十二碳-(2E,6E)-二烯基二磷酸酯(上述式(B)所示的化合物)的合成)
以香叶醇为起始物质合成。在无水二氯甲烷中用吡啶和无水醋酸乙酰化,得到醋酸酯(下述(bi)所示的化合物)(收率95%)。接着,在乙醇中将8位的碳进行硒氧化,得到醛体(下述(bii)所示的化合物)(收率24%)。接着,用氢氧化钾进行碱水解,得到醇体(下述(biii)所示的化合物)(收率38%)。接着,在无水二氯甲烷中用咪唑、叔丁基二苯基氯硅烷(TBDPS)得到下述(biv)所示的化合物(收率80%)。然后,使丁基锂在无水醚中反应,得到丁基醇体(下述(bv)所示的化合物)(收率73%)。接着,在无水四氢呋喃中用氢氧化钠作成钠盐后加入甲基碘,通过Williamson合成,得到醚体(下述(bvi)所示的化合物)(收率95%)。接着,在无水四氢呋喃中用四正氟化铵脱离,得到醇体(下述(bvii)所示的化合物)(收率87%)。接着,在-40℃以下、无水二氯甲烷溶剂中用N-氯代琥珀酸酰亚胺与二甲硫醚对伯羟基进行氯取代,得到氯化物(下述(bviii)所示的化合物)(收率92%)。接着,在无水乙腈中用三(四正丁基铵)氢化磷酸盐进行二磷酸化,得到目标物质即下述(bix)所示的化合物(上述式(B)所示的化合物)(收率26%)。
各合成阶段的中间体和最终产物的确认使用TLC和仪器分析(IR、NMR)进行。
【化27】
(制造例3)
(8-羟基-3,7-二甲基-十二碳-(2E,6E)-二烯基二磷酸酯(上述式(C)所示的化合物)的合成)
以香叶醇为起始物质合成。在无水二氯甲烷中用吡啶和无水醋酸乙酰化,得到醋酸酯(下述(ci)所示的化合物)(收率97%)。接着,在乙醇中对8位的碳进行硒氧化得到醛体(下述(cii)所示的化合物)(收率20%)。接着,用氢氧化钾进行碱水解,得到醇体(下述(ciii)所示的化合物)(收率42%)。接着,在无水二氯甲烷中用咪唑、叔丁基二苯基氯硅烷(TBDPS)得到下述(civ)所示的化合物(收率80%)。然后,在无水醚中使丁基锂反应,得到丁基醇体(收率62%)。接着,在无水四氢呋喃中用四正氟化铵脱离,得到二元醇体(下述(cvi)所示的化合物)(收率94%)。接着,在-40℃以下、无水二氯甲烷溶剂中用N-氯代琥珀酸酰亚胺与二甲硫醚对伯羟基进行氯取代,得到氯化物(下述(cvii)所示的化合物)(收率90%)。接着,在无水乙腈中用三(四正丁基铵)氢化磷酸盐进行二磷酸化,得到目标物质即下述(cviii)所示的化合物(上述式(C)所示的化合物)(收率46%)。
各合成阶段的中间体和最终产物的确认使用TLC和仪器分析(IR、NMR)进行。
【化28】
(制造例4)
((10S)-羟基-3,7-二甲基-十二碳-(2E,6E)-二烯基二磷酸酯(上述式(D)所示的化合物)的合成)
以金合欢醇为起始物质合成。用咪唑、无水二甲基甲酰胺、无水二氯甲烷、叔丁基二苯基氯硅烷(TBDPS)使金合欢醇的羟基与保护基结合,得到TBDPS保护体(下述(di)所示的化合物)(收率99%)。接着,在无水二氯甲烷溶剂下,用间氯过氧苯甲酸进行反应,得到环氧体(下述(dii)所示的化合物)(收率29%)。接着,在醚、四氢呋喃混合溶剂中通过使用了原高碘酸的高碘酸氧化得到醛体(下述(diii)所示的化合物)(收率73%)。在无水醚溶剂下,用乙基碘、镁制备格氏试剂后,进行与醛的反应,生成醇体(下述(div)所示的化合物)(收率80%)。在无水二氯甲烷溶剂中,在N,N-二环己基碳二亚胺、4-二甲基氨基吡啶、(+)-10-樟脑磺酸存在下用(S)-MaNPacid使与醇体的外消旋体仲羟基反应,得到非对映异构体。然后,通过HPLC进行光学分离,通过由NMR确定绝对构型,得到光学上为下述(dv)所示的化合物(收率:80%)。再在无水四氢呋喃中用正四丁基铵水合物对TBDPS保护基进行脱保护,得到二元醇体(下述(dvi)所示的化合物)(收率80%)。接着,在-40℃以下、无水二氯甲烷溶剂中用N-氯代琥珀酸酰亚胺与二甲硫醚对伯羟基进行氯取代,得到氯化物(下述(dvii)所示的化合物)(收率80%)。接着,在无水乙腈中用三(四正丁基铵)氢化磷酸盐进行二磷酸化,得到目标物质即下述(dviii)所示的化合物(上述式(D)所示的化合物)(收率46%)。
各合成阶段的中间体和最终产物的确认使用TLC和仪器分析(IR、NMR)进行。
【化29】
(制造例5)
((10R)-羟基-3,7-二甲基-十二碳-(2E,6E)-二烯基二磷酸酯(上述式(E)所示的化合物)的合成)
以金合欢醇为起始物质合成。用咪唑、无水二甲基甲酰胺、无水二氯甲烷、叔丁基二苯基氯硅烷(TBDPS)使金合欢醇的羟基与保护基结合,得到TBDPS保护体(下述(ei)所示的化合物)(收率99%)。接着,在无水二氯甲烷溶剂下用间氯过氧苯甲酸进行反应,得到环氧体(下述(eii)所示的化合物)(收率29%)。接着,在醚、四氢呋喃混合溶剂中通过使用了原高碘酸的高碘酸氧化得到醛体(下述(eiii)所示的化合物)(收率73%)。在无水醚溶剂下,用乙基碘、镁制备格氏试剂后,进行与醛的反应,生成醇体(下述(eiv)所示的化合物)(收率80%)。无水二氯甲烷溶剂中,在N,N-二环己基碳二亚胺、4-二甲基氨基吡啶、(+)-10-樟脑磺酸存在下用(S)-MaNPacid使与醇体的外消旋体仲羟基反应,得到非对映异构体。然后,通过HPLC进行光学分离,通过由NMR确定绝对构型,得到光学上为下述(ev)所示的化合物(收率:84%)。再在无水四氢呋喃中用正四丁基铵水合物对TBDPS保护基进行脱保护,得到二元醇体(下述(evi)所示的化合物)(收率91%)。接着,在-40℃以下、无水二氯甲烷溶剂中用N-氯代琥珀酸酰亚胺与二甲硫醚对伯羟基进行氯取代,得到氯化物(下述(evii)所示的化合物)(收率70%)。接着,在无水乙腈中用三(四正丁基铵)氢化磷酸盐进行二磷酸化,得到目标物质即下述(eviii)所示的化合物(上述式(E)所示的化合物)(收率59%)。
各合成阶段的中间体和最终产物的确认使用TLC和仪器分析(IR、NMR)进行。
【化30】
(制造例6)
(10-羟基-3,7-二甲基-十二碳-(2E,6E)-二烯基二磷酸酯(上述式(R)所示的化合物)的合成)
以金合欢醇为起始物质合成。用咪唑、无水二甲基甲酰胺、无水二氯甲烷、叔丁基二苯基氯硅烷(TBDPS)使金合欢醇的羟基与保护基结合,得到TBDPS保护体(fi)(收率99%)。接着,在无水二氯甲烷溶剂下,用间氯过氧苯甲酸进行反应,得到环氧体(fii)(收率29%),在醚、四氢呋喃混合溶剂中通过使用了原高碘酸的高碘酸氧化得到醛体(fiii)(收率73%)。在无水醚溶剂下,用乙基碘、镁制备格氏试剂后,进行与醛的反应,生成醇体(fiv)(收率80%)。在无水四氢呋喃溶剂中,用四丁基氟化铵使(fiv)的TBDPS基脱离,生成二元醇(fv)(收率93%)。
二元醇(fv)在-40℃、无水二氯甲烷溶剂中,用N-氯代琥珀酸酰亚胺和二甲硫醚,进行二元醇的烯丙基位上存在的羟基的氯化,生成氯化物(fvi)(收率69%)。无水乙腈溶剂中,用三(四-N-丁基)铵氢焦磷酸进行(fvi)的二磷酸化,用离子交换柱合成目标物质(fvii)(上述式(R)所示的化合物)(收率28%)。
各合成阶段的中间体和最终产物的确认使用TLC和仪器分析(IR、NMR)进行。
【化31】
(制造例7)
(8-[(叔丁基二甲基硅烷基)氧基]-3,7-二甲基-十碳-(2E,6E)-二烯基二磷酸酯(上述式(P)所示的化合物)的合成)
以香叶醇为起始物质合成。在无水二氯甲烷中用吡啶和无水醋酸乙酰化,得到醋酸酯(下述(gi)所示的化合物)(收率97%)。接着,在乙醇中对8位的碳进行硒氧化,得到醇体(下述(gii)所示的化合物)(收率20%)。通过在使用了咪唑的碱性催化剂下,使氯化叔丁基二甲基甲硅烷反应,得到下述(giii)所示的化合物(收率87%)。接着,通过氢氧化钾水解,得到醇体(下述(giv)所示的化合物)(收率78%)。醇体由N-氯代琥珀酰亚胺法氯化,得到氯化物(下述(gv)所示的化合物)(收率40%)。接着,在无水乙腈中与二磷酸氢正丁基铵盐混合,得到目标物质即下述(gvi)所示的化合物(上述式(P)所示的化合物)(收率26%)。
各合成阶段的中间体和最终产物的确认使用TLC和仪器分析(IR、NMR)进行。
【化32】
(制造例8)
(8-甲氧基甲氧基-3,7-二甲基-十碳-(2E,6E)-二烯基二磷酸酯(上述式(H)所示的化合物)的合成)
以香叶醇为起始物质合成。在无水醋酸和吡啶中搅拌香叶醇,将羟基乙酰化,得到下述(hi)所示的化合物(收率12%)。接着,进行采用二氧化硒和叔丁基过氧化氢的氧化反应,得到反式醇体(下述(hii)所示的化合物)(收率38%)。使用氯代甲乙醚和二异丙基乙基胺使醇体在二氯甲烷中反应,得到在8位羟基引入了甲氧基甲基醚基的下述(hiii)所示的化合物(收率76%)。接着,通过氢氧化钾使乙酰基成为羟基,得到醇体(下述(hiv)所示的化合物)(收率95%)。通过用N-氯代琥珀酸酰亚胺将醇体的羟基氯化从而得到氯化物(下述(hv)所示的化合物)(收率30%)。然后,通过二磷酸氢三(四-正丁基)铵进行二磷酸化,通过纤维素柱得到目标物质即下述(hvi)所示的化合物(上述式(H)所示的化合物)(收率77%)。
各合成阶段的中间体和最终产物的确认使用TLC和仪器分析(IR、NMR)进行。
【化33】
(制造例9)
(8-正丙基硫代-3,7-二甲基-十碳-(2E,6E)-二烯基二磷酸酯(上述式(M)所示的化合物)的合成)
以香叶醇为起始物质合成。通过对甲苯磺酸吡啶鎓盐催化剂使香叶醇和二氢吡喃缩合,得到香叶醇的羟基被四氢吡喃环保护的下述(ii)所示的化合物(收率85%)。接着,采用二氧化硒和叔丁基过氧化氢进行氧化反应,得到反式的醇体(下述(iii)所示的化合物)(收率47%)。在二氯甲烷中用N-氯代琥珀酰亚胺将醇体氯化,得到下述(iiii)所示的化合物)(收率92%)。接着,使其与在将金属钠溶解于乙醇而得到的溶液中添加了正丙烷硫醇得到的液体反应,得到硫醚(下述(iiv)所示的化合物)(收率28%)。接着,通过在甲醇中使对甲苯磺酸作用,得到醇体(下述(iv)所示的化合物)(收率75%)。醇体通过N-氯代琥珀酰亚胺法氯化,得到氯化物(下述(ivi)所示的化合物)(收率40%)。接着,在无水乙腈中与二磷酸氢正丁基铵盐混合,得到目标物质即下述(ivii)所示的化合物(上述式(M)所示的化合物)(收率32%)。
各合成阶段的中间体和最终产物的确认使用TLC和仪器分析(IR、NMR)进行。
【化34】
(制造例10)
(8-苄氧基-3,7-二甲基-十碳-(2E,6E)-二烯基二磷酸酯(上述式(N)所示的化合物)的合成)
以香叶醇为起始物质合成。通过对甲苯磺酸吡啶鎓盐催化剂使香叶醇和二氢吡喃缩合,得到香叶醇的羟基被四氢吡喃环保护的下述(ji)所示的化合物(收率85%)。接着,进行采用二氧化硒与叔丁基过氧化氢的氧化反应,得到反式体的醇体(下述(jii)所示的化合物)(收率47%)。接着,在无水四氢呋喃中加入溴化苄、氢氧化钠,得到醚(下述(jiii)所示的化合物)(收率87%)。接着,通过在甲醇中使对甲苯磺酸作用,得到醇体(下述(jiv)所示的化合物)(收率69%)。醇体通过N-氯代琥珀酰亚胺法氯化,得到氯化物(下述(jv)所示的化合物)(收率40%)。接着,在无水乙腈中与二磷酸氢正丁基铵盐混合,得到目标物质即下述(jvi)所示的化合物(上述式(N)所示的化合物)(收率26%)。
各合成阶段的中间体和最终产物的确认使用TLC和仪器分析(IR、NMR)进行。
【化35】
(制造例11)
(7-乙酰基-7-氮杂-3-甲基-十二碳(2E)-二烯基二磷酸酯(上述式(K)所示的化合物)的合成)
以香叶醇为起始物质合成。在无水二氯甲烷中、二甲基氨基吡啶存在下,用无水醋酸通过香叶醇的乙酰化得到酯体(下述(ki)所示的化合物)(收率96%)。在无水二氯甲烷中,用间氯苯甲酸将6位的烯烃氧化,得到环氧体(下述(kii)所示的化合物)(收率92%)。接着,在无水四氢呋喃中通过原高碘酸氧化得到醛体(下述(kiii)所示的化合物)(收率66%)。接着,在无水甲醇中进行使用正丁基胺和氰基硼氢化钠进行还原的氨基化,得到仲胺(下述(kiv)所示的化合物)(收率66%)。在无水二氯甲烷溶剂下,二甲基氨基吡啶存在下,进行采用无水醋酸的乙酰化,得到仲酰胺(下述(kv)所示的化合物)(收率38%)。在无水甲醇中通过氢氧化钾不可逆地水解酯部位,得到伯醇体(下述(kvi)所示的化合物)(收率76%)。接着,在-40℃以下、无水二氯甲烷溶剂中用N-氯代琥珀酸酰亚胺与二甲硫醚对伯羟基进行氯取代,得到氯化物(下述(kvii)所示的化合物)(收率67%)。接着,在无水乙腈中用三(四正丁基铵)氢化磷酸盐进行二磷酸化,得到目标物质(下述(kviii)所示的化合物(上述式(K)所示的化合物))(收率50%)。
各合成阶段的中间体和最终产物的确认使用TLC和仪器分析(IR、NMR)进行。
【化36】
(制造例12)
(突变导入酶的制备)
试药使用Stratagene公司的QuickChange定点突变试剂盒(QuickChange Site-DirectedMutagenesis Kit)。设计引物以使能够在目的部位引入突变。突变引入用引物购自株式会社医学生物学研究所(生产厂家:XX IDT)。设计的引物如下所示。
突变酶N31A制备用引物
正向引物5′-gac gga gca ggc cga tgg gca aaa-3′(序列号23)
反向引物5′-cat cgg cct gct ccg tcc ata atg a-3′(序列号24)
突变酶N77A制备用引物
正向引物5′-act gaa gca tgg tct cgt cct aaa g-3′(序列号25)
反向引物5′-gag acc atg ctt cag ttg aaa atg c-3′(序列号26)
突变酶L91N制备用引物
正向引物5′-gat gaa aaa ccc ggg tga ttt ttt aa-3′(序列号27)
反向引物5′-cac ccg ggt ttt tca tca agt aatta-3′(序列号28)
突变酶L91D制备用引物
正向引物5′-gat gaa aga tcc ggg tga ttt ttt aa-3′(序列号29)
反向引物5′-cac ccg gat ctt tca tca agt aat ta-3′(序列号30)
突变酶N31Q制备用引物
正向引物5′-gac gga caa ggc cga tgg gca aaa-3′(序列号31)
反向引物5′-cca tcg gcc ttg tcc gtc cat aat-3′(序列号32)
突变酶N77Q制备用引物
正向引物5′-act gaa caa tgg tct cgt cct aaa g-3′(序列号33)
反向引物5′-cga gac cat gct tca gtt gaa aat gc-3′(序列号34)
突变酶L91G制备用引物
正向引物5′-gat gaa agg acc ggg tga ttt ttt aa-3′(序列号35)
反向引物5′-acc cgg tcc ttt cat caa gta att aac-3′(序列号36)
突变酶L91K制备用引物
正向引物5′-gat gaa aaa acc ggg tga ttt ttt aa-3′(序列号37)
反向引物5′-acc cgg ttt ttt cat caa gta att aa-3′(序列号38)
突变酶F95A制备用引物
正向引物5′-ggg tga tgc gtt aaa cac att ttt ac-3′(序列号39)
反向引物5′-gtt taa tgc atc acc cgg tag ttt ca-3′(序列号40)
突变酶F95W制备用引物
正向引物5′-ggg tga ttg gtt aaa cac att ttt ac-3′(序列号41)
反向引物5′-gtt taa cca atc acc cgg tag ttt ca-3′(序列号42)
dsDNA模板(双链DNA模板)使用组合了来自藤黄微球菌B-P26的十一异戊二烯基二磷酸合成酶(以下也称为野生型酶)的pET22b(pET22b/MLU-UPS)。pET22b/MLU-UPS由日本东北大学多元物质科学研究所的古山种俊教授转让得到。混合10x Pfu聚合酶缓冲液2μl、dsDNA模板2-20ng、正向引物50ng、反向引物50ng、2.5mMeach dNTP 0.4μl、ddH2O共20μl、Pfu聚合酶(2.5U/μl)0.4ml,进行PCR反应。PCR反应在95℃30sec进行1次、95℃30sec-55℃1min-68℃8min进行15次。PCR后,在PCR反应液中加入0.4μl的Dpn I,进行37℃1小时的Dpn I处理。使用Dpn I处理液1-10μl通过热休克法将E.coli DH5α转化,将该转化体涂布在含有50μg/mL的氨苄青霉素的LB琼脂培养基上后,37℃下培养一晚,选择转化株。在含有50μg/ml的氨苄青霉素的LB培养基内整夜培养该转化体,通过碱SDS法由得到的培养液配制质粒。使用序列分析仪确认了该质粒引入突变。
(制造例13)
(具有异戊二烯基转移酶活性的蛋白质的生产)
使用质粒pET22b/MLU-UPS(野生型和突变型)将大肠杆菌E.coli BL21(DE3)转化。将得到的E.coli BL21(DE3)/pET22b/MLU-UPS(野生型和突变型)接种到装有3mL含有50μg/mL的氨苄青霉素的LB培养基的试管中,在37℃下振荡培养5小时。得到的培养液中,取1mL接种至装有100mL的含有50μg/mL氨苄青霉素的LB培养基的500mL锥形瓶中,在37℃下振荡培养3小时后,添加IPTG使其为0.1mmol/L,在30℃下振荡培养18小时。离心分离该培养液。得到湿菌体。
通过超声波处理粉碎上述得到的湿菌体后,离心分离,使用HisTrap(アマシヤム公司制)从得到的上清液中纯化具有异戊二烯基转移酶活性的蛋白质。纯化后的蛋白质通过SDS-PAGE确认纯化。
(实施例和比较例)
(异戊二烯低聚物的配制)
配制含有纯化后的各蛋白质10mg、50mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)、40mM氯化镁、40mM Triton X-100、25mM 2-巯基乙醇、1mM起始基质(法尼基二磷酸、制造例1~11中配制的各起始基质)、1mM异戊烯基二磷酸的反应液,使其在37℃的水浴中反应1小时。
反应结束后,加入饱和食盐水100ml和1-丁醇500ml,搅拌后,静置。然后,通过蒸发浓缩固化上清液(1-丁醇层)。取一部分通过NMR确认结构,得到异戊二烯低聚物。
得到的异戊二烯低聚物的详细情况(式(1)中的n、m)如表1、2所示。Y为羟基或上述式(2)所示的基团。
以使用的起始基质的信息和采用TLC的异戊二烯链长为基础算出式(1)中的n、m。此外,通过NMR和IR鉴定Y的结构。
【表1】
【表2】
(实施例和比较例)
(野生型酶和突变酶的活性比较(不同基质的相对活性))
使用制造例1~11中配制的起始基质和法尼基二磷酸,在以下的条件下进行反应,以野生型酶(来自藤黄微球菌B-P26的十一异戊二烯基二磷酸合成酶)的活性相对于各起始基质为100,用指数表示各突变酶的活性。
配制含有纯化后的蛋白质500ng、50mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)、40mM氯化镁、40mM TritonX-100、25mM 2-巯基乙醇、12.5μM起始基质、50μM[1-14C]异戊烯基二磷酸的反应液,使其在37℃的水浴中反应1小时。反应后,通过液体闪烁计数的值和TLC定量,测定各酶的活性。
【表3】
(实施例和比较例)
(聚异戊二烯的配制)
配制含有乳胶成分10μl、50mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)、25mM氯化镁、40mM2-巯基乙醇、40mM氟化钾、50μM异戊二烯低聚物、1mM异戊烯基二磷酸的反应液,使其在30℃的水浴反应3天。反应后,通过GPC测定分子量。然后,以测定的分子量和使用的起始基质的信息为基础,算出式(4)中的n、q。得到的聚异戊二烯的详细情况(式(4)中的n、q)如表4、5所示。Y是羟基或上述式(2)所示的基团。此外,Y的鉴定与实施例(异戊二烯低聚物的配制)同样地进行。
乳胶成分使用通过将从巴西橡胶树得到的乳胶超离心分离而配制的浆液。
使用的异戊二烯低聚物为与实施例(异戊二烯低聚物の配制)同样的条件下使用突变酶N31A等、使用各起始基质(法尼基二磷酸、制造例1~11中配制的各起始基质)而得到的异戊二烯低聚物。以下,使用法尼基二磷酸、上述式(S)所示的化合物、上述式(B)所示的化合物、上述式(C)所示的化合物、上述式(D)所示的化合物、上述式(E)所示的化合物、上述式(R)所示的化合物、上述式(P)所示的化合物、上述式(H)所示的化合物、上述式(M)所示的化合物、上述式(N)所示的化合物、上述式(K)所示的化合物作为起始基质,将在与实施例(异戊二烯低聚物的配制)同样条件下使用突变酶N31A等得到的异戊二烯低聚物分别制成异戊二烯低聚物(O)、异戊二烯低聚物(S)、异戊二烯低聚物(B)、异戊二烯低聚物(C)、异戊二烯低聚物(D)、异戊二烯低聚物(E)、异戊二烯低聚物(R)、异戊二烯低聚物(P)、异戊二烯低聚物(H)、异戊二烯低聚物(M)、异戊二烯低聚物(N)、异戊二烯低聚物(K)。
【表4】
【表5】
(抗菌试验)
在与实施例(异戊二烯低聚物的配制)同样的条件使用由突变酶N31A得到的异戊二烯低聚物进行抗菌试验。异戊二烯低聚物使用异戊二烯低聚物(O)、异戊二烯低聚物(S)、异戊二烯低聚物(B)、异戊二烯低聚物(C)、异戊二烯低聚物(D)、异戊二烯低聚物(E)、异戊二烯低聚物(R)、异戊二烯低聚物(P)、异戊二烯低聚物(H)、异戊二烯低聚物(M)、异戊二烯低聚物(N)、异戊二烯低聚物(K)。
抗菌试验使用以下的菌株。
革兰氏阳性菌:金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(13276)、枯草杆菌(Bacillussubtilis)(3134)
革兰氏阴性菌:大肠杆菌(Echerichia coli)(3972)、沙门氏菌(Salmonella enteric)(100797)、铜绿假单胞菌(Peudomonas aeruginosa)(13275)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumonia)(3512)
真菌类:白色念珠菌(Candida albicans)(1594)
()内表示独立行政法人制品评价技术基础机构生物技术本部生物遗传资源部门编号(NBRC No.)。使用的菌株均购自NBRC。
接着,将使用的菌株的复原、培养条件示于表6。
【表6】
培养基的组成(各1L溶液)
108:葡萄糖10g,蛋白胨5克,酵母提取物3g,麦芽提取物3g,琼脂15克,pH 5.6
702:聚蛋白胨10g,酵母提取物2g,MgSO4·7H2O 1g,pH7.0
703:葡萄糖10g,蛋白胨5g,酵母提取物3g,麦芽提取物3g,pH6.0
802:聚蛋白胨10g,酵母提取物2g,MgSO4·7H2O 1g,琼脂15g,pH7.0
将金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)菌株接种到装有2ml液体培养基(聚蛋白胨10g/L,酵母提取物2g/L,MgSO4·7H2O1g/L,pH7.0)的试管中,在30℃、150rpm下进行5小时培养,接种到固体培养基(聚蛋白胨10g/L,酵母提取物2g,MgSO4·7H2O1g/L,琼脂15g/L,pH7.0)中,在30℃培养一晚,第二天确认菌落。将固体培养基上的一个菌落接种到装有4ml液体培养基的试管中,30℃下培养一晚,这是前培养。接着,在装有4ml液体培养基的新试管中加入前培养液100μl,再30℃、150rpm下进行培养。培养的中间,用分光光度计测定浊度培养至O.D.600=0.1~0.3。使用稀释法调整培养液至105cfu/ml,用于抗菌试验。
通过一般的调查抗微生物物质的活性的实验方法即最小抑菌浓度(MIC)法测定MIC。在1.5ml试管内分别加入调整为105cfu/ml的培养了上述菌的培养液和配制为0.5-5mM的异戊二烯低聚物,混合,在30℃、150rpm下培养一晚。培养后,用涂布棒在固体培养基上涂布各浓度的培养液,在30℃下培养1-4日。培养后,通过肉眼观察来调查上述菌有无发育,将上述菌不发育的最小的上述末端修饰异戊二烯低聚物化合物的添加浓度作为MIC。
对于其它的菌也同样地求出MIC。
使用的异戊二烯低聚物和MIC示于表7。
【表7】
(表7的结果的考察)
反式结构部中含有的原子或原子团的至少一个没有被其它的原子或原子团取代的比较例(异戊二烯低聚物(O)(由法尼基二磷酸得到的异戊二烯低聚物))未见抗菌活性(未见800ppm以下的抗菌活性)。另一方面,使用反式结构部中含有的原子或原子团的至少一个被其它的原子或原子团取代的异戊二烯低聚物的实施例见到抗菌活性。
(橡胶组合物)
接着,将本发明的异戊二烯低聚物、聚异戊二烯混合在橡胶组合物中进行性能评价。首先,根据与制造例1~11同样的方法进行上述式(F)所示的化合物的合成。
接着,使用法尼基二磷酸和合成的起始基质(上述式(K)所示的化合物、上述式(F)所示的化合物)配制异戊二烯低聚物。得到的异戊二烯低聚物的详细情况(式(1)中的n、m、Y)由与实施例(异戊二烯低聚物的配制)同样的方法确定。
(制造例14)
(异戊二烯低聚物(F)的配制)
使用上述式(F)所示的化合物作为起始基质进行异戊二烯低聚物(F)的配制。为了调整得到的异戊二烯低聚物的分子量,调整上述(异戊二烯低聚物的調整)中记载的条件进行反应。
得到的异戊二烯低聚物(F)的详细情况(式(1)中的n、m)为n=2、m=5~8。Y是羟基或上述式(2)所示的基团。
(制造例15)
(异戊二烯低聚物(K)的配制)
使用上述式(K)所示的化合物作为起始基质进行异戊二烯低聚物(K)的配制。为了调整得到的异戊二烯低聚物的分子量,调整上述(异戊二烯低聚物的調整)中记载的条件进行反应。
得到的异戊二烯低聚物(K)的详细情况(式(1)中的n、m)为n=1、m=5~7。Y是羟基或上述式(2)所示的基团。
(制造例16)
(异戊二烯低聚物(O)的配制)
使用法尼基二磷酸作为起始基质进行异戊二烯低聚物(O)的配制。为了调整得到的异戊二烯低聚物的分子量,调整上述(异戊二烯低聚物的調整)中记载的条件进行反应。
得到的异戊二烯低聚物(O)的详细情况(式(1)中的n、m)为n=3、m=5~7。Y是羟基或上述式(2)所示的基团。
接着,使用制造例14~16中得到的异戊二烯低聚物(异戊二烯低聚物(F)、异戊二烯低聚物(K)、异戊二烯低聚物(O))配制聚异戊二烯。得到的聚异戊二烯的详细情况(式(4)中的n、q、Y)根据与实施例(聚异戊二烯的配制)同样的方法确定。
(制造例17)
(聚异戊二烯(F)的配制)
使用制造例14中配制的异戊二烯低聚物(F)进行聚异戊二烯(F)的配制。为了调整得到的聚异戊二烯的分子量,调整上述(聚异戊二烯的調整)中记载的条件进行反应。
得到的聚异戊二烯(F)的详细情况(式(4)中的n、q)为n=2、q=7000~12000。Y是羟基或上述式(2)所示的基团。
(制造例18)
(聚异戊二烯(K-1)的配制)
使用制造例15中配制的异戊二烯低聚物(K)进行聚异戊二烯(K-1)的配制。为了调整得到的聚异戊二烯的分子量,调整上述(聚异戊二烯的調整)中记载的条件进行反应。
得到的聚异戊二烯(K-1)的详细情况(式(4)中的n、q)为n=1、q=3500~7000。Y是羟基或上述式(2)所示的基团。
(制造例19)
(聚异戊二烯(K-2)的配制)
使用制造例15中配制的异戊二烯低聚物(K)进行聚异戊二烯(K-2)的配制。为了调整得到的聚异戊二烯的分子量,调整上述(聚异戊二烯的調整)中记载的条件进行反应。
得到的聚异戊二烯(K-2)的详细情况(式(4)中的n、q)为n=1、q=7000~12000。Y是羟基或上述式(2)所示的基团。
(制造例20)
(聚异戊二烯(O)的配制)
使用制造例16中配制的异戊二烯低聚物(O)进行聚异戊二烯(O)的配制。为了调整得到的聚异戊二烯的分子量,调整上述(聚异戊二烯的調整)中记载的条件进行反应。
得到的聚异戊二烯(O)的详细情况(式(4)中的n、q)为n=3、q=7000~12000。Y是羟基或上述式(2)所示的基团。
以下,对实施例12~21和比较例2~6中使用的各种化学试剂总结说明。
NR:TSR20
BR:JSR(株)制的BR01
炭黑:三菱化学(株)制的ダイヤブラツク(N220)
异戊二烯低聚物(F)、异戊二烯低聚物(K)、异戊二烯低聚物(O):制造例14~16中得到的异戊二烯低聚物
聚异戊二烯(F)、聚异戊二烯(K-1)、聚异戊二烯(K-2)、聚异戊二烯(O):制造例17~20中得到的聚异戊二烯
氧化锌:三井金属矿业(株)制的氧化锌1号
硬脂酸:日油(株)制的硬脂酸
防老化剂:大内新兴化学工业(株)制的ノクラツク6C(N-(1,3-二甲基丁基)-N’-苯基对苯二胺)
蜡:大内新兴化学工业(株)制的サンノツクワツクス
硫:鹤见化学(株)制的粉末硫
硫化促进剂NS:大内新兴化学工业(株)制的ノクセラ-NS(N-叔丁基-2-苯并噻唑次磺酰胺)
二氧化硅:日本二氧化硅(株)制的ニツプシ一ルAQ(湿式二氧化硅)
硅烷偶联剂:德固赛公司制的Si266(双(3-三乙氧基甲硅烷基丙基)二硫化物)
硫化促进剂DPG:大内新兴化学工业(株)制的ノクセラ一D(N,N-二苯基胍)
实施例12~21和比较例2~6
按照表8,9所示的配方,使用1.7L班伯里混合机混炼硫和硫化促进剂以外的材料,得到混炼物。接着,在得到的混炼物中添加硫和硫化促进剂,用开口辊将其捏合,得到未硫化橡胶组合物。使用蒸汽硫化机在压力80kgf/cm2、150℃下对得到的未硫化橡胶组合物硫化30分钟,得到硫化橡胶组合物。
对得到的硫化橡胶组合物进行下述评价。结果示于表8、9。表8的基准配合为比较例4、表9的基准配合为比较例5。
(粘弹性试验)
使用(株)岩本制作所制的粘弹性分析仪在70℃、变形2%时(初期伸长率)的条件进行tanδ的测定,以基准配合的tanδ为100以指数表示。指数越大表示发热越大。指数为100以下时,视为耐发热性(低发热性)提高。即,指数越小低发热性越优异。
(兰伯恩磨耗试验)
使用(株)岩本制作所制的兰伯恩磨耗试验机,在荷重3kg、滑移率40%和砂量15g/分的条件下实施5分钟磨耗试验。使样品的形状为厚5mm、直径50mm,研磨石使用粒度#80的GC型研磨粒。以基准配合为100(基准)将试验结果指数化。指数越大耐磨性越优异,指数超过100时,视为耐磨性提高。
(拉伸试验)
根据JIS K6251“硫化橡胶和热塑性橡胶-拉伸特性的求法”,使用由上述硫化橡胶片构成的3号哑铃型试验片实施拉伸试验,测定断裂强度(TB)(MPa)、断裂时伸长率(EB)(%)。断裂时伸长率不足480%则用于大型轮胎时容易产生橡胶碎片,需要改良。此外,由于断裂强度下降的话也是造成轮胎破坏的原因,因此需要防止因材料的改变引起的下降。
【表8】
【表9】
由表8可知,使用反式结构部中含有的原子或原子团的至少一个被其它的原子或原子团取代的异戊二烯低聚物的实施例,其低发热性、耐磨性、断裂时伸长率优异。
由表9可知,使用反式结构部中含有的原子或原子团的至少一个被其它的原子或原子团取代的聚异戊二烯的实施例,其低发热性、耐磨性、断裂强度优异。
接着,通过对天然存在的起始基质法尼基二磷酸等维持上述式(I)的I部分的结构,即使其它部分引入希望的结构时,通过使用天然存在的低聚物生成酶异戊二烯基转移酶、将其一部分突变后的酶,可以生成异戊二烯低聚物,使用没有维持上述式(I)的I部分的结构的起始基质时,显示没有进行酶反应,为了显示上述事实,进行了下述实验。
首先,进行没有维持上述式(I)的I部分的结构的下述起始基质1~4的合成。
【化37】
(起始基质1(2E-二磷酸丁烯酯)的合成)
以巴豆醇为起始物质合成。在无水二氯甲烷溶剂中使用N-氯代琥珀酰亚胺和二甲硫醚,对伯羟基进行氯取代,得到氯化物(下述(i)所示的化合物)(收率78%)。接着,在无水乙腈中用三(四正丁基铵)氢化磷酸盐进行二磷酸化,得到目标物质即下述(ii)所示的化合物(起始基质1)(收率50%)。各合成阶段的中间体和最终生成物的确认使用TLC和仪器分析(IR、NMR)进行。
【化38】
(起始基质2(7-甲基-八碳-2E,6E-二烯基二磷酸酯)的合成)
以3-甲基-2-丁烯-1-醇为起始物质合成。在氮气氛下、无水二氯甲烷中使用N-氯代琥珀酰亚胺(NCS)、二甲硫醚(DMS)将3-甲基-2-丁烯-1-醇的羟基氯化,得到氯化物(下述(i)所示的化合物)(收率90%)。接着,在无水N,N-二甲基甲酰胺中、氢氧化锂存在下,使氰基乙酸乙酯反应,得到酯体(下述(ii)所示的化合物)(收率44%)。接着,通过氢氧化钾和甲醇水解,得到羧酸(下述(iii)所示的化合物)(收率92%)。接着,通过二甲亚砜和食盐进行脱碳酸,得到腈体(下述(iv)所示的化合物)(收率40%)。无水二氯甲烷下,通过二异丁基氢化锂、饱和氯化铵还原,得到醛体(下述(v)所示的化合物)(收率89%)。在无水四氢呋喃中用氢化钠、二乙基膦酰基乙酸乙酯得到反式的酯体(下述(vi)所示的化合物)(收率84%)。接着,在无水二氯甲烷、无水己烷中用二异丁基氢化锂、甲醇还原,得到醇体(下述(vii)所示的化合物)(收率19%)。接着,在-40℃以下、无水二氯甲烷溶剂中用N-氯代琥珀酸酰亚胺与二甲硫醚对伯羟基进行氯取代,得到氯化物(下述(viii)所示的化合物)(收率82%)。接着,在无水乙腈中用三(四正丁基铵)氢化磷酸盐进行二磷酸化,得到目标物质即下述(ix)所示的化合物(起始基质2)(收率50%)。各合成阶段的中间体和最终生成物的确认使用TLC和仪器分析(IR、NMR)进行。
【化39】
(起始基质3(7,11-二甲基-十二碳-2E,6E,10E-三烯基二磷酸酯)的合成)
以香叶醇为起始物质合成。氮气氛下在无水二氯甲烷中使用N-氯代琥珀酰亚胺(NCS)、二甲硫醚(DMS)将香叶醇的羟基氯化,得到氯化物(下述(i)所示的化合物)(收率94%)。接着,在无水N,N-二甲基甲酰胺中,在氢氧化锂存在下,使氰基乙酸乙酯反应,得到酯体(下述(ii)所示的化合物)(收率34%)。接着,通过氢氧化钾和甲醇水解,得到羧酸(下述(iii)所示的化合物)(收率95%)。接着,在二甲亚砜中通过食盐脱碳酸,得到腈体(下述(iv)所示的化合物)(收率40%)。在无水二氯甲烷中通过二异丁基氢化锂、饱和氯化铵还原,得到醛体(下述(v)所示的化合物)(收率91%)。在无水四氢呋喃中,使用氢化钠、二乙基膦酰基乙酸乙酯得到反式的酯体(下述(vi)所示的化合物)(收率82%)。接着,在无水二氯甲烷、无水己烷中用二异丁基氢化锂、甲醇还原,得到醇体(下述(vii)所示的化合物)(收率19%)。接着,在无水二氯甲烷溶剂中用N-氯代琥珀酸酰亚胺与二甲硫醚对伯羟基进行氯取代,得到氯化物(下述(viii)所示的化合物)(收率82%)。接着,在无水乙腈中用三(四正丁基铵)氢化磷酸盐进行二磷酸化,得到目标物质即下述(ix)所示的化合物(起始基质3)(收率42%)。各合成阶段的中间体和最终生成物的确认使用TLC和仪器分析(IR、NMR)进行。
【化40】
(起始基质4(7,11,15-三甲基-十六碳-2E,6E,10E,14E-四烯基二磷酸酯)的合成)
以金合欢醇为起始物质合成。在氮气氛下、无水二氯甲烷中使用N-氯代琥珀酰亚胺(NCS)、二甲硫醚(DMS)将金合欢醇的羟基氯化,得到氯化物(下述(i)所示的化合物)(收率91%)。在无水N,N-二甲基甲酰胺中、氢氧化锂存在下,使氰基乙酸乙酯反应,得到酯体(下述(ii)所示的化合物)(收率34%)。接着,通过氢氧化钾和甲醇水解,得到羧酸(下述(iii)所示的化合物)(收率88%)。接着,在二甲亚砜通过食盐脱碳酸,得到腈体(下述(iv)所示的化合物)(收率40%)。在无水二氯甲烷中通过二异丁基氢化锂、饱和氯化铵还原,得到醛体(下述(v)所示的化合物)(收率81%)。在无水四氢呋喃中,使用氢化钠、二乙基膦酰基乙酸乙酯得到反式的酯体(下述(vi)所示的化合物)(收率84%)。接着,在无水二氯甲烷、无水己烷中用二异丁基氢化锂、甲醇还原,得到醇体(下述(vii)所示的化合物)(收率30%)。接着,在无水二氯甲烷溶剂中用N-氯代琥珀酸酰亚胺与二甲硫醚对伯羟基进行氯取代,得到氯化物(下述(viii)所示的化合物)(收率86%)。接着,在无水乙腈中用三(四正丁基铵)氢化磷酸盐进行二磷酸化,得到目标物质即下述(ix)所示的化合物(起始基质4)(收率41%)。各合成阶段的中间体和最终生成物的确认使用TLC和仪器分析(IR、NMR)进行。
【化41】
接看,按照与制造例1~11同样的方法进行上述式(G)所示的化合物、上述式(I)所示的化合物、上述式(Q)所示的化合物的合成。
接着,使用来自藤黄微球菌B-P26的十一异戊二烯基二磷酸合成酶作为酶,使用上述起始基质1~4、上述式(B)所示的化合物、上述式(C)所示的化合物、上述式(G)所示的化合物、上述式(K)所示的化合物和法尼基二磷酸(FPP)在以下的条件下进行反应。结果,以酶对法尼基二磷酸的活性为100,将酶对起始基质1~4、上述式(B)所示的化合物、上述式(C)所示的化合物、上述式(G)所示的化合物、上述式(K)所示的化合物的相对活性示于表10。
配制含有酶500ng、50mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)、40mM氯化镁、40mM TritonX-100、25mM 2-巯基乙醇、12.5μM起始基质、50μM[1-14C]异戊烯基二磷酸、的反应液,在37℃的水浴中使其反应1小时。反应后,通过液体闪烁计数的值和TLC定量,测定酶相对于各起始基质的活性。
【表10】
起始基质 | 相对活性(%) |
法尼基二磷酸 | 100 |
起始基质1 | 0.3 |
起始基质2 | 0.6 |
起始基质3 | 1.2 |
起始基质4 | 5.9 |
式(B)的化合物 | 68.4 |
式(C)的化合物 | 74.8 |
式(G)的化合物 | 72.9 |
式(K)的化合物 | 40.6 |
由表10的结果可知,使用没有维持上述式(I)的I部分的结构的起始基质1~4时,酶反应几乎没有进行。另一方面,使用维持上述式(I)的I部分的结构的起始基质时,酶反应进行。
接着,使用来自藤黄微球菌B-P26以外的生物的具有异戊二烯基转移酶活性的酶时,也同样地,根据有无维持上述式(I)的I部分的结构,与来自藤黄微球菌B-P26的十一异戊二烯基二磷酸合成酶时一样可见上述趋势,使用来自嗜热脂肪芽孢杆菌(BachillusStearothermophilus)的法尼基二磷酸合成酶、来自嗜酸热硫化叶菌(Sulfolobusacidocaldarius)的香叶基香叶基二磷酸合成酶进行下述实验。
首先,配制来自嗜热脂肪芽孢杆菌(Bachillus Stearothermophilus)的法尼基二磷酸合成酶。
使用组入了来自嗜热脂肪芽孢杆菌(Bachillus Stearothermophilus)的法尼基二磷酸合成酶的质粒pET22b(pET22b/BsFPS),与上述方法同样地将大肠杆菌E.coli BL21(DE3)转化。pET22b/BsFPS由日本东北大学多元物质科学研究所古山教授转让。
将E.coli BL21(DE3)/pET22b/BsFPS接种到装有3mL含有50μg/mL的氨苄青霉素的LB培养基的试管中,37℃下振荡培养5小时。将得到的培养液中的1mL接种到装有100mL的含50μg/mL氨苄青霉素的LB培养基的500mL锥形瓶中,在37℃下振荡培养3小时,添加IPTG以使其成为0.1mmol/L,在30℃下振荡培养18小时。将该培养液离心分离,取得湿菌体。通过超声波处理将上述得到的湿菌体破碎后,离心分离,使用HisTrap(アマシヤム社制)从得到的上清液纯化具有异戊二烯基转移酶活性的蛋白质(来自嗜热脂肪芽孢杆菌(Bachillus Stearothermophilus)的法尼基二磷酸合成酶)。通过SDS-PAGE确认纯化后的蛋白质的纯化。
接着,进行来自嗜酸热硫化叶菌(Sulfolobus acidocaldarius)的香叶基香叶基二磷酸合成酶的配制。
使用组入来自嗜酸热硫化叶菌(Sulfolobus acidocaldarius)的香叶基香叶基二磷酸合成酶的质粒pET22b(pET22b/SaGGPS),与上述方法同样地将大肠杆菌E.coli BL21(DE3)转化。pET22b/SaGGPS由日本东北大学大学院工学研究科西野德三教授转让。
将E.coli BL21(DE3)/pET22b/SaGGPS接种到装有3mL的含50μg/mL氨苄青霉素的LB培养基的试管中,在37℃下振荡培养5小时。将得到的培养液中的1mL接种到装有100mL的含50μg/mL氨苄青霉素的LB培养基的500mL锥形瓶中,在37℃下振荡培养3小时,添加IPTG以使其成为0.1mmol/L,在30℃下振荡培养18小时。将该培养液离心分离,取得湿菌体。通过超声波处理将上述得到的湿菌体破碎后,离心分离,使用HisTrap(アマシヤム社制)从得到的上清液纯化具有异戊二烯基转移酶活性的蛋白质(来自嗜酸热硫化叶菌(Sulfolobus acidocaldarius)的香叶基香叶基二磷酸合成酶)。通过SDS-PAGE确认纯化后的蛋白质的纯化。
使用得到的来自嗜热脂肪芽孢杆菌(Bachillus Stearothermophilus)的法尼基二磷酸合成酶,使用上述起始基质1~4、上述式(F)所示的化合物、上述式(I)所示的化合物、上述式(Q)所示的化合物和下述所示结构的香叶基二磷酸(GPP),在以下的条件下进行反应。结果,将酶对香叶基二磷酸的活性设为100,将酶对起始基质1~4、上述式(F)所示的化合物、上述式(I)所示的化合物、上述式(Q)所示的化合物的相对活性示于表11。
配制含有纯化后的酶500ng、50mM Tris-HCl缓冲液(pH8.5)、40mM氯化镁、50mM氯化铵、40mM TritonX-100、25mM 2-巯基乙醇、12.5μM起始基质、50μM[1-14C]异戊烯基二磷酸的反应液,使其在55℃的水浴中反应1小时。反应后,通过液体闪烁计数的值和TLC定量,测定酶对各起始基质的活性。
【化42】
【表11】
起始基质 | 相对活性(%) |
香叶基二磷酸 | 100 |
起始基质1 | 1.4 |
起始基质2 | 3.2 |
起始基质3 | 2.1 |
起始基质4 | 0.7 |
式(F)的化合物 | 52.3 |
式(I)的化合物 | 44.1 |
式(Q)的化合物 | 54.3 |
此外,同样地,使用来自嗜酸热硫化叶菌(Sulfolobus acidocaldarius)的香叶基香叶基二磷酸合成酶,使用上述起始基质1~4、上述式(B)所示的化合物、上述式(C)所示的化合物、上述式(G)所示的化合物、上述式(K)所示的化合物、上述式(F)所示的化合物、上述式(I)所示的化合物、上述式(Q)所示的化合物、法尼基二磷酸(FPP)、香叶基二磷酸(GPP)在以下的条件下进行反应。结果,将酶对法尼基二磷酸或香叶基二磷酸的活性设为100,将酶对起始基质1~4、上述式(B)所示的化合物、上述式(C)所示的化合物、上述式(G)所示的化合物、上述式(K)所示的化合物、上述式(F)所示的化合物、上述式(I)所示的化合物、上述式(Q)所示的化合物的相对活性示于表12、13。
配制含有纯化后的酶500ng、50mM Tris-HCl缓冲液(pH5.8)、40mM氯化镁、50mM氯化铵、40mM TritonX-100、25mM 2-巯基乙醇、12.5μM起始基质、50μM[1-14C]异戊烯基二磷酸的反应液,使其在55℃的水浴中反应1小时。反应后,通过液体闪烁计数的值和TLC定量,测定酶对各起始基质的活性。
【表12】
起始基质 | 相对活性(%) |
香叶基二磷酸 | 100 |
起始基质1 | 0.4 |
起始基质2 | 0.4 |
起始基质3 | 0.6 |
起始基质4 | 0.8 |
式(F)的化合物 | 52.3 |
式(I)的化合物 | 44.1 |
式(Q)的化合物 | 54.3 |
【表13】
起始基质 | 相对活性(%) |
法尼基二磷酸 | 100 |
起始基质1 | 2.3 |
起始基质2 | 2.5 |
起始基质3 | 3.9 |
起始基质4 | 1.4 |
式(B)的化合物 | 70.6 |
式(C)的化合物 | 37.3 |
式(G)的化合物 | 70.4 |
式(K)的化合物 | 38.6 |
由表11~13的结果可知,使用来自嗜热脂肪芽孢杆菌(Bachillus Stearothermophilus)的法尼基二磷酸合成酶、来自嗜酸热硫化叶菌(Sulfolobus acidocaldarius)的香叶基香叶基二磷酸合成酶时也与使用来自藤黄微球菌B-P26的十一异戊二烯基二磷酸合成酶时一样,使用没有维持上述式(I)的I部分的结构的起始基质1~4时,酶反应几乎未进行。另一方面,使用维持上述式(I)的I部分的结构的起始基质时,酶反应进行。
由表1~3、10~13的结果可知,通过对作为天然存在的起始基质的法尼基二磷酸和香叶基二磷酸等维持上述式(I)的I部分的结构,即使其它部分引入希望的结构,通过使用作为天然存在的低聚物生成酶的具有异戊二烯基转移酶活性的酶、将其一部分突变后的酶,能够生成异戊二烯低聚物。
(序列表自由文本)
序列号1:来自藤黄微球菌B-P 26的十一异戊二烯基二磷酸合成酶(野生型酶)的碱基序列
序列号2:来自藤黄微球菌B-P 26的十一异戊二烯基二磷酸合成酶(野生型酶)的氨基酸序列
序列号3:突变酶N31A的碱基序列
序列号4:突变酶N31A的氨基酸序列
序列号5:突变酶N77A的碱基序列
序列号6:突变酶N77A的氨基酸序列
序列号7:突变酶L91N的碱基序列
序列号8:突变酶L91N的氨基酸序列
序列号9:突变酶L91D的碱基序列
序列号10:突变酶L91D的氨基酸序列
序列号11:突变酶N31Q的碱基序列
序列号12:突变酶N31Q的氨基酸序列
序列号13:突变酶N77Q的碱基序列
序列号14:突变酶N77Q的氨基酸序列
序列号15:突变酶L91G的碱基序列
序列号16:突变酶L91G的氨基酸序列
序列号17:突变酶L91K的碱基序列
序列号18:突变酶L91K的氨基酸序列
序列号19:突变酶F95A的碱基序列
序列号20:突变酶F95A的氨基酸序列
序列号21:突变酶F95W的碱基序列
序列号22:突变酶F95W的氨基酸序列
序列号23:突变酶N31A制备用正向引物
序列号24:突变酶N31A制备用反向引物
序列号25:突变酶N77A制备用正向引物
序列号26:突变酶N77A制备用反向引物
序列号27:突变酶L91N制备用正向引物
序列号28:突变酶L91N制备用反向引物
序列号29:突变酶L91D制备用正向引物
序列号30:突变酶L91D制备用反向引物
序列号31:突变酶N31Q制备用正向引物
序列号32:突变酶N31Q制备用反向引物
序列号33:突变酶N77Q制备用正向引物
序列号34:突变酶N77Q制备用反向引物
序列号35:突变酶L91G制备用正向引物
序列号36:突变酶L91G制备用反向引物
序列号37:突变酶L91K制备用正向引物
序列号38:突变酶L91K制备用反向引物
序列号39:突变酶F95A制备用正向引物
序列号40:突变酶F95A制备用反向引物
序列号41:突变酶F95W制备用正向引物
序列号42:突变酶F95W制备用反向引物
Claims (14)
5.如权利要求4所述的异戊二烯低聚物,使用具有异戊二烯基转移酶活性的酶进行所述生物合成。
6.如权利要求5所述的异戊二烯低聚物,所述具有异戊二烯基转移酶活性的酶为以下的[1]~[3]中任一项所记载的蛋白质,
[1]由序列号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22中的任意一个序列号所示的氨基酸序列构成的蛋白质
[2]由序列号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22中的任意一个序列号所示的氨基酸序列中包含1个或多个氨基酸的取代、缺失、插入或附加的序列构成、且具有催化下述式(3)所示的、下述式(3)中的异戊二烯单元中含有的原子或原子团的至少一个被其它的原子或原子团取代的烯丙基性二磷酸与异戊烯基二磷酸反应的活性的蛋白质
[3]由与序列号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22中的任意一个序列号所示的氨基酸序列具有45%以上的序列同一性的氨基酸序列构成、且具有催化下述式(3)所示的、下述式(3)中的异戊二烯单元中含有的原子或原子团的至少一个被其它的原子或原子团取代的烯丙基性二磷酸与异戊烯基二磷酸反应的活性的蛋白质
【化6】
式(3)中,p表示1~10的整数。
8.如权利要求7所述的异戊二烯低聚物的制造方法,使用具有异戊二烯基转移酶活性的酶进行所述生物合成。
11.如权利要求9或10所述的聚异戊二烯,由权利要求1~6中任一项所述的异戊二烯低聚物与异戊烯基二磷酸进行生物合成而得到。
12.如权利要求9或10所述的聚异戊二烯的制造方法,所述聚异戊二烯由权利要求1~6中任一项所述的异戊二烯低聚物与异戊烯基二磷酸进行生物合成。
13.一种橡胶组合物,含有权利要求1~6中任一项所述的异戊二烯低聚物和/或权利要求9~11中任一项所述的聚异戊二烯。
14.一种充气轮胎,使用权利要求13所述的橡胶组合物制造。
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